מיפוי אופטי של Intra-sarcoplasmic reticulum Ca Published: September 10, 2015 doi: 10.3791/53166

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Lianguo Wang¹, Nicole M. De Jesus², Crystal M. Ripplinger¹

¹Department of Pharmacology, University of California Davis, ²Departments of Pharmacology and Biomedical Engineering, University of California Davis

Summary

מאמר זה מתאר את הפרוטוקול מפורט וציוד הכרחי למיפוי כפול אופטי של _{(מ 'V)} פוטנציאל הטרנסממברני וחופשי רשתית תוך-sarcoplasmic (SR) Ca ^{2 +} בלב ארנב Langendorff-perfused. שיטה זו מאפשרת לתצפית ישירה וכימות של _מטר V ^ו2+ דינמיקת Ca SR בלב שלם.

Protocol

כל הנהלים הקשורים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת קליפורניה, דייוויס, ודבקו במדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה שפורסם על ידי המכון הלאומי לבריאות.

1. הכנה

1. הכן שתי מניות (25x) מרוכזות של הפתרון של Tyrode שונה מראש ולאחסן ב 4 ° C: (1) במלאי אני (מ"מ: 3,205 NaCl, CaCl ₂ 32.5, KCl 117.5, Nah ₂ PO ₄ 29.75, MgCl ₂ 26.25) ו (2) במלאי II (מ"מ: NaHCO ₃ 500).
   1. טרי להכין הפתרון של 2 L Tyrode של הרכב הבא (מ"מ): NaCl 128.2, CaCl ₂ 1.3, KCl 4.7, MgCl ₂ 1.05, Nah _{2 4} 1.19 PO, NaHCO ₃ 20 וגלוקוז 11.1 על ידי שילוב של 1,840 מיליליטר של deionized (DI) מים, 80 מיליליטר צילומים אני, 80 מיליליטר של המלאי השני, ו4 גרם של גלוקוז. אל ישירות לערבב צילומים אני וצילומים השני; להוסיף אתמ 'ל1,840 מיליליטר DI כדי למנוע משקעים.
2. הכן פתרון מניות של blebbistatin uncoupler עירור-ההתכווצות ב 10 מ"ג / מיליליטר בdi-methylsulfoxide נטול מים (DMSO) מראש ולאחסן את פתרון המניה ב 4 מעלות צלזיוס.
3. הכן פתרונות מניות של צבעי ניאון: (1) RH237 מתח רגיש לצבוע (1 מ"ג / מיליליטר בDMSO) ו- (2) מחוון סידן זיקה נמוכה Fluo-5N בבוקר (2 מ"ג / מיליליטר בDMSO) על פי המלצות יצרן. השתמש בהכנות מייד כדי למנוע פירוק עם האובדן הבא של קיבולת טעינה.
4. ראש מערכת הסירקולציה המחודשת Langendorff זלוף עם חומץ (95% O _2, 5% CO ₂₎ הפתרון של Tyrode. התאם את הזרימה של O ₂ / CO ₂ כדי לשמור את ה- pH של הפתרון של Tyrode 7.4 ± 0.05. השתמש במסנן נקי ב- קו ניילון ארוג (גודל נקבובית: 11 מיקרומטר) כדי לסנן את perfusate ברציפות.
   1. ראש מערכת זלוף ב RT, כloadi הבאng של Fluo-5N בבוקר מתבצע על RT. לטעינה בבוקר Fluo-5N, להשתמש במספר קטן של perfusate הסירקולציה המחודשת (~ 150 מיליליטר). לאחר טעינת צבע, להשתמש נפח גדול יותר של perfusate (1 - 2 L, ראה איור 1 ג).
5. הפעל מערכת רכישת נתונים ולהתכונן לניטור רציף של לחץ א.ק.ג. וזלוף. הכן מערכת לחץ ניטור: חבר מתמר לחץ לקו זלוף ולפקח על לחץ זלוף עם מגבר transbridge. התאם את לחץ זלוף בסיס ל0 מ"מ כספית כאשר הלב אינו מחובר למערכת זלוף.
6. יישר את המצלמות אופטי מיפוי על מנת להבטיח יישור המרחבי בין _{מ 'V} וCa ^{2 +} אותות SR.
   1. ראשית, להתמקד על ידי הצבת מצלמות שליט או אובייקט עם טקסט לתוך צלחת זלוף. הפעל מצלמות מיפוי למצב תצוגה חיה ולהתאים את המיקוד עד שהטקסט הוא חד וברור. לרכוש תמונת מסגרת אחת מכל מצלמה.
   2. כיסויתמונות ואלה להתאים את השקיפות של תמונה העליונה כך ששני התמונות הן נראה לעין. הטקסט בתמונות צריך לחפוף בדיוק. אם לא מיושר לגמרי, להתאים את הזווית של מראה dichroic או את המיקום של כל מצלמה עד שני התמונות מיושרות.

