Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تحديد مسببات الأمراض البكتيرية النادرة التي 16S الريباسي جين تسلسل وMALDI-TOF MS

Published: July 11, 2016 doi: 10.3791/53176
Automatic Translation
1, 1, 2, 2
1Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, TU Dresden, 2Institut für Virologie, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, TU Dresden

Abstract

وهناك عدد من مسببات الأمراض البكتيرية نادرة، وبالتالي، وصفت فيه الكفاية التي تشير التقارير إلى تسبب التهابات شديدة وخاصة في المرضى الذين يعانون من نقص المناعة. في معظم الحالات إلا القليل من البيانات، التي نشرت معظمها تقارير الحالة، تتوفر التي بالتحقيق في دور هذه الجراثيم وكيلا المعدية. ولذلك، من أجل توضيح الطابع الإمراض مثل هذه الكائنات الحية الدقيقة، فمن الضروري إجراء الدراسات الوبائية التي تشمل أعدادا كبيرة من هذه البكتيريا. الأساليب المستخدمة في هذه الدراسة المراقبة يجب أن تفي بالمعايير التالية: التعرف على سلالات أن تكون دقيقة وفقا لتسمية صحيحة، يجب أن يكون من السهل التعامل مع (الشدة)، اقتصادا في التشخيص الروتيني ولديهم لتوليد مقارنة النتائج بين المختبرات المختلفة. عموما، هناك ثلاث استراتيجيات لتحديد السلالات البكتيرية في إعداد الروتيني: 1) تحديد المظهرية التي تميز BIOCHEMICAلتر والتمثيل الغذائي خصائص البكتيريا، 2) التقنيات الجزيئية مثل التسلسل الجيني 16S الريباسي و 3) قياس الطيف الكتلي بوصفه نهجا وبروتيوم الرواية. منذ مطياف الكتلة والنهج الجزيئية هي الأدوات الواعدة لتحديد مجموعة كبيرة ومتنوعة من الأنواع البكتيرية، وصفت هاتين الطريقتين. وتناقش التقدم والقيود والمشاكل المحتملة عند استخدام هذه التقنيات.

Introduction

ويعوق تحديد آمن من مسببات الأمراض النادرة في التشخيص الروتيني من خلال حقيقة أن أساليب الثقافية والبيوكيميائية الكلاسيكية هي معقدة ومشكوك فيها في بعض الأحيان. وعلاوة على ذلك، مختبر علم الأحياء الدقيقة التشخيص لديه لمعالجة عدد كبير من مسببات الأمراض، بدءا من بضع مئات إلى عدة آلاف، يوميا، الأمر الذي يتطلب استخدام النظم الآلية. وبالإضافة إلى إدارة إنتاجية يومية عالية، هناك حاجة إلى تحديد دقيق الأنواع البكتيرية. هناك ما يبرر هذا لأنها تختلف في نمط التعرض للميكروبات ويوفر تحديد ولالصحيح الطبيب بالمعلومات الضرورية لاختيار المضادات الحيوية المناسبة (على سبيل المثال، المعوية النيابة.، الراكدة النيابة.) 12،43.

الأنظمة الأوتوماتيكية لتحديد الميكروبية (أميس) تنطبق مجموعات موحدة من التفاعلات الإنزيمية لتوصيف خصائص التمثيل الغذائي من العزلات البكتيرية على سبيل المثال، 47 في بطاقة GN لبعثة الاتحاد الأفريقي المستخدمة في هذه الدراسة 52، هذه التصاريح استراتيجية تحديد آمن فقط لمجموعة محددة من البكتيريا. وعلاوة على ذلك، وقواعد البيانات، ونظام خبير المتقدمة، ويركز بشكل واضح على الكشف عن البكتيريا ذات الصلة وذات أهمية كبيرة من الأهمية الطبية 13،15،16،36. نظامين أخرى، وتستخدم على نطاق واسع في المختبرات، وأيضا تطبيق هذا النهج البيوكيميائية لتحديد البكتيريا. الدراسات الحديثة تثبت دقة تحديد مقارنة بين بعثة الاتحاد الأفريقي المستخدمة في هذه الدراسة واحدة من المنافسين (93.7٪ و 93.0٪ على التوالي)، في حين أن 3 الثالثة بعثة الاتحاد الأفريقي لديه دقة تحديد٪ فقط 82.4 على مستوى الأنواع 35. ويمكن تفسير هذه التناقضات من خلال نوعية من المراجع بيانات تحديد الهوية الأساسية، إصدارات مجموعات والبرمجيات، والاختلافات في METABOlism والكفاءة من الكوادر الفنية 35،36.

وهي تستخدم أساسا اثنين الآلي أنظمة MALDI-TOF MS (MALDI-TOF نظام بالميكروبات، MMIS). وتسمح هذه النظم للكشف عن عدد كبير من الأنواع البكتيرية على أساس البروتين الأطياف بصمة كتلتها. على سبيل المثال، في قاعدة بيانات MMIS المستخدمة تحتوي على 6000 الأطياف المرجعية. نظم التعرف على أساس قياس الطيف الكتلي تقدم كشف سريع وموثوق بها مجموعة كبيرة ومتنوعة من الكائنات الحية الدقيقة بما في ذلك مسببات الأمراض النادرة 11،48،51. حتى الآن تتوفر بين MMIS المستخدمة في هذه الدراسة ومنافسيها 19،33 سوى عدد قليل من المقارنات المباشرة. وفقا لDaek وآخرون. وتوفر كلا النظامين ارتفاع معدل مماثل من دقة تحديد الهوية، ولكن MMIS المستخدمة في هذه الدراسة يبدو أن أكثر موثوقية في تحديد الأنواع 19.

الجينات متميزة وبالمثل، التقنيات الجزيئية عنونة حفظها بشكل جيد ولكن أيضا ( rpoB) تسمح لتحديد الأنواع واضحا 3،22،61. ومن بين هؤلاء، والحمض النووي المؤتلف 16S هو الأكثر استخداما على نطاق واسع التدبير المنزلي الجينات بسبب وجودها في جميع البكتيريا 34. تظل وظيفتها دون تغيير، وأخيرا، مع ما يقرب من 1500 سنة مضت، كان طويلا بما فيه الكفاية لتكون مناسبة لالحيوي المعلوماتية 14،34. العديد من الباحثين يعتبرون تحليل الجينات 16S الريباسي باسم "الذهب القياسية" لتحديد البكتيريا 21. ويرجع ذلك إلى حقيقة أن بعض المختبرات تستخدم تقنيات التهجين الحمض النووي DNA حتى الآن لتحديد البكتيريا نادرة أو جديدة 14،34 هذا. بالإضافة إلى ذلك، تتوفر والتي يمكن استخدامها لتحليل الجينات 16S الريباسي 50 قواعد بيانات أكثر وأكثر. ومع ذلك، فإنه يجب أن يؤخذ في الاعتبار أن أنظمة الكشف عن الحمض النووي المؤتلف 16S أساس لها حساسية محدودة مقارنة البروتوكولات PCR القياسية. وعلاوة على ذلك، فإن النهج الجزيئي هو متطور، وقتا طويلا ويتطلب موظفين مدربين تدريبا عاليا وكذلكمرافق المختبرات المخصصة وغير، وبالتالي، لا تنفذ بسهولة في التشخيص الروتيني 55. وعلاوة على ذلك، فقد تبين أن الجمع بين اثنين على الاقل من الطرق المختلفة لتحديد البكتيريا يؤدي إلى تحديد سلالة دقيقة للغاية. مزيج من MALDI-TOF MS و16S الحمض النووي المؤتلف التسلسل يسمح بتحديد أعداد كبيرة من الأنواع البكتيرية المختلفة بدقة عالية. مؤخرا تم تقديم مزيج من التحليل الجيني MALDI-TOF MS و 16S الريباسي لتحديد البكتيريا دراسة المسائل الوبائية ومسببات الأمراض النادرة 56.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. استخراج الحمض النووي البكتيري

