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Biology

इंट्रा-sarcoplasmic जालिका सीए के ऑप्टिकल मानचित्रण Published: September 10, 2015 doi: 10.3791/53166
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Pharmacology, University of California Davis, 2Departments of Pharmacology and Biomedical Engineering, University of California Davis

Summary

यह लेख Langendorff-भरकर रखा खरगोश दिल में विस्तृत प्रोटोकॉल और transmembrane क्षमता (वी एम) के दोहरे ऑप्टिकल मानचित्रण और मुक्त इंट्रा-sarcoplasmic जालिका (एसआर) के लिए आवश्यक उपकरण सीए 2 का वर्णन है। इस विधि को बरकरार दिल में प्रत्यक्ष अवलोकन और वी मीटर की मात्रा का ठहराव और एसआर सीए 2 गतिशीलता के लिए अनुमति देता है।

Protocol

सभी जानवरों को शामिल प्रक्रियाओं कैलिफोर्निया, डेविस विश्वविद्यालय के पशु की देखभाल और उपयोग समिति ने मंजूरी दे दी है, और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा प्रकाशित प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड का पालन किया गया था।

1. तैयारी

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर अग्रिम और दुकान में संशोधित Tyrode समाधान के दो केंद्रित (25X) के शेयरों तैयार: (1) स्टॉक मैं (मिमी में: सोडियम क्लोराइड 3205, 2 CaCl 32.5, KCl 117.5, नाह 2 4 पीओ 29.75, 2 MgCl 26.25) और (2) (मिमी में: 3 NaHCO 500) स्टॉक द्वितीय।
    1. (डीआई) सोडियम क्लोराइड 128.2, 2 CaCl 1.3, KCl 4.7, 2 MgCl 1.05, नाह 2 4 पीओ 1.19, 3 NaHCO 20 और विआयनीकृत 1840 मिलीलीटर के संयोजन से 11.1 ग्लूकोज: हौसले (मिमी) में निम्न रचना के 2 एल Tyrode समाधान तैयार पानी, 80 मिलीलीटर शेयर मैं, स्टॉक द्वितीय की 80 मिलीलीटर, और ग्लूकोज की 4 जी। सीधे स्टॉक मैं और शेयर द्वितीय मिश्रण नहीं है; जोड़ें1840 मिलीलीटर डि करने के लिए मीटर वर्षा से बचने के लिए।
  2. अग्रिम में 10 मिलीग्राम निर्जल DI-methylsulfoxide (DMSO) में / मिलीलीटर में उत्तेजना-संकुचन uncoupler blebbistatin का जायजा समाधान तैयार है और 4 डिग्री सेल्सियस पर शेयर समाधान की दुकान।
  3. फ्लोरोसेंट रंगों के शेयर समाधान तैयार: (1) वोल्ट के प्रति संवेदनशील डाई RH237 (DMSO में 1 मिलीग्राम / एमएल) और (2) कम आत्मीयता कैल्शियम सूचक Fluo-5N पूर्वाह्न निर्माता की सिफारिशों के अनुसार (DMSO में 2 मिलीग्राम / एमएल)। लदान क्षमता के बाद के नुकसान के साथ अपघटन से बचने के लिए तुरंत तैयारियों का प्रयोग करें।
  4. प्रधानमंत्री ऑक्सीजन के साथ recirculating Langendorff छिड़काव प्रणाली (95% ओ 2, 5% सीओ 2) Tyrode समाधान। 7.4 ± 0.05 पर Tyrode समाधान के पीएच रखने के लिए 2 हे / सीओ 2 के प्रवाह को समायोजित करें। लगातार perfusate फिल्टर करने के लिए: एक लाइन में नायलॉन बुना शुद्ध फिल्टर (11 माइक्रोन रोमकूप आकार) का प्रयोग करें।
    1. बाद में Loadi रूप आरटी पर प्रधानमंत्री छिड़काव प्रणाली,Fluo-5N बजे की एनजी आरटी पर किया जाता है। Fluo-5N पूर्वाह्न लोड करने के लिए, रीसर्क्युलेटिंग perfusate की एक छोटी मात्रा (~ 150 एमएल) का उपयोग करें। डाई लोड करने के बाद, perfusate की एक बड़ी मात्रा का उपयोग (1 - 2 एल, चित्रा 1C देखें)।
  5. डाटा अधिग्रहण प्रणाली को चालू करें और ईसीजी और छिड़काव दबाव की सतत निगरानी के लिए तैयार करते हैं। दबाव की निगरानी प्रणाली तैयार: छिड़काव लाइन के लिए एक दबाव transducer कनेक्ट और एक transbridge एम्पलीफायर के साथ छिड़काव दबाव की निगरानी। दिल छिड़काव प्रणाली से जुड़ा नहीं है जब 0 एमएमएचजी करने के लिए आधारभूत छिड़काव दबाव को समायोजित करें।
  6. वी मीटर और एसआर सीए 2 संकेतों के बीच स्थानिक संरेखण को सुनिश्चित करने के लिए ऑप्टिकल मानचित्रण कैमरों संरेखित करें।
    1. सबसे पहले, एक शासक या छिड़काव डिश में पाठ के साथ एक वस्तु रखकर कैमरों ध्यान केंद्रित। एक लाइव देखें मोड में मानचित्रण कैमरों मुड़ें और पाठ कुरकुरा और स्पष्ट है जब तक ध्यान समायोजित। प्रत्येक कैमरे से एक भी फ्रेम छवि मोल।
    2. ओवरलेदोनों छवियों दिखाई दे रहे हैं ताकि इन छवियों और शीर्ष छवि की पारदर्शिता को समायोजित। छवियों में पाठ बिल्कुल ओवरलैप चाहिए। पूरी तरह से गठबंधन नहीं तो दो छवियों गठबंधन कर रहे हैं, जब तक dichroic दर्पण या प्रत्येक कैमरे की स्थिति के कोण समायोजित करें।

