Summary
Dieser Artikel beschreibt das detaillierte Protokoll und Anlagen für die duale optische Abbildung von Transmembranpotential (V m) und freie inner Retikulum (SR) notwendig Ca 2+ in der Langendorff-perfundierten Kaninchenherzen. Dieses Verfahren ermöglicht die direkte Beobachtung und Quantifizierung von V m und SR Ca 2+ Dynamik im intakten Herzens.
Protocol
Alle Verfahren, die Tiere wurden von der Animal Care und Verwenden Committee der University of California, Davis zugelassen und auf den Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durch die National Institutes of Health veröffentlicht geklebt.
1. Vorbereitung
- Bereiten Sie zwei konzentriert (25x) Aktien von modifizierten Tyrode-Lösung im Voraus und bei 4 ° C: (1) Auf I (in mM: NaCl 3205, CaCl 2 32,5, KCl 117,5, NaH 2 PO 4 29.75, MgCl 2 26.25) und (2) Stock II (in mM: NaHCO 3 500).
- Frisch herzustellen 2 l Tyrode-Lösung der folgenden Zusammensetzung (in mM): NaCl 128,2, CaCl 2 1,3, KCl 4,7, MgCl 2 1.05, NaH 2 PO 4 1,19, NaHCO 3 20 und Glucose 11,1 durch Kombination von 1840 ml entionisiertem (DI) Wasser, 80 ml Lizenz I, 80 ml Lizenz II und 4 g Glucose. Nicht direkt Mischung Stock I und Vektor II; hinzufügenm bis 1.840 ml DI, um die Ausfällung zu vermeiden.
- Bereiten Stammlösung der Erregung und Kontraktion Entkoppler blebbistatin bei 10 mg / ml in wasserfreien Di-Dimethylsulfoxid (DMSO) im Voraus und lagern Sie die Stammlösung bei 4 ° C.
- Stammlösungen von fluoreszierenden Farbstoffen: (1) spannungsempfindlichen Farbstoff RH237 (1 mg / ml in DMSO) und (2) von geringer Affinität Calciumindikator Fluo-5N AM (2 mg / ml in DMSO) gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Mit den Vorbereitungen sofort zur Zersetzung mit anschließendem Verlust von Ladekapazität zu vermeiden.
- Prime das Rezirkulieren Langendorff-Perfusionssystem mit oxygeniertem (95% O 2, 5% CO 2) Tyrodelösung. Einstellen der Strömung von O 2 / CO 2, um den pH-Wert der Tyrodelösung bei 7,4 ± 0,05 zu halten. Verwenden Sie eine in-line Nylon gewebt Nettofilter (Porengröße: 11 & mgr; m), um kontinuierlich filtern das Perfusat.
- Prime das Perfusionssystem bei RT, wie nachfolgende loading Fluo-5N Uhr bei RT durchgeführt. Für Fluo-5N AM Beladung mit einem kleinen Kreislaufvolumen Perfusat (~ 150 ml). Nach der Farbstoffbeladung, verwenden Sie ein größeres Volumen an Perfusat (1 - 2 L, siehe Abbildung 1C).
- Schalten Sie Datenerfassungssystem und die Vorbereitungen für die kontinuierliche Überwachung von EKG und Perfusionsdruck. Bereiten Druck-Überwachungssystem: Verbinden Sie einen Druckwandler, um die Perfusion Linie und der Perfusionsdruck mit einem Transbridge Verstärker zu überwachen. Können die Grundlinien Perfusionsdruck auf 0 mmHg, wenn das Herz nicht in das Perfusionssystem angebracht ist.
- Richten Sie die optische Abbildungskameras, um räumliche Ausrichtung zwischen dem V m und SR Ca 2+ Signale zu gewährleisten.
- Zunächst konzentrieren sich die Kameras, indem Sie ein Lineal oder ein Objekt mit Text in die Perfusion Gericht. Drehen Sie die Mapping-Kameras in eine Live View-Modus, und stellen Sie den Fokus, bis der Text ist scharf und klar. Erwerben Sie einen einzelnen Frame Bild von jeder Kamera.
