Summary
この記事では、ランゲンドルフ灌流ウサギの心臓における詳細なプロトコルおよび膜貫通電位 （Vm）のデュアル光学マッピングとフリーイントラ筋小胞体（SR）のために必要な機器のCa 2+を説明しています。この方法は、無傷の中心部にあるV mとSRのCa 2+動態の直接観察と定量化を可能にします。
Protocol
動物に関わるすべての手続きは、カリフォルニア大学デービス校の動物実験委員会によって承認され、国立衛生研究所によって公開実験動物の管理と使用に関する指針に付着させました。
1.準備
- 4℃に予め、店舗で修正されたタイロード液の2集中（25X）の株式を準備します（1）株式のI（MM中：NaClの3205、CaCl 2を32.5、塩化カリウム117.5、のNaH 2 PO 4 29.75、のMgCl 2 26.25）と（2）株式II（MM中：のNaHCO 3 500）。
- NaClの128.2、 塩化カルシウム1.3、塩化カリウム4.7、MgCl 2を1.05、のNaH 2 PO 4 1.19、NaHCO 3で20、脱イオン（DI）の1840ミリリットルを組み合わせることにより、11.1グルコース：たて（MM）で、以下の組成の2 Lのタイロード溶液を調製水、80ミリリットル証券私、証券IIの80ミリリットル、およびグルコースの4グラム。直接株式私と証券IIを混在させないでください。加えます沈殿を回避するために1840ミリリットルのDIにメートル。
- 事前に無水ジメチルスルホキシド（DMSO）中に10mg / mlで興奮収縮脱共役剤のブレビスタチンの原液を調製し、4℃で保存溶液を保存します。
- 蛍光色素のストック溶液を準備します（1）電位感受性色素RH237（DMSO中1mg / ml）及び（2）低親和性のカルシウム指示薬フルオ-5N AM、製造業者の推奨に従って（DMSO中に2mg / ml）を。積載量のその後の損失と分解を避けるために、すぐに準備を使用してください。
- プライム酸素（95％O 2、5％CO 2）タイロード溶液で再循環ランゲンドルフ灌流システム。 7.4±0.05でタイロード液のpHを維持するために、O 2 / CO 2の流れを調整します。継続的に灌流液をフィルタリングする：イン・ラインナイロン織りネットフィルター（11μmの孔サイズ）を使用します。
- その後のLOADIとして内閣総理RTで灌流システム、Fluo-5N AMのNGを室温で行われます。フルオ-5N AMローディングのために、再循環灌流液の少量（〜150ミリリットル）を使用します。色素負荷後、灌流液の大量使用（1 - 2 Lを、 図1Cを参照）。
- データ収集システムの電源をオンにし、ECGおよび灌流圧を連続的に監視するための準備。圧力監視システムを準備します。灌流ラインに圧力変換器を接続し、transbridgeアンプで灌流圧を監視します。心臓が灌流システムに接続されていないとき0 mmHgのベースライン潅流圧を調整します。
- V mとSRのCa 2+シグナルとの間の空間的な位置合わせを確実にするために、光学マッピングカメラの位置を合わせます。
- まず、灌流皿にルーラーやテキストを使用してオブジェクトを配置することによって、カメラの焦点を合わせます。ライブビューモードにマッピングカメラを回して、テキストはくっきりと鮮明になるまでフォーカスを調整します。各カメラから単一のフレーム画像を取得します。
- オーバーレイこれらの画像との両方の画像が表示されるように、トップ画像の透明度を調整します。画像内のテキストが正確にオーバーラップする必要があります。完全に整列していない場合、2つの画像が位置合わせされるまで、ダイクロイックミラーまたは各カメラの位置の角度を調整します。
2.ウサギの心の収穫、灌流、および色素ローディング
- 承認されたウサギの制止にウサギを固定します。深くペントバルビタールナトリウム（50mg / kg）およびヘパリン（千IU）の静脈内注射（辺縁耳静脈）を介して麻酔。
- ウサギは、侵害受容反射の欠如を表示する場合は、胸骨と肋骨を露出するために正中線皮膚切開を行います。胸骨柄の剣状突起から鈍い先端の外科ハサミで胸骨を切断。胸骨を開いている間に心を傷つけないように注意してください。心臓を露出するためのリブを広げます。
- すぐに急速にすべての血管および結合組織を切断することにより、全体の心肺ブロックを切り出します。 Immediately氷冷タイロード溶液中に心肺ブロックを配置します。