खरगोश दिल की 2. कटाई, छिड़काव, और डाई लोडिंग

  1. एक अनुमोदित खरगोश restrainer में खरगोश सुरक्षित। गहरा सोडियम pentobarbital (50 मिलीग्राम / किग्रा) और हेपरिन (1,000 आइयू) की एक अंतःशिरा इंजेक्शन (सीमांत कान की नस) के माध्यम से anesthetize।
    1. खरगोश को प्रदर्शित करता है nociceptive सजगता की कमी है, जब एक midline त्वचा चीरा उरोस्थि और पसलियों को बेनकाब करने के लिए बनाते हैं। Manubrium को xyphoid से कुंद की नोक शल्य कैंची के साथ उरोस्थि के माध्यम से कट। उरोस्थि को खोलने के दौरान दिल को नुकसान नहीं ख्याल रखना। दिल को बेनकाब करने के लिए पसलियों बिखरा हुआ है।
    2. जल्दी से तेजी से सभी जहाजों और संयोजी ऊतक काटने से पूरे दिल फेफड़ों ब्लॉक आबकारी। Immediately ठंडा Tyrode समाधान में दिल फेफड़ों ब्लॉक जगह है।
  2. प्रतिगामी छिड़काव के लिए महाधमनी का पता लगा। महाधमनी चाप की तीन शाखाओं के लिए बस के समीपस्थ आरोही महाधमनी कट। छिड़काव प्रणाली से जुड़े एक 8 जी प्रवेशनी महाधमनी cannulate। प्रवेशनी पर महाधमनी सुरक्षित करने के लिए खासियत 0 रेशम सीवन के एक टुकड़े का उपयोग करें।
  3. ध्यान से दिल से श्वासनली, फेफड़े, और एपिकार्डियल वसा काटना। एक तेज संदंश और विच्छेदन कैंची के साथ, मिट्रल वाल्व लगाने और ध्यान से नुकसान या बाएं वेंट्रिकल में समाधान भीड़ को रोकने के लिए एक पत्रक को हटा दें।
  4. इमेजिंग के लिए सामना करना पड़ रहा है दिल के पूर्वकाल सतह के साथ क्षैतिज कांच तख्ताबंदीवाला छिड़काव कक्ष में दिल डूब। मानचित्रण (चित्रा -1) के दौरान दिल की आवाजाही रोकने के लिए पकवान की सिलिकॉन तल पर यू के आकार का पिन के साथ Sylgard के एक टुकड़े के लिए प्रवेशनी सुरक्षित। अगर वांछित, स्टेशन के लिए दिल के शीर्ष पर एक छोटा सा कीट पिन डालनेbilization।
  5. स्थिति इलेक्ट्रोकार्डियोग्राम (ईसीजी) दिल के दाईं और बाईं ओर के स्नान में इलेक्ट्रोड। पूरी तरह से स्नान में इलेक्ट्रोड डूब और वे एक लीड मैं विन्यास के लिए एक मात्रा आयोजित ईसीजी अनुरूप प्रदान करने के लिए दिल की सतह के साथ संपर्क में नहीं हैं सुनिश्चित करते हैं। एक सामान्य लीड मैं ईसीजी आकृति विज्ञान सत्यापित करें। 70 एमएमएचजी - महाधमनी दबाव 60 पर बनाए रखा है कि यह सुनिश्चित करने के लिए - (35 मिलीग्राम / मिनट 25) के प्रवाह को समायोजित करें।