- OverlayDiese Bilder und die Transparenz anzupassen des oberen Bildes, so dass die beiden Bilder sichtbar sind. Der Text in den Bildern sollte genau überlappen. Wenn nicht perfekt ausgerichtet sind, kann der Winkel des dichroitischen Spiegels oder der Position jeder Kamera einzustellen, bis die beiden Bilder ausgerichtet sind.
2. Ernten, Perfusion und Farbstoffbeladung von Kaninchen-Herz
- Sichern Sie das Kaninchen in einem zugelassenen Rückhalte Kaninchen. Tief anästhesiert über eine intravenöse Injektion (marginale Ohrvene) von Natriumpentobarbital (50 mg / kg) und Heparin (1000 IU).
- Als die Kaninchen Displays fehlt der nozizeptiven Reflexen, stellen Sie eine Mittellinie Hautschnitt, um den Brustbein und Rippen freizulegen. Schnitt durch das Brustbein mit stumpfen Spitze chirurgische Scheren aus dem Schwertfortsatz, um den Hammergriff. Achten Sie darauf, das Herz schädigen beim Öffnen des Brustbeins. Verbreiten Sie die Rippen, um das Herz freizulegen.
- Schnell auszuschneiden das gesamte Herz-Lungen-Block durch schnelles Schneiden aller Gefäße und Bindegewebe. Immediadig legen Sie die Herz-Lungen-Block in Lösung eiskalten Tyrodes.
- Suchen Sie die Aorta für die retrograde Perfusion. Schneiden Sie den aufsteigenden Aorta proximal der drei Zweige des Aortenbogens. Kanülieren die Aorta in eine 8 G Kanüle in das Perfusionssystem verbunden. Verwenden Sie ein Stück USP 0 Seidenfaden, um die Aorta auf die Kanüle zu sichern.
- Sorgfältig sezieren die Luftröhre, Lunge und epikardialen Fett aus dem Herzen. Mit einem scharfen Pinzette und Schere Dissektion, suchen Sie die Mitralklappe und sorgfältig beschädigen oder entfernen Sie eine Broschüre zur Lösung Staus in der linken Herzkammer zu verhindern.
- Tauchen Sie die Herzen in der Glasmantel Perfusionskammer horizontal mit der anterioren Oberfläche des Herzens nach oben für die Bildgebung. Sichern die Kanüle in einem Stück Sylgard mit U-förmigen Stifte auf dem Silizium Boden der Schale, um die Bewegung des Herzens während der Zuordnung (Figur 1D) zu verhindern. Falls gewünscht, legen Sie ein kleines Insekt Stift an der Spitze des Herzens für stasierung.
- Position Elektrokardiogramm (EKG) Elektroden, die in dem Bad an der rechten und linken Seite des Herzens. Vollständig versenken die Elektroden im Bad und sicherzustellen, dass sie nicht in Kontakt mit der Herzoberfläche, um ein Volumen-EKG durchgeführt analog zu einem Lead I Konfiguration bereitzustellen. Stellen Sie sicher, eine normale Ableitung I EKG-Morphologie. Einstellen der Strömung (25 - 35 ml / min), um sicherzustellen, dass der Aortendruck wird bei 60 gehalten - 70 mmHg.
- Schalten Sie die Raumbeleuchtung und fügen Sie 0,3 bis 0,6 ml blebbistatin Stammlösung (Schritt 1.2) zum Perfusat (Endkonzentration 10 - 20 & mgr; M).
- Schalten Sie die Raumbeleuchtung zu Photoinaktivierung blebbistatin vermeiden. Falls erforderlich, kann ein kleines Spotlight oder Stirnlampe verwendet werden, um Arbeitsplatzbeleuchtung bereitzustellen.
Hinweis: blebbistatin ist ein Myosin-ATPase-Inhibitor und eine Erregung und Kontraktion Entkoppler. Weil Fluo-5N Lade erweiterten (60 min) RT (Hypothermie) Bedingungen erfordert (siehe Schritte 2,8-2,10), Herz-Energieproduktion beeinträchtigt sein kann. Therefore, Zugabe von blebbistatin in das Perfusat vor dem Laden Farbstoff kann den Energiebedarf 16 Verringerung und Beseitigung von Bewegungsartefakten bei der nachfolgenden optischen Aufnahmen 17.