- 逆行性灌流のための大動脈の位置を確認します。大動脈弓の3支店のすぐ近位上行大動脈をカットします。灌流システムに接続された8 Gカニューレに大動脈にカニューレを挿入。カニューレ上に大動脈を確保するために、USP 0絹縫合糸の一部を使用します。
- 慎重に心臓から気管、肺、および心外膜脂肪を分析。鋭いピンセットと解剖ハサミで、僧帽弁を見つけて、慎重に左心室内の溶液の混雑を防ぐために、1リーフレットを損傷したり、削除します。
- イメージングのために上向きに心臓の前面と水平にガラスジャケット付き灌流チャンバーに心を沈めます。マッピング（ 図1D）の間、心臓の動きを防止するために皿のシリコン底部にU字型ピンとシルガードの片にカニューレを固定します。必要に応じて、STAのための心の頂点に小さな虫ピンを挿入bilization。
- ポジション心電図（ECG）は、心臓の右側と左側にバス内の電極。完全に浴に電極を浸し、彼らがリード私の構成に類似したボリューム行わ心電図を提供するために、心臓の表面に接触していないことを確認します。通常のリードI ECG形態を確認してください。 70 mmHgの - 大動脈圧は60に維持されることを確実にするために - （35ミリリットル/分25）の流れを調整します。
- 部屋の照明をオフにして、0.3を追加 - （ - 20μMの最終濃度10）灌流液にブレビスタチン原液（ステップ1.2）の0.6ミリリットルを。
- ブレビスタチンの光不活性化を回避するために、部屋の照明をオフにします。必要に応じて、小さなスポットライトやヘッドランプは、作業照明を提供するために使用することができます。
注意：ブレビスタチンは、ミオシンATPアーゼ阻害剤および興奮収縮脱共役剤です。フルオ-5Nの荷重が延長（60分）、RT（低体温）条件（ステップ2.8を参照してください。 - 2.10）を必要とするので、心臓のエネルギー生産が損なわれることがあります。目ereforeは、ロードを染める前に灌流液へのブレビスタチンの添加は、エネルギー需要16を削減し、その後の光学記録17の間にモーションアーチファクトを除去することができます。
- ブレビスタチンの光不活性化を回避するために、部屋の照明をオフにします。必要に応じて、小さなスポットライトやヘッドランプは、作業照明を提供するために使用することができます。
- 心臓の収縮が停止した場合（10 - 大動脈圧の記録に検証15分）、小容量循環灌流システム（ステップ1.4.1を参照）に切り替えます。
- 準備したFluo-5N AMのローディング溶液をロード：0.25ミリリットル暖かい20％プルロニックF127にフルオ-5N AM原液（ステップ1.3）の0.25ミリリットルを追加します。 0.5mlの混合物に暖かいタイロード液を加えよく混ぜ、および小容量循環灌流システムに追加します。
- 連続灌流圧と心電図をモニターし、必要に応じて流れを調整します。色素負荷は、室温で約1時間かかります。ロードが開始された45分後、37℃に灌流システムおよび灌流液を暖め始めるために循環水浴をオンにします。
- フルオ-5N AM搭載の60分後、SWI大容量循環灌流システムに灌流をTCH（ステップ1.4を参照）。
- 温かいタイロード液1mlに電位感受性色素RH237ストック溶液（ステップ1.3）、50μlの希釈し、カニューレに注入口の近位に（〜5分かけて）ゆっくりと加えます。
3.光学マッピング
- 色素負荷の最後の瞬間の間に、心を合わせて、実験用のビューの適切なフィールドを確保するために、光学マッピングカメラの焦点を合わせます。
- 必要に応じて、ペーシングのために心臓の心外膜表面に双極ペーシング電極を配置します。
- 灌流液の循環に存在することができる液面にモーションアーチファクトを低減するために灌流チャンバーの表面のプラスチックまたはガラスカバースリップを置きます。
注意：カバースリップに代わるものとして、クリーンなプラスチック製の50ミリメートルのペトリ皿のカバーを使用しています。 - 均一Eで心臓の表面を照明する光ガイドをフォーカスxcitation光。 495 nmのバンドパスフィルタ（ 図1A） -青色発光ダイオード（LED）光源を使用し、さらに475の光をフィルタリングします。
- マクロスコープ及び二つの相補型金属酸化膜半導体（CMOS）光学的マッピングカメラで放出された蛍光を集めます。 545 nmのダイクロイックミラーで放出された光を分割します。