  1. إعداد برنامج تلفزيوني الحل
    1. تزن 1.65 غرام نا 2 هبو 4 × 2H 2 O، 0.22 غ ناه 2 ص 4 × 2H 2 O و8.80 جم كلوريد الصوديوم في قارورة وملء مع الماء المقطر إلى الحجم النهائي من 1000 مل. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4. للاستخدام النهائي تصفية الحل عن طريق البكتيريا مقاومة لل(0.22 ميكرون) فلتر.
  2. البكتيريا استخراج الحمض النووي من سلبية الغرام
    1. خط المواد المريض على وسائل الإعلام ثقافة المناسب (على سبيل المثال، كولومبيا أجار الدم)، وتحديد وعزل مسببات الأمراض المحتملة.
    2. إعداد ثقافة نقية وأداء غرام تلطيخ من أجل تحديد نمط شكلي ولتأكيد نقاء والثقافة 49.
    3. اختيار مستعمرة بكتيرية واحدة وتحويلها مع 1 ميكرولتر استخدام مرة واحدة التلقيح حلقة في أنبوب 2.0 مل رد الفعل العقيمة التي تحتوي على 1 مل PBS حل.
    4. احتضان هذا تعليق في thermomixإيه في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. بعد مرور فترة الحضانة، والسماح للاستخراج البكتيريا (التي تحتوي على الحمض النووي المنحلة) بارد لدرجة حرارة الغرفة، وإما استخدامها مباشرة لتضخيم أو مخزن في -20 درجة مئوية لاستخدامها مرة أخرى (الشكل 1A).
  3. البكتيريا استخراج الحمض النووي من إيجابية الجرام
    1. خط المواد المريض على وسائل الإعلام ثقافة المناسب (على سبيل المثال، كولومبيا أجار الدم)، وتحديد وعزل مسببات الأمراض المحتملة. أداء غرام تلطيخ من أجل تأكيد نمط شكلي للثقافة.
    2. إعداد ثقافة نقية وأداء غرام تلطيخ من أجل تحديد نمط شكلي ولتأكيد نقاء الثقافة.
    3. اختيار مستعمرة بكتيرية واحدة مع معقمة 1 ميكرولتر التلقيح حلقة وتعليقه في 500 حل ميكرولتر PBS في أنبوب 2.0 مل التفاعل.
    4. إضافة 500 الزجاج والخرز ميكرولتر ونقل أنبوب إلى الخالط تتأرجح، تعمل على الحد الأقصى التردد والسعة (50 هرتز)، لمدة 5 دقائق. استخدام الزجاج حبات من قطر 1.0 ململتعطيل جدران الخلايا البكتيرية.
    5. احتضان هذا الأنبوب لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة 95 درجة مئوية، وبارد لدرجة حرارة الغرفة. استخدام استخراج إما مباشرة للتفاعل PCR أو مخزن في -20 درجة مئوية لاستخدامها مرة أخرى.

2. 16S الحمض النووي المؤتلف PCR

  1. إعداد تضخيم الاشعال
    1. استخدام TPU1 الاشعال (5'-AGA GTT TGA TCM TGG جنة مكافحة الإرهاب AG-3 '[M = A / C]) كما التمهيدي إلى الأمام وRTU4 (5'-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3') كما التمهيدي العكسي 25. يعد حل الأسهم التمهيدي مع الدناز وريبونوكلياز المياه مجانا، وجود تركيز 100 بمول / ميكرولتر (100 ميكرون) وتمييع أكثر من ذلك إلى حل العاملة في 10 بمول / ميكرولتر. تخزين الأسهم التمهيدي والعمل الحل في -20 درجة مئوية أو استخدامها مباشرة.
  2. إعداد رد الفعل مزيج PCR
    1. ماصة 1 ميكرولتر من كل التمهيدي، 1 ميكرولتر dNTP المزيج (100 ملم)، و 2.5 ميكرولتر من استخراج الحمض النووي، 5 ميكرولتر 10X PCR العازلة (التي تحتوي على 25 ملي المغنيسيومCL 2)، 0.25 ميكرولتر طق البلمرة (5 وحدات / ميكرولتر) و39.25 ميكرولتر DNAse- وريبونوكلياز المياه PCR مجانا إلى العقيمة 200 أنبوب رد فعل ميكرولتر.
  3. بروتوكول PCR
    1. بدء تشغيل البرنامج PCR بنيت على النحو التالي: أولا، خطوة الحضانة الأولية في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وهو أمر ضروري لتفعيل طق البلمرة. ثانيا، 35 دورات التضخيم، تحتوي على 1 دقيقة. خطوة تمسخ في 95 درجة مئوية، 1 دقيقة. خطوة التمهيدي الصلب عند 50 درجة مئوية، والتمهيدي خطوة التمديد 1.5 دقيقة عند 72 درجة مئوية. ثالثا، على تمديد نهائي لمدة 10 دقيقة عند 72 درجة مئوية. وأخيرا، يتم تبريد تفاعل PCR إلى 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: المكورات العنقودية الذهبية وH 2 O تخدم السيطرة كما الإيجابية والسلبية (الشكل 1B).
    2. وضع الأنبوب الذي يحتوي على مزيج تفاعل PCR في thermocycler وبدء تشغيل البرنامج.
  4. تنقية المنتج PCR
    ملاحظة: من أجل تنقية المنتج PCR، عدة بروتوكولات إماويمكن استخدام انزيم القائم أو مع السيليكا الامتزاز المصفوفة. وPCR تنظيف خطوة واحدة تستخدم هنا يستخدم اثنين من التفاعلات الإنزيمية حلمهي. في حين نوكلياز خارجية الأول (إكسو الأول) يزيل الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحد، الفوسفاتيز القلوية الروبيان (SAP) مائيا dNTPs الفردية. ويستند هذا الإجراء الثاني على الامتزاز تقنية الغشاء السيليكا مع الملح العالية ملزمة بسرعة - يغسل - منخفض الملح دورة شطف.
    1. إضافة 1.5 ميكرولتر من مزيج الأنزيمية التي تحتوي على حد سواء إكسو أنا وSAP إلى 25 ميكرولتر منتج PCR، تخلط جيدا ونقل إلى thermocycler تطبيق بروتوكول بسيط من أول دقيقة 15 عند 37 درجة مئوية تليها 15 دقيقة في 80 درجة مئوية. تخزين PCR المنتج المنقى إما في -20 درجة مئوية أو استخدامها مباشرة هدفا لوصفها PCR.