- Schalten Sie die Raumbeleuchtung zu Photoinaktivierung blebbistatin vermeiden. Falls erforderlich, kann ein kleines Spotlight oder Stirnlampe verwendet werden, um Arbeitsplatzbeleuchtung bereitzustellen.
- Bei Kontraktion des Herzens aufgehört hat (10 bis 15 min, auf der Aortendruck Aufzeichnung überprüft), um kleinvolumigen rezirkulierenden Perfusion (siehe Schritt 1.4.1) wechseln.
- Bereiten Sie und laden Fluo-5N AM Beladungslösung: In 0,25 ml Fluo-5N AM-Stammlösung (Schritt 1.3) zu 0,25 ml warmem 20% Pluronic F127. 0,5 ml warmem Tyrodelösung zu der Mischung, gut mischen, und fügen Sie der kleinvolumigen Umlauf Perfusionssystem.
- Kontinuierlich Perfusionsdruck und EKG-Überwachung und den Fluss ggf. einstellen. Farbstoffbeladung dauert ca. 1 h bei RT. 45 Minuten nach dem Laden begonnen hat, schalten Sie den zirkulierenden Wasserbad Erwärmung der Perfusionssystem und Perfusat auf 37 ° C zu beginnen.
- Nach 60 min Fluo-5N AM Laden, switch die Perfusion des größeren Volumens Umlauf Perfusionssystem (siehe Schritt 1.4).
- Verdünnte 50 ul spannungsempfindlichen Farbstoff RH237 Stammlösung (Stufe 1.3) in 1 ml warmem Tyrodelösung und langsam (über ~ 5 min) in eine Injektionsöffnung proximal der Kanüle.
3. Optische Mapping
- Während der letzten Momente der Farbstoffbeladung, positionieren Sie den Herzen und konzentrieren sich die optischen Abbildungskameras, um die entsprechende Sichtfeld für das Experiment zu gewährleisten.
- Falls gewünscht, eine bipolare Schrittmacherelektrode an der epikardialen Oberfläche des Herzens zur Stimulierung.
- Legen Sie eine Kunststoff- oder Glasdeckglas auf der Oberfläche der Perfusionskammer, um Bewegungsartefakte auf der Flüssigkeitsoberfläche, die vorhanden sein können, aufgrund von Rückführung des Perfusat zu reduzieren.
Hinweis: Als Alternative zu einem Deckglas mit einem sauberen Plastik 50 mm Petrischale Cover. - Fokus der Lichtleiter gleichmäßig die Oberfläche des Herzens mit e beleuchtenxcitation Licht. Verwenden blauen Leuchtdiode (LED) Lichtquellen und das Licht weiter zu filtern mit einem 475-495 nm Bandpassfilter (Abbildung 1A).
- Sammeln emittiert Fluoreszenz mit einer Makroskops und zwei komplementären Metall-Oxid-Halbleiter (CMOS) optische Abbildungskameras. Teilen Sie das emittierte Licht mit einer dichroitischen Spiegel bei 545 nm.
- Langpaßfilter langwelligeren Gruppierung, enthaltend die V m Signal bei 700 nm. Bandpassfilter die kürzeren Wellenlängen-Einheit, mit dem SR Ca 2+ Signal, 502 bis 534 nm (Abbildung 1A). Stellen Sie die Frequenz des optischen Datenerfassung, um 0,5 bis 1 kHz.
- Für jeden optischen Aufzeichnungs zunächst initiieren die gewünschte Stimulationsprotokoll, schalten Sie das Anregungslicht, und sammeln 1-4 sec von Daten. Falls gewünscht, synchronisieren die Stimulationsprotokolle und Datenerfassung.
Anmerkung: Es ist nicht möglich, wieder laden, Fluo-5N AM, also das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) wird decrease während des Versuchs infolge einer Leckage aus dem SR färben. Begrenzen experimentelle Protokoll auf 1 - 2 h, hohe SNR-Werte zu gewährleisten. - Nach dem Versuch, wäscht den Perfusionssystem in der Sequenz von DI-Wasser, 70% Reagensalkohol und nochmals mit DI-Wasser.
- Filtern jedes Datensatzes mit einer Orts Gaußfilter (Radius 3 Pixel) unter Verwendung von im Handel erhältlichen Software-Paketen gemäß dem Protokoll des Herstellers.