  6. कमरे में रोशनी बंद करें और 0.3 जोड़ - perfusate (- 20 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता 10) को blebbistatin शेयर समाधान (1.2 चरण) के 0.6 मिलीलीटर।
    1. Blebbistatin की photoinactivation से बचने के लिए कमरे में रोशनी बंद कर दें। यदि आवश्यक हो, एक छोटे से सुर्खियों या हेडलैम्प कार्य प्रकाश प्रदान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
      नोट: Blebbistatin एक मायोसिन ATPase अवरोध करनेवाला और एक उत्तेजना-संकुचन uncoupler है। , हृदय ऊर्जा उत्पादन समझौता किया जा सकता है - Fluo-5N लोड हो रहा है विस्तारित (60 मिनट) आर टी (हाइपोथर्मिया) की स्थिति की आवश्यकता है क्योंकि (2.10 कदम 2.8 देखें)। गुerefore, perfusate से पहले में blebbistatin के अलावा ऊर्जा की मांग में 16 को कम करने और बाद में ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग 17 के दौरान गति कलाकृतियों को समाप्त कर सकते लोडिंग डाई करने के लिए।
  7. हृदय के संकुचन नहीं रह गया है जब (10 - महाधमनी दबाव रिकॉर्डिंग पर सत्यापित 15 मिनट), छोटे मात्रा रीसर्क्युलेटिंग छिड़काव प्रणाली (कदम 1.4.1 देखें) के लिए स्विच।
  8. तैयार है और Fluo-5N AM लोड हो रहा समाधान लोड: 0.25 मिलीलीटर गर्म 20% Pluronic F127 के लिए Fluo-5N पूर्वाह्न शेयर समाधान (1.3 चरण) के 0.25 मिलीलीटर जोड़ें। , 0.5 मिलीग्राम मिश्रण को गर्म Tyrode समाधान जोड़ें मिश्रण अच्छी तरह से, और छोटे मात्रा रीसर्क्युलेटिंग छिड़काव प्रणाली में जोड़ें।
  9. लगातार छिड़काव दबाव और ईसीजी पर नजर रखने और यदि आवश्यक हो तो प्रवाह को समायोजित। डाई लोड हो रहा आरटी पर लगभग 1 घंटा लग जाते हैं। लदान के बाद 45 मिनट के 37 डिग्री सेल्सियस तक छिड़काव प्रणाली और perfusate वार्मिंग शुरू करने के लिए घूम पानी स्नान पर बारी शुरू हो गया है।
  10. Fluo-5N AM लोड हो रहा, श्रृंगार के 60 मिनट के बादबड़ी मात्रा रीसर्क्युलेटिंग छिड़काव प्रणाली के लिए छिड़काव दर्पण (1.4 कदम देखें)।
  11. गर्म Tyrode समाधान के 1 मिलीलीटर में वोल्टेज संवेदनशील डाई RH237 शेयर समाधान (1.3 चरण) के 50 μl पतला और प्रवेशनी को एक इंजेक्शन बंदरगाह समीपस्थ में (5 ~ से अधिक मिनट) धीरे-धीरे जोड़ें।