2. קציר, זלוף, ודיי-טעינה של לב ארנב

1. אבטח את הארנב בעוצר ארנב אושר. עמוק להרדים באמצעות הזרקה תוך ורידית (וריד אוזן שולי) של נתרן pentobarbital (50 מ"ג / קילוגרם) והפרין (1,000 IU).
   1. כאשר מוצג הארנב חסר של רפלקסים nociceptive, לעשות חתך בעור קו האמצע כדי לחשוף את עצם החזה וצלעות. לחתוך את עצם החזה עם מספריים כירורגיות בוטים-טיפ מxyphoid לmanubrium. יש להיזהר שלא לפגוע בלב בעת פתיחת עצם החזה. מורחים את הצלעות כדי לחשוף את הלב.
   2. מהירות בלו כל גוש לב-הריאה במהירות על ידי חיתוך כל הכלים ורקמות חיבור. Immediately למקם את בלוק לב-ריאה לפתרון של Tyrode קר כקרח.
2. אתר את אב העורקים לזלוף מדרדר. חותך את אב העורקים עולים רק הפרוקסימלי לשלושה הסניפים של קשת אב העורקים. Cannulate אב העורקים לצינורית 8 G המחובר למערכת זלוף. השתמש בפיסת תפר 0 משי USP כדי לאבטח את אב העורקים על הצינורית.
3. בזהירות לנתח את קנה הנשימה, ריאות, ושומן epicardial מהלב. עם מלקחיים חדים ומספריים לנתיחה, לאתר את שסתום צניפי ובזהירות נזק או להסיר עלון אחד כדי למנוע גודש פתרון בחדר השמאלי.
4. להטביע את הלב בתא זלוף-מקטורן הזכוכית אופקי עם המשטח הקדמי של הלב כלפי מעלה להדמיה. אבטח את הצינורית לפיסת Sylgard עם סיכות בצורת U על תחתית סיליקון של המנה, כדי למנוע תנועה של הלב במהלך המיפוי (1D איור). אם תרצה, להכניס סיכת חרקים קטנה בשיא של הלב לSTAbilization.
5. רל עמדה (ECG) אלקטרודות באמבטיה בצד הימין וצד שמאל של הלב. באופן מלא להטביע את האלקטרודות באמבטיה ולוודא שהם לא במגע עם משטח הלב לספק א.ק.ג.-נערך נפח מקביל לתצורה אני עופרת. ודא מורפולוגיה אני א.ק.ג. עופרת רגילה. התאם את הזרימה (25 - 35 מיליליטר / דקה) כדי להבטיח שלחץ אב העורקים נשמר 60 - 70 מ"מ כספית.
6. כבה את האורות בחדר ולהוסיף 0.3-0.6 מיליליטר של תמיסת blebbistatin מניות (שלב 1.2) לperfusate (הריכוז סופי 10 - 20 מיקרומטר).
   1. כבה את האורות בחדר, כדי למנוע photoinactivation של blebbistatin. במידת צורך, זרקור קטן או פנס יכול לשמש כדי לספק תאורת משימה.
      הערה: Blebbistatin הוא מעכב ATPase שרירן וuncoupler עירור-התכווצות. בגלל טעינת Fluo-5N דורשת תנאים מורחבים (60 דקות) RT (היפותרמיה) (ראה צעדים 2.8-2.10), ייצור אנרגיית לב עלול להיות בסכנה. הerefore, תוספת של blebbistatin לperfusate לפני לצבוע טעינה עשוי להפחית את הביקוש לאנרגיה ¹⁶ ולחסל חפצי תנועה במהלך הקלטות אופטיות עוקבות ^17.
7. כאשר התכווצות של הלב חדל (10 - 15 דקות, מאומתות על הקלטת לחץ אב העורקים), לעבור למערכת זלוף הסירקולציה המחודשת הקטן-הנפח (ראה שלב 1.4.1).
8. הכן ולטעון פתרון טעינת Fluo-5N בבוקר: הוסף 0.25 מיליליטר של פתרון מניות Fluo-5N בבוקר (שלב 1.3) עד 0.25 מיליליטר 20% F127 pluronic החם. הוסף 0.5 מיליליטר הפתרון של Tyrode החם לתערובת, מערבב היטב, ולהוסיף למערכת זלוף הסירקולציה המחודשת הקטן-הנפח.
9. לפקח באופן רציף לחץ זלוף וא.ק.ג. ולהתאים את הזרימה במידת צורך. טעינת צבע לוקחת כ 1 שעה ב RT. 45 דקות לאחר הטעינה החלה, להפעיל את אמבט מים במחזור להתחיל מחממים את מערכת זלוף וperfusate עד 37 מעלות צלזיוס.
10. לאחר 60 דקות של טעינת Fluo-5N בבוקר, swiטצ זלוף למערכת זלוף הסירקולציה המחודשת נפח הגדול יותר (ראה שלב 1.4).
11. לדלל 50 μl של פתרון מניות RH237 הצבע רגיש מתח (שלב 1.3) ב 1 מיליליטר של הפתרון של Tyrode החם ולהוסיף לאט (מעל ~ 5 דקות) להפרוקסימלי נמל הזרקה לצינורית.