3. الحمض النووي الاغاروز جل الكهربائي

  1. إعداد العازلة الكهربائي (TBE العازلة)
    1. عاير 54.0 غ (445 ملم) قاعدة تريس، 27.5 غ (445 ملم) حمض البوريك و 20 مل من EDTA M 0.5 (10ملي) حل في درجة الحموضة 8.0 مع هيدروكسيد الصوديوم في قارورة وملئه بالماء المقطر إلى إجمالي حجم 1000 مل. ثم تمييع هذا المخزن المؤقت 5X 01:10 بالماء المقطر (0.5X TBE) لالكهربائي.
  2. إعداد العازلة تحميل
    1. مزيج 250 ملغ برموفينول الأزرق، 250 ملغ سيانول زايلين FF و 15 غرام من polysucrose (مواد الجدول) في قارورة. ثم تعبئته مع العازلة 0.5X TBE إلى إجمالي حجم 100 مل. قسامة صبغ التحميل إلى 1 مل أجزاء ومخزن في -20 درجة مئوية لمزيد من الاستخدام.
  3. الصب من جل الاغاروز
    1. تزن 6 ز الكهربائي القياسي الاغاروز إلى 300 عازلة مل 0.5X TBE (انظر القسم 3.1.1) في قارورة، لإعداد 2٪ (ث / ت) agarose هلام. ثم وضع الخليط الاغاروز في فرن الميكروويف، وتسخينها نقطة قريبة من الغليان حتى يذوب تماما agarose والحل يبدو واضحا.
    2. السماح للالاغاروز المنصهرة باردة بما فيه الكفاية وإضافة 10 ميكرولتر من 1٪ (ث / ت) إيثيديوم بروميد الأسهم المحاليلنشوئها. صب الحل في المدلى بها ووضع مشط هلام (السماح ل30 بئرا) في المدلى بها. إزالة مشط عندما هلام طدت تماما ووضع الجل الى غرفة الكهربائي التي تحتوي عازلة 0.5X TBE.
      ملاحظة: بروميد إيثيديوم السامة والتشوهات الخلقية. ولذلك ينبغي التعامل معها بحذر. فمن المستحسن استخدام قفازات النتريل. هناك بقع حمض الإقحام نوكليك البديلة التي يمكن استخدامها كبديل غير سامة.
  4. الاغاروز جل الكهربائي من المنتجات PCR
    ملاحظة: من أجل التحقق من حجم الصحيح من amplicons PCR وتقدير تركيز الحمض النووي يتم فصل المنتج PCR المنقى في هلام الاغاروز.
    1. ماصة 2 ميكرولتر من العازلة تحميل في أنبوب تفاعل PCR وإضافة 8 ميكرولتر من الناتج PCR. ماصة هذا المزيج في الآبار من هلام. إضافة 8 ميكرولتر من حجم علامة الوزن الجزيئي (DNA سلم) في بئر مستقل لتقدير حجم المنتج PCR.
    2. تطبيقالجهد ثابتا عند 10 V / سم ووقف الكهربائي حالما برموفينول علامة زرقاء وصلت حوالي ¾ من الطول الكلي للهلام. تصور شظايا PCR فصل باستخدام-نقل transilluminator الأشعة فوق البنفسجية (الطول الموجي 302 نانومتر) وتوثيقها باستخدام نظام هلام الوثائق. تقدير كمية من الحمض النووي عن طريق المقارنة البصرية مع سلم الحمض النووي. استخدام ما يقرب من 10 نانوغرام هدفا لوضع العلامات PCR.

4. سانجر تسلسل

  1. دورة تسلسل PCR
    ملاحظة: قم بوضع العلامات PCR في رد فعل 10 ميكرولتر باستخدام طقم التجارية (مواد الجدول).
    1. إضافة 2 ميكرولتر من mastermix رد فعل 5X، 2 ميكرولتر من إعداد الحمض النووي، 1.5 ميكرولتر من TPU1 أو RTU4 حل العمل (10 بمول / ميكرولتر) و 4.5 ميكرولتر من الدناز وريبونوكلياز المياه مجانا.
    2. وضع هذا المزيج رد فعل التسلسل في thermocycler وتشغيل PCR آخر. في المجموع، وعملية 25 دورة تتكون من خطوة تمسخ (96 درجة مئوية،10 ثانية)، خطوة الصلب (45-60 درجة مئوية، 5 ثانية) وخطوة التمديد (60 درجة مئوية، 2 دقيقة). وأخيرا، تهدئة رد الفعل إلى 4 درجات مئوية.
  2. تنقية رد فعل التسلسل
    1. تنقية مزيج العلامات رد فعل باستخدام الأعمدة تدور التجارية لتنقية PCR (مواد الجدول).
    2. تحميل 10 ميكرولتر من رد فعل التسلسل على ما قبل المائية مصفوفة هلام الترشيح وإجراء خطوة الطرد المركزي في 750 x ج لمدة 3 دقائق.
      ملاحظة: من خلال استخدام هذا الإجراء يتم الاحتفاظ الإنهاء صبغة غير مدمج في المصفوفة هلام.
    3. ثم تجفيف شطافة المائية في مكثف فراغ. أجهزة الطرد المركزي في 2500 x ج لمدة 20 إلى 30 دقيقة عند 40 درجة مئوية لاستكمال جفاف.
    4. إضافة 10 ميكرولتر من الفورماميد منزوع الأيونات عالية ثم تفسد عند 90 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ويبرد الخليط على الجليد. ماصة 10 ميكرولتر من العينات التشويه والتحريف على لوحة ميكرولتر جيدا 96. تخزين المنتج PCR المجففة وتنظيفها عند درجة حرارة -20 درجة مئوية إذا كان التحليلالتي يتعين الاضطلاع بها في وقت لاحق.
  3. 16S الريباسي جين تسلسل وتحليل تسلسل الحمض النووي
    ملاحظة: إجراء تحليل تسلسل على المنظم الآلي (مواد الجدول). المنظم المستخدم هنا هو نظام الشعرية الكهربائي القائم على مضان الآلي الذي يحلل 4 عينات في وقت واحد (مجموعة 50 سم 4-الشعرية) مع السائل البوليمر 67 (الشكل 1C).
    1. وضع لوحة microtiter في التسلسل. إرسال ورقة عينة (رقم قياسي لوحة) على النحو المنصوص عليه في 2، حفظه وبدء تسلسل المدى / تحليل باتباع الخطوات الواردة في 1.
      ملاحظة: المدة من سلسلة المدى هو 2 ساعة وتقدم البيانات من 800 إلى 1000 سنة مضت.
    2. فتح البرنامج تحليل التسلسل (مواد الجدول). فالبيانات معطاة تسلسل كملف نصي (.seq) وملف يحتوي على رحلاني بما في ذلك القيم الجودة (QV) (.ab1).
      ملاحظة: الدعوة الأساسي هو تلقائيا فيشكلت من قبل برنامج تحليل تسلسل ويتم فحص رحلاني الأساسي بصريا (على سبيل المثال، ذروة الذروة، ذروة فصل) يستخدم قبل تسلسل لمزيد من التطبيقات.
    3. مقارنة المخزنة ملف تسلسل الحمض النووي لقاعدة البيانات NR NCBI باستخدام خوارزمية انفجار (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi؟db=Nucleotide).