3. ऑप्टिकल मानचित्रण

  1. डाई लोडिंग के अंतिम क्षणों के दौरान, दिल की स्थिति और प्रयोग के लिए देखने के उपयुक्त क्षेत्र को सुनिश्चित करने के लिए ऑप्टिकल मानचित्रण कैमरों ध्यान केंद्रित।
  2. अगर वांछित, पेसिंग के लिए दिल की एपिकार्डियल सतह पर एक द्विध्रुवी पेसिंग इलेक्ट्रोड जगह है।
  3. कारण perfusate की पुनःपरिसंचरण के लिए उपस्थित हो सकता है कि तरल सतह पर गति विरूपण साक्ष्य को कम करने के लिए छिड़काव चैम्बर की सतह पर एक प्लास्टिक या कांच कवर पर्ची रखें।
    नोट: एक कवर पर्ची के लिए एक विकल्प, एक साफ प्लास्टिक 50 मिमी पेट्री डिश कवर का उपयोग करें।
  4. समान रूप से ई के साथ दिल की सतह रोशन करने के लिए प्रकाश गाइड फोकसxcitation प्रकाश। 495 एनएम bandpass फिल्टर (चित्रा 1 ए) - नीले प्रकाश उत्सर्जक डायोड (एलईडी) प्रकाश स्रोतों का प्रयोग करें और आगे एक 475 के साथ प्रकाश फिल्टर।
  5. एक macroscope और दो पूरक धातु ऑक्साइड अर्धचालक (CMOS) ऑप्टिकल मानचित्रण कैमरों के साथ उत्सर्जित प्रतिदीप्ति लीजिए। 545 एनएम पर एक dichroic दर्पण के साथ प्रकाश उत्सर्जित विभाजित।
    1. लंबी पास 700 एनएम, वी एम संकेत युक्त, अब तरंगदैर्ध्य आधा भाग फिल्टर। 534 एनएम (चित्रा 1 ए) - बैंड-पास 502 से, एसआर सीए 2 संकेत युक्त, छोटी तरंग दैर्ध्य आधा भाग फिल्टर। 1 किलो हर्ट्ज - 0.5 करने के लिए ऑप्टिकल डाटा अधिग्रहण की आवृत्ति सेट करें।
  6. प्रत्येक ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग के लिए, पहली बार, वांछित पेसिंग प्रोटोकॉल आरंभ उत्तेजना प्रकाश पर बारी है, और 1 इकट्ठा - डेटा के 4 सेकंड। अगर वांछित, पेसिंग प्रोटोकॉल और डाटा अधिग्रहण सिंक्रनाइज़।
    नोट: यह संभव नहीं है Fluo-5N AM, इसलिए संकेत करने वाली शोर अनुपात (SNR) को फिर से लोड decrea होगाएसई एसआर से रिसाव डाई करने के कारण प्रयोग के दौरान। उच्च SNR मूल्यों सुनिश्चित करने के लिए 2 घंटा - 1 के लिए प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल सीमित करें।
  7. प्रयोग के बाद, डि पानी के साथ फिर डि पानी, 70% अभिकर्मक शराब के अनुक्रम में छिड़काव प्रणाली धोने, और।
  8. निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर संकुल का उपयोग कर एक स्थानिक गाऊसी फिल्टर (त्रिज्या 3 पिक्सल) के साथ प्रत्येक डाटासेट फ़िल्टर।
  9. यदि आवश्यक हो, स्थानिक वी मीटर और एसआर सीए 2 डेटा सेट पंक्ति में। 1.6 चरण में के रूप में, प्रत्येक कैमरे से ओवरले छवियों और सत्यापित करें कि दृश्य (यानी, प्रवेशनी, पेसिंग इलेक्ट्रोड) के क्षेत्र में दिल के संरचनात्मक ढांचे (यानी।, कोरोनरी वाहिका, अटरिया के किनारों या निलय) या अन्य वस्तुओं को बिल्कुल ओवरलैप। यदि नहीं, तो डेटासेट के स्थानिक संरेखण के लिए आवश्यक है।
  10. पिक्सेल की संख्या को ध्यान में कर रही है, सटीक ओवरलैप तक एक्स और वाई दिशा हासिल की है में शीर्ष पारदर्शी छवि पारीछवि प्रत्येक दिशा में स्थानांतरित कर दिया जाना चाहिए। शीर्ष छवि (वी एम या एसआर सीए 2 या तो) के लिए इसी पूरे डाटासेट तो वी मीटर और एसआर सीए 2 डेटासेट के बीच सटीक संरेखण आश्वस्त करने के लिए प्रत्येक दिशा में पिक्सल के निर्धारित संख्या से स्थानांतरित कर दिया जाना चाहिए।