3. מיפוי אופטי

1. ברגעים האחרונים של טעינת צבע, למקם את הלב ולמקד את המצלמות אופטי מיפוי על מנת להבטיח את השדה המתאים מבט לניסוי.
2. אם תרצה, למקם את האלקטרודה צעדה דו קוטבית על פני השטח epicardial של הלב לצעדה.
3. מניחים פלסטיק או זכוכית לכסות להחליק על פני השטח של תא זלוף להפחית חפץ תנועה על פני הנוזל שיכול להיות נוכח בשל מחזור של perfusate.
   הערה: כחלופה ללהחליק את המכסה, להשתמש כיסוי פלסטיק נקי 50 מ"מ פטרי צלחת.
4. להתמקד מדריכי האור כדי להאיר את פני השטח של הלב עם דואר אחידxcitation אור. השתמש בדיודה כחולה פולט אור (LED) מקורות אור ועוד לסנן את האור עם 475-495 מסנן bandpass ננומטר (איור 1 א).
5. לאסוף הקרינה נפלטת עם macroscope ושתי מצלמות מיפוי משלימות תחמוצת מתכת מוליכים למחצה (CMOS) אופטיות. לפצל את האור הנפלט עם מראה dichroic ב545 ננומטר.
   1. ארוך לעבור לסנן את מחצית אורך הגל ארוכה יותר, המכיל את האות _{מ 'V,} ב 700 ננומטר. להקה עוברת לסנן את מחצית אורך גל הקצרה יותר, המכיל את אות Ca ^{2 +} SR, 502-534 ננומטר (איור 1 א). הגדר את התדירות של רכישת נתונים אופטית ל0.5-1 קילו-הרץ.
6. לכל הקלטה אופטית, ליזום ראשון פרוטוקול צעדה הרצוי, להדליק את אור העירור, ולאסוף 1 - 4 שניות של נתונים. אם תרצה, לסנכרן את רכישת פרוטוקולי צעדה ונתונים.
   הערה: לא ניתן לטעון מחדש Fluo-5N בבוקר, ולכן יחס אות לרעש (SNR) יהיה decrease לאורך הניסוי בשל לצבוע דליפה מSR. הגבל את פרוטוקול ניסוי ל1 - 2 שעות על מנת להבטיח ערכי SNR גבוהים.
7. בעקבות הניסוי, לשטוף את מערכת זלוף ברצף של מים DI, 70% אלכוהול מגיב, ושוב עם מים די.
8. סנן כל בסיס הנתונים עם מסנן מרחבי גאוס (רדיוס 3 פיקסלים) באמצעות חבילות תוכנה זמינות באופן מסחרי על פי הפרוטוקול של היצרן.
9. במידת צורך, מרחבית ליישר _{מ 'V} וערכות נתונים SR Ca ^{2 +.} כמו בשלב 1.6, תמונות של שכבות מכל מצלמה ולוודא שהמבנים אנטומיים של הלב (כלומר., כלי דם כליליים, קצוות של הפרוזדורים או חדרי הלב) או פריטים אחרים בשדה הראייה (כלומר, צינורית, אלקטרודה צעדה) בדיוק חפיפה. אם לא, יישור המרחבי של מערכי נתונים הכרחי.
10. Shift תמונה השקופה העליונה בX וה- Y הכיוון עד חפיפה מדויקת מושגת, מה שהופך את ההערה של מספר פיקסליםהתמונה חייבת להיות מוזז לכל כיוון. בסיס הנתונים כולו המתאימים לתמונה העליונה (או _{מ 'V} או Ca SR ^{2 +)} חייבים אז להיות מוזז במספר שנקבע של פיקסלים לכל כיוון כדי להבטיח תיאום מדויק בין _מ' V וCa ^{2 +} מערכי נתונים SR.