5. MALDI-TOF MS

ملاحظة: يستخدم مطياف الكتلة على 337 نانومتر N 2 ليزر، وسيتم تشغيلها من قبل برنامج حاسوبي لمراقبة معين (مواد الجدول). تسجل الأطياف في وضع الخطية ومجموعة الشامل بين 2000 إلى 20000 وتغطي دا. ويتم تفسير البيانات وتوزيع الدرجات للعينات في الوقت الحقيقي من خلال برمجيات تحليل (مواد الجدول) (1D الشكل).

  1. إعداد البكتيريا لMALDI-TOF تحليل MS
    1. تنمو البكتيريا من الفائدة (على سبيل المثال، Myroides odoratimimus) على العقيدumbia أجار الدم التي تحتوي على 5٪ الدم الحصان عند 37 درجة مئوية لمدة 18-24 ساعة، اعتمادا على سلالة بكتيرية (الشكل 2A). أداء غرام تلطيخ للتحقق من نمط شكلي للكائن الحي تحت التحقيق، فضلا عن نقاء الثقافة.
    2. استخدام المسواك الخشبي لنقل مستعمرة بكتيرية واحدة لبئر هدفا الصلب 96-جيدا (الشكل 2B و2C). البقعة 1 ميكرولتر من حمض الفورميك 70٪ على رأس كائن الهواء المجفف على الهدف الصلب وتترك لتجف لمدة حوالي 2-3 دقائق.
    3. ثم، تراكب الفور مع 1 ميكرولتر حل المصفوفة، التي تحتوي على 50 ملغ / مل CHCA (α-Cyano-4-hydroxycinnamic حامض) في مذيب عضوي (50٪ الأسيتونتريل، حمض trifluoroacetic 2.5٪، 47.5٪ H 2 O).
      ملاحظة: طريقة تراكب الحمضية (على طريقة إعداد لوحة) يمكن أن تستخدم لتحسين نوعية أطياف الشامل. وقد تبين أن للبكتيريا إيجابية الغرام مثل هذا "الهجوم بالحمض" يزيد من درجة زارة شؤون المحاربين القدامىالزهرى من أطياف قياس 45.
      ملاحظة: بدلا من ذلك على النظام الآلي وإعداد العينات (مواد الجدول) يمكن أن تستخدم فيها الاتصال مجانا بقع من 1 ميكرولتر 70٪ من محلول حمض الفورميك، وبعد دورة التجفيف الأولى، يتم تطبيق 1 ميكرولتر حل مصفوفة على مسحة البكتيرية. ثم تجفف العينات تحت ظروف قياسية في الرطوبة النسبية 60٪ ونحن على استعداد لاستخدامها في التحليل.
    4. السماح للتشويه مع مصفوفة مضافين الهواء الجاف مرة أخرى لمدة 5 دقائق في غطاء محرك السيارة. هذا تشويه البكتيرية مع مصفوفة تطبيقها الآن مستقرة لعدة ساعات.
      ملاحظة: مسحات البكتيرية دون مصفوفة قد لا تكون مستقرة بسبب تدهور البروتين.
  2. أداء تحليل MS MALDI-TOF
    1. مقدمة من عينات
      1. فتح برنامج حاسوبي لمراقبة من MMIS لدينا (مواد الجدول).
      2. تهوية ميناء تحميل عينة من مطياف الكتلة عن طريق الضغط على زر / OUT في الصك.
      3. فتح ميناء التحميل بعد نقرة وإدراج لوحة الهدف MALDI-TOF MS مع مسحة البكتيرية المجففة بالإضافة إلى المصفوفة.
      4. إغلاق ميناء وإجلاء مرة أخرى. مراقبة فراغ وعندما يصل إلى 4.5 × 10 -6 م بار بدء القياس.
    2. تحليل عينة
      1. فتح البرنامج تحليل MMIS لدينا (مواد الجدول) وانقر على القائمة "ملف". حدد "تصنيف جديد" ونافذة "MALDI biotyper الوقت الحقيقي المعالج تصنيف" الجديد يفتح. اكتب اسم المشروع، على سبيل المثال "project_1 قياس Myroides، في حقل" اسم المشروع "واضغط على زر" جديد ". وبموجب مربع الحوار جديد يسمى" مشروع جديد "اسم المشروع الاختيار والمضي قدما عن طريق الضغط على زر" موافق ".
      2. في "biotyper MALDI الوقت الحقيقي المعالج تصنيف" مراقبة "الحليلة وضع" نافذة مفتوحة. حدد مواقع المستهدفة (على سبيل المثال، A1، A2، A3 ...) انقر بزر الماوس الأيمن المبادرة القطريةالمسيخ أي الموضع المحدد (المشار إليها مربع اللون الأزرق) وحدد "إضافة عينات". في فتحها تلقائيا الجدول نوع العرض في اسم عينة، معرف عينة واختياريا للتعليق. انقر على زر "التالي" للمتابعة.
      3. في "biotyper MALDI الوقت الحقيقي المعالج تصنيف" مراقبة "اختيار MALDI طرق biotyper" نافذة مفتوحة. حدد "بروكر تصنيف" من "المشاريع متوسطة الحجم من أشجار التصنيف" وانقر على "التالي" للمتابعة.
      4. في "biotyper MALDI الوقت الحقيقي المعالج تصنيف" مراقبة "موجز مشروع" نافذة مفتوحة. تحقق الإدخالات إدراج المذكورة أعلاه للمشروع تصنيف الفعلي. بدء تصنيف تشغيل عن طريق الضغط على زر "إنهاء" (الشكل 2D - و). قياس يبدأ تلقائيا عند الوصول إلى الفراغ المناسب.
      5. اتبع على المدى تصنيف حتى يتم الانتهاء من قياس بنجاح. عرض جدول النتائج في تيوقال انه "MALDI Biotyper الوقت الفعلي Myroides مشروع تصنيف قياس project_1" فتح القائمة "عرض" ثم انقر على "نتائج".
      6. عرض "بروكر DALTONICS MALDI Biotyper نتائج تصنيف" كملف HTML في مستعرض ويب الافتراضي. طباعة وحفظ النتائج.
    3. قياس معيار اختبار مسبق يوميا لعينة التحليل لمعايرة أجهزة القياس وأداء أسبوعي وضع الآلية (أداة الاختبار الذاتي).
      ملاحظة: خلال قياس MALDI-TOF الأطياف وتحليلها في الوقت الحقيقي من خلال برامج التحليل (مواد الجدول). وترد قائمة من عشرة أنواع مع العشرات كل منها وإدخالها في نظام معلومات المختبر (LIS) لتقديم التقارير.
    4. تقييم نقدي لنتائج MALDI-TOF MS (انظر نتائج ممثل)، وإذا كان ذلك مناسبا، وتشمل اختبارات أخرى، مثل التشكيلات biochemical- والمضادات الحيوية قابلية أو 16S الريباسي التسلسل الجيني، وإذا لزم الأمر، غرام تلطيخ لتعيين الأنواع البكتيرية للتقرير الميكروبيولوجي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

