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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

-16 RRNA जीन अनुक्रमण और MALDI-TOF एमएस द्वारा दुर्लभ बैक्टीरियल रोगज़नक़ों की पहचान

Published: July 11, 2016 doi: 10.3791/53176
Automatic Translation
1, 1, 2, 2
1Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, TU Dresden, 2Institut für Virologie, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, TU Dresden

Abstract

दुर्लभ और इसलिए, अपर्याप्त वर्णित है, बैक्टीरियल रोगज़नक़ों जो विशेष रूप से गंभीर संक्रमण immunocompromised रोगियों में कारण बताया जाता है की एक संख्या हैं। ज्यादातर मामलों केवल कुछ डेटा, ज्यादातर मामले की रिपोर्ट के रूप में प्रकाशित में उपलब्ध है, जो एक संक्रामक एजेंट के रूप में इस तरह के रोगाणुओं की भूमिका की जांच कर रहे हैं। इसलिए, ताकि इस तरह के सूक्ष्मजीवों के रोगजनक चरित्र को स्पष्ट करने के लिए यह आवश्यक महामारी विज्ञान के अध्ययन है जो इन बैक्टीरिया की बड़ी संख्या में शामिल हैं आचरण है। इस तरह के एक निगरानी अध्ययन में इस्तेमाल किया तरीकों निम्नलिखित मानदंडों को पूरा करना होगा: उपभेदों की पहचान, वे नियमित निदान में संभाल करने के लिए आसान (मजबूती), किफायती होना चाहिए वैध नामकरण के अनुसार सटीक हो गया है और वे तुलना उत्पन्न करने के लिए विभिन्न प्रयोगशालाओं के बीच का परिणाम है। आम तौर पर, वहाँ एक नियमित स्थापना में जीवाणु उपभेदों की पहचान करने के लिए तीन रणनीतियों रहे हैं: 1) प्ररूपी biochemica निस्र्पक पहचानबैक्टीरिया के एल और चयापचय गुण, 2) ऐसे -16 rRNA जीन अनुक्रमण और एक उपन्यास proteome आधारित दृष्टिकोण के रूप में 3) मास स्पेक्ट्रोमेट्री के रूप में आणविक तकनीक। चूंकि मास स्पेक्ट्रोमेट्री और आणविक दृष्टिकोण बैक्टीरियल प्रजातियों में से एक बड़ा विभिन्न प्रकार की पहचान करने के लिए सबसे होनहार उपकरण हैं, इन दोनों तरीकों से वर्णित हैं। अग्रिम, सीमाओं और संभावित समस्याओं जब इन तकनीकों का उपयोग कर चर्चा कर रहे हैं।

Introduction

नियमित निदान में दुर्लभ रोगाणुओं की सुरक्षित पहचान तथ्य यह है कि शास्त्रीय सांस्कृतिक और जैव रासायनिक तरीकों बोझिल और कभी कभी संदिग्ध हैं आड़े आती है। इसके अलावा, एक नैदानिक ​​सूक्ष्म जीव विज्ञान प्रयोगशाला रोगाणुओं की एक बड़ी संख्या है, कई हजारों करने के लिए कुछ सौ से लेकर दैनिक, जो स्वचालित प्रणाली के उपयोग की आवश्यकता प्रक्रिया है। एक उच्च दैनिक throughput के प्रबंधन के अलावा, बैक्टीरियल प्रजातियों की सटीक पहचान की जरूरत है। यह warranted है के बाद से वे अपने रोगाणुरोधी संवेदनशीलता पैटर्न में मतभेद है और इसलिए सही पहचान उचित एंटीबायोटिक दवाओं के चयन करने के लिए आवश्यक जानकारी (जैसे, उदर एसपीपी।, Acinetobacter एसपीपी।) 12,43 के साथ चिकित्सक उपलब्ध कराता है।

स्वचालित माइक्रोबियल पहचान प्रणाली (एमिस) बैक्टीरियल आइसोलेट्स के चयापचय गुण को चिह्नित करने एंजाइमी प्रतिक्रियाओं के मानकीकृत सेट लागू है, जैसे, इस अध्ययन के 52 में इस्तेमाल किया एमिस के जीएन कार्ड में 47, केवल बैक्टीरिया की एक सीमित सेट के लिए इस रणनीति का परमिट सुरक्षित पहचान का उपयोग। इसके अलावा, डेटाबेस, एक उन्नत विशेषज्ञ प्रणाली, स्पष्ट रूप से चिकित्सा महत्व 13,15,16,36 के प्रासंगिक है और बहुत ही प्रासंगिक बैक्टीरिया का पता लगाने पर ध्यान केंद्रित किया है। आगे के दो प्रणालियों, व्यापक रूप से प्रयोगशालाओं में प्रयोग किया जाता है, यह भी जीवाणु पहचान के लिए इस जैव रासायनिक दृष्टिकोण लागू होते हैं। हाल के अध्ययनों से इस अध्ययन में इस्तेमाल एमिस और प्रतियोगियों में से एक (93.7% और 93.0% क्रमशः) के बीच एक तुलनीय पहचान सटीकता का प्रदर्शन करते हुए 3 एमिस पर प्रजातियों के स्तर 35 केवल 82.4% की एक पहचान सटीकता है। इस तरह की विसंगतियों अंतर्निहित पहचान डेटा संदर्भ, किट और सॉफ्टवेयर, METABO में मतभेद के संस्करणों की गुणवत्ता से समझाया जा सकता हैlism और तकनीकी कर्मियों 35,36 की प्रवीणता।

दो स्वचालित MALDI-TOF एमएस सिस्टम (MALDI-TOF माइक्रोबियल पहचान प्रणाली, MMIS) मुख्य रूप से इस्तेमाल कर रहे हैं। इन प्रणालियों को उनके प्रोटीन फिंगरप्रिंट जन स्पेक्ट्रा के आधार पर बैक्टीरियल प्रजातियों में से एक बड़ी संख्या का पता लगाने के लिए अनुमति देते हैं। उदाहरण के लिए, प्रयोग किया जाता है MMIS के डेटाबेस 6,000 संदर्भ स्पेक्ट्रा शामिल हैं। पहचान मास स्पेक्ट्रोमेट्री पर आधारित सिस्टम दुर्लभ रोगजनकों 11,48,51 सहित सूक्ष्मजीवों के एक महान विविधता की तेज और विश्वसनीय का पता लगाने की पेशकश करते हैं। तिथि करने के लिए केवल कुछ ही प्रत्यक्ष तुलना इस अध्ययन में इस्तेमाल MMIS और अपने प्रतिद्वंद्वी 19,33 के बीच उपलब्ध हैं। Daek के अनुसार एट अल। दोनों प्रणालियों पहचान सटीकता की एक ऐसी ही उच्च दर प्रदान करते हैं लेकिन इस अध्ययन में इस्तेमाल MMIS प्रजातियों की पहचान 19 में और अधिक विश्वसनीय लगता है।