- Falls erforderlich, räumlich ausrichten V m und SR Ca 2+ Datensätze. Wie in Schritt 1.6, Overlay-Bilder von jeder Kamera, und überprüfen Sie, dass die anatomischen Strukturen des Herzens (dh., Koronargefäße, Kanten der Atrien oder Ventrikel) oder andere Gegenstände in das Blickfeld (dh Kanüle, Schrittmacherelektrode) genau, überlappen. Falls nicht, wird räumliche Ausrichtung der Datensätze notwendig.
- Schieben Sie die Top-transparentes Bild in der x- und y-Richtung, bis genaue Überdeckung erreicht wird, unter Nennung der Anzahl der Pixelmuss das Bild in jeder Richtung verschoben werden. Die gesamte Datenmenge entsprechend dem oberen Bild (entweder m oder V SR Ca 2+) ist dann bestimmt durch die Anzahl von Pixeln in jeder Richtung verschoben werden, um eine genaue Ausrichtung zwischen dem V m und SR Ca 2+ Datensätze zu gewährleisten.
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Representative Results
1A zeigt eine schematische Darstellung der optischen Anordnung für Dual V m und SR Ca 2+ Kartierung. Mit diesem Setup, gibt es komplette spektrale Trennung der V m und SR Ca 2+ Signale (Abbildung 1B). Ein Diagramm des Dual-Schleifen Perfusionssystem für Fluo-5N Farbstoffbeladung verwendet wird, in Figur 1C veranschaulicht. Figur 1D zeigt die horizontale Ausrichtung des Herzens in das Perfusionssystem Schale. Vertreter V m und SR Ca 2+ optischen Spuren während der kontinuierlichen Stimulation von verschiedenen Orten auf der epikardialen Oberfläche des Herzens sind in 2A gezeigt. Das optische Sichtfeld bei dieser Konfiguration beträgt 31 mm x 31 mm und die Orientierung des Herzens innerhalb des Sichtfeldes ist in 2B gezeigt. Aktivierungskarten sind ebenfalls in 2B gezeigt ist, und werden durch Auswahl des Aktivierungszeit von jedem Pixel und p konstruiertlotting diesen Wert auf einem isochronen Karte (beachten Sie die typische Verzögerung von ~ 8 - 10 ms zwischen dem V m und SR Ca 2+ Aktivierungskarten). Wichtig ist, dass Tastenaktionspotential (AP) Eigenschaften wie AP Anstiegszeit (von 10% bis 90% der Amplitude [Trise]) und AP Dauer bei 80% Repolarisation (APD 80), statistisch signifikanten Unterschied zwischen Herzen mit RH237 geladen sind nicht und Fluo-5N Vergleich zu denen mit RH237 und Rhod-2 (Trise geladen: 14,9 ms ± 1,9 ms vs. 14,2 ± 1,2 msec msec und APD 80: 155,3 ms ± 5,8 ms vs 156,9 ± 5,7 msec msec für Fluo-5N und Rhod-2; p> 0,05 für beide;. n = 8 / Gruppe), was auf einen minimalen Effekt Fluo-5N oder Farbstoffbeladung auf dem AP 2C zeigt die Fähigkeit, zu beobachten und zu quantifizieren relativen Veränderungen des diastolischen SR Ca 2+ Last und systolischen SR Ca 2+ Freisetzung Amplituden bei verschiedenen Schrittmacherzykluslängen. Nur relative Änderungen dieser Parameter können qu werdenantified als absolute Kalibrierung ([Ca 2+] SR) des Signals in der intakten Herzens ist nicht möglich.
Dieser Ansatz ist besonders nützlich zur Charakterisierung und Quantifizierung von pathologischen SR Ca 2+ Handhabung, wie in Figur 3 gezeigt ist. Nach dem Aufbringen der β-adrenerge Rezeptor-Agonist Isoproterenol (100 nM), klare diastolischen Ca 2+ Leck vom SR beobachtet ( rote Pfeile, 3A). Wenn das Leck groß genug ist, vermittelte Ca 2+ ausgelöste Aktivität auftreten kann (Abbildung 3B).