MALDI-TOF MS رواية، طريقة سريعة وغير مكلفة لتشخيص الروتينية الميكروبيولوجية. تحديد أنواع البكتيريا عن طريق MALDI-TOF MS تنتج أطياف تتكون أساسا من البروتينات الريباسي ولكن أيضا غيرها من "البروتينات الحفاظ جدا مع وظائف التدبير المنزلي تتأثر إلى حد أدنى من الظروف البيئية" 17. وقاعدة بيانات لهذه MMIS يحتوي على مجموعة كبيرة من الأطياف المرجعية وحتى البكتيريا التي نادرا ما توجد في العزلات السريرية يمكن تحديدها بشكل آمن 7،56،57. تظهر قيم درجة موثوقية من الأنواع التي تم تحديدها. عشرات فوق 2.300 تمثل تحديد الأنواع من المحتمل جدا، على درجة بين 2.000 و 2.300 تدل على تحديد الأنواع آمن، على درجة بين 1.700 و 2.000 المدرجات لتحديد الأنواع المحتمل ودرجة أقل من 1،700 لغير موثوقة. في حالة الأنواع أكثر من واحد يجري تحديدها مع أي درجة أعلى من 2.000، قسم التدريب والامتحانات إضافيةالخبر لا بد من تطبيقها، وهذا هو السبب في أننا تضافرت أساليب مختلفة مثل 16S الحمض النووي المؤتلف التسلسل، والمعهد وتقنيات معالجة morpho- بكتيريا و / أو النمط الظاهري مثل صبغة جرام، الحركة وما إلى ذلك في حالة ما إذا كانت النتيجة أقل من 1.700 الاختبارات المذكورة أعلاه لا بد من استخدامها لتحقيق تحديد الأنواع يمكن الاعتماد عليها. وقد تجلى مزيج من MALDI-TOF MS و16S الحمض النووي المؤتلف التسلسل مؤخرا 56-58. وتجدر الإشارة إلى أن مبادئ توجيهية واضحة لتحديد الأنواع على أساس 16S الحمض النووي المؤتلف تسلسل homologies لا تزال تفتقر إلى 22،61. لتفسير عملي، homologies من ≥97٪، على النحو الذي اقترحه Stackebrandt وGÖBEL 61، وتستخدم 56. التقدم في تسلسل الحمض النووي تسمح تحديد العوامل الوراثية البكتيرية بأكملها من خلال تقنيات الجيل القادم بتكلفة منخفضة نسبيا، وبالتالي في تحديد مبدأ من البكتيريا على أساس تسلسل الجينوم الخاصة بهم. وقد تم بالفعل استخدام هذه التقنية فيالجينوم إدارة اندلاع مقرها أو في علم الأوبئة 9،29. ومع ذلك، فإن أقوى القيد اليوم هو عدم وجود سهلة الاستخدام حزم البرمجيات للمستخدم النهائي 65.

وترد سبعة أمثلة من البكتيريا التي تحدث نادرة ومعزولة من عينات المرضى أثناء التشخيص الروتيني وتحليلها من قبل كل من MALDI-TOF MS و 16S الريباسي التسلسل الجيني في الجدول 1. وترد MALDI-TOF أطياف سلالة رقم 1 إلى رقم 6 في الشكل 3 و يتم عرض مجموعة من سلالة رقم 7، Sphingobacterium spiritivorum، في الشكل 1E. تظهر جميع العزلات درجات عالية في تحليل MS MALDI-TOF و 99 إلى 100٪ 16S الحمض النووي المؤتلف تسلسل homologies. وهكذا، وفي كلتا الطريقتين تؤدي إلى تأمين جنس والأنواع تحديد الهوية. لكن، وكما ورد في منشور صدر مؤخرا على المقارنة بين طرق تحديد Myroides س.، أدى مزيج من التسلسل الجيني MALDI-TOF MS و 16S الريباسي إلى r أكثر موثوقيةesults 56. وتوضح هذه البيانات أن أسلوب واحد المستخدمة قد لا تكون دائما كافية لتحقيق نتيجة تحديد موثوقة. الجمع بين طريقتين مستقلة يؤدي إلى دقة أعلى ويوسع قاعدة بيانات تجارية MALDI-TOF MS مع أدت القيود في تحديد الأنواع لا لبس فيه 56 عاما في المنزل.

وقد تم تحديد سلالة # 1 كما Chryseobacterium gleum (MALDI-TOF MS يسجل 2.490، تسلسل تناظر 99٪). Chryseobacteria هي سالبة الجرام، وعدم تخمر قضبان وتتعلق Myroides النيابة. Chryseobacterium النيابة. تعتبر مسببات الأمراض الناشئة، ويرتبط مع تسمم الدم والالتهاب الرئوي والتهابات المسالك البولية. تضم Chryseobacterium جنس عدد كبير من الأنواع وأفضل الأنواع المدروسة indologenes Chryseobacterium. على غرار الالتهابات التي تسببها Myroides س.، تتأثر المرضى في الغالب المناعة6،10،60. وقد تم تحديد السلالة رقم 2 كما Myroides odoratimimus (MALDI-TOF MS يسجل 2.436، تسلسل تناظر 99٪) والسلالة رقم 3 كما Myroides odoratus (MALDI-TOF MS يسجل 2.237، تسلسل تناظر 99٪) Myroides ليرة سورية. هي سالبة الجرام، nonfermenting القضبان التي ترتبط بأمراض خطيرة مثل تعفن الدم، التهاب النسيج الخلوي أو الالتهاب الرئوي. معظمهم من مرضى نقص المناعة مع الدموية أو الأورام الأمراض الكامنة تتأثر 8،18،42. وقد تم تحديد سلالة # 4 كما Sphingobacterium multivorum 32،71 (MALDI-TOF MS يسجل 2.092، تسلسل تناظر 99٪).