इसी तरह, आणविक तकनीक अच्छी तरह से संरक्षित लेकिन यह भी संबोधित अलग जीन ( rpoB) एक स्पष्ट प्रजातियों की पहचान 3,22,61 की अनुमति है। इनमें -16 rDNA सभी बैक्टीरिया 34 में अपनी उपस्थिति की वजह से सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल हाउसकीपिंग जीन है। इसका कार्य अपरिवर्तित रहता है और अंत में, मोटे तौर पर 1,500 बीपी के साथ, यह काफी लंबे समय जैव सूचना 14,34 के लिए उपयुक्त हो रहा है। कई शोधकर्ताओं के संबंध में जीवाणु पहचान 21 के लिए 'सोने के मानक' के रूप -16 rRNA जीन विश्लेषण। यह सच है कि कुछ प्रयोगशालाओं दुर्लभ या नए बैक्टीरिया 14,34 की पहचान के लिए तिथि करने के लिए डीएनए डीएनए संकरण तकनीक का उपयोग करने के कारण है। इसके अतिरिक्त, अधिक से अधिक डेटाबेस उपलब्ध है जो -16 rRNA जीन विश्लेषण 50 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, यह है कि 16S rDNA आधार पर पता लगाने प्रणालियों मानक पीसीआर प्रोटोकॉल की तुलना में एक सीमित संवेदनशीलता को ध्यान में रखा जाना है। इसके अलावा, आणविक दृष्टिकोण परिष्कृत, समय लगता है और उच्च प्रशिक्षित कर्मियों के साथ ही आवश्यकता हैसमर्पित प्रयोगशाला सुविधाओं और है, इसलिए आसानी से नियमित निदान 55 में लागू नहीं किया। इसके अलावा, यह दिखाया गया है कि जीवाणु पहचान के कम से कम दो अलग अलग तरीकों का संयोजन बेहद सटीक तनाव पहचान की जाती गया है। MALDI-TOF एमएस और 16S rDNA अनुक्रमण के संयोजन उच्च सटीकता के साथ विभिन्न प्रजातियों के जीवाणु की बड़ी संख्या की पहचान के लिए परमिट। हाल ही में MALDI-TOF एमएस और -16 rRNA जीन विश्लेषण के संयोजन जीवाणु पहचान महामारी विज्ञान के प्रश्न और दुर्लभ रोगजनकों 56 के अध्ययन के लिए प्रस्तुत किया गया था।

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Protocol

1. जीवाणु के डीएनए की निकासी

  1. पीबीएस समाधान की तैयारी
    1. 1.65 छ ना 2 HPO एक फ्लास्क में 4 एक्स 2H 2 हे, 0.22 छ ​​नः 2 पीओ 4 एक्स 2H 2 हे और 8.80 छ NaCl वजन और 1000 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा करने के लिए आसुत जल से भर देते हैं। 7.4 पीएच को समायोजित करें। अंतिम उपयोग के लिए एक बैक्टीरिया प्रूफ (0.22 माइक्रोन) फिल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर।
  2. के डीएनए निष्कर्षण ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया
    1. स्ट्रीक उचित संस्कृति मीडिया (जैसे, कोलंबिया रक्त अगर) पर रोगी सामग्री, की पहचान करने और संभावित रोगजनकों अलग।
    2. शुद्ध संस्कृति को तैयार है और आदेश मोर्फोटाइप का निर्धारण और पवित्रता की पुष्टि के लिए और संस्कृति 49 के लिए ग्राम-धुंधला प्रदर्शन करते हैं।
    3. एक भी जीवाणु कॉलोनी उठाओ और एक 1 μl एकल उपयोग टीका पाश के साथ यह हस्तांतरण एक बाँझ 2.0 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब जो 1 मिलीलीटर पीबीएस समाधान होता है में।
    4. एक Thermomix में इस निलंबन सेते10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर इंजी। ऊष्मायन के बाद, बैक्टीरियल निकालने (भंग डीएनए युक्त) कमरे के तापमान को शांत करते हैं और या तो इसे ° आगे उपयोग (चित्रा 1 ए) के लिए सी -20 में प्रवर्धन या दुकान के लिए सीधे इस्तेमाल करते हैं।
  3. के डीएनए निष्कर्षण ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया
    1. स्ट्रीक उचित संस्कृति मीडिया (जैसे, कोलंबिया रक्त अगर) पर रोगी सामग्री, की पहचान करने और संभावित रोगजनकों अलग। आदेश संस्कृति का मोर्फोटाइप पुष्टि करने के लिए ग्राम-धुंधला प्रदर्शन करना।
    2. शुद्ध संस्कृति को तैयार है और आदेश मोर्फोटाइप निर्धारित करने के लिए और संस्कृति की पवित्रता पुष्टि करने के लिए ग्राम-धुंधला प्रदर्शन करते हैं।
    3. एक बाँझ 1 μl टीका पाश के साथ एक एकल बैक्टीरियल कॉलोनी उठाओ और एक 2.0 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में 500 μl पीबीएस समाधान में यह रोक देते हैं।
    4. 500 μl गिलास मोती जोड़ें और, एक oscillating homogenizer, अधिकतम आवृत्ति और आयाम (50 हर्ट्ज) पर संचालित करने के लिए ट्यूब हस्तांतरण 5 मिनट के लिए। का प्रयोग 1.0 मिमी व्यास का गिलास मोतीबैक्टीरिया कोशिका दीवारों को बाधित करने के लिए।
    5. 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इस ट्यूब सेते हैं और कमरे के तापमान को शांत। पीसीआर प्रतिक्रिया या आगे उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर के लिए निकालने या तो सीधे प्रयोग करें।

2. -16 rDNA पीसीआर

  1. प्रवर्धन प्राइमर की तैयारी
    1. प्राइमरों TPU1 का उपयोग करें (5'-आगा GTT TGA टीसीएम TGG सीटीसी एजी -3 '[एम = ए / सी]) आगे प्राइमर और RTU4 (5'-टीएसी कैग GGT एटीसी TAA टीसीसी टीजीटी टी-3') रिवर्स किताब के रूप में के रूप में 25। , DNase और RNase मुक्त पानी के साथ एक किताब के शेयर समाधान तैयार 100 pmol / μl (100 सुक्ष्ममापी) के एक एकाग्रता होने और 10 pmol / μl पर काम कर रहे एक समाधान के लिए आगे यह पतला। -20 डिग्री सेल्सियस पर प्राइमर शेयर और काम समाधान स्टोर या सीधे का उपयोग करें।
  2. पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण की तैयारी
    1. पिपेट प्रत्येक प्राइमर के 1 μl, 1 μl dNTP मिश्रण (100 मिमी), डीएनए निकालने के 2.5 μl, 5 μl 10x पीसीआर बफर (युक्त 25 मिमी मिलीग्रामसीएल 2), 0.25 Taq-पोलीमर्स μl (5 इकाइयों / μl) और 39.25 μl DNAse- और RNase एक बाँझ 200 μl प्रतिक्रिया ट्यूब में मुक्त पीसीआर पानी।
  3. पीसीआर प्रोटोकॉल
    1. पीसीआर कार्यक्रम बनाया प्रारंभ इस प्रकार है: पहला, 5 मिनट के जो Taq-पोलीमर्स को सक्रिय करने के लिए आवश्यक है के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रारंभिक ऊष्मायन कदम है। दूसरा, 35 प्रवर्धन चक्र, एक 1 मिनट से युक्त। 95 डिग्री सेल्सियस, एक 1 मिनट पर विकृतीकरण कदम है। 50 डिग्री सेल्सियस पर प्राइमर annealing कदम है, और एक 1.5 मिनट 72 डिग्री सेल्सियस पर प्राइमर विस्तार कदम है। तीसरा, 72 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए एक अंतिम विस्तार। अंत में, पीसीआर प्रतिक्रिया 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा किया जाता है।
      नोट: स्ताफ्य्लोकोच्चुस और एच 2 ओ के रूप में सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण की सेवा (चित्रा 1 बी)।
    2. thermocycler में पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण युक्त ट्यूब प्लेस और कार्यक्रम शुरू करते हैं।
  4. पीसीआर उत्पाद के शोधन
    नोट: पीसीआर उत्पाद शुद्ध करने के क्रम में, कई प्रोटोकॉल में या तोएंजाइम आधारित या सिलिका सोखना मैट्रिक्स के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है। एकल कदम पीसीआर सफाई यहां इस्तेमाल दो hydrolytic एंजाइमी प्रतिक्रियाओं का इस्तेमाल करता है। Exonuclease मैं (Exo मैं) एकल असहाय डीएनए को हटा जबकि, झींगा alkaline फॉस्फेट (एसएपी) अनिगमित dNTPs hydrolyses। धोने - - कम नमक क्षालन चक्र दूसरी प्रक्रिया एक उच्च नमक तेजी बंधन के साथ एक सिलिका झिल्ली सोखना तकनीक पर आधारित है।
    1. Exo मैं और एसएपी दोनों युक्त 25 μl पीसीआर उत्पाद के लिए एक enzymatic मिश्रण के 1.5 μl जोड़ें, मिश्रण अच्छी तरह से और 80 डिग्री सेल्सियस पर 37 डिग्री सेल्सियस 15 मिनट के द्वारा पीछा किया पर एक thermocycler पहले 15 मिनट की एक साधारण प्रोटोकॉल को लागू करने के लिए स्थानांतरण। शुद्ध पीसीआर उत्पाद या तो दुकान -20 डिग्री सेल्सियस पर या पीसीआर लेबलिंग के लिए लक्ष्य के रूप में यह सीधे का उपयोग करें।