- ロングパスは700 nmで、V mの信号を含む、より長い波長成分をフィルタ。 534ナノメートル（ 図1A） -バンドパス502から、SR の Ca 2+シグナルを含む、短波長成分をフィルタリングします。 1 kHzの - 0.5に光データ収集の頻度を設定します。
- 各光記録のために、第1の所望のペーシングプロトコルを開始し、励起光をオンにし、1収集 - データの4秒。必要に応じて、ペーシングプロトコルとデータ収集を同期させます。
注：これは、再ロードのFluo-5N AMすることは不可能であるので、信号対雑音比（SNR）がdecreaますSE、SRからの漏れを染料による実験を通して。高いSNR値を確保するために、2時間 - 1に実験プロトコルを制限します。 - 実験の後、DI水で再びDI水、70％の試薬アルコールの順序で灌流システムを洗浄し、。
- 製造業者のプロトコルに従って、市販のソフトウェアパッケージを使用した空間ガウスフィルタ（半径3ピクセル）と各データセットをフィルタリングします。
- 必要に応じて、空間V mとSR の Ca 2+のデータセットを整列させます。ステップ1.6のように、各カメラからの画像をオーバーレイし、検証し、そのビュー（ すなわち、カニューレ、ペーシング電極）の分野における心臓の解剖学的構造（すなわち、冠血管系、心房のエッジまたは心室）、またはその他の項目を正確に重複。そうでない場合、データセットの空間的な位置合わせが必要です。
- 正確なオーバーラップが達成されるまで、画素数のノートを作り、x軸とy方向に上部の透明画像をシフト画像は、それぞれの方向にシフトしなければなりません。トップ画像（V mまたはSRのCa 2+のいずれか）に対応するデータセット全体は、その後、V mとSRのCa 2+データセット間の正確な位置合わせを保証するために、各方向の画素の決定された数だけシフトする必要があります。
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Representative Results
図1Aは、二重のV mおよびSR の Ca 2+マッピングの光学的構成の概略図を示します。この設定では、V mの完全なスペクトル分離とSRのCa 2+シグナル （ 図1B）があります 。フルオ-5N染料ロードに使用デュアルループ灌流システムの図を図1Cに示されている。 図1Dは 、灌流皿の中の心の水平方向を示しています。代表V mとSR の Ca 2+心臓の心外膜表面上の異なる位置から連続ペーシング時の光跡は、 図2Aに示されています。このセットアップでのビューの光学視野は、x 31 mmの31ミリメートルであり、視野内の中心部の向きは、図2Bに示されています。活性化マップは、 図2Bに示されており、各画素とpの起動時間を選択することによって構成されています等時マップ上では、この値をブロッティング（ - V mとSRのCa 2+活性化マップ間の10ミリ秒〜8の典型的な遅延に注意してください）。重要なことは、そのようなAPの立ち上がり時間などの重要な活動電位（AP）のプロパティは、80％再分極（APD 80）で、とAP時間（振幅[TRISE]の10％から90％まで）、RH237を搭載した心の間に統計的な差はありません14.9ミリ秒±1.9ミリ秒対14.2ミリ秒±1.2ミリ秒とAPD 80：とのFluo-5Nは、RH237とRhod-2を搭載したもの（TRISEに比べ155.3ミリ秒±5.8ミリ秒対のFluo-5Nのための156.9ミリ秒±5.7ミリ秒とRhod-2、それぞれ; P>両方のための0.05; N = 8 /群）、AP上のFluo-5Nまたは色素負荷の最小の効果を示す図2Cは、拡張期のSRのCaの相対的変化を観察し、定量する能力を実証2+様々なペーシングサイクル長での荷重と収縮期のSRのCa 2+放出の振幅。これらのパラメータでのみ相対的変化クすることができます無傷の心臓における信号の絶対キャリブレーション（の[Ca 2+] SRは ）不可能であるとして、antified。
図3に示されているように、このアプローチは、病理学的なSR内Ca 2+処理を特徴付けし、定量化するために特に有用である。βアドレナリン受容体作動薬イソプロテレノール（100 nM）を適用後、SRから明らかな拡張期の Ca 2+漏れは（観察され赤い矢印、 図3A）。リークが十分に大きい場合には、Ca 2+がトリガー活性を媒介（ 図3B）が発生する可能性があります。