البكتيريا هي قضبان غير تخمر سالبة الجرام، والتي قد تسبب تسمم الدم في المرضى الذين يعانون من نقص المناعة 5،24،44،53. وبالإضافة إلى ذلك، تم الإبلاغ عن حالة من التهاب السحايا والدماغ مميتة 70. البقع # 5 (MALDI-TOF MS يسجل 2.282، تسلسل تناظر 100٪) ورقم 6 (MALDI-TOF MS يسجل 2.289، تسلسل homologوقد تم تحديد ذ 100٪) كما Wohlfahrtiimonas chitiniclastica وهذه البكتيريا هي قصيرة، غير متحركة، عصيات سلبية الجرام التي تم عزلها لأول مرة من يرقات ذبابة طفيلية الفولفارتية الضارية وصفها في عام 2008 66. وتعتبر هذه البكتيريا الحيوانية كما مسببات الأمراض الناشئة و العوامل المسببة لتجرثم الدم، تسمم الدم أو التهابات الانسجة الرخوة 4،40،64. ومن المثير للاهتمام، أن معظم المرضى ذكرت إما بلا مأوى و / أو يعاني من الإدمان على الكحول، وبالتالي وقوع هذه الجراثيم نادرة قد يفسر ارتفاع نسبة الطفيليات الخارجية في السكان بلا مأوى 4،54. سلالة رقم 7، Sphingobacterium spiritivorum (MALDI-TOF MS يسجل 2.269، تسلسل تناظر 100٪)، والممرض نادرة. ويمكن أن يسبب وصفت إصابات في المرضى الذين يعانون من نقص المناعة وعزلة الإنسان الأولى في عام 1982 31،71. ويحدد تقرير صدر مؤخرا Sphingobacterium spiritivorum كوكيل المسبب لحالة قاتلة من البكالورياteremia وتعفن الدم في المريض مع سرطان الدم النخاعي الحاد 38.

شكل 1
يتم تضخيمه سير العمل للحمض النووي و / أو قياس الطيف الكتلي على أساس الكشف عن البكتيريا ذات الصلة سريريا في مختبر علم الأحياء الدقيقة الطبية بدءا من ثقافة نقية (أ)، استهداف الحمض النووي في thermocycler (ب): الشكل 1. والتسلسل amplicons PCR في التسلسل أربعة الشعرية باستخدام تكنولوجيا سانجر (ج). يتم تحديد تسلسل النتائج كما homologies في المئة من تسلسل الاستعلام إلى إدخالات قاعدة البيانات عن طريق مقارنة بمساعدة الحاسوب. ثانيا، البروتينات طريقة مقرها، يستخدم قياس الطيف الكتلي (د) وفي المركز الطيفية نتيجة الجماعية لسلالة # 1 في الجدول رقم 1، وتعطى Sphingobacterium spiritivorum، بما في ذلك MS النتيجة MALDI-TOF لها، (ه </ قوي>). مزيج من قياس الطيف الكتلي و16S الريباسي التسلسل الجيني قد يكون ضروريا، من أجل تحقيق تحديد الأنواع أكثر موثوقية ودقة. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: إجراء تحليل باستخدام MALDI-TOF MS لتحديد البكتيريا ذات الصلة سريريا يأخذ المشغل خلية كاملة المواد البكتيرية (أ) مع المسواك من ثقافة نقية (ب) ويضع مسحات البكتيرية على هدف الصلب (ج). يتم إدخال الهدف الصلب في ميناء التحميل من مطياف الكتلة. عند الوصول إلى الفراغ المناسب لل5 × 10 -6 م بار، سيتم نقل الهدف إلى غرفة التأين. باستخدام -lase N 2ص، يتم إنشاء الأيونات من قبل الامتزاز لينة يتم بعد ذلك المتسارع في مجال الكهرباء (د) وفصل في أنبوب رحلة (ه). الوقت الرحلة (TOF) اللازمة لأيونات للوصول إلى كشف من الأنبوب الرحلة (و) يرتبط ارتباطا مباشرا كتلتها ويشكل أساس الحسابات اللاحقة من قمم الجماعية. برنامج تحديد معين (مواد الجدول) ثم يحدد قيم النتيجة إلى بصمة الطيف الكتلي من البروتينات البكتيرية المؤينة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل (3): MALDI-TOF الأطياف وتعيين العشرات من مسببات الأمراض النادرة في هذا الشكل، MALDI-TOF أطياف التمثيل في أول ستة الدعاوى مسببات الأمراض النادرة.وتظهر تيد في الجدول 1. ويلاحظ اسم الأنواع والنتيجة MALDI-TOF MS المقابلة في كل الطيف. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

# 3
سلالة تحديد MALDI النتيجة MALDI نتيجة 16S الحمض النووي المؤتلف انفجار تناظر
# 1 Chryseobacterium gleum 2.211 Chryseobacterium gleum هوية 99٪
# 2 Myroides odoratimimus 2،397 Myroides odoratimimus هوية 99٪
Myroides odoratus 2.237 Myroides odoratus هوية 99٪
# 4 Sphingobacterium multivorum 2.093 Sphingobacterium multivorum هوية 99٪
# 5 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 2،282 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica هوية 100٪
# 6 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica 2،289 Wohlfahrtiimonas chitiniclastica هوية 100٪
# 7 Sphingobacterium spiritivorum 2،269 Sphingobacterium spiritivorum

الجدول 1: نتائج الممثل MALDI-TOFs من البكتيريا التي تحدث نادرة بالمقارنة مع 16S الريباسي التسلسل الجيني.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

كلا MALDI-TOF MS و 16S الريباسي التسلسل الجيني تقدم إمكانية لتحديد أعداد كبيرة من البكتيريا المختلفة. MALDI-TOF MS هو طريقة سريعة وغير مكلفة، والتي من السهل التعامل مع ووقواعد البيانات الكبيرة من أطياف الشامل البكتيرية المتاحة. لهذا السبب، MALDI-TOF MS هو، والتكلفة طريقة سريعة فعالة وموثوق بها لإجراء دراسات الفحص تركز على مسببات الأمراض البكتيرية نادرة 17،20،39،51. في دراسة استطلاعية مقارنة MALDI-TOF MS مع أساليب تحديد المظهرية الأخرى، سنج وآخرون الفعالية من حيث التكلفة شرحها وسرعة MALDI-TOF MS 59 وتان وآخرون عن تحقيق خفض تكاليف كاشف والعمل لتحديد البكتيريا في مختبر الإعداد لها من 56.9٪ سنويا 62. ويدعم هذه التخفيضات التكلفة بموجب مذكرة من Gaillot وآخرون. 28