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Representative Results

चित्रा 1 ए दोहरी वी मीटर और एसआर सीए 2 मानचित्रण के लिए ऑप्टिकल विन्यास की एक योजनाबद्ध चित्र से पता चलता है। इस स्थापना के साथ, वी मीटर और एसआर सीए 2 संकेतों (चित्रा 1 बी) का पूरा वर्णक्रम अलग नहीं है। Fluo-5N डाई लोड करने के लिए इस्तेमाल किया दोहरे पाश छिड़काव प्रणाली का एक चित्र चित्रा 1C में सचित्र है। चित्रा -1 छिड़काव डिश में दिल की क्षैतिज उन्मुखीकरण से पता चलता है। प्रतिनिधि वी मीटर और दिल की एपिकार्डियल सतह पर विभिन्न स्थानों से निरंतर पेसिंग दौरान एसआर सीए 2 ऑप्टिकल निशान चित्रा 2A में दिखाया जाता है। इस सेटअप के साथ देखने की ऑप्टिकल क्षेत्र x 31 मिमी और देखने के क्षेत्र के भीतर दिल का उन्मुखीकरण चित्रा 2 बी में दिखाया गया है 31 मिमी है। सक्रियण नक्शे भी चित्रा 2B में दिखाया जाता है और प्रत्येक पिक्सेल और पी के सक्रियण समय का चयन करके निर्माण कर रहे हैंएक isochronal मानचित्र पर इस मूल्य lotting (- वी मीटर और एसआर सीए 2 सक्रियण नक्शे के बीच 10 मिसे ~ 8 की ठेठ देरी ध्यान दें)। महत्वपूर्ण बात है, ऐसे एपी वृद्धि समय के रूप में महत्वपूर्ण कार्य क्षमता (एपी) गुण 80% repolarization (APD 80) पर, और एपी अवधि (आयाम [Trise] का 10% से 90% से), RH237 के साथ भरी हुई दिलों के बीच सांख्यिकीय अलग नहीं हैं 14.9 मिसे ± 1.9 मिसे बनाम 14.2 मिसे ± 1.2 मिसे और APD 80: Fluo-5N और के लिए 155.3 मिसे ± 5.8 मिसे बनाम 156.9 मिसे ± 5.7 मिसे और Fluo-5N RH237 और Rhod -2 (Trise के साथ भरी हुई उन लोगों की तुलना rhod -2, क्रमशः; पी दोनों के लिए> 0.05;। एन = 8 / समूह), कम से कम Fluo-5N के प्रभाव या एपी चित्रा -2 पर लोडिंग डाई का संकेत पालन और डायस्टोलिक एसआर सीए में रिश्तेदार परिवर्तन यों की क्षमता को दर्शाता है 2 + लोड और सिस्टोलिक एसआर सीए 2 रिलीज विभिन्न पेसिंग चक्र लंबाई में आयाम। इन मानकों में केवल रिश्तेदार परिवर्तन qu किया जा सकताबरकरार दिल में संकेत के antified, के रूप में पूर्ण अंशांकन ([सीए 2 +] एसआर) संभव नहीं है।

3 चित्र में दिखाया गया है के रूप में यह दृष्टिकोण, निस्र्पक और रोग एसआर सीए 2 से निपटने बढ़ाता के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। मनाया जाता है एसआर से β एड्रीनर्जिक रिसेप्टर agonist isoproterenol (100 एनएम), स्पष्ट डायस्टोलिक सीए 2 रिसाव के आवेदन (के बाद लाल तीर, चित्रा 3)। रिसाव काफी बड़ी है, तो सीए 2 ट्रिगर गतिविधि (चित्रा 3 बी) को हो सकती है मध्यस्थता।