3. डीएनए agarose जेल वैद्युतकणसंचलन

  1. वैद्युतकणसंचलन बफर (TBE बफर) की तैयारी
    1. Titrate 54.0 ग्राम (445 मिमी) Tris आधार, 27.5 ग्राम (445 मिमी) बोरिक एसिड और एक 0.5 एम EDTA के 20 मिलीलीटर (10मिमी) एक फ्लास्क में NaOH के साथ पीएच 8.0 पर समाधान और 1000 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए आसुत जल के साथ भरें। तब वैद्युतकणसंचलन के लिए आसुत जल (0.5x TBE) के साथ इस 5x बफर 01:10 पतला।
  2. लोड हो रहा है बफर की तैयारी
    1. मिक्स 250 मिलीग्राम bromophenol नीले, 250 मिलीग्राम xylene cyanol एफएफ और एक फ्लास्क में polysucrose (सामग्री तालिका) की 15 ग्राम। तो फिर 100 मिलीलीटर की कुल मात्रा को 0.5x TBE बफर के साथ भरें। आगे उपयोग के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिलीलीटर भागों के लिए लोडिंग डाई और दुकान विभाज्य।
  3. Agarose जेल की कास्टिंग
    1. 6 ग्राम मानक वैद्युतकणसंचलन एक फ्लास्क में 300 मिलीलीटर 0.5x TBE बफर (देखें खंड 3.1.1) के लिए agarose वजन, एक 2% (w / v) agarose जेल तैयार करने के लिए। तब तक agarose पूरी तरह भंग है agarose मिश्रण एक माइक्रोवेव ओवन में पास-उबलते बिंदु डाल दिया, यह गर्मी और समाधान स्पष्ट प्रतीत होता है।
    2. पिघला हुआ agarose पर्याप्त शांत करते हैं और एक 1% के 10 μl जोड़ने (डब्ल्यू / वी) ethidium ब्रोमाइड शेयर समाधानtion। एक डाली में समाधान डालो और कलाकारों में एक जेल कंघी (30 कुओं के लिए अनुमति देता है) जगह है। कंघी निकालें जब जेल पूरी तरह से जम जाता है और वैद्युतकणसंचलन 0.5x TBE बफर युक्त कक्ष में जेल में डाल दिया।
      नोट: ethidium ब्रोमाइड विषाक्त और mutagenic है। इसलिए यह सावधानी के साथ संभाला जाना चाहिए। यह nitrile दस्ताने का उपयोग करने की सलाह दी जाती है। वहाँ वैकल्पिक intercalating न्यूक्लिक एसिड दाग जो एक गैर विषैले विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
  4. पीसीआर उत्पादों की agarose जेल वैद्युतकणसंचलन
    नोट: आदेश पीसीआर amplicons का सही आकार को सत्यापित करने और डीएनए एकाग्रता शुद्ध पीसीआर उत्पाद एक agarose जेल में अलग किया जाता है अनुमान लगाने के लिए।
    1. पिपेट एक पीसीआर प्रतिक्रिया ट्यूब में लोड हो रहा है बफर के 2 μl और पीसीआर उत्पाद के 8 μl जोड़ें। जेल के कुओं में इस मिश्रण पिपेट। पीसीआर उत्पाद के आकार का अनुमान लगाने के लिए एक अलग कुएं में एक आणविक वजन आकार मार्कर (डीएनए सीढ़ी) के 8 μl जोड़ें।
    2. लागू करें10 वी / सेमी में एक निरंतर वोल्टेज और जैसे ही वैद्युतकणसंचलन रोकने के रूप में bromophenol नीले मार्कर जेल की कुल लंबाई की ¾ के बारे में पहुँच गया है। एक यूवी transilluminator (तरंग दैर्ध्य 302 एनएम) का उपयोग कर अलग पीसीआर टुकड़े कल्पना और एक जेल प्रलेखन प्रणाली का उपयोग कर उन्हें दस्तावेज़। डीएनए सीढ़ी के साथ दृश्य तुलना द्वारा डीएनए की मात्रा का अनुमान है। लेबलिंग पीसीआर के लिए लक्ष्य के रूप में लगभग 10 एनजी का प्रयोग करें।

4. सेंगर अनुक्रमण

  1. साइकिल अनुक्रमण पीसीआर
    नोट: एक वाणिज्यिक किट (सामग्री तालिका) का उपयोग कर एक 10 μl प्रतिक्रिया में पीसीआर लेबलिंग प्रदर्शन करना।
    1. 5x प्रतिक्रिया mastermix के 2 μl, डीएनए तैयारी के 2 μl, TPU1 या RTU4 काम समाधान (10 pmol / μl) और DNase के 4.5 μl और RNase मुक्त पानी की 1.5 μl जोड़ें।
    2. thermocycler में इस अनुक्रमण प्रतिक्रिया मिश्रण डाल दिया और एक अन्य पीसीआर चला रहे हैं। कुल में, इस प्रक्रिया को 25 चक्र एक विकृतीकरण कदम से मिलकर (96 डिग्री सेल्सियस,10 सेकंड), एक annealing कदम (45-60 डिग्री सेल्सियस, 5 सेकंड) और एक विस्तार कदम (60 डिग्री सेल्सियस, 2 मिनट)। अंत में, 4 डिग्री सेल्सियस की प्रतिक्रिया शांत।
  2. अनुक्रमण प्रतिक्रिया की शुद्धि
    1. पीसीआर शुद्धि (सामग्री तालिका) के लिए वाणिज्यिक स्पिन स्तंभों का उपयोग लेबलिंग प्रतिक्रिया मिश्रण शुद्ध।
    2. पूर्व हाइड्रेटेड जेल निस्पंदन मैट्रिक्स पर अनुक्रमण प्रतिक्रिया के 10 μl लोड और 3 मिनट के लिए 750 XG पर एक centrifugation कदम प्रदर्शन करते हैं।
      नोट: इस प्रक्रिया असमावेशित डाई Terminators जेल मैट्रिक्स में रखा जाता है का उपयोग करके।
    3. फिर एक शून्य concentrator में जलीय eluate सूखी। 40 डिग्री सेल्सियस पर 20 से 30 मिनट के लिए 2500 XG पर अपकेंद्रित्र सूखापन को पूरा करने के लिए।
    4. जोड़े अत्यधिक विआयनीकृत formamide के 10 μl तो 2 मिनट के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर denature और बर्फ पर मिश्रण को ठंडा। पिपेट एक साथ 96 μl प्लेट पर विकृत नमूने के 10 μl। -20 डिग्री सेल्सियस पर सूखे और साफ पीसीआर उत्पाद की दुकान करता है, तो विश्लेषण हैबाद में बाहर ले जाया गया।
  3. -16 RRNA जीन अनुक्रमण और डीएनए अनुक्रम का विश्लेषण
    नोट: एक स्वचालित sequencer (सामग्री तालिका) पर अनुक्रम विश्लेषण प्रदर्शन। यहां इस्तेमाल sequencer एक स्वचालित प्रतिदीप्ति आधारित केशिका वैद्युतकणसंचलन प्रणाली है कि 4 नमूने एक साथ (50 सेमी 4-केशिका सरणी) एक तरल बहुलक 67 (चित्रा -1 सी) के साथ विश्लेषण करती है।
    1. sequencer में microtiter प्लेट रखें। एक नमूना शीट (प्लेट रिकार्ड) के रूप में 2 में बाहर रखी लिखें, इसे बचाने और अनुक्रमण रन / विश्लेषण 1 में दिए गए चरणों का पालन शुरू करते हैं।
      नोट: एक दृश्य रन की अवधि 2 घंटा है और 800 से 1,000 बीपी के लिए डेटा प्रदान करता है।
    2. अनुक्रमण विश्लेषण सॉफ्टवेयर (सामग्री तालिका) खोलें। अनुक्रम डेटा एक पाठ फ़ाइल (.seq) और गुणवत्ता के मूल्यों (QV) सहित electropherogram युक्त एक फ़ाइल के रूप में दिया जाता है (.ab1)।
      नोट: बेस बुला प्रति स्वचालित रूप से हैअनुक्रमण विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा गठित और अंतर्निहित electropherogram नेत्रहीन जाँच की है (जैसे, शिखर ऊंचाई, शिखर जुदाई) अनुक्रम से पहले आगे अनुप्रयोगों के लिए प्रयोग किया जाता है।
    3. बम विस्फोट एल्गोरिथ्म (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide) एन सी बी आई एन.आर. डेटाबेस का उपयोग करने के लिए संग्रहीत डीएनए अनुक्रम फ़ाइल की तुलना करें।