Abbildung 1. System Setup für Dual-Mapping von V m und SR Ca 2+. (A) Schematische Darstellung des optischen Aufbaus, einschließlich der notwendigen Filter und dichroitische Spiegel für die richtige spektrale Trennung. (B) Bildgebung des Herz entweder mit Fluo-5N nur (i) oder RH237 nur geladen (ii) zeigt eine vollständige spektrale Trennung der V m und SR Ca 2+ Fluoreszenzsignale. Ex: Anregung, Em:. Emissions (C) Schematische Darstellung der Dual-Loop-Perfusionssystem für normale Durchblutung und Fluo-5N Farbstoffbeladung (D) Bild einer Kanüle versehen Herz und EKG-Elektroden in der Perfusion Gericht.. Panels A und B wiedergegeben mit Genehmigung von Wang et al. 15. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. V m und SR Ca 2+ optischen Gebrauchsspuren während Kontinuierliche und Non-Dauerstimulation. (A) Repräsentative V m und SR Ca 2+ optical Spuren während der kontinuierlichen Stimulation bei einer Zykluslänge von 300 ms. Signale von den in (B) angegebenen einzelnen Standorten dargestellt. Beachten Sie die Verzögerung von ~ 8 - 10 ms zwischen dem V m und SR Ca 2+ Aktivierungszeiten wie es typisch ist für den normalen elektromechanischen Kopplung. (B) Bild von ein Herz in der Mapping-Sichtfeld (weiße Pfeilspitze zeigt Stimulationselektroden) und Aktivierung Karten von V m und SR Ca 2+. (C) SR Ca 2+ optischen Gebrauchsspuren zeigen Veränderungen der diastolische SR Ca 2+ Last und die Amplitude des SR Ca 2+ -Freisetzung nach einer abrupten Änderungen der Stimulationsfrequenz. Alle Spuren beginnen mit Stimulation bei CL = 300 ms. Stimulationsfrequenz wird dann schlagartig auf CL = 500 ms (i), CL geändert = 400 ms (ii) oder CL = 250 ms (iii). Wenn längere CLs eingeleitet (I - II), kommt es zu einer größeren SR Ca 2+ -Freisetzung ersten (aufgrund der längeren diastolischen Intervalls und Rückgewinnung von RyRs) und dem diastolischen SR Ca2+ Last etwas verringert zu einem neuen stationären (horizontal gestrichelte Linie). Wenn eine kürzere CL eingeleitet wird, tritt jedoch eine kleinere SR Ca 2+ -Freisetzung Amplitude (aufgrund der kürzeren diastolischen Intervalls und unvollständige Erholung der RyRs) und diastolischen SR Ca 2+ Last zunimmt, um einen neuen Beharrungszustand (horizontale gestrichelte Linie) . Wechsel der SR Ca 2+ Freisetzung Amplitude tritt auch bei CL = 250 msec. S: kleine Release Amplitude, L: große Release Amplitude. (CL: Zykluslänge) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Der diastolische SR Ca 2+ Leak und anschließende Triggered Aktivität. (A) EKG, V m und SR Ca 2+ Spuren während der Baseline (links) und nachBehandlung mit 100 nM Isoproterenol (Iso, rechts). ISO, wird erhebliche diastolische SR Ca 2+ Leck beobachtet (rote Pfeile). SR Ca 2+ Signalamplituden haben vor und nach Iso normiert. Der Sinusknoten wurde abgetragen, um Schrittmacher CL = 300 ms in beiden Fällen zu ermöglichen. (B) Wenn SR Ca 2+ Leck groß genug ist, kann es fokale Aktivität (vorzeitige ventrikuläre Komplexe, PVCs) auslösen. In diesem Beispiel sind PVCs Unterbrechung des normalen Sinusrhythmus. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Die Schlüssel zur erfolgreichen Fluo-5N Farbstoffbeladung sind der kleinvolumige rezirkulierenden Perfusion Einrichtung, die für eine hohe Fluo-5N-Konzentration ermöglicht, ohne die Notwendigkeit für große Mengen an Farbstoff, der Länge der Ladezeit (1 h) und Ausführen des Lade bei RT. Wenn das Laden bei physiologischen Temperaturen, zellulären Enzymaktivität schnell spaltet die -AM-Tag, wenn der Farbstoff kreuzt die Zellmembran, Einfangen der Farbstoffmoleküle in das Cytosol und nicht so dass sie die Membran zu durchqueren SR durchgeführt. Bei RT jedoch enzymatische Aktivität verlangsamt wird, und eine ausreichende Menge an Farbstoff kann sowohl die Zellmembran und SR-Membran vor der -AM tag kreuzen gespalten wird, Abfangen des Farbstoffs in der SR.