चित्र 1
दोहरी वी मीटर की मैपिंग और एसआर सीए 2। आवश्यक फिल्टर और उचित वर्णक्रम अलग होने के लिए dichroic दर्पण सहित ऑप्टिकल सेटअप, (ए) आरेख। (चित्रा 1. सिस्टम सेटअपया तो Fluo-5N केवल (i) या RH237 के साथ भरी हुई दिल की बी) इमेजिंग (ii) वी मीटर की पूरी वर्णक्रम जुदाई और एसआर सीए 2 फ्लोरोसेंट संकेत इंगित करता है। पूर्व: उत्तेजना, एम। सामान्य छिड़काव और Fluo-5N डाई लोड करने के लिए दोहरे पाश छिड़काव प्रणाली के उत्सर्जन (सी) आरेख (डी) छिड़काव डिश में एक cannulated दिल और ईसीजी इलेक्ट्रोड की छवि।। पैनलों ए और बी वैंग एट अल। 15 से अनुमति के साथ reproduced। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. वी मीटर और एसआर सीए सतत और गैर निरंतर पेसिंग के दौरान 2 + ऑप्टिकल बताते हैं। (ए) प्रतिनिधि वी मीटर और एसआर सीए 2 ऑप्टिकलएल 300 मिसे के एक चक्र की लंबाई पर निरंतर पेसिंग दौरान निशान। सिग्नल (बी) में संकेत अलग-अलग स्थानों से दिखाए जाते हैं। सामान्य उत्तेजना-संकुचन युग्मन के लिए विशिष्ट है के रूप में वी मीटर और एसआर सीए 2 सक्रियण समय के बीच 10 मिसे - ~ 8 की देरी पर ध्यान दें। (बी) के दृश्य की मैपिंग के क्षेत्र के भीतर एक दिल की छवि वी मीटर और एसआर सीए 2। (सी) डायस्टोलिक एसआर सीए 2 भार में परिवर्तन का प्रदर्शन एसआर सीए 2 ऑप्टिकल निशान की और सक्रियण नक्शे (सफेद नोक इलेक्ट्रोड पेसिंग इंगित करता है) और एसआर सीए 2 रिलीज के आयाम दर पेसिंग में अचानक परिवर्तन के बाद। सभी निशान सीएल = 300 मिसे पर पेसिंग के साथ शुरू करते हैं। दर पेसिंग फिर अचानक सीएल = 500 मिसे (मैं), सीएल में बदल जाता है = 400 मिसे (द्वितीय), या सीएल = 250 मिसे (iii)। अब CLs शुरू कर रहे हैं जब (मैं - द्वितीय), एक बड़ा एसआर सीए 2 रिलीज के पहले और डायस्टोलिक एसआर सीए (कारण अब डायस्टोलिक अंतराल और RyRs की वसूली के लिए) होता है2 + भार थोड़ा एक नई स्थिर राज्य (क्षैतिज धराशायी लाइन) के लिए कम हो जाती है। एक छोटी सीएल शुरू की है, हालांकि, एक छोटे एसआर सीए 2 रिलीज आयाम एक नया स्थिर राज्य (क्षैतिज धराशायी लाइन) के लिए और डायस्टोलिक एसआर सीए 2 लोड बढ़ जाती है (कारण RyRs के छोटे डायस्टोलिक अंतराल और अधूरा वसूली के लिए) होता है । एसआर सीए 2 रिलीज आयाम के प्रत्यावर्तन भी सीएल = 250 मिसे पर होता है। एस: छोटे रिहाई आयाम, एल: बड़ी रिलीज आयाम। (सीएल: चक्र लंबाई) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
आधारभूत (बाएं) और निम्न दौरान चित्रा 3. डायस्टोलिक एसआर सीए 2 रिसाव और उसके बाद के उत्प्रेरित गतिविधि। (ए) ईसीजी, वी मीटर, और एसआर सीए 2 निशान100 एनएम isoproterenol (आईएसओ, दाएं) के साथ इलाज। आईएसओ के साथ, महत्वपूर्ण डायस्टोलिक एसआर सीए 2 रिसाव (लाल तीर) मनाया जाता है। एसआर सीए 2 संकेत आयाम से पहले और आईएसओ के बाद सामान्यीकृत कर दिया गया है। चीन आलिंद नोड दोनों ही मामलों में सीएल = 300 मिसे पेसिंग के लिए अनुमति देने के लिए ablated गया था। (बी) एसआर सीए 2 रिसाव काफी बड़ी है, तो यह फोकल गतिविधि (समय से पहले वेंट्रिकुलर परिसरों, PVCs) ट्रिगर हो सकता है। इस उदाहरण में, PVCs सामान्य साइनस लय दखल दे रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

सफल Fluo-5N डाई लोड हो रहा करने के लिए चाबी डाई की बड़ी मात्रा में, लोडिंग समय (1 घंटा) की लंबाई के लिए आवश्यकता के बिना एक उच्च Fluo-5N एकाग्रता के लिए अनुमति देता है जो छोटे मात्रा रीसर्क्युलेटिंग छिड़काव सेटअप कर रहे हैं, और लदान के प्रदर्शन आरटी पर। लोड हो रहा है जल्दी से शारीरिक तापमान, सेलुलर enzymatic गतिविधि cleaves डाई cytosol में डाई अणु फँसाने और उन्हें एसआर झिल्ली को पार करने की इजाजत नहीं, कोशिका झिल्ली को पार करते -AM टैग पर किया जाता है। आरटी पर, तथापि, enzymatic गतिविधि धीमी हो गई है और -AM टैग से पहले कोशिका झिल्ली और एसआर झिल्ली दोनों पार कर सकते हैं डाई के लिए पर्याप्त मात्रा में एसआर में डाई फँसाने, cleaved है।