Representative Results

איור 1 א מציג תרשים סכמטי של התצורה האופטית _למטר V כפול ומיפוי Ca ^{2 +} SR. עם ההגדרה הזאת, יש הפרדה מוחלטת של רוח רפאים _{מ 'V} וCa ^{2 +} אותות SR (איור 1). תרשים של מערכת זלוף הכפולה לולאה משמשת לטעינת צבע Fluo-5N מודגם באיור 1 ג. 1D איור מראה את הכיוון האופקי של הלב בצלחת זלוף. _{מ 'V} נציג וCa ^{2 +} עקבות אופטיות SR במהלך צעדה רציפה ממקומות שונים על פני השטח epicardial של הלב מוצגים באיור 2 א. השדה האופטי של נוף עם התקנה זו הוא 31 מ"מ x 31 מ"מ וכיוון של הלב בתוך שדה הראייה מוצג באיור 2. מפות הפעלה גם מוצגות באיור 2 ובנויות על ידי בחירת זמן ההפעלה של כל פיקסל ועמ 'lotting ערך זה על מפת isochronal (שים לב לעיכוב האופייני ~ 8 - 10 אלפיות שניים בין _{מ 'V} ומפות הפעלת SR Ca ^{2 +).} חשוב לציין, פוטנציאל פעולת מפתח (AP) מאפיינים כגון זמן עליית AP (מ -10% ל -90% ממשרעת [Trise]), ומשך AP בrepolarization 80% (APD _80), אינם שונים מבחינה סטטיסטית בין הלבבות עמוסים RH237 וFluo-5N בהשוואה לאלו עמוסים RH237 וRhod-2 (Trise: 14.9 msec ± 1.9 msec לעומת 14.2 msec ± 1.2 msec וAPD _80: 155.3 אלפיות השני ± 5.8 156.9 אלפיות השני ± 5.7 msec msec לעומת לFluo-5N ו Rhod-2, בהתאמה, p> 0.05 לשניהם;. N = 8 / קבוצה), המצביע על השפעה מינימאלית של Fluo-5N או לצבוע טעינה בAP איור 2C מדגים את היכולת להתבונן ולכמת שינויים יחסי בCa SR ^{2 +} הדיאסטולי עומס ושחרור Ca SR סיסטולי ^{2 +} אמפליטודות באורכי מחזור צעדה שונים. ניתן qu רק שינויים יחסי בפרמטרים אלהantified, כיול מוחלט _(SR [Ca ^{2 +])} של האות בלב שלם הוא לא אפשרי.

גישה זו שימושית במיוחד לאפיון וכימות טיפול Ca ^{2 +} SR פתולוגי, כפי שמוצגים באיור 3. בעקבות יישום של isoproterenol β-adrenergic אגוניסט קולטן (100 ננומטר), Ca ^{2 +} הדליפה הדיאסטולי ברורה מSR הוא ציין ( חיצים אדומים, איור 3 א). אם הדליפה היא גדולה מספיק, Ca ^{2 +} תיווך פעילות מאולצת עלולה להתרחש (איור 3).