Auch bei optimaler Beladungsbedingungen jedoch Signalamplituden und fraktionierte Fluoreszenzänderungen (& Dgr; F / F) mit diesem Ansatz wird niedriger als bei herkömmlichen optischen Abbildung von V m und der intrazellulären Ca 2+ mit hochaffine Farbstoffe. Beispielsweise mit dem optischen Aufbau verwendet hier, dass der LED-Erregungslicht, makroskopische Ziele großen Filtern und dichroitischen Spiegel (5 cm x 5 cm) und CMOS-Kameras, fraktionierte Fluoreszenzänderungen besteht (& Dgr; F / F) in der Größenordnung von 1 - 2% für die Fluo-5N Signal und 2 - 3% für die RH237 Signal 15. Der Bruch Fluoreszenz wird, natürlich, abhängig von der spezifischen optischen Konfiguration, Lichtquelle, und Kameras eines bestimmten Setup, aber selbst unter optimalen Bedingungen die Fluo-5N-Signal ist deutlich geringer als das, was in der Regel für die Aufnahmen der intrazellulären Ca 2+ beobachtet mit hoher Affinität Farbstoffe. Zum Beispiel auf dem gleichen Setup, ist & Dgr; F / F in der Größenordnung von 20 - 30% für Rhod-2, wenn Grün (545 nm) Anregungslicht verwendet wird 18. Die grüne Anregungslicht ist auch näher an der Anregungsbande RH237, wodurch die & Dgr; F / F von RH237 auch größer in diesem Fall etwa 4 - 5%. So kann diese Labors bereits Führen doppelten optischen Abbildung von V m Ca 2+, sollte darauf geachtet werden, dass alle Komponenten der optischen Einrichtung zu optimieren, um eine maximale & Dgr; F zu gewährleisten.
Mit diesem Ansatz können die Ermittler genau sondieren SR Ca 2+ Dynamik und ihrer Auswirkungen auf die V m in einer Weise, die nicht mit bestehenden Ansätzen möglich. Beispielsweise können quantitative Messungen der SR Ca 2+ Leck (wie in 3A) und die präzise Zeitkonstante SR Ca 2+ Recovery (tau -a Maß SR Ca 2+ -ATPase [SERCA] Aktivität) durchgeführt werden. In einem der vorhandenen Ansätze zur optischen Abbildung der intrazellulären Ca 2+ mit hoher Affinität Farbstoffe, können diese Messungen "kontaminiert" werden mit Transmembran-Ca 2+ Fluss (dh., Beiträgen von L-Typ-Ca 2+ -Kanäle und der Na + -Ca 2 + Tauscher). Darüber hinaus haben hochaffinen Ca 2+ Indikatoren von Natur aus langsamer kinetics als niedriger Affinität Indikatoren 5 und damit Fluo-5N-Signale werden voraussichtlich am genaue SR Ca 2+ Bewegungen mit hoher Wiedergabetreue und im wesentlichen ohne Zeitverzögerung zwischen dem tatsächlichen Ca 2+ Änderungen und entsprechende Veränderungen in der Fluoreszenz zu melden.
Die Fähigkeit, die detaillierten Mechanismen, durch die SR Ca 2+ Freisetzung und Wiederaufnahme-tragen zu arrhythmogenen Phänomene untersuchen, ist ein weiterer Vorteil dieses Ansatzes. Beispielsweise unter Verwendung dieser Methode haben wir vor kurzem berichtet, wie Feuerfestigkeit SR Ca 2+ -Freisetzung trägt zum Auftreten von Ca 2+ Alternans und dass während Kammerflimmern, SR Ca 2+ -Freisetzung bleibt nahezu kontinuierlich refraktären 15. Dies war der erste Bericht der SR Ca 2+ Dynamik beim Flimmern und unterstreicht die entscheidende Vorteil der SR Ca 2+ Bildgebung in der intakten Herzen: räumlich getrennten und komplexe Phänomene wie räumlich disharmonisch alternans und fibrillation untersucht werden können. Leider kann diese Art von Informationen nicht aus isolierten Zellen, in denen Flimmern nicht möglich ist, oder von Methoden, die nur von einem einzigen Standort aufzeichnen am intakten Herzens 12 zu entnehmen.