यहाँ तक कि इष्टतम लोड हो रहा शर्तों के साथ, हालांकि, संकेत आयाम और इस दृष्टिकोण के साथ आंशिक प्रतिदीप्ति परिवर्तन (ΔF / एफ) उच्च आत्मीयता रंगों के साथ वी मीटर की पारंपरिक ऑप्टिकल मानचित्रण और intracellular सीए 2 के साथ की तुलना में कम हो जाएगा। उदाहरण के लिए, एलईडी उत्तेजना प्रकाश, स्थूल उद्देश्यों, बड़े फिल्टर और dichroic दर्पण (5 सेमी एक्स 5 सेमी), और CMOS कैमरा, आंशिक प्रतिदीप्ति परिवर्तन के होते हैं कि यहां इस्तेमाल ऑप्टिकल सेटअप के साथ (ΔF / एफ) 1 के आदेश पर हैं RH237 संकेत 15 के लिए 3% - - Fluo-5N संकेत और 2 के लिए 2%। आंशिक प्रतिदीप्ति, ज़ाहिर है, विशिष्ट ऑप्टिकल विन्यास, प्रकाश स्रोत, और एक विशेष स्थापना के कैमरों पर निर्भर करेगा, लेकिन फिर भी इष्टतम परिस्थितियों में Fluo-5N संकेत आम तौर पर intracellular सीए की रिकॉर्डिंग के लिए मनाया जाता है की तुलना में काफी कम है 2+ उच्च आत्मीयता रंगों के साथ। ग्रीन (545 ​​एनएम) उत्तेजना प्रकाश 18 का इस्तेमाल किया जाता है जब Rhod-2 के लिए 30% - उदाहरण के लिए, एक ही स्थापना पर, ΔF / एफ 20 के आदेश पर है। 5% - हरे रंग उत्तेजना प्रकाश भी RH237 की उत्तेजना शिखर के करीब है, इस प्रकार RH237 के ΔF / एफ 4 चारों ओर, इस मामले में भी बड़ा है। इस प्रकार, उन प्रयोगशालाओं के लिए पहले से ही वी मीटर की दोहरी ऑप्टिकल मानचित्रण प्रदर्शन कर 2 इंट्रासेल्युलर, देखभाल अधिक से अधिक ΔF सुनिश्चित करने के लिए ऑप्टिकल सेटअप के सभी घटकों का अनुकूलन करने के लिए लिया जाना चाहिए / Fluo-5N संकेत के लिए एफ।

इस दृष्टिकोण के साथ, जांचकर्ताओं ठीक एसआर सीए 2 गतिशीलता और मौजूदा दृष्टिकोण के साथ संभव नहीं हैं कि मायनों में वी एम पर इसके प्रभाव की जांच कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, (चित्रा 3 ए के रूप में) एसआर सीए 2 रिसाव की मात्रात्मक मापन और एसआर सीए 2 वसूली (एसआर सीए 2 -ATPase [SERCA] गतिविधि के ताऊ -एक उपाय) की सटीक समय लगातार किया जा सकता है। उच्च आत्मीयता रंगों के साथ 2 + intracellular सीए के ऑप्टिकल मानचित्रण के लिए मौजूदा तरीकों का उपयोग करना, इन मापों (ट्रांसमेम्ब्रेन सीए 2 प्रवाह के साथ 'दूषित' किया जा सकता है अर्थात्।, एल प्रकार से योगदान सीए 2 चैनलों और ना + -CA 2 + एक्सचेंजर)। इसके अलावा, उच्च आत्मीयता सीए 2 संकेतक स्वाभाविक धीमी कश्मीरकम आत्मीयता संकेतक 5 से inetics, इस प्रकार Fluo-5N संकेतों उच्च निष्ठा और वास्तविक सीए 2 परिवर्तन और प्रतिदीप्ति में इसी परिवर्तन के बीच अनिवार्य रूप से कोई समय में देरी के साथ सटीक एसआर सीए 2 की गतिविधियों पर रिपोर्ट करने के लिए उम्मीद कर रहे हैं।

एसआर सीए 2 जारी है और अवरोध arrhythmogenic घटना के लिए जो योगदान से विस्तृत तंत्र की जांच करने की क्षमता इस दृष्टिकोण का एक और फायदा है। उदाहरण के लिए, इस पद्धति का उपयोग कर, हम हाल ही में एसआर सीए 2 रिलीज के दुराग्रह सीए 2 alternans की शुरुआत करने के लिए योगदान देता है और उस ventricular fibrillation के दौरान, एसआर सीए 2 रिलीज लगभग लगातार आग रोक 15 रहता है कि कैसे सूचना दी। इस fibrillation के दौरान एसआर सीए 2 गतिशीलता की पहली रिपोर्ट थी और बरकरार दिल में एसआर सीए 2 इमेजिंग के प्रमुख लाभ पर प्रकाश डाला गया: इस तरह के स्थानिक बेताल alternans और च के रूप में स्थानिक अलग और जटिल घटनाibrillation का अध्ययन किया जा सकता है। दुर्भाग्य से, इस प्रकार की जानकारी fibrillation के लिए संभव नहीं है, या केवल बरकरार दिल 12 पर एक ही स्थान से रिकॉर्ड है कि तरीकों से जहां अलग कक्षों से बटोरा जा नहीं सकते हैं।