من ناحية أخرى، 16S الحمض النووي المؤتلف التسلسل هو أكثر استهلاكا للوقت، وشاقة ومذكرات متخصصة صersonnel لإجراء تحليل 34. ومع ذلك، كلا النهجين هي مناسبة لالتشخيص الروتيني ويمكن التدليل على أن الجمع بين هاتين الطريقتين يؤدي إلى درجة أعلى من الموثوقية والدقة تحديد أكثر أمنا، وهي مفيدة بشكل خاص في حالة النتائج المشكوك في تحصيلها 56. لذلك، نقترح الجمع بين الطريقتين كأفضل نهج للتحقق من التعرف على البكتيريا التي تحدث نادرة في التشخيص الروتيني. لتحديد الأنواع موثوق بها، فإنه من الضروري على الاطلاق لاستخدام الثقافات البكتيرية نقية لأن الثقافات المختلطة تمنع تحديد الأنواع. كما فحص المعقولية، وتحديد الأنواع التي تم الحصول عليها إما MALDI TOF MS أو 16S الحمض النووي المؤتلف تسلسل يجب أن يكون وفقا للنتائج من الجرام تلطيخ، وتوصيف والكيمياء الحيوية والسريرية 49.

واقترح الطيف الكتلي كأداة تحليلية لتحديد البكتيريا لأول مرة في عام 197551. ومع ذلك، استغرق الأمر حتى أواخر 1980s إلى وضع نهج عملي لتحليل البروتين. تم إدخال تكنولوجيا "لينة الامتزاز التأين" كويتشي تاناكا في عام 1985 (63 عاما) الذي حصل على جائزة نوبل في الكيمياء عام 2002، مما يسمح تحليل البروتينات سليمة. في نفس الوقت تم إدخال الوقت التأين بمساعدة مصفوفة مطياف الكتلة الرحلة من خلال هيلينكامب وكاراس كما كانت أول من استخدم حمض عضوي لتحليل الجزيئات الحيوية 37 وهذه هي الطريقة التي لا تزال تستخدم اليوم. على الرغم من أن التكنولوجيا MALDI استخدمت بشكل متقطع 23،30،41، استغرق الأمر حتى عام 2004 عندما قدم بروكر DALTONICS microflex نظام MALDI Biotyper في (مؤتمر PITTCON والمعرض، 2004، صحفي)، أن بالميكروبات MALDI-TOF MS استنادا أصبح روتين تقنية التشخيص 46. أعطت النهج الحديثة في تقنيات MALDI-TOF MS الفرصة للتعرف على الخمائر، والكشف عن البكتيريا multiresistantوتؤدي مضادات الميكروبات اختبار الحساسية 17،51. وعلاوة على ذلك، بعض الإجراءات توفر إمكانية لتحليل مباشرة البكتيريا من العينات الأولية، مثل البول أو الدم الثقافات 17،51.

على الرغم من أن استخدام هذا النظام سهل في المقام الأول، هناك بعض العثرات التي قد تؤثر على النتائج. عمر الكائنات الحية الدقيقة على سبيل المثال يؤثر على التعبير البروتين البكتيري وبالتالي فإن استنساخ النتائج. أولا، ظروف النمو قد يكون هناك مشكلة. وكمثال على ذلك، enterobacteria مثل كولاي تنمو بشكل أسرع من البكتيريا غير تخمر (على سبيل المثال، الزائفة aeruginos أ)، وبالتالي لا بد من تحليلها في وقت سابق 17. وثانيا، فإن المصفوفة تستخدم لMALDI-TOF MS تتكون من جزيئات الحمض العضوية الصغيرة التي لديها الليزر امتصاص بصري قوي لطول موجة الليزر المستخدمة. قبل التحليل يتم إضافة مصفوفة العينة وكلا العنصرين الخضوع لcrystallizatioعملية ن تشكل حلا الصلبة.

وهذا ما يفسر لماذا التغييرات في المصفوفة قد تؤثر على دقة تحديد البكتيريا 17. لذلك، الطازجة حلول مصفوفة، لا يزيد عمرها عن 7 أيام، وينبغي أن تستخدم. ثالثا، متوسطة من التي التقطت البكتيريا قد تؤثر على تحديد النتائج 17،68. على سبيل المثال، البنفسجي وضوح الشمس، وهو مكون من ماكونكي أجار، يتداخل مع أطياف الشامل 17. بالإضافة إلى ذلك، فإن العديد من البكتيريا أيضا تطبيقها على الهدف الصلب يؤدي إلى انخفاض درجات، وبالتالي تؤثر على دقة تحديد الهوية. ولذلك، فإنه من المستحسن أن تحدد معايير واضحة لكيفية إجراء تحليل. ومع ذلك، نتائج مضللة يؤديها MALDI-TOF MS هي سبب معظمها غير كافية الأطياف المرجعية الواردة في قاعدة البيانات. (حاليا يحتوي على قاعدة بيانات> 6000 إدخالات.) وهذا صحيح بشكل خاص تزال القضية للتعرف على البكتيريا اللاهوائية 17. ومع ذلك،ويمكن أن يضاف أطياف dditional من قبل المستخدم. مكتبة MALDI-TOF MS على سبيل المثال يحتوي على 98 الأطياف إشارة إضافية من العزلات التي لم تعالج بشكل كاف عن طريق قاعدة البيانات الأصلية، مثل الميكوبلازما س.، Myroides س.، البكتيريا س.، Roseomonas س.، Comamonas ليرة سورية. وChryseobacterium ليرة سورية. ونتيجة لذلك، سوف أطياف إشارة إضافية تؤدي إلى ارتفاع دقة تحديد 59،69. وأخيرا، في بعض الحالات أطياف من مختلف الأنواع متشابهة جدا. هذا يمكن أن يؤدي إلى عدم التعرف في حالات مثل التمييز من الإشريكية القولونية والشيجلا النيابة. أو العقدية الرئوية والعقدية هين 17،51.

تسلسل الحمض النووي المؤتلف 16S والجينات إضافية مثل rpoB وتبسيط تحديد الجزيئي للبكتيريا نادرة أو غير معروفة. هذه الجينات هي شائعة في معظم البكتيريا وظيفتها الفرديةمطابق. ومع ذلك، لأنها تملك ما يكفي من التباين الوراثي لإنتاج النتائج التي تسمح للتمايز على جنس ومستوى الأنواع، ويمكن استخدامها لتحديد البكتيريا 34. وفقا لStackebrandt وGÖBEL، homologies <97٪ وتمثل الأنواع المختلفة 61. ومع ذلك، homologies> 97٪ لا يؤدي بالضرورة إلى تحديد الأنواع آمن 34،47. هذه الشكوك لها عدة أسباب.

