Summary
Questo articolo viene descritto il protocollo dettagliato e le attrezzature necessarie per la mappatura ottica doppio di transmembrana potenziale (V m) e senza reticolo intra-sarcoplasmatico (SR) Ca 2+ nel cuore di coniglio Langendorff-perfusione. Questo metodo consente l'osservazione diretta e la quantificazione delle Vm e SR Ca 2+ dinamica nel cuore intatto.
Protocol
Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono stati approvati dalla cura e l'uso Comitato Animale dell'Università di California, Davis, e aderito alla Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio pubblicato dal National Institutes of Health.
1. Preparazione
- Preparare due (25X) le scorte concentrati di soluzione Tyrode modificato in anticipo e conservare a 4 ° C: (1) Stock I (in mm: NaCl 3205, CaCl 2 32.5, KCl 117,5, NaH 2 PO 4 29.75, MgCl 2 26.25) e (2) Stock II (in mM: NaHCO3 500).
- Appena preparare la soluzione di 2 L Tyrode della seguente composizione (in mM): NaCl 128,2, CaCl 2 1,3, KCl 4,7, MgCl 2 1.05, NaH 2 PO 4 1.19, NaHCO3 20 e glucosio 11,1 combinando 1840 ml di acqua deionizzata (DI) acqua, 80 ml Stock I, 80 ml di Fotografico II, e 4 g di glucosio. Non miscelare direttamente I Stock e della II; aggiungere ilm 1.840 ml DI per evitare la precipitazione.
- Preparare soluzione di riserva della eccitazione-contrazione disaccoppiatore blebbistatin a 10 mg / ml in anidra di-methylsulfoxide (DMSO) in anticipo e conservare la soluzione di riserva a 4 ° C.
- Preparare soluzioni di coloranti fluorescenti: (1) RH237 tensione sensibili dye (1 mg / ml in DMSO) e (2) Indicatore di affinità calcio Fluo-5N AM (2 mg / ml in DMSO) secondo le raccomandazioni del fabbricante. Utilizzare immediatamente i preparativi per evitare la decomposizione, con conseguente perdita di capacità di carico.
- Prime il ricircolo sistema di perfusione Langendorff con ossigenata (95% O 2, 2 5% di CO) soluzione Tyrode. Regolare il flusso di O 2 / CO 2 per mantenere il pH della soluzione di Tyrode a 7,4 ± 0,05. Utilizzare un filtro a rete in filo di nylon tessuto (dimensione dei pori: 11 micron) per filtrare continuamente il perfusato.
- Prime il sistema di perfusione a temperatura ambiente, come la successiva loading di Fluo-5N AM viene eseguita a temperatura ambiente. Per Fluo-5N AM caricamento, utilizzare un piccolo volume di ricircolo perfusato (~ 150 ml). Dopo colorante carico, utilizzare un volume maggiore di perfusato (1 - 2 L, vedere Figura 1C).
- Accendere il sistema di acquisizione dati e di preparare per il monitoraggio continuo di ECG e pressione di perfusione. Preparare il sistema di pressione di monitoraggio: collegare un trasduttore di pressione alla linea di perfusione e monitorare la pressione di perfusione con un amplificatore transbridge. Regolare la pressione di perfusione basale a 0 mmHg quando il cuore non è collegato al sistema di perfusione.
- Allineare le telecamere di mappatura ottica per garantire l'allineamento spaziale tra il V m e SR Ca 2 + segnali.
- In primo luogo, mettere a fuoco le telecamere posizionando un sovrano o di un oggetto con il testo nel piatto perfusione. Girare le telecamere di mapping in una modalità di visualizzazione dal vivo e regolare la messa a fuoco fino a quando il testo è nitido e chiaro. Acquisire un'immagine singolo fotogramma da ogni telecamera.
- Sovrapposizionequeste immagini e regolare la trasparenza dell'immagine superiore in modo che entrambe le immagini sono visibili. Il testo delle immagini dovrebbe sovrapporsi esattamente. Se non perfettamente allineati, regolare l'angolo dello specchio dicroico o la posizione di ciascuna telecamera fino a quando le due immagini vengono allineate.