5. MALDI-TOF एमएस

नोट: मास स्पेक्ट्रोमीटर एक 337 एनएम एन 2 लेजर का उपयोग करता है और एक विशिष्ट नियंत्रण सॉफ्टवेयर (सामग्री तालिका) द्वारा संचालित है। स्पेक्ट्रा रेखीय मोड के बीच 2,000 से 20,000 दा कवर किया जाता है एक बड़े पैमाने पर रेंज में दर्ज हैं। नमूने के लिए डेटा व्याख्या और स्कोर के आवंटन एक विश्लेषण सॉफ्टवेयर (सामग्री तालिका) (चित्रा -1) द्वारा वास्तविक समय में किया जाता है।

  1. MALDI-TOF एमएस विश्लेषण के लिए बैक्टीरिया की तैयारी
    1. कर्नल पर ब्याज की (जैसे, Myroides odoratimimus) बैक्टीरिया बढ़नेumbia रक्त 18 से 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% घोड़े रक्त युक्त, बैक्टीरियल तनाव (चित्रा 2A) के आधार पर अगर। जांच के तहत जीव की मोर्फोटाइप के साथ ही संस्कृति की पवित्रता को सत्यापित करने के लिए ग्राम-धुंधला प्रदर्शन करना।
    2. एक 96 अच्छी तरह से इस्पात लक्ष्य की एक अच्छी तरह से करने के लिए एक भी जीवाणु कॉलोनी स्थानांतरित करने के लिए एक लकड़ी दन्तखुदनी का उपयोग करें (और चित्रा 2 बी 2 सी)। स्पॉट स्टील लक्ष्य पर हवा सूखे जीव के शीर्ष पर 70% फार्मिक एसिड की 1 μl और लगभग 2-3 मिनट के लिए शुष्क करने के लिए छोड़ दें।
    3. फिर, 1 μl मैट्रिक्स समाधान के साथ मौके ओवरले, एक कार्बनिक विलायक (50% acetonitrile, 2.5% trifluoroacetic एसिड, 47.5% एच 2 ओ) में 50 मिलीग्राम / एमएल CHCA (α-cyano-4-hydroxycinnamic एसिड) से युक्त।
      नोट: एसिड ओवरले विधि (प्लेट तैयारी विधि पर) जन स्पेक्ट्रा की गुणवत्ता में सुधार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह दिखाया गया है कि ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया के लिए इस तरह के एक "एसिड हमले" स्कोर VA बढ़ जाती हैमापा स्पेक्ट्रा 45 की लूस।
      नोट: वैकल्पिक रूप से एक स्वचालित नमूना तैयार करने की प्रणाली (सामग्री तालिका) है जिसमें एक पहले सुखाने चक्र के बाद 1 μl 70% फार्मिक एसिड समाधान और, के संपर्क मुक्त धब्बे, 1 μl मैट्रिक्स समाधान बैक्टीरियल धब्बा पर लागू कर रहे हैं इस्तेमाल किया जा सकता है। नमूने तो 60% सापेक्ष आर्द्रता में मानकीकृत की शर्तों के तहत सूखे और विश्लेषण के लिए उपयोग करने के लिए तैयार कर रहे हैं।
    4. मैट्रिक्स के साथ धब्बा एक डाकू के बारे में 5 मिनट के लिए फिर से हवा शुष्क मढ़ा करते हैं। मैट्रिक्स आवेदन के साथ यह जीवाणु धब्बा अब कई घंटे के लिए स्थिर है।
      ध्यान दें: मैट्रिक्स के बिना बैक्टीरियल स्मीयर प्रोटीन गिरावट के कारण स्थिर नहीं हो सकता है।
  2. MALDI-TOF एमएस विश्लेषण प्रदर्शन
    1. नमूने का परिचय
      1. हमारे MMIS (सामग्री तालिका) का नियंत्रण सॉफ्टवेयर खोलें।
      2. यंत्र की / बाहर बटन दबाकर मास स्पेक्ट्रोमीटर का नमूना लोड हो रहा है बंदरगाह Aerate।
      3. एक क्लिक के बाद लोडिंग बंदरगाह खोलने और सूखे बैक्टीरियल धब्बा प्लस मैट्रिक्स के साथ MALDI-TOF एमएस लक्ष्य थाली डालें।
      4. पोर्ट बंद करें और पुन खाली। वैक्यूम का निरीक्षण करें और जब यह पहुंचता है 4.5 x 10 -6 मिलीबार माप शुरू करते हैं।
    2. नमूना विश्लेषण
      1. हमारे MMIS (सामग्री तालिका) का विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें और "फाइल" मेनू क्लिक करें। खोलता चुनें "नया वर्गीकरण" और एक नई विंडो "MALDI biotyper वास्तविक समय वर्गीकरण जादूगर"। परियोजना का नाम टाइप करें, उदाहरण के लिए "Myroides माप project_1, क्षेत्र में" परियोजना का नाम "और बटन दबाएँ" नया "। नामित नया संवाद बॉक्स के तहत" नई परियोजना "की जांच परियोजना का नाम और बटन दबाने से आगे बढ़ना" ठीक है "।
      2. "MALDI biotyper वास्तविक समय वर्गीकरण जादूगर" में "analyte प्लेसमेंट" खिड़की खुली निरीक्षण करते हैं। चयन लक्ष्य पदों (जैसे, A1, A2, A3 ...), राइट-सीएलआईसीके किसी भी चयनित स्थिति (एक नीले वर्ग ने संकेत दिया) और चुनें "नमूने जोड़ें"। नमूना नाम, नमूना आईडी और वैकल्पिक रूप से एक टिप्पणी में स्वचालित रूप से खोला तालिका दृश्य प्रकार में। आगे बढ़ने के लिए बटन "अगला" क्लिक करें।
      3. "MALDI biotyper वास्तविक समय वर्गीकरण जादूगर" में "MALDI का चयन biotyper तरीकों" खिड़की खुली निरीक्षण करते हैं। से "Bruker वर्गीकरण" "वर्गीकरण पेड़ से एमएसपी" का चयन करें और जारी रखने के लिए "अगला" क्लिक करें।
      4. "MALDI biotyper वास्तविक समय वर्गीकरण जादूगर" में "प्रोजेक्ट सारांश" खिड़की खुली निरीक्षण करते हैं। वास्तविक वर्गीकरण परियोजना के लिए ऊपर दिए गए डाला प्रविष्टियों की जाँच करें। वर्गीकरण चलाने प्रारंभ बटन "समाप्त" दबाने से (चित्रा 2 डी - एफ)। जब उचित वैक्यूम तक पहुँच जाता है मापन स्वचालित रूप से शुरू होता है।
      5. जब तक माप सफलतापूर्वक पूरा हो गया है वर्गीकरण रन का पालन करें। टी में परिणाम तालिका देखेंउन्होंने कहा, "MALDI Biotyper रीयलटाइम वर्गीकरण परियोजना Myroides माप project_1" मेनू "देखें" खोलने के लिए और क्लिक करें "परिणाम"।
      6. दृश्य को डिफ़ॉल्ट वेब ब्राउज़र में HTML फ़ाइल के रूप में "Bruker Daltonics MALDI Biotyper वर्गीकरण परिणाम"। प्रिंट और परिणाम को बचाने के।
    3. एक परीक्षण मानक दैनिक प्रायर को मापने के विश्लेषण के नमूने के लिए साधन जांचना और साधन सत्यापन साप्ताहिक (साधन आत्म परीक्षण) प्रदर्शन करने के लिए।
      नोट: माप MALDI-TOF स्पेक्ट्रा के दौरान विश्लेषण सॉफ्टवेयर (सामग्री तालिका) द्वारा वास्तविक समय में विश्लेषण कर रहे हैं। उनके संबंधित स्कोर के साथ दस प्रजातियों में से एक सूची दी है और रिपोर्टिंग के लिए प्रयोगशाला सूचना प्रणाली (एलआईएस) में खिलाया है।
    4. समीक्षकों का मूल्यांकन MALDI-TOF एमएस परिणाम (प्रतिनिधि परिणाम देखें) और, यदि उपयुक्त हो, इस तरह के biochemical- और एंटीबायोटिक संवेदनशीलता प्रोफाइल या -16 rRNA जीन अनुक्रमण और, यदि आवश्यक, ग्राम-धुंधला के रूप में अन्य परीक्षणों में शामिलसूक्ष्मजीवविज्ञानी को एक बैक्टीरियल प्रजातियों बताए।