デュアルV mのマッピングおよびSRのCa 2+。必要なフィルタと適切なスペクトル分離用のダイクロイックミラーなどの光学装置、（A）の図。（図1.システムセットアップB）のいずれかのFluo-5Nを搭載した心のイメージングのみ（i）またはRH237のみ（II）は、V mの完全なスペクトル分離とSRのCa 2+蛍光シグナルを示しています。例：励起、エム：灌流皿でカニューレを挿入し、心臓およびECG電極の放出（C）通常の灌流とのFluo-5N色素ローディングのための二重ループ灌流システムの図（D）画像 。パネルAおよびBは、Wangら15から許可を得て複製。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2. V mとのSRのCa 2+の連続と非連続ペーシング時の光のパターンは、（A）代表 V mとSRのCa 2+ opticalは300ミリ秒のサイクル長での連続ペーシングの間にトレースします。信号は、（B）に示されている個々の場所で示されています。通常の興奮収縮連関に典型的であるように、V mとSRのCa 2+活性化時間の間に10ミリ秒- 〜8の遅延に注意してください。 （B）のビューのマッピングフィールド内の心臓の画像は、V mとSRのCa 2+。（C）拡張期のSRのCa 2+負荷の変化を実証し、SRのCa 2+光学トレースの活性化マップ（白矢印は、電極をペーシング示します）そして、ペーシングレートの急激な変化、次のSRのCa 2+放出の振幅。すべてのトレースは、CL = 300ミリ秒でペーシングを開始します。ペーシングレートは、その後、突然、CL = 500ミリ秒（I）、CL = 400ミリ秒（II）、またはCL = 250ミリ秒（III）に変更されます。長いのCLが開始されると（私は- II）、大きなSRのCa 2+放出は、第一および拡張期のSRのCa（より長い拡張期間隔とRyRsの回復）が発生2+負荷が少し新しい定常状態（水平の破線）に減少。短いCLが開始されると、しかし、小さいSRのCa 2+放出の振幅が（短縮による拡張期間隔とRyRsの不完全リカバリに）発生し、新たな定常状態に拡張期のSRのCa 2+負荷が増加する（水平の破線） 。 SRのCa 2+放出振幅の交替も、CL = 250ミリ秒で起こります。 S：小さなリリース振幅、L：大きなリリース振幅。 （CL：サイクル長）は、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ベースライン（左）と、次の中の図3.拡張期のSRのCa 2+リークとその後撃発活動。（A）心電図、V mを、およびSRのCa 2+のトレース100nMのイソプロテレノール（ISO、右）で処理します。磯では、大幅な拡張期のSRのCa 2+リークが（赤い矢印）が観察されます。 SRのCa 2+信号振幅は、ISO前後の正規化されています。洞房結節は、いずれの場合においても、CL = 300ミリ秒をペーシングを可能にするために切除された。（B）のSRのCa 2+リークが十分に大きい場合、それは焦点活動（心室性期外複合体、PVCを）トリガすることができます。この例では、PVCは正常洞調律を中断している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
成功のFluo-5Nの色素負荷への鍵は、色素の大量を必要とせずに高いのFluo-5N濃度を可能にする小容量循環灌流セットアップ、ロード時間（1時間）の長さ、およびロードを実行していますRTで。ロードが生理的温度、細胞の酵素活性で実行された場合、色素が細胞質ゾルに染料分子を捕捉し、それらは、SR膜を通過することができない、細胞膜を横切るときに迅速-AMタグを切断します。 RTで、しかし、酵素活性を遅くし、-AMタグがSRに色素を捕捉する、切断される前に染料の十分な量は、細胞膜およびSR膜の両方を通過することができます。
