Summary
이 문서에서는 랑겐 돌프 - 관류 토끼 심장의 상세한 프로토콜과 횡단 전위 (V 분)의 이중 광학 매핑 및 무료 내 근질 세망 (SR)에 필요한 장비 칼슘을 설명합니다. 이 방법은 그대로 심장에 직접 관찰 및 V (M)의 정량 및 SR 칼슘 역학 수 있습니다.
Protocol
동물과 관련된 모든 절차는 캘리포니아 데이비스 대학의 동물 관리 및 사용위원회의 승인을, 건강의 국립 연구소에 의해 게시 된 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드를 부착했다.
1. 준비
- 4 ° C에서 사전 및 저장소에 수정 된 타이로드의 솔루션의 두 집중 (25X) 주식을 준비한다 : (1) 주식 I (MM에서 : 염화나트륨 3205, 염화칼슘 2 32.5, KCl을 117.5,의 NaH 2 PO 4 29.75,의 MgCl 2 26.25) 및 (2) (MM의 :의 NaHCO3 500) 주식 II.
- (DI)을 염화나트륨 128.2, CaCl2를 1.3의 KCl 4.7의 MgCl 2 1.05의 NaH 2 PO 4 1.19의 NaHCO3 (20) 및 탈 이온수 1840 ㎖에 결합하여 11.1 글루코스 : 갓 (㎜)에하기 조성의 2 L 타이로드의 용액을 제조 물 80 ml의 스톡 I, II의 스톡 80 ㎖, 및 글루코스 4g. 직접 주식 나는 그리고 스톡 II를 함께 사용하지 마십시오 추가1,840 ml의 DI에 m은 침전을 방지 할 수 있습니다.
- 사전에 10 mg을 무수 디 메틸 설폭 사이드 (DMSO)에 / ㎖에서 여기 수축 uncoupler의 blebbistatin의 주식 솔루션을 준비하고 4 ℃에서 원액을 저장합니다.
- 형광 염료의 스톡 용액을 제조한다 : (1) 전압에 민감한 염료 RH237 (DMSO에 1 ㎎ / ㎖), (2) 낮은 친 칼슘 지시등 FLUO-5N AM 제조자의 권장 사항에 따라 (DMSO 2 ㎎ / ㎖)를. 적재 능력의 후속 손실 분해를 방지하기 위해 즉시 준비를 사용합니다.
- 프라임 산소화 함께 재순환 랑겐 돌프 관류 시스템 (95 % O 2, 5 % CO 2)의 타이로드 용액. 7.4 ± 0.05의 타이로드 용액의 pH를 유지하기 위해, O2 / CO (2)의 흐름을 조정한다. 지속적으로 관류를 필터링 : 인라인 나일론 짠 그물 필터 (11 μm의 기공 크기)를 사용합니다.
- 이후 loadi으로 실온에서 국무 관류 시스템,FLUO-5N 오전 NG 실온에서 수행됩니다. FLUO-5N 오전 로딩, 순환 관류의 작은 볼륨 (~ 150 ㎖)를 사용합니다. 염료로드 한 후, 관류의 더 큰 볼륨 사용 (1-2 패, 그림 1C 참조).
- 데이터 수집 시스템의 전원을 켜고 심전도 및 관류 압력을 지속적으로 모니터링 준비합니다. 압력 모니터링 시스템을 준비합니다 관류 라인에 압력 변환기를 연결하고 transbridge 앰프 관류 압력을 모니터링 할 수 있습니다. 심장이 관류 시스템에 연결되지 않은 경우 0 mmHg로 기준선 관류 압력을 조정합니다.
- V 분 및 SR 칼슘 신호 사이의 공간 정렬을 보장하기 위해 광학 매핑 카메라를 맞 춥니 다.
- 첫째, 통치자 또는 관류 접시에 텍스트 개체를 배치하여 카메라 초점을 맞 춥니 다. 라이브 뷰 모드로 매핑 카메라를 켜고 텍스트가 선명하고 선명해질 때까지 초점을 조절합니다. 각각의 카메라로부터 하나의 프레임 화상을 취득.