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Representative Results

MALDI-TOF एमएस एक उपन्यास, सूक्ष्मजीवविज्ञानी दिनचर्या निदान के लिए तेजी से और सस्ता तरीका है। MALDI-TOF एमएस द्वारा बैक्टीरियल प्रजातियों की पहचान मुख्य रूप से ribosomal प्रोटीन बल्कि अन्य "घर कीपिंग कार्यों पर्यावरण की स्थिति से एक न्यूनतम हद तक प्रभावित के साथ बहुत संरक्षित प्रोटीन 'की रचना की स्पेक्ट्रा का उत्पादन इस MMIS 17 व्याप्ति डेटाबेस संदर्भ स्पेक्ट्रा का एक बड़ा सेट शामिल और यहां तक कि बैक्टीरिया है जो शायद ही कभी नैदानिक ​​वियोजन में पाए जाते हैं सुरक्षित रूप से 7,56,57 पहचाना जा सकता है। स्कोर मूल्यों की पहचान की प्रजातियों की विश्वसनीयता दिखा। 2.300 ऊपर स्कोर एक बहुत संभव प्रजातियों की पहचान का प्रतिनिधित्व करते हैं, 2.000 और 2.300 के बीच एक अंक के लिए एक सुरक्षित प्रजातियों की पहचान को इंगित करता है, एक संभावित प्रजातियों की पहचान के लिए 1.700 और 2.000 के बीच खड़ा एक अंक और 1.700 के नीचे एक स्कोर गैर-विश्वसनीय है। एक से अधिक प्रजातियों के मामले में 2.000, अतिरिक्त टीईएस ऊपर स्कोर के साथ पहचान की जा रहीटीएस लागू किया जा रहा है और यही कारण है कि हम इस तरह के ग्राम दाग, गतिशीलता आदि मामले में के रूप में ऐसी -16 rDNA अनुक्रमण, एपीआई के रूप में विभिन्न तरीके और तकनीक बैक्टीरियल morpho- और / या phenotype को संबोधित कर रहे संयुक्त है जहां स्कोर नीचे है 1.700 ऊपर उल्लेख किया परीक्षण विश्वसनीय प्रजातियों की पहचान को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जाना है। MALDI-TOF एमएस और 16S rDNA अनुक्रमण का एक संयोजन हाल ही में 56-58 प्रदर्शित किया गया है। ऐसा नहीं है कि प्रजातियों निर्धारण के लिए स्पष्ट दिशा निर्देश -16 rDNA अनुक्रम homologies के आधार पर अभी भी 22,61 कमी कर रहे हैं बाहर की ओर इशारा किया जाना चाहिए। व्यावहारिक व्याख्या के लिए, ≥97% की homologies, के रूप में Stackebrandt और Gobel 61 द्वारा प्रस्तावित 56 उपयोग किया जाता है। डीएनए अनुक्रमण के क्षेत्र में अग्रिम उनके जीनोम अनुक्रम के आधार पर बैक्टीरिया के सिद्धांत पहचान में, अपेक्षाकृत कम लागत पर अगली पीढ़ी की तकनीक द्वारा पूरे बैक्टीरियल जीनोम के निर्धारण की अनुमति है और, इसलिए। इस तकनीक में पहले से ही इस्तेमाल किया गया हैजीनोम आधारित प्रकोप प्रबंधन या महामारी विज्ञान 9,29 में। हालांकि, सबसे मजबूत सीमा आज अंत उपयोगकर्ता 65 के लिए सॉफ्टवेयर संकुल का उपयोग करने के लिए आसान की कमी है।

दुर्लभ होने वाली बैक्टीरिया के सात उदाहरण, दिनचर्या निदान के दौरान मरीज ​​के नमूने से अलग है और दोनों MALDI-TOF एमएस और -16 rRNA जीन अनुक्रमण द्वारा विश्लेषण तालिका में सूचीबद्ध हैं 1। # 6 # 1 तनाव के MALDI-TOF स्पेक्ट्रा 3 चित्र में दिखाया जाता है और तनाव # 7, Sphingobacterium spiritivorum, की एक स्पेक्ट्रम चित्रा 1e में दिखाया गया है। सभी वियोजन MALDI-TOF एमएस विश्लेषण में उच्च अंक और 99 से 100% -16 rDNA अनुक्रम homologies दिखा। इस प्रकार, दोनों तकनीकों को सुरक्षित करने के जीनस और प्रजातियों की पहचान का नेतृत्व। हालांकि, के रूप Myroides सपा की पहचान तरीकों की तुलना पर हाल ही में एक प्रकाशन में बताया।, MALDI-TOF एमएस और -16 rRNA जीन अनुक्रमण के संयोजन और अधिक विश्वसनीय आर करने के लिए नेतृत्वesults 56। ये आंकड़े यह दर्शाते हैं कि एक भी इस्तेमाल किया विधि हमेशा के लिए एक विश्वसनीय पहचान परिणाम प्राप्त करने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता। दो स्वतंत्र विधियों के संयोजन के लिए एक उच्च सटीकता की ओर जाता है और साथ में घर में प्रविष्टियों को एक स्पष्ट प्रजातियों की पहचान 56 में हुई वाणिज्यिक MALDI-TOF एमएस डेटाबेस फैलता है।