2. la raccolta, Perfusione, e Dye-caricamento di Rabbit Heart
- Fissare il coniglio in un dispositivo di immobilizzazione di coniglio approvato. Profondamente anestetizzare tramite iniezione endovenosa (vena marginale dell'orecchio) di sodio pentobarbital (50 mg / kg) ed eparina (1000 IU).
- Quando viene visualizzato il coniglio mancanza di riflessi nocicettivi, fare una incisione cutanea mediana per esporre lo sterno e costole. Tagliare lo sterno con blunt punta forbici chirurgiche dal xifoidea al manubrio. Fare attenzione a non danneggiare il cuore durante l'apertura dello sterno. Stendere le costole per esporre il cuore.
- Accise rapidamente l'intero blocco cuore-polmone per rapidamente tagliando tutte le navi e tessuto connettivo. Immediatamente posizionare il blocco cuore-polmone in soluzione Tyrode ghiacciata.
- Individuare l'aorta per perfusione retrograda. Tagliare l'aorta ascendente prossimale solo per i tre rami dell'arco aortico. Incannulare l'aorta di una cannula 8 G connesso al sistema di perfusione. Usare un pezzo di USP sutura di seta 0 per fissare l'aorta sulla cannula.
- Sezionare con cura la trachea, polmoni, e il grasso epicardico dal cuore. Con una pinza taglienti e forbici dissezione, localizzare la valvola mitrale e accuratamente danneggiare o rimuovere un foglio per prevenire la congestione soluzione nel ventricolo sinistro.
- Immergere il cuore nella camera di perfusione di vetro rivestito orizzontalmente con la superficie anteriore del cuore rivolto verso l'alto per l'imaging. Fissare la cannula di un pezzo di Sylgard con perni a forma di U sul fondo del piatto di silicio per impedire il movimento del cuore durante la mappatura (Figura 1D). Se lo si desidera, inserire un piccolo perno insetto all'apice del cuore per STAbilization.
- Posizione elettrocardiogramma (ECG) elettrodi nel bagno sul lato destro e sinistro del cuore. Immergere completamente gli elettrodi nel bagno e assicurarsi che non sono in contatto con la superficie del cuore di fornire un ECG volume analogo condotto ad una configurazione che piombo. Verifica di un lead normale che ECG morfologia. Regolare il flusso (25 - 35 ml / min) per garantire che la pressione aortica è mantenuta a 60 - 70 mmHg.
- Spegnere le luci della stanza e aggiungere ,3-0,6 ml di soluzione madre blebbistatin (passo 1.2) al perfusato (concentrazione finale 10-20 micron).
- Spegnere luci della stanza per evitare photoinactivation di blebbistatin. Se necessario, una piccola riflettore o proiettore possono essere utilizzati per fornire l'illuminazione di operazione.
Nota: blebbistatin è un inibitore ATPasi miosina e un disaccoppiatore eccitazione-contrazione. Perché Fluo-5N di carico richiede estesi (60 min) RT (ipotermia) le condizioni (vedi i punti 2.8 - 2.10), la produzione di energia cardiaco può essere compromessa. Therefore, l'aggiunta di blebbistatin nella prima perfusato per tingere di carico può ridurre la domanda di energia 16 ed eliminare gli artefatti da movimento durante le successive registrazioni ottiche 17.
- Spegnere luci della stanza per evitare photoinactivation di blebbistatin. Se necessario, una piccola riflettore o proiettore possono essere utilizzati per fornire l'illuminazione di operazione.
- Quando la contrazione del cuore ha cessato (10 - 15 min, verificato sulla registrazione pressione aortica), passare al sistema di ricircolo perfusione piccolo volume (vedi punto 1.4.1).
- Preparare e caricare la soluzione di carico Fluo-5N AM: Aggiungere 0,25 ml di Fluo-5N AM soluzione madre (passo 1,3) a 0,25 ml caldo del 20% F127 Pluronic. Aggiungere 0,5 ml di soluzione calda Tyrode al composto, mescolare bene e aggiungere al sistema di ricircolo perfusione piccoli volumi.
- Monitorare continuamente pressione di perfusione e ECG e regolare il flusso, se necessario. Dye caricamento dura circa 1 ora a temperatura ambiente. 45 minuti dopo il caricamento è iniziato, accendere il bagno di acqua circolante per iniziare il riscaldamento del sistema di perfusione e perfusato a 37 ° C.