הגדרת מערכת באיור 1. לDual מיפוי של _מטר V וCa SR ^{2 +.} () תרשים של ההתקנה האופטית, כולל מסננים הכרחיים ומראה dichroic להפרדת רפאים נכון. (ההדמיה B) של לב עמוס או Fluo-5N בלבד (i) או RH237 בלבד (ii) מצביעה על הפרדה מוחלטת של רוח רפאים של _מטר V וCa ^{2 +} אותות ניאון SR. Ex: עירור, Em:. פליטה (ג) תרשים של מערכת זלוף הכפולה לולאה לזלוף הנורמלי וטעינת צבע Fluo-5N (ד) תמונה של אלקטרודות לב וא.ק.ג. cannulated בצלחת זלוף.. לוחות A ו- B לשכפל באישור מet al וואנג. ^15. לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. _{מ 'V} וCa SR ^{2 +} עקבות אופטיות במהלך צעדה רציפה וללא רציפה. _מ' V נציג (א) ואופטיקה Ca ^{2 +} SRl עוקב במהלך צעדה רציפה באורך מחזור של 300 אלפיות שניים. אותות מוצגים במיקומים הבודדים מצויינים ב( B). שים לב לעיכוב של ~ 8 - 10 אלפיות שניים בין _{מ 'V} וזמני הפעלת SR Ca ^{2 +} כאופייני לצימוד עירור-התכווצות נורמלית. (ב) תמונה של לב בתחום מיפוי מבט (ראש החץ לבן מציינת צעדה אלקטרודות) ומפות הפעלה של _מטר V וCa SR ^{2 +.} (ג) Ca ^{2 +} עקבות אופטיות SR מדגימות שינויים בCa ^{2 +} עומס SR הדיאסטולי ואת המשרעת של שחרור Ca ^{2 +} SR בעקבות שינויים פתאומיים בצעדת שיעור. כל העקבות להתחיל עם צעדה בCL = 300 אלפיות שניים. צעדה שיעור לאחר מכן שינה פתאום לCL = 500 אלפיות שני (i), CL = 400 אלפיות שני (II), או CL = 250 אלפיות שני (iii). כאשר CLS כבר הם יזמו (i - ii), שחרור גדול SR Ca ^{2 +} מתרחשת ראשונה (בשל המרווח הדיאסטולי יותר והתאוששות של RyRs) וCa SR הדיאסטולי2 + עומס מעט יורד למצב יציב חדש (קו מקווקו אופקי). כאשר CL קצר הוא יזם, לעומת זאת, משרעת קטן SR Ca ^{2 +} שחרור מתרחש (עקב התאוששות מרווח והשלם הדיאסטולי הקצר של RyRs) ועליית עומס הדיאסטולי SR Ca ^{2 +} ל( קו מקווקו אופקי) מצב יציב חדש . התחלפות של משרעת שחרור SR Ca ^{2 +} מתרחשת גם בCL = 250 אלפיות שני. S: משרעת שחרור קטן, L: משרעת שחרור גדול. (CL: אורך מחזור) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. Ca ^{2 +} SR הדיאסטולי דליפה ופעילות שהופעלה לאחר. () א.ק.ג., _{מ 'V,} וCa SR ^{2 +} העקבות בתחילת מחקר (משמאל) והבאטיפול עם 100 isoproterenol ננומטר (ISO, מימין). עם ISO, דליפת ^{2 +} Ca SR הדיאסטולי המשמעותי הוא ציין (חצים אדומים). אמפליטודות אות Ca ^{2 +} SR כבר מנורמל לפני ואחרי Iso. צומת סין-פרוזדורים הייתה ablated כדי לאפשר לצעדת CL = 300 אלפיות שניים בשני המקרים. (ב) אם דליפת Ca ^{2 +} SR היא גדולה מספיק, זה עשוי לעורר פעילות מוקד (מתחמי חדרית מוקדמים, PVCs). בדוגמא זו, PVCs הם קוטעים את קצב סינוס הרגיל. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

המפתחות לטעינת צבע Fluo-5N המוצלחת הם התקנת זלוף הסירקולציה המחודשת הקטן-נפח, המאפשרת לריכוז Fluo-5N גבוה ללא הצורך בכמויות גדולות של צבע, את משך זמן טעינה (1 שעה), ומבצעים את הטעינה ב RT. אם הטעינה מתבצעת בטמפרטורות פיסיולוגיות, פעילות האנזימטית סלולרית במהירות דבק תג -AM כאשר הצבע חוצה את קרום התא, לכידת מולקולות הצבע בcytosol ולא מאפשר להם לחצות את קרום SR. ב RT, לעומת זאת, פעילות האנזימטית מואטת וכמות מספקת של צבע יכול לחצות שני קרום התא וקרום SR לפני תג -AM הוא ביקע, ההשמנה הצבע בSR.