- 오버레이두 이미지가 볼 수 있도록 이러한 이미지 및 상단 이미지의 투명도를 조정합니다. 이미지의 텍스트가 정확히 겹쳐한다. 완벽하게 정렬되지 않은 경우 두 이미지가 정렬 될 때까지, 다이크로 익 미러 또는 각 카메라의 위치의 각도를 조정한다.
토끼 심장의 2. 수확, 관류, 그리고 염료 로딩
- 승인 된 토끼 제한 수단의 토끼를 고정합니다. 깊이 펜 토바 비탈 나트륨 (50 mg / kg) 및 헤파린 (1000 IU)의 정맥 내 주사 (귀 가장자리 정맥)을 통해 마취.
- 토끼가 표시 침해 반사 신경이 부족하면, 중간 선 피부 절개는 흉골과 갈비뼈를 노출 할 수 있습니다. 흉골에 xyphoid에서 무딘 팁 수술 가위로 흉골을 통해 잘라. 흉골을 여는 동안 심장이 손상되지 않도록주의하십시오. 마음을 노출 갈비뼈를 확산.
- 빠르게 빠르게 모든 선박과 결합 조직을 절단하여 전체 심장 - 폐 블록은 절제. 최단 당일tely 얼음처럼 차가운 타이로드의 용액에 심장 - 폐 블록을 배치합니다.
- 역 행성 관류의 대동맥을 찾습니다. 대동맥 궁의 세 가지에 바로 인접 상행 대동맥을 잘라. 관류 시스템에 연결 8 G 캐 뉼러에 대동맥 Cannulate. 캐 뉼러에 대동맥을 확보하기 위해 USP 0 실크 봉합사의 조각을 사용합니다.
- 조심스럽게 마음에서 기관, 폐 및 심 외막 지방을 해부하다. 날카로운 집게 및 해부 가위, 승모판의 위치를주의 깊게 손상 또는 좌심실에서 솔루션 혼잡을 방지하기 위해 하나의 전단지를 제거합니다.
- 이미징이 위를 향하도록 마음의 전방 표면과 수평으로 유리 외피 관류 실에 마음을 담근다. 매핑 (그림 1D) 동안 마음의 움직임을 방지하기 위해 접시의 실리콘 바닥에 U 자형 핀 실 가드의 조각에 캐 뉼러를 고정합니다. 원하는 경우, STA에 대한 심장의 정점에 작은 곤충 핀을 삽입bilization.
- 위치 심전도 (ECG) 심장의 오른쪽과 왼쪽에 목욕 전극. 완전히 욕 전극 잠수함 그들이 리드 I 구성으로 부피가 유사한 실시 ECG 제공 심장 표면과 접촉하지 않는 보장. 보통의 리드 나는 심전도 형태를 확인합니다. 70 mmHg로 - 대동맥 압력이 60으로 유지 될 수 있도록 - (35 ml / 분 25) 흐름을 조정합니다.
- 실내 조명을 끄고 0.3 추가 - 관류 (- 20 μm의 최종 농도 10)에 blebbistatin 주식 솔루션 (단계 1.2)의 0.6 ml에.
- blebbistatin의 photoinactivation을 방지하기 위해 실내 조명을 끄십시오. 필요한 경우, 소형 스포트 또는 전조등은 작업 조명을 제공하기 위해 사용될 수있다.
주 :이 Blebbistatin 미오신 ATP 아제 억제제 및 여진 수축 uncoupler이다. 심장 에너지 생산이 손상 될 수있다 - FLUO-5N 로딩 확장 (60 분), RT (저체온증) 조건을 요구하기 때문에 (2.10 단계 2.8 참조). 목erefore, 관류 종래에 blebbistatin 첨가 에너지 수요 (16)을 감소시키고 후속 광학 레코딩 17 동안 모션 아티팩트를 제거 할 수있다 로딩 염료.