तनाव # 1 Chryseobacterium gleum के रूप में पहचान की गई थी (MALDI-TOF एमएस 2.490, अनुक्रम अनुरूपता 99% अंक)। Chryseobacteria ग्राम नकारात्मक, गैर fermenting छड़ और Myroides एसपीपी। Chryseobacterium एसपीपी करने के लिए संबंधित हैं। उभरते रोगजनकों, सेप्टिसीमिया, निमोनिया और मूत्र मार्ग में संक्रमण के साथ जुड़े के रूप में माना जाता है। जीनस Chryseobacterium प्रजातियों में से एक बड़ी संख्या में शामिल हैं और सबसे अच्छा अध्ययन प्रजातियों Chryseobacterium indologenes है। Myroides सपा की वजह से संक्रमण के समान।, ज्यादातर immunocompromised रोगियों प्रभावित कर रहे हैं6,10,60। तनाव # 2 Myroides odoratimimus के रूप में पहचान की गई थी (MALDI-TOF एमएस स्कोर 2.436, अनुक्रम अनुरूपता 99%) और # 3 तनाव Myroides odoratus के रूप में (MALDI-TOF एमएस 2.237, अनुक्रम अनुरूपता 99% अंक) Myroides सपा। ग्राम नकारात्मक, nonfermenting छड़ जो इस प्रकार की पूति, cellulitis या निमोनिया के रूप में गंभीर रोगों के साथ जुड़े रहे हैं। ज्यादातर अंतर्निहित hematologic या Oncologic रोगों के साथ रोगियों immunocompromised 8,18,42 प्रभावित कर रहे हैं। तनाव # 4 Sphingobacterium multivorum 32,71 के रूप में पहचान की गई थी (MALDI-TOF एमएस स्कोर 2.092, अनुक्रम अनुरूपता 99%)।

बैक्टीरिया ग्राम नकारात्मक गैर fermenting छड़, जो immunocompromised रोगियों 5,24,44,53 में सेप्टीसीमिया का कारण बन सकता है। इसके अलावा, घातक meningoencephalitis के एक मामले में 70 सूचित किया गया है। दाग # 5 (MALDI-TOF एमएस स्कोर 2.282, अनुक्रम अनुरूपता 100%) और # 6 (MALDI-TOF एमएस स्कोर 2.289, अनुक्रम HomologY 100%) Wohlfahrtiimonas chitiniclastica के रूप में पहचान की गई। ये जीवाणु कम, गैर गतिशील, ग्राम नकारात्मक छड़ जो पहले परजीवी मक्खी Wohlfahrtia magnifica के लार्वा से अलग और 2008 में वर्णित किया गया हैं 66। ये जूनोटिक बैक्टीरिया उभरते रोगजनकों के रूप में माना जाता है और bacteremia, सेप्टीसीमिया या नरम ऊतक संक्रमण 4,40,64 के लिए प्रेरणा का एजेंट। दिलचस्प है, अधिकांश रोगियों को सूचना दी तो बेघर और / या शराब से नुकसान उठाना पड़ा है और इसलिए, इन दुर्लभ रोगाणुओं की घटना बेघर जनसंख्या 4,54 में ectoparasites की उच्च दर से समझाया जा सकता है थे। तनाव # 7, Sphingobacterium spiritivorum (MALDI-TOF एमएस स्कोर 2.269, अनुक्रम अनुरूपता 100%), एक दुर्लभ रोगज़नक़ है। यह कारण हो सकता immunocompromised रोगियों और पहले मानव में संक्रमण वियोजन 1982 31,71 में वर्णित किया गया। एक ताजा रिपोर्ट में बीएसी की एक घातक मामले के लिए Sphingobacterium spiritivorum के रूप में प्रेरणा का एजेंट को पहचानतीTeremia और तीव्र myeloid लेकिमिया 38 के साथ एक रोगी में पूति।

आकृति 1
चित्रा 1:। न्यूक्लिक एसिड और / या चिकित्सा सूक्ष्म जीव विज्ञान प्रयोगशाला में चिकित्सकीय प्रासंगिक बैक्टीरिया का मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधार पर पता लगाने के लिए कार्यप्रवाह एक शुद्ध संस्कृति से शुरू (एक), डीएनए को निशाना thermocycler में परिलक्षित होता है (ख)। पीसीआर amplicons सेंगर प्रौद्योगिकी (ग) का उपयोग कर एक चार केशिका sequencer में अनुक्रम कर रहे हैं। अनुक्रमण परिणाम कंप्यूटर सहायता तुलना द्वारा डेटाबेस प्रविष्टियों के लिए क्वेरी दृश्यों का प्रतिशत homologies के रूप में निर्धारित कर रहे हैं। एक दूसरा, प्रोटिओमिक्स आधारित पद्धति, मास स्पेक्ट्रोमेट्री (डी) और तालिका 1 में # 1 तनाव का एक जन स्पेक्ट्रोस्कोपी परिणाम केंद्र में, अपने MALDI-TOF एमएस स्कोर सहित Sphingobacterium spiritivorum, दिया जाता है (ई <का उपयोग करता है/ Strong>)। मास स्पेक्ट्रोमेट्री और -16 rRNA जीन अनुक्रमण का एक संयोजन के लिए आवश्यक हो सकता है। क्रम में एक और अधिक विश्वसनीय और सटीक प्रजातियों की पहचान प्राप्त करने के लिए, यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। विश्लेषण प्रक्रिया चिकित्सकीय प्रासंगिक बैक्टीरिया की पहचान के लिए MALDI-TOF एमएस का उपयोग कर एक ऑपरेटर पूरे सेल बैक्टीरियल सामग्री ले जाता है (एक) एक शुद्ध संस्कृति से एक दंर्तखोदनी के साथ (ख) और एक इस्पात लक्ष्य (ग) पर बैक्टीरियल स्मीयर देता है। इस्पात लक्ष्य मास स्पेक्ट्रोमीटर की लोडिंग बंदरगाह में डाला जाता है। जब 5 एक्स 10 -6 मिलीबार के समुचित वैक्यूम तक पहुँच जाता है, लक्ष्य आयनीकरण कक्ष में ले जाया जाएगा। एक एन 2 -lase का प्रयोगआर, आयनों मुलायम desorption जो तब एक electrostatic क्षेत्र (घ) में त्वरित हैं और उड़ान ट्यूब (ई) में अलग से बनाई गई हैं। उड़ान (TOF) के समय आयनों के लिए आवश्यक उड़ान ट्यूब (च) सीधे उनके द्रव्यमान से संबंधित है डिटेक्टर तक पहुँचने और बड़े पैमाने पर चोटियों के बाद की गणना के आधार बनाता है। विशिष्ट पहचान सॉफ्टवेयर (सामग्री तालिका) तो स्कोर मूल्यों आयनित बैक्टीरियल प्रोटीन का जन स्पेक्ट्रम फिंगरप्रिंट को प्रदान करती है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: दुर्लभ रोगाणुओं की MALDI-TOF स्पेक्ट्रा और सौंपा स्कोर इस चित्र में, पहले छह दुर्लभ रोगजनकों फूल के प्रतिनिधि MALDI-TOF स्पेक्ट्रा।तालिका 1 में टेड दिखाए जाते हैं। प्रजाति का नाम है और इसी MALDI-TOF एमएस स्कोर प्रत्येक स्पेक्ट्रम में उल्लेख किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

# 3
तनाव MALDI पहचान MALDI स्कोर -16 RDNA परिणाम बम विस्फोट अनुरूपता
# 1 Chryseobacterium gleum 2.211 Chryseobacterium gleum 99% पहचान
# 2 Myroides odoratimimus 2.397 Myroides odoratimimus 99% पहचान
Myroides odoratus 2.237 Myroides odoratus 99% पहचान
# 4 Sphingobacterium multivorum 2.093 Sphingobacterium multivorum 99% पहचान
# 5 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 2.282 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 100% पहचान
# 6 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 2.289 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 100% पहचान
# 7 Sphingobacterium spiritivorum 2.269 Sphingobacterium spiritivorum

तालिका 1: -16 rRNA जीन अनुक्रमण की तुलना में दुर्लभ होने वाली बैक्टीरिया के प्रतिनिधि MALDI-TOFs का परिणाम है।