אפילו בתנאים אופטימליים טעינה, לעומת זאת, אמפליטודות אות וקרינת שינויי השבר (ΔF / F) עם גישה זו תהיה נמוכות יותר מאשר עם מיפוי מסורתי אופטי של _מטר V וCa ^{2 +} תאיים עם צבעים גבוהה זיקה. לדוגמא, עם ההתקנה האופטית המשמשת כאן שמורכבת מאור LED העירור, מטרות מקרוסקופית, מסננים גדולים ומראה dichroic (5 סנטימטרים X 5 סנטימטרים), ומצלמות CMOS, שינויי הקרינה השבר (ΔF / F) נמצא על סדר 1 - 2% לאות Fluo-5N ו -2 - 3% לאות RH237 ^15. הקרינה השבר תהיה, כמובן, תלויה בתצורה הספציפית האופטית, מקור אור, ומצלמות של התקנה מסוימת, אך גם בתנאים אופטימליים אות Fluo-5N היא נמוכה באופן משמעותי ממה שנצפה בדרך כלל להקלטות של Ca ^{2 +} תאיים עם צבעים גבוהה זיקה. לדוגמא, באותו ההתקנה, ΔF / F הוא בסדר הגודל של 20 - 30% עבור Rhod-2 כאשר אור ירוק (545 ​​ננומטר) העירור משמש ^18. אור העירור הירוק הוא גם קרוב יותר לשיא העירור של RH237, כך ΔF / F של RH237 הוא גם גדול יותר במקרה זה, סביב 4 - 5%. לפיכך, למעבדות אלה שכבר מבצעים מיפוי אופטי כפול של _מטר V 2 +, יש לנקוט זהירות כדי לייעל את כל הרכיבים של ההתקנה האופטית כדי להבטיח ΔF המקסימאלי / F לאות Fluo-5N.

עם גישה זו, חוקרים יכולים דווקא לחקור Ca ^{2 +} דינמיקת SR והשפעתו על _{מ 'V} בדרכים שאינן אפשריים עם גישות קיימות. לדוגמא, מדידות כמותיות של דליפת Ca ^{2 +} SR (כמו באיור 3 א) וקבועת הזמן המדויק של התאוששות SR Ca ^{2 +} (מדד -a טאו של ^{2 +} -ATPase [SERCA] פעילות Ca SR) יכולים להתבצע. שימוש בגישות קיימות למיפוי אופטי של Ca ^{2 +} תאיים עם צבעים גבוהה זיקה, מדידות אלה עשויים להיות "מזוהמות" עם הטרנסממברני שטף Ca ^{2 +} (כלומר., תרומות מסוג L-Ca ^{2 +} ערוצים וNa ⁺ -Ca ^{2 +} מחליף). יתר על כן, יש לי גבוהה זיקת אינדיקטורים Ca ^{2 +} k מטבע איטיinetics מאשר מדדים נמוך זיקה ^5, ובכך אותות Fluo-5N צפויים לדווח על Ca ^{2 +} תנועות SR מדויקות עם איכות גבוהה ובעצם אין השהיית זמן בין שינויי Ca ^{2 +} בפועל ושינויים מקביל בקרינה.

היכולת לחקור את המנגנונים מפורטים שבו שחרור SR Ca ^{2 +} וספיגה חוזרת לתרום לתופעות arrhythmogenic היא יתרון נוסף של גישה זו. לדוגמא, השימוש במתודולוגיה זו, שדיווחנו לאחרונה איך refractoriness של שחרור SR Ca ^{2 +} תורם להופעה של Ca ^{2 +} alternans וכי במהלך פרפור חדרים, Ca SR ^{2 +} השחרור נשאר כמעט ברציפות עקשן ^15. זה היה הדו"ח הראשון של ^{2 +} דינמיקת Ca SR במהלך פרפור ומדגיש את היתרון העיקרי של ההדמיה Ca ^{2 +} SR בלב שלם: תופעות מרחבית שונות ומורכבות כגון alternans וF מרחבית הצורמים ibrillation ניתן ללמוד. למרבה הצער, זה סוג של מידע לא יכול להיות שלוקט מהתאים מבודדים, שבו פרפור אינו אפשרי, או משיטות שלהקליט רק ממקום אחד, בלב שלם ^12.