- blebbistatin의 photoinactivation을 방지하기 위해 실내 조명을 끄십시오. 필요한 경우, 소형 스포트 또는 전조등은 작업 조명을 제공하기 위해 사용될 수있다.
- 심장의 수축이 중단되면 (10 - 대동맥 압력 기록에 대한 확인 15 분), 작은 볼륨 순환 관류 시스템 (단계 1.4.1 참조)로 전환합니다.
- 준비하고 FLUO-5N 오전 로딩 솔루션을로드 : 0.25 ml의 따뜻한 20 % 플루로 닉 F127에 FLUO-5N 오전 원액 (1.3 단계)의 0.25 ML을 추가합니다. 0.5 ml의 혼합물에 따뜻한 타이로드의 솔루션을 추가 잘 혼합하고, 소량 순환 관류 시스템에 추가 할 수 있습니다.
- 연속적으로 관류 압력 및 ECG를 모니터하고 필요하다면 흐름을 조절한다. 염료 로딩은 실온에서 약 1 시간 소요됩니다. 로딩 후 45 분, 37 ℃로 관류 시스템 및 관류를 따뜻하게 시작 순환 물 목욕을 켜 시작했다.
- FLUO-5N 오전 로딩, SWI의 60 분 후큰 부피 재순환 관류 시스템에 관류 TCH (단계 1.4 참조).
- 따뜻한의 타이로드 액 1ml에 전압 감응 염료 RH237 원액 (단계 1.3) 50 μL를 희석하고 캐뉼라에 주입구 근위로 (~ 5 분에 걸쳐)을 천천히 부가.
3. 광학 매핑
- 염료로드의 마지막 순간 동안, 마음을 놓고 실험에 대한보기의 해당 필드를 보장하기 위해 광학 매핑 카메라 초점을 맞 춥니 다.
- 원하는 경우, 페이싱에 대한 마음의 심 외막 표면에 양극 페이싱 전극을 배치합니다.
- 인해 관류의 재순환에 존재할 수있는 액체의 표면에 동 잡음을 줄이기 위해 관류 챔버의 표면에 플라스틱이나 유리 커버 슬립을 배치했다.
주 : 커버 슬립에 대한 대안이 깨끗한 플라스틱 50mm 페트리 접시 덮개를 사용할 때. - 균일 전자와 마음의 표면을 조명 빛 가이드를 초점xcitation 빛. 495 nm의 대역 통과 필터 (도 1a) - 청색 발광 다이오드 (LED) 광원을 사용하여 상기 (475)로 광을 필터링.
- macroscope 두 상보성 금속 산화물 반도체 (CMOS) 광학 매핑 카메라와 방출되는 형광을 수집합니다. 545 nm에서 이색 거울 방출 된 빛을 분할합니다.
- 롱 패스는 700 nm에서, V의 m 신호를 포함하는, 긴 파장 부분을 필터링. 534 나노 미터 (도 1A) - 밴드 패스 (502)에서, SR 칼슘 신호를 포함하는, 단파장 잔기 필터. 1 kHz에서 - 0.5 광 데이터 수집의 빈도를 설정합니다.
- 각각의 광 기록, 처음으로, 원하는 페이싱 프로토콜을 시작 여기 광을 켜고 1 수집 - 데이터의 4 초. 필요한 경우, 페이징 프로토콜 및 데이터 획득을 동기화.
주 : 것은 불가능 FLUO-5N AM, 따라서 신호 대 잡음비 (SNR)를 재 로딩한다 decrea자체 SR에서 누출 염료에 의한 실험을하는 동안. 높은 SNR 값을 보장하기 위해 2 시간 - 1 실험 프로토콜을 제한합니다. - 실험 후, 탈 이온수로 다시 DI 물, 70 % 알코올 시약의 순차적 관류 시스템을 씻어.
- 제조사의 프로토콜에 따라 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어 패키지를 이용하여 공간 가우시안 필터 (반경 3 픽셀)를 각 데이터 세트를 필터링.