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Discussion

दोनों MALDI-TOF एमएस और -16 rRNA जीन अनुक्रमण अलग बैक्टीरिया की बड़ी संख्या की पहचान करने की संभावना प्रदान करते हैं। MALDI-TOF एमएस एक तेजी से और सस्ती विधि है, जो संभाल करने और बैक्टीरियल जन स्पेक्ट्रा के बड़े डेटाबेस उपलब्ध हैं आसान है। इस कारण से, MALDI-TOF एमएस दुर्लभ बैक्टीरियल रोगज़नक़ों 17,20,39,51 पर ध्यान केंद्रित स्क्रीनिंग अध्ययन का संचालन करने के लिए एक तेजी से, लागत प्रभावी और विश्वसनीय तरीका है। अन्य प्ररूपी पहचान तरीकों, सेंग एट अल। प्रदर्शन लागत प्रभावशीलता और MALDI-TOF एमएस 59 और टैन की गति के साथ MALDI-TOF एमएस की तुलना में एक भावी अध्ययन में एट अल। उनकी प्रयोगशाला स्थापित करने में बैक्टीरिया की पहचान के लिए अभिकर्मक और श्रम लागत की कमी की सूचना दी 56.9% सालाना 62 से। इस तरह की लागत में कटौती Gaillot एट अल के एक नोट के द्वारा समर्थित हैं। 28

दूसरी ओर, 16S rDNA अनुक्रमण अधिक समय लगता है, श्रमसाध्य है और वारंट विशेष पीविश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए 34 ersonnel। फिर भी, दोनों तरीकों दिनचर्या निदान के लिए उपयुक्त हैं और यह प्रदर्शन किया जा सकता है कि इन दोनों विधियों के संयोजन के लिए एक उच्च विश्वसनीयता और अधिक सुरक्षित पहचान सटीकता, जो संदिग्ध परिणाम 56 के मामले में विशेष रूप से लाभप्रद है की ओर जाता है। इसलिए, हम सबसे अच्छा तरीका के रूप में दोनों विधियों के संयोजन का प्रस्ताव दिनचर्या निदान में दुर्लभ होने वाली जीवाणुओं की पहचान सत्यापित करने के लिए। विश्वसनीय प्रजातियों की पहचान के लिए, यह पूरी तरह से शुद्ध बैक्टीरियल संस्कृतियों का उपयोग करें क्योंकि मिश्रित संस्कृतियों प्रजातियों दृढ़ संकल्प को रोकने के लिए जरूरी है। एक दिखावट चेक के रूप में, प्रजातियों की पहचान या तो MALDI TOF एमएस या -16 rDNA अनुक्रमण के साथ प्राप्त की ग्राम धुंधला, जैव रासायनिक लक्षण और नैदानिक ​​प्रस्तुति 49 से परिणाम के अनुसार किया गया है।

बैक्टीरियल पहचान के लिए एक विश्लेषणात्मक उपकरण के रूप में मास स्पेक्ट्रोमेट्री पहली बार 1975 में प्रस्तावित किया गया था51। हालांकि, यह 1980 के अंत तक ले लिया प्रोटीन विश्लेषण के लिए एक व्यावहारिक दृष्टिकोण स्थापित करने के लिए। "मुलायम desorption आयनीकरण" प्रौद्योगिकी 1985 में 63, 2002 में रसायन शास्त्र के लिए नोबेल पुरस्कार प्राप्त करने में कोइची तनाका द्वारा पेश किया गया था, अक्षत प्रोटीन का विश्लेषण की इजाजत दी। एक ही समय में मैट्रिक्स की मदद से उड़ान मास स्पेक्ट्रोमेट्री के आयनीकरण समय Hillenkamp और Karas द्वारा पेश किया गया था के रूप में वे पहले biomolecules 37 विश्लेषण करने के लिए एक कार्बनिक अम्ल का उपयोग किया गया है और इस विधि जो आज भी प्रयोग किया जाता है। हालांकि MALDI प्रौद्योगिकी कई मायनों 23,30,41 इस्तेमाल किया गया है, यह 2004 में जब Bruker Daltonics अपनी MICROFLEX MALDI Biotyper प्रणाली (Pittcon सम्मेलन और प्रदर्शनी, 2004, प्रेस विज्ञप्ति), शुरू की है कि MALDI-TOF एमएस आधारित माइक्रोबियल पहचान एक दिनचर्या बन गया जब तक ले लिया नैदानिक ​​तकनीक 46। MALDI-TOF एमएस तकनीक में हाल के दृष्टिकोण खमीर की पहचान करने के लिए, multiresistant बैक्टीरिया का पता लगाने का अवसर दियाऔर रोगाणुरोधी संवेदनशीलता परीक्षण 17,51 प्रदर्शन करते हैं। इसके अलावा, कुछ प्रक्रियाओं संभावना सीधे इस तरह के मूत्र या रक्त संस्कृतियों 17,51 के रूप में प्राथमिक नमूने, बैक्टीरिया से विश्लेषण करने के लिए प्रदान करते हैं।

हालांकि इस प्रणाली का उपयोग मुख्य रूप से आसान है, वहाँ कुछ नुकसान है, जो परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं। उदाहरण के लिए सूक्ष्मजीवों की उम्र बैक्टीरियल प्रोटीन अभिव्यक्ति और इसलिए परिणाम के reproducibility प्रभावित करता है। सबसे पहले, विकास की स्थिति एक समस्या हो सकती है। एक उदाहरण के रूप में, इस तरह के कोलाई के रूप में enterobacteria गैर fermenting बैक्टीरिया की तुलना में तेजी से बढ़ने (जैसे, स्यूडोमोनास aeruginos क) और फलस्वरूप पहले 17 विश्लेषण किया जाना है। दूसरा, MALDI-TOF एमएस के लिए इस्तेमाल किया मैट्रिक्स छोटे कार्बनिक अम्ल अणुओं लेजर इस्तेमाल की तरंग दैर्ध्य के लिए एक मजबूत लेजर ऑप्टिकल अवशोषण है कि के होते हैं। विश्लेषण करने से पहले मैट्रिक्स नमूना करने के लिए जोड़ा जाता है और दोनों घटकों एक crystallizatio गुजरनाn प्रक्रिया एक ठोस समाधान के गठन।

इस वजह मैट्रिक्स में परिवर्तन जीवाणु पहचान 17 की सटीकता को प्रभावित कर सकता है। इसलिए, हौसले से मैट्रिक्स समाधान, नहीं 7 दिनों से पुराने तैयार, इस्तेमाल किया जाना चाहिए। तीसरा, मध्यम बैक्टीरिया की पहचान को प्रभावित कर सकते उठाया जाता है जिसमें से 17,68 परिणाम है। उदाहरण के लिए, क्रिस्टल बैंगनी, जो MacConkey अगर की एक घटक है, जन स्पेक्ट्रा 17 के साथ हस्तक्षेप। इसके अतिरिक्त भी कई बैक्टीरिया स्टील लक्ष्य पर लागू कम स्कोर को बढ़ावा मिलेगा और इसलिए पहचान शुद्धता को प्रभावित। इसलिए, यह कैसे एक विश्लेषण किया जाता है के रूप में स्पष्ट मानदंड को परिभाषित करने की सलाह दी जाती है। हालांकि, MALDI-TOF एमएस द्वारा किया जाता भ्रामक परिणाम ज्यादातर डेटाबेस में निहित अपर्याप्त संदर्भ स्पेक्ट्रा के कारण होता है। (वर्तमान में डेटा बेस> 6000 प्रविष्टियों में शामिल है।) यह विशेष रूप से अभी भी अवायवीय जीवाणु 17 की पहचान के लिए मामला है। हालांकि, एकdditional स्पेक्ट्रा उपयोगकर्ता द्वारा जोड़ा जा सकता है। उदाहरण के लिए MALDI-TOF एमएस पुस्तकालय ऐसे माइकोप्लाज्मा सपा के रूप में वियोजन जो पर्याप्त रूप से मूल डेटाबेस से संबोधित नहीं कर रहे हैं, के 98 अतिरिक्त संदर्भ स्पेक्ट्रा में शामिल है।, Myroides सपा।, लीजोनेला सपा।, Roseomonas सपा।, Comamonas सपा। और Chryseobacterium सपा। नतीजतन, अतिरिक्त संदर्भ स्पेक्ट्रा एक उच्च सटीकता पहचान 59,69 को बढ़ावा मिलेगा। अंत में, कुछ मामलों में विभिन्न प्रजातियों के स्पेक्ट्रा बहुत समान हैं। इस तरह के कोलाई और शिगेला एसपीपी के रूप में भेदभाव के मामलों में गलत पहचान करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। या स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया और स्ट्रेप्टोकोकस 17,51 Mitis।