であっても、最適な負荷条件で、しかし、このアプローチには、信号振幅および分別蛍光の変化（ΔF/ F）は、高親和性染料とV m及び細胞内Ca 2+の従来の光学的マッピングの場合よりも低くなります。例えば、LED励起光で構成され、ここで使用される光学装置、巨視的な目的、大きなフィルタおよびダイクロイックミラー（×5 cmで5センチ）、及びCMOSカメラで、分数の蛍光の変化（ΔF/ F）は、1のオーダーでありますRH237 信号 15は3％ - -のFluo-5N信号と2の2％。小数の蛍光は、もちろん、特定の光学構成、光源、および特定の設定のカメラに依存することになるが、それでも最適な条件の下でのFluo-5N信号は、典型的には、細胞内Caの記録のために観察されるものよりも著しく低い2+高親和性染料と。 Rhod-2緑（545 nm）で励起光18が使用されるための30％ -例えば、同じ設定で、ΔF/ Fが20程度です。 5％ - 緑色の励起光もRH237の励起ピークに近い、このようにRH237のΔF/ F 4の周囲に、この場合も大きいです。したがって、これらのラボのために既にV mのデュアル光学マッピングを行います細胞内Ca 2+、注意がのFluo-5N信号に対して最大ΔF/ Fを確実にするために、光学セットアップのすべてのコンポーネントを最適化するために取られるべきです。
このアプローチでは、研究者らは、正確に、SRのCa 2+動態および既存の手法では不可能な方法で、V m上の影響を調べることができます。例えば、SR の Ca 2+（ 図3Aのように）漏れおよびSR の Ca 2+回復（SR の Ca 2+ -ATPase [SERCA]アクティビティのタウ-a測定）の正確な時定数の定量的測定を行うことができます。高親和性色素と細胞内Ca 2+の光学マッピングのための既存のアプローチを使用して、これらの測定は、膜貫通のCa 2+フラックス（すなわち、L型Ca 2+チャネルからの拠出およびNa + -Ca 2で'汚染されてもよいです+交換 ）。さらに、高親和性の Ca 2+指標が本質的に遅いKを有しています低親和性の指標5よりineticsは、このようにフルオ5N信号が高い忠実度と蛍光の実際のCa 2+の変化と対応する変化の間に、本 質的に、時間遅延のない正確なSRのCa 2+の動きについて報告することが期待されます。
SRのCa 2+放出と再取り込みが不整脈現象に寄与することで、詳細なメカニズムを調査する能力は、このアプローチのもう1つの利点です。例えば、この方法論を使用して、我々は最近報告方法のSRのCa 2+放出の耐火は、Ca 2+交代の発症に寄与し、心室細動の際に、SRのCa 2+放出は、耐火ほぼ連続して15のままであること。これは細動時のSRのCa 2+動態の最初の報告であり、無傷の心の中のSRのCa 2+イメージングの重要な利点に焦点を当てています。そのような空間的に不一致交代およびfとして空間的に異なると複雑な現象ibrillationを研究することができます。残念ながら、この種の情報は、細動が不可能である、または唯一無傷の心臓 12に単一の場所から録音方法から単離された細胞から収集することはできません。
さらに、無傷の中心部にV mと無料のSRのCa 2+の同時光学マッピングは、異常のCa 2+を評価する心不全を含む病理学的状態に処理するための新たなツールを提供することができます。潜在的に心不全に変更されたCa 2+サイクリング、すべてのすべての主要なステップ- - SRのCa 2+放出 、拡張期のSRのCa 2+漏れ、およびSR の Ca 2+の取り込みの活性化および終了を含むSRのCa 2+調節、異常直接研究することができます。また、この方法論はまた、そのようなのRyRの安定化19およびSERCA変調20としての新規治療的介入の効果を評価するための有用なツールである可能性があります。
2+] SR濃度を正確する蛍光値を校正することができないことを含め、しかし、制限がないわけではありません。残念ながら、実験の過程を通して、SRから心臓、および光退色と色素漏れの曲面への色素負荷、不均一な励起および発光光の変動は、それが非常に困難にフルオ-5N信号を校正することを可能にします無傷の中心部に正確なの[Ca 2+] SR。生理的緩衝溶液中で前のin vitro試験および透過性に分離された筋細胞は、このようなキャリブレーションを報告しているとのFluo-5N蛍光の変化は変化に比例していることが示されたの[Ca 2+] SRと蛍光は生理的に飽和することが期待されていないの[Ca 2 +] SRレベル11。このため、研究者らは、Ca 2+ MAの方法を選択する必要があります彼らの特定の実験の目的や生理的な調査に基づいてpping（低または高親和性染料）。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-1 | Component of Tyrode's solution |