- 필요한 경우, 공간적으로 V의 m 및 SR 칼슘 2 + 데이터 세트를 맞 춥니 다. 단계 1.6에서와 같이, 각각의 카메라에서 이미지를 중첩되는지 확인보기 (즉, 정맥, 페이싱 전극)의 분야에서 심장의 해부학 적 구조 (즉., 관상 동맥 혈관, 심방의 가장자리 또는 심실) 또는 기타 항목을 정확하게 중복. 그렇지 않은 경우, 데이터 세트의 공간 배치가 필요하다.
- 화소 번호를 기록하게 정확한 오버랩까지 X 축 및 Y 방향이 달성에 상부 투명 이미지를 이동이미지는 각 방향으로 이동해야합니다. 상부 이미지 (V m 또는 SR 칼슘 하나)에 대응하는 전체 데이터 세트는 V의 m 및 SR 칼슘 2 데이터 세트 사이의 정확한 정렬을 보장하기 위해, 각 방향의 화소 수만큼 시프트 결정되어야한다.
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Representative Results
도 1a는 이중 V의 m 및 SR 칼슘 매핑 광학 구성의 개략도를 나타낸다. 이 설정으로, V의 m 및 SR 칼슘 신호 (그림 1B)의 전체 스펙트럼 분리가있다. FLUO-5N 염료 로딩에 사용되는 이중 루프 관류 시스템의 도면은도 1c에 도시된다.도 1d는 관류 접시 심장의 가로 방향을 나타낸다. 대표적인 V의 M과 심장의 심 외막 표면에 다른 위치에서 지속적으로 조율 중에 SR 칼슘 2 + 광학 추적은 그림 2A에 표시됩니다. 이 설정으로 뷰의 광 필드는 X 31mm 및 시야 내의 중심부의 방향이도 2b에 도시되어 31mm이다. 활성화 맵은 또한도 2b에 도시되어 있으며, 각 픽셀 (P)의 활성화 시간을 선택함으로써 구성된다등시의지도에이 값을 분양 (- V의 m 및 SR 칼슘 활성화지도 사이에 10 밀리 초 ~ 8의 전형적인 지연에주의). 중요한 것은, 이러한 AP 상승 시간 등의 주요 활동 전위 (AP) 특성이 80 % 재분극 APD (80)에서, 그리고 AP 기간 (진폭 [따른 Trise]의 10 % ~ 90 %에서), RH237로드 마음 사이에 통계적으로 차이가 있습니다 14.9 밀리 ± 1.9 밀리 초 대 14.2 밀리 ± 1.2 밀리 초와 APD 80 : FLUO-5N과에 대한 155.3 밀리 초 ± 5.8 밀리 초 대 156.9 밀리 ± 5.7 밀리 초 및 FLUO-5N은 RH237와 루비로드-2 (따른 Trise로드와 비교 루비로드-2, 각각; P 모두> 0.05;. N = 8 / 그룹), 최소 FLUO-5N의 효과 나 AP 그림 2C에로드 염색을 나타내는 관찰하고 이완기 SR 칼슘의 상대적인 변화를 정량화 할 수있는 능력을 보여줍니다 2+ 부하와 수축기 SR 칼슘 2 + 릴리스는 다양한 페이싱주기 길이에 진폭이. 이러한 매개 변수 만 상대적으로 변화가 숨어 될 수있다그대로 마음에 신호의 정량화, 절대 교정 ([칼슘 2 +] SR)은 할 수 없습니다.
그림 3에 도시 된 바와 같이이 방법은, 특성화 및 병리학 SR 칼슘 처리를 정량화에 특히 유용하다. 관찰 SR에서 β 아드레날린 수용체 작용제 이소 (100 ㎚), 명확한 이완기 칼슘 누수의 응용 프로그램 (다음 빨간색 화살표, 그림 3A). 누수가 충분히 큰 경우, 칼슘은 트리거 활동 (그림 3B)를 발생할 수 있습니다 - 중재.