Darüber hinaus kann die gleichzeitige optische Abbildung von V m und freie SR Ca 2+ in der intakten Herzens eine neue Instrument für die Bewertung abnorme Ca 2+ Handhabung bei pathologischen Zuständen, einschließlich Herzversagen. Die Anomalien in SR Ca 2+ Regulierung, einschließlich der Aktivierung und Beendigung der SR Ca 2+ Freisetzung, diastolische SR Ca 2+ auslaufen und SR Ca 2+ Aufnahme - alle wichtigen Schritte in Ca 2+ Radfahren und alle potenziell in Herzinsuffizienz verändert - kann direkt untersucht werden. Darüber hinaus könnte diese Methode auch ein nützliches Werkzeug für die Beurteilung der Auswirkungen neuer therapeutischer Interventionen wie RyR Stabilisierung 19 und SERCA Modulation 20 zu sein.
[Ca 2+] SR Konzentrationen exakt. Leider Variabilität der Farbstoffbeladung, ungleichmäßige Anregungs- und Emissionslicht aufgrund der gekrümmten Oberfläche des Herzens, und der Photobleichung und Farbstoffaustritt aus dem SR im gesamten Verlauf des Experiments machen es äußerst schwierig, Fluo-5N Signale zu kalibrieren Exakte [Ca 2+] SR im intakten Herzens. Vorherige in vitro-Studien in physiologischen Pufferlösungen und permeabilisiert isoliert Myocyten haben solche Kalibrierungen berichtet und angegeben, dass Änderungen in Fluo-5N Fluoreszenz ist proportional zur Änderung sind [Ca 2+] SR und die Fluoreszenz wird nicht erwartet, dass sie bei physiologischem sättigen [Ca 2 +] SR Ebenen 11. Somit sollte Ermittler des Verfahrens von Ca 2+ ma wählenpping (nieder- oder hochaffinen Farbstoff) auf der Basis ihrer spezifischen experimentellen Ziele und physiologischen Untersuchungen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-1 | Component of Tyrode's solution |
| CaCl2 (2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | Component of Tyrode's solution |
| KCl | Fisher Scientific | S217-500 | Component of Tyrode's solution |
| MgCl2 (6H2O) | Fisher Scientific | M33-500 | Component of Tyrode's solution |
| NaH2PO4 (H2O) | Fisher Scientific | S369-500 | Component of Tyrode's solution |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233-3 | Component of Tyrode's solution |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | Component of Tyrode's solution |
| 95% O2 5% CO2 | AirGas | carbogen | For oxygenation and pH of Tyrode's solution |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience | 1760 | Excitation-contraction uncoupler |
| RH237 | Biotium | 61018 | Voltage-sensitive dye |
| Fluo-5N AM | Invitrogen | F-26915 | Low-affinity Ca2+ indicator; Alternative: Invitrogen F-14204; Loading must be performed at room temperature |
| Pluronic F127 | Biotium | 59004 | For Ca2+ indicator loading; Warm until the solution is clear before use |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | For dissolving blebbistatin and dyes |
| Filter | EMD Millipore | NY1104700 | 11 μm in-line filter |
| Pressure Transducer | WPI | BLPR2 | For measuring perfusion pressure |
| Transbridge Transducer Amplifier | WPI | SYS-TBM4M | For transducing/amplifing pressure signal; PowerLab may also be used with appropriate BioAmp |
| PowerLab 26T | ADInstruments | For continuous recording of pressure and ECG signals | |
| THT Macroscope | SciMedia | Macroscopic optical setup. Details: 0.63X objective (NA = 0.31), 2X condensing objective, resultant field of view = 3.1 cm x 3.1 cm, depth of focus = ~ 1.5 mm | |
| MiCam Ultima-L CMOS | SciMedia | Optical mapping cameras | |
| Precision LED Spot Light | Mightex | PLS-0470-030-15-S | LED light source |
References
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