- Dopo 60 min di Fluo-5N AM caricamento, SWItch la perfusione per il volume del sistema di ricircolo perfusione più grande (vedi punto 1.4).
- Diluire 50 ml di soluzione colorante sensibile RH237 magazzino tensione (passo 1.3) in 1 ml di soluzione calda di Tyrode e aggiungere lentamente (sopra ~ 5 min) a una porta di iniezione prossimale alla cannula.
3. mappatura ottica
- Durante i momenti finali di colorante carico, posizionare il cuore e mettere a fuoco le telecamere di mappatura ottica per garantire campo appropriato della vista per l'esperimento.
- Se lo si desidera, posizionare un elettrodo di stimolazione bipolare sulla superficie epicardica del cuore per la stimolazione.
- Posizionare una custodia di plastica o di vetro sulla superficie della camera di perfusione per ridurre artefatti da movimento sulla superficie del liquido che può essere presente a causa di ricircolo del perfusato.
Nota: In alternativa un vetrino, utilizzare una plastica di copertura pulito 50 millimetri Petri piatto. - Focalizzare le guide di luce per illuminare uniformemente la superficie del cuore con eluce xcitation. Utilizzare diodi emettitori di luce blu (LED) fonti di luce e filtrare ulteriormente la luce con un 475-495 filtro passa-banda nm (Figura 1A).
- Raccogliere fluorescenza emessa con un macroscope e due complementari metallo-ossido-semiconduttore (CMOS) telecamere mappatura ottica. Dividere la luce emessa con uno specchio dicroico a 545 nm.
- -Pass filtro lungo la lunghezza d'onda più lunga porzione, contenente il segnale V m, a 700 nm. Filtro passa-banda della lunghezza d'onda più corta porzione, contenente il segnale SR Ca 2+, da 502 - 534 nm (Figura 1A). Impostare la frequenza di acquisizione dati ottici a 0,5 - 1 kHz.
- Per ogni registrazione ottica, prima di avviare il protocollo di stimolazione desiderata, accendere la luce di eccitazione, e raccogliere 1-4 sec di dati. Se lo si desidera, sincronizzare i protocolli di stimolazione e acquisizione dati.
Nota: Non è possibile ricaricare il Fluo-5N AM, quindi il rapporto segnale-rumore (SNR) si decrease tutto l'esperimento a causa di perdite dal tingere SR. Limitare protocollo sperimentale per 1-2 ore per garantire elevati valori di SNR. - Dopo l'esperimento, lavare il sistema di perfusione nella sequenza di acqua deionizzata, 70% alcool reagente, e di nuovo con acqua deionizzata.
- Filtro ogni insieme di dati con un filtro gaussiano spaziale (raggio 3 pixel) utilizzando i pacchetti software disponibili in commercio secondo il protocollo del produttore.
- Se necessario, spazialmente allineare il V m e SR Ca 2+ insiemi di dati. Come al punto 1.6, sovrapporre le immagini da ogni telecamera e verificare che le strutture anatomiche del cuore (es., Vascolare coronarico, bordi di atri o ventricoli) o altri oggetti nel campo visivo (ad esempio, la cannula, elettrodi di stimolazione) esattamente sovrapposizione. In caso contrario, l'allineamento spaziale delle serie di dati è necessario.
- Spostare l'immagine in alto trasparente si ottiene X e Y-direzione fino sovrapposizione esatta, prendendo nota del numero di pixell'immagine deve essere spostata in ciascuna direzione. L'intero insieme di dati corrispondente all'immagine superiore (o V mo SR Ca 2+) deve quindi essere spostata dal numero determinato di pixel in ogni direzione per assicurare un allineamento preciso tra V m e SR Ca 2+ set di dati.