듀얼 V (m)의 매핑 및 SR 칼슘 2 +. 필요한 필터와 적절한 스펙트럼 분리 다이크로 익 미러를 포함하는 광 설치,의 (A)도. (그림 1. 시스템 설치하나 FLUO-5N 전용 (I) 또는 RH237로드 마음의 B) 영상 만 (II) V (m)의 전체 스펙트럼 분리 및 SR 칼슘 2 + 형광 신호를 나타냅니다. 예 : 여기, 엠 :. 정상 관류 및 FLUO-5N 염료 로딩을위한 이중 루프 관류 시스템의 방출 (C)도 (D) 관류 접시에 유관 심장 및 심전도 전극의 이미지.. 패널 A와 B는 왕 등. (15)의 허가를 재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. V의 m 및 SR 칼슘 연속 및 비 연속 페이싱 동안 2 + 광학 추적합니다. (A) 대표 V 분 및 SR 칼슘하기 OpticaL은 300 밀리의주기 길이의 연속 페이싱 동안 추적합니다. 신호 (B)에 나타낸 각각의 위치에서 도시된다. 일반 여기 수축 커플 링에 대한 전형적인으로 V의 m 및 SR 칼슘 활성화 시간 사이에 10 밀리 초 - ~ 8의 지연을합니다. (B)보기의 매핑 필드 내 마음의 이미지 V 분 및 SR 칼슘 2 +. (C) 이완기 SR 칼슘 부하의 변화를 보여주는 SR 칼슘 광 흔적 및 활성화지도 (흰색 화살표는 전극을 페이싱 표시) 및 SR 칼슘 2 + 릴리스의 진폭은 속도를 페이싱에 급격한 변화를 다음과 같습니다. 모든 흔적은 CL = 300 밀리 초에서 서성로 시작합니다. 레이트 페이싱하는 것은 다음 급격 CL = 500 밀리 초 (I), CL로 변화 = 400 밀리 초 (II), 또는 CL = 250 밀리 초 (III). 이상 CL에서이 시작되면 (난 - II), 큰 SR 칼슘 2 + 릴리스는, 제 1 및 이완기 SR 칼슘 (인해 더 이상 이완기 간격과 RyRs의 회복) 발생2 + 부하가 약간 새로운 정상 상태 (수평 점선)로 감소. 짧은 CL가 시작되면, 그러나, 작은 SR 칼슘 방출 진폭 새로운 정상 상태 (가로 점선)과 이완기 SR 칼슘 부하 증가 (인해 RyRs 짧은 이완기 간격 불완전한 복구에) 발생 . SR 칼슘 방출 진폭의 교대는 CL = 250 밀리 초에서 발생한다. S : 작은 방출 진폭, L : 큰 릴리스 진폭. (CL : 사이클 길이) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
베이스 라인 (왼쪽)와 다음 중 그림 3. 이완기 SR 칼슘 2 + 누출 및 후속 트리거 된 활동. (A) 심전도, V의 M 및 SR 칼슘 흔적100 나노 미터 이소 (ISO, 오른쪽)와 치료. 이소로, 상당한 이완기 SR 칼슘 누수가 (빨간색 화살표)이 관찰된다. SR 칼슘 신호 진폭 전 및 ISO 후 정상화되었다. 중국 - 심방 노드는 두 경우 모두 CL = 300 밀리 초를 서성 수 있도록 절제되었다. (B) SR 칼슘 누수가 충분히 크다면, 그것은 초점 활동 (조기 심실 단지, PVC를)를 실행할 수 있습니다. 이 예에서, PVC를 정상 동 율동을 중단한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
성공적인 FLUO-5N 염료 로딩 키 염료 대량의 로딩 시간 (1 시간)의 길이에 대한 필요없이 높은 FLUO-5N 농도 허용 소량 재순환 관류 셋업하고, 로딩을 수행 실온에서. 로딩 빠르게 생리 온도, 셀룰러 절단 효소 활성 염료 세포질에서 염료 분자를 포착하고이를 SR 세포막을 통과 할 수없는, 세포막을 통과 -AM 태그에서 수행되는 경우. RT에서, 그러나, 효소 활성은 둔화되고 -AM 태그 전에 세포막과 SR 막 모두를 교차 할 수 염료 충분량 SR에 염료를 포착, 절단된다.