| CaCl2 (2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | Component of Tyrode's solution |
| KCl | Fisher Scientific | S217-500 | Component of Tyrode's solution |
| MgCl2 (6H2O) | Fisher Scientific | M33-500 | Component of Tyrode's solution |
| NaH2PO4 (H2O) | Fisher Scientific | S369-500 | Component of Tyrode's solution |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233-3 | Component of Tyrode's solution |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | Component of Tyrode's solution |
| 95% O2 5% CO2 | AirGas | carbogen | For oxygenation and pH of Tyrode's solution |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience | 1760 | Excitation-contraction uncoupler |
| RH237 | Biotium | 61018 | Voltage-sensitive dye |
| Fluo-5N AM | Invitrogen | F-26915 | Low-affinity Ca2+ indicator; Alternative: Invitrogen F-14204; Loading must be performed at room temperature |
| Pluronic F127 | Biotium | 59004 | For Ca2+ indicator loading; Warm until the solution is clear before use |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | For dissolving blebbistatin and dyes |
| Filter | EMD Millipore | NY1104700 | 11 μm in-line filter |
| Pressure Transducer | WPI | BLPR2 | For measuring perfusion pressure |
| Transbridge Transducer Amplifier | WPI | SYS-TBM4M | For transducing/amplifing pressure signal; PowerLab may also be used with appropriate BioAmp |
| PowerLab 26T | ADInstruments | For continuous recording of pressure and ECG signals | |
| THT Macroscope | SciMedia | Macroscopic optical setup. Details: 0.63X objective (NA = 0.31), 2X condensing objective, resultant field of view = 3.1 cm x 3.1 cm, depth of focus = ~ 1.5 mm | |
| MiCam Ultima-L CMOS | SciMedia | Optical mapping cameras | |
| Precision LED Spot Light | Mightex | PLS-0470-030-15-S | LED light source |
References
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