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Representative Results
La figura 1A mostra un diagramma schematico della configurazione ottica per la doppia V m e SR Ca 2+ mappatura. Con questa configurazione, vi è la completa separazione spettrale del Vm e SR Ca 2 + segnali (Figura 1B). Lo schema del sistema di perfusione a doppio loop usato per Fluo-5N colorante carico è illustrato nella Figura 1C. Figura 1D mostra l'orientamento orizzontale del cuore nel piatto perfusione. Rappresentante V m e SR Ca 2 + tracce ottiche durante stimolazione continua da diversi punti della superficie epicardica del cuore sono mostrati in Figura 2A. Il campo di vista ottico con questa configurazione è di 31 mm x 31 mm e l'orientamento del cuore all'interno del campo di vista è mostrato in figura 2B. Mappe di attivazione sono anche mostrati in figura 2B e sono costruiti selezionando il tempo di attivazione di ciascun pixel e plottizzazione questo valore su una mappa isocrona (notare il ritardo tipico di ~ 8 - 10 msec tra il V m e SR Ca 2 + attivazione mappe). È importante sottolineare che i potenziali azione chiave (AP) proprietà quali AP tempo di salita (dal 10% al 90% dell'ampiezza [Trise]), e la durata AP a 80% ripolarizzazione (APD 80), non sono statisticamente differenti tra i cuori caricate con RH237 e Fluo-5N rispetto a quelli caricati con RH237 e Rhod-2 (Trise: 14,9 ms ± 1,9 ms vs. 14.2 ms ± 1.2 msec e APD 80: 155,3 ms ± 5.8 ms vs. 156,9 ms ± 5.7 msec per Fluo-5N e Rhod-2, rispettivamente; p> 0,05 per entrambi;. n = 8 / gruppo), indicando un effetto minimo di Fluo-5N o tingere il carico sul AP Figura 2C dimostra la capacità di osservare e quantificare variazioni relative diastolica SR Ca 2 + carico e sistolica SR rilascio di Ca 2+ ampiezze in varie lunghezze ciclo di stimolazione. Solo variazioni relative a questi parametri possono essere quantified, calibrazione come assoluto ([Ca 2+] SR) del segnale nel cuore intatto non è possibile.
Questo approccio è particolarmente utile per caratterizzare e quantificare patologica SR Ca 2+ manipolazione, come è illustrato nella figura 3. Dopo l'applicazione del β-adrenergico isoproterenolo agonista del recettore (100 nM), chiaro diastolica Ca 2+ perdita dal SR si osserva ( frecce rosse, figura 3a). Se la perdita è abbastanza grande, Ca 2+, media le attività innescata può verificarsi (Figura 3B).
Figura 1. Installazione del sistema per doppia mappatura di Vm e SR Ca 2 +. (A) Schema della configurazione ottica, inclusi filtri necessari e specchio dicroico per una corretta separazione spettrale. (B) Imaging di cuori caricati sia con Fluo-5N con (i) o RH237 solo (ii) indica la completa separazione spettrale della V m e segnali fluorescenti SR Ca 2+. Es: eccitazione, Em:. Emissione (C) Schema del sistema di perfusione a doppio loop per la perfusione normale e Fluo-5N dye carico (D) immagine di un cuore e di ECG cannulate elettrodi nel piatto perfusione.. Pannelli A e B riprodotte con il permesso di Wang et al., 15. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. V m e SR Ca 2 + Tracce ottico durante la stimolazione continui e non continuo. (A) Rappresentante V m e SR Ca 2 + Optical tracce durante stimolazione continua ad una durata del ciclo di 300 msec. I segnali sono indicati dalle singole posizioni indicate in (B). Notare il ritardo di ~ 8 - 10 msec tra il V m e SR Ca 2 + tempi di attivazione come è tipico per il normale accoppiamento eccitazione-contrazione. (B) L'immagine di un cuore all'interno del campo mappatura di vista (freccia bianca indica stimolazione degli elettrodi) e mappe di attivazione di Vm e SR Ca 2 +. (C) SR Ca 2+ tracce ottiche dimostrano cambiamenti diastolica SR Ca 2+ carico e l'ampiezza del rilascio SR Ca 2 + seguito bruschi cambiamenti di frequenza di stimolazione. Tutte le tracce iniziano con stimolazione a CL = 300 msec. Frequenza di stimolazione viene poi bruscamente cambiato in CL = 500 msec (i), CL = 400 msec (ii), o CL = 250 msec (iii). Quando vengono avviate CL più lunghi (i - ii), una grande SR rilascio di Ca 2+ prima verifica (dato l'intervallo più diastolica e recupero di RyRs) e diastolica SR Ca2+ carico diminuisce leggermente a un nuovo stato stazionario (linea tratteggiata orizzontale). Quando viene avviato un CL più breve, tuttavia, un SR Ca 2+ ampiezza minore