심지어 최적의 하중 조건으로, 그러나, 신호 진폭이 접근 분수 형광 변화 (ΔF / F)는 높은 친 화성 염료와 V (m)의 전통적인 광학 매핑 및 세포 내 칼슘보다 낮은 것. 예를 들어, LED를 여기 광, 거시적 목적, 큰 필터와 다이크로 익 미러 (5 cm × 5 cm)에, 그리고 CMOS 카메라, 분수 형광 변화 이루어져 여기서 사용되는 광 설정으로 (ΔF / F) (1)의 순서에있는 RH237 신호 (15)에 대한 3 % - - FLUO-5N 신호와 2 2 %. 분수 형광은 물론, 특정 광학 구성, 광원, 및 특정 설치의 카메라에 달려 있지만, 심지어 최적 조건 FLUO-5N 신호는 전형적으로 세포 내 칼슘의 레코딩에 대해 관찰 된 것보다 상당히 낮다 2+ 높은 친 화성 염료. 녹색 (545 ㎚), 여기 광 (18)을 사용하는 경우 루비로드 -2- 30 % - 예를 들어, 같은 설정에 ΔF / F가 20 정도이다. 5 % - 그린 여기 광도 RH237의 여기 피크에 근접하므로 RH237의 ΔF / F (4) 주위에,이 경우도 크다. 따라서, 그 실험실 이미 V (m)의 이중 광학 매핑을 수행 2 + 세포, 치료가 최대 ΔF을 보장하기 위해 광 설치의 모든 구성 요소를 최적화하기 위해주의해야한다 / FLUO-5N 신호 F.
이 방법, 연구자들은 정확하게 SR 칼슘 역학과 기존의 접근 가능하지 않은 방법으로 V 분에 미치는 영향을 조사 할 수 있습니다. 예를 들어, (그림 3A에서와 같이) SR 칼슘 2 + 누출의 정량적 측정 및 SR 칼슘 2 + 복구 (SR 칼슘 2 + -ATPase [SERCA] 활동의 타우 -a 측정)의 정확한 시정을 수행 할 수 있습니다. 높은 친 화성 염료 2+ 세포 내 칼슘의 광학 매핑에 대한 기존의 접근 방식을 사용하여, 이러한 측정은 (횡단 칼슘 이온 플럭스 '오염'할 수있다 즉., L 형의 기여 칼슘 채널과 나 + -ca 2 + 기). 또한, 높은 친화력 칼슘 2 + 지표는 본질적으로 느린 K가낮은 친화도 지표 (5)보다 inetics은, 따라서 FLUO-5N 신호는 높은 충실도와 실제 칼슘의 변화와 형광에 해당하는 변화 사이 본질적으로 시간 지연없이 정확한 SR 칼슘의 움직임을보고 할 것으로 예상된다.
SR 칼슘 재 흡수 및 방출은 부정맥 현상에 기여하는 구체적인 메커니즘을 조사하는 기능이 방법의 또 다른 장점이다. 예를 들어,이 방법을 사용하여, 우리는 최근 SR 칼슘 2 + 릴리스의 내화도는 칼슘 alternans의 발병에 기여하고는 심실 세동 동안, SR 칼슘 방출이 거의 지속적으로 내화 (15) 남아있는 보도했다. 이 세동 동안 SR 칼슘 역학의 첫 번째 보고서이고 그대로 마음에 SR 칼슘 이미징의 주요 장점을 강조 : 이러한 공간적 불일치 alternans와 f와 같은 공간적으로 독특하고 복잡한 현상을ibrillation은 공부하실 수 있습니다. 불행히도, 이러한 유형의 정보 세동이 불가능하거나 단지 심장 손상 12 번의 위치에서 기록 방법에서 분리 된 세포로부터 수집 될 수 없다.