-16 RDNA और इस तरह के रूप में अतिरिक्त rpoB जीन का अनुक्रमण दुर्लभ या अज्ञात बैक्टीरिया की आणविक पहचान सरल है। इन जीनों सबसे बैक्टीरिया में आम हैं और अपने व्यक्तिगत कार्य हैसमान। हालांकि, बाद से वे काफी आनुवंशिक परिवर्तनशीलता परिणाम है जो जीनस और प्रजातियों के स्तर पर एक भेदभाव की अनुमति का उत्पादन करने के अधिकारी हैं, वे जीवाणु पहचान 34 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। Stackebrandt और Gobel के अनुसार, homologies <97% विभिन्न प्रजातियों के 61 प्रतिनिधित्व करते हैं। हालांकि, homologies> 97% जरूरी एक सुरक्षित प्रजातियों की पहचान करने के लिए 34,47 नेतृत्व नहीं है। इन अनिश्चितताओं कई वजहें हैं।

डेटाबेस जो homologies गणना करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं की गुणवत्ता में कभी कभी संदिग्ध 34 है। मामलों में जहां -16 rDNA स्तर पर उच्च homologies मौजूद है, अनिश्चितताओं प्रजातियों की पहचान हो सकता है। विभिन्न आनुवंशिक क्षेत्रों का एक संयोजन इसलिए अधिक सुरक्षित परिणामों को जन्म दे सकता है। इसके अलावा, वहाँ -16 rDNA अनुक्रमण डेटा 22,34,61 की व्याख्या के लिए कोई सामान्य दिशा निर्देश हैं। हालांकि, मौजूदा डेटाबेस की विश्वसनीयता को बढ़ाने के लिए एक उच्च ACCU को बढ़ावा मिलेगाजीवाणु पहचान इस आणविक दृष्टिकोण 34 उपयोग करने के लिए कास। अनुक्रमण प्रतिक्रिया हम उस अनुक्रमण परिणामों की सटीकता ज्यादातर अंतर्निहित पीसीआर की गुणवत्ता पर निर्भर करता है उल्लेख करने की जरूरत के बारे में। इसके अलावा, के बाद से परिणाम उन्हें प्रविष्टियों सार्वजनिक डेटाबेस में सूचीबद्ध करने के लिए की तुलना द्वारा प्राप्त की जा रही हैं, अनुक्रम प्रविष्टियों और डेटा के रखरखाव की गुणवत्ता में महत्वपूर्ण महत्व का है।

सामान्य में, हालांकि दोनों दृष्टिकोण, MALDI-TOF एमएस और -16 rRNA जीन अनुक्रमण, फायदे हैं वे भी कमजोरी है। दोनों विधियों के संयोजन, तथापि, बैक्टीरियल पहचान के लिए एक उच्च सटीकता के लिए होता है। उदाहरण के लिए, पिछले एक अध्ययन में हम प्रदर्शन कर सकता है कि MALDI-TOF एमएस Myroides odoratimimus और Myroides odoratus 56 के बीच भेद करने में सक्षम है। कुछ मामलों में MALDI स्कोर, अविश्वसनीय प्रजातियों की पहचान का सुझाव दिया है, जबकि परिणाम -16 rDNA अनुक्रमण के द्वारा प्राप्त की प्रजातियों की पुष्टि कर सकतापहचान। इन वियोजन के मास वर्णक्रमीय उंगलियों के निशान तो बनाया है और हमारे MALDI संदर्भ स्पेक्ट्रा डेटाबेस में पेश किए गए। भविष्य के अनुसंधान अन्य दुर्लभ बैक्टीरिया पर ध्यान केंद्रित प्रस्तावित रणनीति की प्रयोज्यता प्रदर्शन कर सकते हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
CHROMASOLV, HPLC grade water, 1 L Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany 270733
Tissue Lyser LT Qiagen, Hilden, Germany 85600 Oscillating homogenizer
Glass-beads 1.0 mm VWR International, Darmstadt, Germany 412-2917
Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg, Germany 2050-100-05
QIAamp DNA Mini Kit (250) Qiagen, Hilden, Germany 51306
Taq PCR Core Kit (1,000 U) Qiagen, Hilden, Germany 201225
Forward Primer TPU1 (5´-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’) biomers.net, Ulm, Germany  -
Reverse Primer RTU4 (5´-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3´) biomers.net, Ulm, Germany  -
Mastercycler  Eppendorf, Hamburg, Germany -  Thermocylcer
Reaction tube 1.5 ml SARSTEDT, Nümbrecht, Germany 72,692
Reaction tube 2 ml SARSTEDT, Nümbrecht, Germany 72,693,005
PCR 8er-CapStrips Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 711040X
PCR 8er-SoftStrips Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 711030X
Sharp R-ZV11  Sharp Electronics, Hamburg, Germany - Microwave
Titriplex III (EDTA Na2-salt dehydrate; 1 kg) Merck, Darmstadt, Germany 1084211000
SeaKem LE Agarose Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 849006
SmartLadder SF - 100 to 1,000 bp Eurogentec, Lüttich, Belgium MW-1800-04
Bromophenol blue (25 g) Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany B0126
Xylene cyanol FF (10 g) Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany X4126
ComPhor L Maxi  Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany -
Ethidium bromide solution 1% (10 ml) Carl Roth, Karlsruhe, Germany 2218.1
Gel Doc 2000 Bio-Rad Laboratories, München, Germany - Gel-documentation system 
ExoSAP-IT (500 reactions) Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, United Kingdom 78201
Buffer (10x) with EDTA  Life Technologies, Darmstadt, Germany 402824
BigDye Terminator Kit v1.1 Life Technologies, Darmstadt, Germany 4337450
Hi-Di formamide (25 ml) Life Technologies, Darmstadt, Germany 4311320
DyeEx 2.0 Spin Kit (250) Qiagen, Hilden, Germany 63206
3130 Genetic Analyzer Life Technologies, Darmstadt, Germany - Sequencer
MicroAmp optical 96-well reaction plate with barcode Life Technologies, Darmstadt, Germany 4306737
3130 Genetic Analyzer, plate base 96-well Life Technologies, Darmstadt, Germany 4317237
3130 Genetic Analyzer, plate retainer 96-well Life Technologies, Darmstadt, Germany 4317241
3130 Genetic Analyzer, well plate septa Life Technologies, Darmstadt, Germany 4315933
3130 Genetic Analyzer, POP-7 Polymer, 7 ml Life Technologies, Darmstadt, Germany 4352759
3130 Genetic Analyzer, 4-Capillary Array, 50 cm Life Technologies, Darmstadt, Germany 4333466
Sequencing Analysis Software 5.4 Life Technologies, Darmstadt, Germany -
microflex Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Our mMIS
VITEK MS bioMérieux, Nürtingen, Germany  2nd mMIS
flexControl 3.4 Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Device control software
Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC) Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Analysis software
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA, 1 g Bruker Daltonik, Bremen, Germany 201344
Peptide Calibration Standard II Bruker Daltonik, Bremen, Germany 222570
MSP 96 target polished steel Bruker Daltonik, Bremen, Germany 8224989
peqGREEN peqlab  37-5010
MALDI Biotyper Galaxy  Bruker Daltonik, Bremen, Germany Part No. 1836007  Automated sample preparation system
Vitek 2  bioMérieux, Nürtingen, Germany  Our aMIS
MicroScan  Beckman Coulter, Krefeld, Germany 2nd aMIS
BD Phoenix™ Automated Microbiology System BD, Heidelberg, Germany 3rd aMIS
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC® 25923™) American Type Culture Collection (ATCC), LGC Standards, Molsheim, France Positive control for PCR 

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References

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Schröttner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS. J. Vis. Exp. (113), e53176, doi:10.3791/53176 (2016).

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