इसके अलावा, वी मीटर और बरकरार दिल में मुक्त एसआर सीए 2 के एक साथ ऑप्टिकल मानचित्रण असामान्य सीए का आकलन करने के लिए 2 + दिल की विफलता सहित रोग की स्थिति में निपटने के लिए एक उपन्यास उपकरण प्रदान कर सकता है। एसआर सीए 2 रिलीज, डायस्टोलिक एसआर सीए 2 रिसाव, और सीए एसआर 2 + तेज की सक्रियता और समाप्ति सहित एसआर सीए 2 विनियमन में असामान्यताएं - सीए में सभी प्रमुख कदम 2 + साइक्लिंग और संभावित दिल की विफलता में बदल सब - सीधे अध्ययन किया जा सकता है। इसके अलावा, इस पद्धति में भी इस तरह RYR स्थिरीकरण 19 और SERCA मॉडुलन के रूप में 20 उपन्यास उपचारात्मक उपायों के प्रभाव का आकलन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता है।

2 +] एसआर सांद्रता सटीक प्रतिदीप्ति मूल्यों जांच करने के लिए असमर्थता सहित, तथापि, सीमाओं के बिना नहीं है। दुर्भाग्य से, प्रयोग के दौरान पूरे एसआर से दिल, और तस्वीर विरंजन और डाई रिसाव की घुमावदार सतह के लिए डाई लोड हो रहा है, गैर वर्दी उत्तेजना और उत्सर्जन प्रकाश में परिवर्तनशीलता यह बहुत मुश्किल करने के लिए Fluo-5N संकेतों जांच करने के लिए बना बरकरार दिल में सटीक [सीए 2 +] एसआर। शारीरिक बफर समाधान में पिछला इन विट्रो अध्ययन और permeabilized पृथक myocytes ऐसे calibrations की सूचना दी है और Fluo-5N प्रतिदीप्ति में परिवर्तन में परिवर्तन करने के लिए आनुपातिक हैं संकेत दिया है कि [सीए 2 +] एसआर और प्रतिदीप्ति शारीरिक पर तर करने की उम्मीद नहीं है [सीए 2 +] एसआर स्तरों 11। इस प्रकार, जांचकर्ताओं सीए 2 एमए की विधि का चयन करना चाहिएउनकी विशिष्ट प्रायोगिक उद्देश्यों और शारीरिक जांच के आधार पर pping (कम या उच्च आत्मीयता डाई)।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
NaCl Fisher Scientific S271-1 Component of Tyrode's solution
CaCl2 (2H2O) Fisher Scientific C79-500 Component of Tyrode's solution
KCl Fisher Scientific S217-500 Component of Tyrode's solution
MgCl2 (6H2O) Fisher Scientific M33-500 Component of Tyrode's solution
NaH2PO4 (H2O) Fisher Scientific S369-500 Component of Tyrode's solution
NaHCO3 Fisher Scientific S233-3 Component of Tyrode's solution
D-Glucose Fisher Scientific D16-1 Component of Tyrode's solution
95% O2 5% CO2 AirGas carbogen For oxygenation and pH of Tyrode's solution
Blebbistatin Tocris Bioscience 1760 Excitation-contraction uncoupler
RH237 Biotium 61018 Voltage-sensitive dye
Fluo-5N AM Invitrogen F-26915 Low-affinity Ca2+ indicator; Alternative: Invitrogen F-14204; Loading must be performed at room temperature
Pluronic F127 Biotium 59004 For Ca2+ indicator loading; Warm until the solution is clear before use
Dimethyl sulphoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650 For dissolving blebbistatin and dyes
Filter EMD Millipore NY1104700 11 μm in-line filter
Pressure Transducer WPI BLPR2 For measuring perfusion pressure
Transbridge Transducer Amplifier WPI SYS-TBM4M For transducing/amplifing pressure signal; PowerLab may also be used with appropriate BioAmp
PowerLab 26T ADInstruments For continuous recording of pressure and ECG signals
THT Macroscope SciMedia Macroscopic optical setup. Details: 0.63X objective (NA = 0.31), 2X condensing objective, resultant field of view = 3.1 cm x 3.1 cm, depth of focus = ~ 1.5 mm
MiCam Ultima-L CMOS SciMedia Optical mapping cameras
Precision LED Spot Light Mightex PLS-0470-030-15-S LED light source

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References

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आण्विक जीवविज्ञान अंक 103 ऑप्टिकल मानचित्रण sarcoplasmic जालिका कैल्शियम कैल्शियम के प्रति संवेदनशील डाई वोल्टेज के प्रति संवेदनशील डाई अतालता कार्डियक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी उत्तेजना-संकुचन युग्मन खरगोश
इंट्रा-sarcoplasmic जालिका सीए के ऑप्टिकल मानचित्रण<sup&gt; 2 +</sup&gt; और Langendorff-भरकर रखा खरगोश दिल में transmembrane क्षमता
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Wang, L., De Jesus, N. M.,… More

Wang, L., De Jesus, N. M., Ripplinger, C. M. Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart. J. Vis. Exp. (103), e53166, doi:10.3791/53166 (2015).

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