또한, V m을하고 그대로 마음에 무료 SR 칼슘의 동시 광학 매핑은 비정상적인 칼슘을 평가하는 2 + 심부전을 포함한 병리학 적 조건에서 처리하기위한 새로운 도구를 제공 할 수있다. SR 칼슘 2 + 릴리스, 이완기 SR 칼슘 2 + 누출,과 칼슘 SR 2+ 흡수의 활성화 및 종료를 포함하여 SR 칼슘 조절에 이상 - CA의 모든 주요 단계 2+ 자전거 잠재적으로 심장 마비에 변경된 모든 - 직접 공부하실 수 있습니다. 또한,이 방법은 또한 안정화 RyR 19 SERCA 변조 20 소설 치료 개입의 영향을 평가하기위한 유용한 도구가 될 수있다.
2+] SR하는 정확한 농도를 형광 값을 보정하는 무능력을 포함하지만, 한계가없는 것은 아니다. 불행히도 의한 실험의 과정을 통해 SR로부터 심장, 및 포토 블리 칭과 염료 누출 곡면 염료 로딩 불균일 여기 및 발광 빛의 가변성은 극히 어렵다에 FLUO-5N 신호를 보정 할 수 있도록 그대로 마음에 정확한 [칼슘] SR. 생리적 완충 용액에 이전 체외 연구와 투과성이 고립 된 근육 세포는 교정을보고하고 FLUO-5N 형광의 변화의 변화에 비례하는 것을 나타낼 [칼슘 2 +] SR과 형광이 생리 학적으로 포화 않을 것으로 예상된다 칼슘 +] SR 수준 (11). 따라서, 연구자들은 칼슘 엄마의 방법을 선택해야합니다특정 실험 목적과 생리 학적 연구를 기반으로 pping (낮은 또는 높은 친 화성 염료).
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-1 | Component of Tyrode's solution |
| CaCl2 (2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | Component of Tyrode's solution |
| KCl | Fisher Scientific | S217-500 | Component of Tyrode's solution |
| MgCl2 (6H2O) | Fisher Scientific | M33-500 | Component of Tyrode's solution |
| NaH2PO4 (H2O) | Fisher Scientific | S369-500 | Component of Tyrode's solution |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233-3 | Component of Tyrode's solution |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | Component of Tyrode's solution |
| 95% O2 5% CO2 | AirGas | carbogen | For oxygenation and pH of Tyrode's solution |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience | 1760 | Excitation-contraction uncoupler |
| RH237 | Biotium | 61018 | Voltage-sensitive dye |
| Fluo-5N AM | Invitrogen | F-26915 | Low-affinity Ca2+ indicator; Alternative: Invitrogen F-14204; Loading must be performed at room temperature |
| Pluronic F127 | Biotium | 59004 | For Ca2+ indicator loading; Warm until the solution is clear before use |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | For dissolving blebbistatin and dyes |
| Filter | EMD Millipore | NY1104700 | 11 μm in-line filter |
| Pressure Transducer | WPI | BLPR2 | For measuring perfusion pressure |
| Transbridge Transducer Amplifier | WPI | SYS-TBM4M | For transducing/amplifing pressure signal; PowerLab may also be used with appropriate BioAmp |
| PowerLab 26T | ADInstruments | For continuous recording of pressure and ECG signals | |
| THT Macroscope | SciMedia | Macroscopic optical setup. Details: 0.63X objective (NA = 0.31), 2X condensing objective, resultant field of view = 3.1 cm x 3.1 cm, depth of focus = ~ 1.5 mm | |
| MiCam Ultima-L CMOS | SciMedia | Optical mapping cameras | |
| Precision LED Spot Light | Mightex | PLS-0470-030-15-S | LED light source |
References
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