rilascio avviene (a causa del breve intervallo diastolica e incompleta recupero RyRs) e diastolica SR Ca 2+ carico aumenta ad un nuovo stato stazionario (linea tratteggiata orizzontale) . Alternanza di SR Ca 2+ ampiezza rilascio si verifica anche in CL = 250 msec. S: ampiezza rilascio piccolo, L: ampiezza rilascio di grandi dimensioni. (CL: lunghezza del ciclo) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. diastolica SR Ca 2+ di perdite e successiva attività Triggered. (A) ECG, V m, e SR Ca 2+ tracce durante basale (a sinistra) e dopoil trattamento con 100 isoproterenolo nM (Iso, a destra). Con Iso, diastolica significativo SR Ca 2 + perdita si osserva (frecce rosse). Ampiezze di segnale SR Ca 2+ sono stati normalizzati prima e dopo Iso. Il nodo seno-atriale è stata ablato per consentire stimolazione CL = 300 msec in entrambi i casi. (B) Se SR Ca 2 + perdita è abbastanza grande, può innescare l'attività focale (complessi ventricolari prematuri, PVC). In questo esempio, PVC sono interrompere il normale ritmo sinusale. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Le chiavi del successo Fluo-5N colorante di caricamento sono configurazione ricircolo perfusione piccolo volume, che consente una elevata concentrazione Fluo-5N, senza la necessità di grandi quantità di colorante, la lunghezza del tempo di caricamento (1 ora), ed eseguire il caricamento a RT. Se il caricamento viene eseguito a temperature fisiologiche, attività enzimatica cellulare rapidamente scinde il tag -AM quando il colorante attraversa la membrana cellulare, intrappolando le molecole di colorante nel citosol e non permettendo loro di attraversare la membrana SR. A RT, tuttavia, l'attività enzimatica viene rallentata e una sufficiente quantità di colorante può attraversare sia la membrana cellulare e la membrana SR prima del tag -AM viene scisso, intrappolando il colorante nella SR.
Anche con le condizioni di carico ottimali, tuttavia, ampiezze di segnale e cambiamenti fluorescenza frazionarie (Af / F) con questo approccio saranno inferiori con la mappatura tradizionale ottica di Vm e intracellulare di Ca 2+ con coloranti ad alta affinità. Ad esempio, con la configurazione ottica usata qui che consiste di luce LED di eccitazione, obiettivi macroscopici, filtri di grandi dimensioni e specchio dicroico (5 cm x 5 cm), e telecamere CMOS, cambiamenti fluorescenza frazionarie (Af / F) sono dell'ordine di 1 - 2% per il segnale Fluo-5N e 2 - 3% per il segnale RH237 15. La fluorescenza frazionata, ovviamente, dipende dalla specifica configurazione ottica, la sorgente luminosa, e telecamere di una configurazione particolare, ma anche in condizioni ottimali segnale Fluo-5N è significativamente inferiore a quello tipicamente osservato per le registrazioni di Ca2 + intracellulare con coloranti ad alta affinità. Ad esempio, nella stessa configurazione, Af / F è dell'ordine di 20 - 30% per Rhod-2 quando verde (545 nm) luce di eccitazione è utilizzato 18. La luce di eccitazione verde è anche più vicino al picco di eccitazione a RH237, così la Af / F di RH237 è anche più grande in questo caso, circa 4 - 5%. Così, per quei laboratori già eseguendo mappatura ottica duale di V m 2+, occorre prestare attenzione per ottimizzare tutti i componenti della configurazione ottica per garantire la massima Af / F per il segnale di Fluo-5N.
Con questo approccio, gli investigatori possono sondare precisamente SR Ca 2+ dinamiche e il suo impatto sulla V m in modi che non sono possibili con approcci esistenti. Ad esempio, le misure quantitative di SR Ca 2 + perdita (come in figura 3A) e la costante di tempo preciso della SR Ca 2 + recupero (misura tau -a della SR Ca 2+ -ATPasi attività [SERCA]) possono essere eseguite. Utilizzando approcci esistenti per la mappatura ottica del Ca2 + intracellulare con coloranti ad alta affinità, queste misure possono essere 'contaminate' con transmembrana Ca 2+ flusso (es., I contributi da L-tipo Ca 2+ canali e Na + -ca 2 + scambiatore). Inoltre, ad alta affinità di Ca 2+ indicatori hanno k intrinsecamente più lentoinetics di indicatori bassa affinità 5, quindi segnali Fluo-5N sono tenuti a riferire su precise SR Ca 2+ movimenti con alta fedeltà ed essenzialmente nessun ritardo tra i cambiamenti effettivi Ca 2+ e variazioni corrispondenti in fluorescenza.