יתר על כן, מיפוי אופטי בו זמנית של _מטר V וCa SR ^{2 +} החופשי בלב שלם יכול לספק כלי חדש להערכת Ca ^{2 +} חריג טיפול במצבים פתולוגיים, כוללים אי ספיקת לב. הליקויים בויסות Ca ^{2 +} SR, כולל הפעלה והפסקה של Ca ^{2 +} שחרור SR, דליפת Ca SR ^{2 +} דיאסטולי, וספיגה ^{2 +} Ca SR - כל השלבים העיקריים בCa ^{2 +} רכיבה על אופניים וכל פוטנציאל לשינוי באי ספיקת לב - ניתן ללמוד באופן ישיר. בנוסף, שיטה זו יכולה גם להיות כלי שימושי להערכת ההשפעות של התערבויות טיפוליות חדשניות, כגון ייצוב ¹⁹ וSERCA אפנון RyR ^20.

ss = "jove_content"> גישה זו היא לא בלי מגבלות, לעומת זאת, כולל ΔF הנמוך / F כפי שפורט לעיל וחוסר היכולת לכייל בדיוק ערכי הקרינה לגבות ריכוזי _SR [Ca ^{2 +].} למרבה הצער, השתנות בטעינת צבע, עירור לא אחיד ופליטת אור בשל המשטח המעוגל של לב, וצילום הלבנת ודליפת צבע מSR בכל מהלך הניסוי לעשות את זה קשה מאוד לכייל אותות Fluo-5N ל מדויק _SR [Ca ^{2 +]} בלב שלם. מחקרים קודמים במבחנה בפתרונות חיץ פיסיולוגיים וmyocytes permeabilized מבודד דיווחו כיולים כזה והראו כי שינויים בקרינת Fluo-5N הם פרופורציונליים לשינויים ב[ Ca ^{2 +]} _SR והקרינה לא צפויה כדי להרוות בפיסיולוגי [Ca ^{2 +]} רמות _SR ^11. לפיכך, חוקרים צריכים לבחור את השיטה של מא Ca ^{2 +}pping (צבע נמוך או גבוהה זיקה) המבוסס על מטרותיהם הספציפיות הניסיוניות וחקירות פיסיולוגיות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NaCl	Fisher Scientific	S271-1	Component of Tyrode's solution
CaCl2 (2H2O)	Fisher Scientific	C79-500	Component of Tyrode's solution
KCl	Fisher Scientific	S217-500	Component of Tyrode's solution
MgCl2 (6H2O)	Fisher Scientific	M33-500	Component of Tyrode's solution
NaH2PO4 (H2O)	Fisher Scientific	S369-500	Component of Tyrode's solution
NaHCO3	Fisher Scientific	S233-3	Component of Tyrode's solution
D-Glucose	Fisher Scientific	D16-1	Component of Tyrode's solution
95% O2 5% CO2	AirGas	carbogen	For oxygenation and pH of Tyrode's solution
Blebbistatin	Tocris Bioscience	1760	Excitation-contraction uncoupler
RH237	Biotium	61018	Voltage-sensitive dye
Fluo-5N AM	Invitrogen	F-26915	Low-affinity Ca2+ indicator; Alternative: Invitrogen F-14204; Loading must be performed at room temperature
Pluronic F127	Biotium	59004	For Ca2+ indicator loading; Warm until the solution is clear before use
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650	For dissolving blebbistatin and dyes
Filter	EMD Millipore	NY1104700	11 μm in-line filter
Pressure Transducer	WPI	BLPR2	For measuring perfusion pressure
Transbridge Transducer Amplifier	WPI	SYS-TBM4M	For transducing/amplifing pressure signal; PowerLab may also be used with appropriate BioAmp
PowerLab 26T	ADInstruments		For continuous recording of pressure and ECG signals
THT Macroscope	SciMedia		Macroscopic optical setup. Details: 0.63X objective (NA = 0.31), 2X condensing objective, resultant field of view = 3.1 cm x 3.1 cm, depth of focus = ~ 1.5 mm
MiCam Ultima-L CMOS	SciMedia		Optical mapping cameras
Precision LED Spot Light	Mightex	PLS-0470-030-15-S	LED light source