La capacità di studiare i meccanismi dettagliati per cui SR rilascio di Ca 2+ e reuptake contribuiscono a fenomeni aritmogena è un altro vantaggio di questo approccio. Ad esempio, utilizzando questa metodologia, abbiamo recentemente riportato come refrattarietà della SR rilascio di Ca 2+ contribuisce all'insorgenza di Ca 2+ alternanza e che durante fibrillazione ventricolare, SR Ca 2+ rilascio rimane quasi continuamente refrattario 15. Questo era il primo rapporto di SR Ca 2+ dinamiche durante la fibrillazione e mette in evidenza il vantaggio chiave di SR Ca 2 + Imaging nel cuore intatto: fenomeni spazialmente distinti e complessi come alternans spazialmente discordanti e fibrillation possono essere studiate. Purtroppo, questo tipo di informazioni non possono essere raccolte da cellule isolate, dove fibrillazione non è possibile, o da metodi che registrano solo da una singola posizione sul cuore intatto 12.
Inoltre, la mappatura ottica simultanea di Vm e la connessione RS Ca 2+ nel cuore intatto può fornire un nuovo strumento per la valutazione Ca 2+ anormale manipolazione in condizioni patologiche, tra cui l'insufficienza cardiaca. Le anomalie di SR Ca 2+ regolamentazione, inclusa l'attivazione e la cessazione della SR Ca 2+ rilascio, diastolica SR Ca 2 + perdite, e SR Ca 2 + assorbimento - tutti i principali passaggi a Ca 2+ ciclismo e tutti potenzialmente alterata nello scompenso cardiaco - possono essere studiati direttamente. Inoltre, questa metodologia potrebbe anche essere un utile strumento per valutare gli effetti di nuovi interventi terapeutici, come RyR stabilizzazione 19 e SERCA modulazione 20.
2+] concentrazioni SR. Purtroppo, la variabilità nel colorante di caricamento, non uniforme di eccitazione ed emissione di luce a causa della superficie curva del cuore, e fotometabolismo e perdite colorante dal SR tutto il corso dell'esperimento rendono estremamente difficile calibrare segnali Fluo-5N a esatto [Ca 2+] SR nel cuore intatto. Precedenti studi in vitro in soluzioni tampone fisiologiche e miociti permeabilizzate isolati hanno riportato calibrazioni e hanno indicato che i cambiamenti nel Fluo-5N fluorescenza sono proporzionali alle variazioni [Ca 2+] SR e la fluorescenza non è previsto di saturare a fisiologico [Ca 2 +] livelli SR 11. Così, gli investigatori dovrebbero scegliere il metodo di Ca 2+ mapping (a bassa o ad alta affinità di colorante) in base ai loro obiettivi specifici e le indagini sperimentali fisiologici.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-1 | Component of Tyrode's solution |
| CaCl2 (2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | Component of Tyrode's solution |
| KCl | Fisher Scientific | S217-500 | Component of Tyrode's solution |
| MgCl2 (6H2O) | Fisher Scientific | M33-500 | Component of Tyrode's solution |
| NaH2PO4 (H2O) | Fisher Scientific | S369-500 | Component of Tyrode's solution |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233-3 | Component of Tyrode's solution |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | Component of Tyrode's solution |
| 95% O2 5% CO2 | AirGas | carbogen | For oxygenation and pH of Tyrode's solution |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience | 1760 | Excitation-contraction uncoupler |
| RH237 | Biotium | 61018 | Voltage-sensitive dye |
| Fluo-5N AM | Invitrogen | F-26915 | Low-affinity Ca2+ indicator; Alternative: Invitrogen F-14204; Loading must be performed at room temperature |
| Pluronic F127 | Biotium | 59004 | For Ca2+ indicator loading; Warm until the solution is clear before use |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | For dissolving blebbistatin and dyes |
| Filter | EMD Millipore | NY1104700 | 11 μm in-line filter |
| Pressure Transducer | WPI | BLPR2 | For measuring perfusion pressure |
| Transbridge Transducer Amplifier | WPI | SYS-TBM4M | For transducing/amplifing pressure signal; PowerLab may also be used with appropriate BioAmp |
| PowerLab 26T | ADInstruments | For continuous recording of pressure and ECG signals | |
| THT Macroscope | SciMedia | Macroscopic optical setup. Details: 0.63X objective (NA = 0.31), 2X condensing objective, resultant field of view = 3.1 cm x 3.1 cm, depth of focus = ~ 1.5 mm | |
| MiCam Ultima-L CMOS | SciMedia | Optical mapping cameras | |
| Precision LED Spot Light | Mightex | PLS-0470-030-15-S | LED light source |
References
- Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells. tissues. Circulation research. 110, 609-623 (2012).
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circulation research. 95, 21-33 (2004).
- Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. Multiparametric optical mapping of the Langendorff-perfused rabbit heart. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. The Journal of physiology. 529 (Pt 1), 171-188 (2000).
- Kong, W., Fast, V. G. The role of dye affinity in optical measurements of Cai(2+) transients in cardiac muscle. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 307, H73-H79 (2014).
- Bers, D. M. Excitation-Contraction Coupling and Cardiac Contractile Force. , 2nd edn, Kluwer Academic. (2001).
- Bers, D. M., Shannon, T. R. Calcium movements inside the sarcoplasmic reticulum of cardiac myocytes. Journal of molecular and cellular cardiology. , (2013).
- Knollmann, B. C. New roles of calsequestrin and triadin in cardiac muscle. The Journal of physiology. 587, 3081-3087 (2009).
- Chen, H., et al. Mechanism of calsequestrin regulation of single cardiac ryanodine receptor in normal and pathological conditions. The Journal of general physiology. 142, 127-136 (2013).
- Diaz, M. E., O'Neill, S. C., Eisner, D. A. Sarcoplasmic reticulum calcium content fluctuation is the key to cardiac alternans. Circulation research. 94, 650-656 (2004).
- Shannon, T. R., Guo, T., Bers, D. M. Ca2+ scraps: local depletions of free [Ca2+] in cardiac sarcoplasmic reticulum during contractions leave substantial Ca2+ reserve. Circulation research. 93, 40-45 (2003).
- Kornyeyev, D., Reyes, M., Escobar, A. L. Luminal Ca(2+) content regulates intracellular Ca(2+) release in subepicardial myocytes of intact beating mouse hearts: effect of exogenous buffers. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 298, H2138-H2153 (2010).
- Picht, E., DeSantiago, J., Blatter, L. A., Bers, D. M. Cardiac alternans do not rely on diastolic sarcoplasmic reticulum calcium content fluctuations. Circulation research. 99, 740-748 (2006).
- Shkryl, V. M., Maxwell, J. T., Domeier, T. L., Blatter, L. A. Refractoriness of sarcoplasmic reticulum Ca2+ release determines Ca2+ alternans in atrial myocytes. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 302, H2310-H2320 (2012).
- Wang, L., et al. Optical mapping of sarcoplasmic reticulum Ca2+ in the intact heart: ryanodine receptor refractoriness during alternans and fibrillation. Circulation research. 114, 1410-1421 (2014).
- Wengrowski, A. M., Kuzmiak-Glancy, S., Jaimes, R. 3rd, Kay, M. W. NADH Changes During Hypoxia, Ischemia, and Increased Work Differ Between Isolated Heart Preparations. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. , (2013).
- Fedorov, V. V., et al. Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts. Heart rhythm : the official journal of the Heart Rhythm Society. 4, 619-626 (2007).
- Myles, R. C., Wang, L., Kang, C., Bers, D. M., Ripplinger, C. M. Local beta-adrenergic stimulation overcomes source-sink mismatch to generate focal arrhythmia. Circulation research. 110, 1454-1464 (2012).
- Marks, A. R. Calcium cycling proteins and heart failure: mechanisms and therapeutics. The Journal of clinical investigation. 123, 46-52 (2013).
- Cutler, M. J., et al. Targeted sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase 2a gene delivery to restore electrical stability in the failing heart. Circulation. 126, 2095-2104 (2012).