نوعية قواعد البيانات التي تستخدم لحساب homologies في بعض الأحيان مشكوك فيها 34. في الحالات التي توجد فيها homologies عالية على مستوى الحمض النووي المؤتلف 16S، قد يؤدي عدم اليقين في تحديد الأنواع. ولذلك فإن الجمع بين مناطق جينية مختلفة قد تؤدي إلى نتائج أكثر أمنا. وعلاوة على ذلك، لا توجد مبادئ توجيهية عامة لتفسير 16S الحمض النووي المؤتلف 22،34،61 تسلسل البيانات. ومع ذلك، وزيادة الاعتماد على قواعد البيانات الموجودة سيؤدي إلى هددت العاليمفعم بالحيوية لتحديد البكتيريا باستخدام هذا النهج الجزيئي 34. وفيما يتعلق رد فعل التسلسل علينا أن نذكر أن دقة نتائج التسلسل يعتمد في الغالب على نوعية PCR الكامنة. وعلاوة على ذلك، لأن النتائج يجري المكتسبة عن طريق مقارنتها الإدخالات المدرجة في قواعد البيانات العامة، ونوعية مدخلات تسلسل وصيانة البيانات ذات أهمية حاسمة.

بشكل عام، على الرغم من أن كلا النهجين، MALDI-TOF MS و 16S الريباسي التسلسل الجيني، لديها مزايا لديهم نقاط ضعف أيضا. الجمع بين الطريقتين، ومع ذلك، يؤدي إلى دقة عالية لتحديد البكتيريا. على سبيل المثال، في دراسة سابقة استطعنا إثبات أن MALDI-TOF MS غير قادرة على التمييز بين Myroides odoratimimus وMyroides odoratus 56. في حالات قليلة تشير النتيجة MALDI تحديد الأنواع لا يمكن الاعتماد عليها، في حين أن النتائج التي تم الحصول عليها عن طريق الحمض النووي المؤتلف 16S تسلسل يستطيع تأكيد الأنواعهوية. ثم تم إنشاؤها بصمات طيفية الجماعية لهذه العزلات وأدخلت في قاعدة البيانات MALDI إشارة الأطياف لدينا. بحث في المستقبل مع التركيز على البكتيريا نادرة أخرى قد تثبت انطباق الاستراتيجية المقترحة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CHROMASOLV, HPLC grade water, 1 L Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany 270733
Tissue Lyser LT Qiagen, Hilden, Germany 85600 Oscillating homogenizer
Glass-beads 1.0 mm VWR International, Darmstadt, Germany 412-2917
Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg, Germany 2050-100-05
QIAamp DNA Mini Kit (250) Qiagen, Hilden, Germany 51306
Taq PCR Core Kit (1,000 U) Qiagen, Hilden, Germany 201225
Forward Primer TPU1 (5´-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’) biomers.net, Ulm, Germany  -
Reverse Primer RTU4 (5´-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3´) biomers.net, Ulm, Germany  -
Mastercycler  Eppendorf, Hamburg, Germany -  Thermocylcer
Reaction tube 1.5 ml SARSTEDT, Nümbrecht, Germany 72,692
Reaction tube 2 ml SARSTEDT, Nümbrecht, Germany 72,693,005
PCR 8er-CapStrips Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 711040X
PCR 8er-SoftStrips Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 711030X
Sharp R-ZV11  Sharp Electronics, Hamburg, Germany - Microwave
Titriplex III (EDTA Na2-salt dehydrate; 1 kg) Merck, Darmstadt, Germany 1084211000
SeaKem LE Agarose Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 849006
SmartLadder SF - 100 to 1,000 bp Eurogentec, Lüttich, Belgium MW-1800-04
Bromophenol blue (25 g) Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany B0126
Xylene cyanol FF (10 g) Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany X4126
ComPhor L Maxi  Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany -
Ethidium bromide solution 1% (10 ml) Carl Roth, Karlsruhe, Germany 2218.1
Gel Doc 2000 Bio-Rad Laboratories, München, Germany - Gel-documentation system 
ExoSAP-IT (500 reactions) Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, United Kingdom 78201
Buffer (10x) with EDTA  Life Technologies, Darmstadt, Germany 402824
BigDye Terminator Kit v1.1 Life Technologies, Darmstadt, Germany 4337450
Hi-Di formamide (25 ml) Life Technologies, Darmstadt, Germany 4311320
DyeEx 2.0 Spin Kit (250) Qiagen, Hilden, Germany 63206
3130 Genetic Analyzer Life Technologies, Darmstadt, Germany - Sequencer
MicroAmp optical 96-well reaction plate with barcode Life Technologies, Darmstadt, Germany 4306737
3130 Genetic Analyzer, plate base 96-well Life Technologies, Darmstadt, Germany 4317237
3130 Genetic Analyzer, plate retainer 96-well Life Technologies, Darmstadt, Germany 4317241
3130 Genetic Analyzer, well plate septa Life Technologies, Darmstadt, Germany 4315933
3130 Genetic Analyzer, POP-7 Polymer, 7 ml Life Technologies, Darmstadt, Germany 4352759
3130 Genetic Analyzer, 4-Capillary Array, 50 cm Life Technologies, Darmstadt, Germany 4333466
Sequencing Analysis Software 5.4 Life Technologies, Darmstadt, Germany -
microflex Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Our mMIS
VITEK MS bioMérieux, Nürtingen, Germany  2nd mMIS
flexControl 3.4 Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Device control software
Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC) Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Analysis software
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA, 1 g Bruker Daltonik, Bremen, Germany 201344
Peptide Calibration Standard II Bruker Daltonik, Bremen, Germany 222570
MSP 96 target polished steel Bruker Daltonik, Bremen, Germany 8224989
peqGREEN peqlab  37-5010
MALDI Biotyper Galaxy  Bruker Daltonik, Bremen, Germany Part No. 1836007  Automated sample preparation system
Vitek 2  bioMérieux, Nürtingen, Germany  Our aMIS
MicroScan  Beckman Coulter, Krefeld, Germany 2nd aMIS
BD Phoenix™ Automated Microbiology System BD, Heidelberg, Germany 3rd aMIS
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC® 25923™) American Type Culture Collection (ATCC), LGC Standards, Molsheim, France Positive control for PCR 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzers - Getting Started Guide. , Applied Biosystems | HITACHI. Foster City, CA 94404, USA. (2010).
  2. Ch. 5. Applied Biosystems 3130/3130xl Genetic Analyzers - Getting Started Guide. , Applied Biosystems | HITACHI. Foster City, CA 94404, USA. 81-104 (2010).
  3. Adekambi, T., Drancourt, M., Raoult, D. The rpoB gene as a tool for clinical microbiologists. Trends Microbiol. 17 (1), 37-45 (2009).
  4. Almuzara, M. N., et al. First case of fulminant sepsis due to Wohlfahrtiimonas chitiniclastica. J.Clin.Microbiol. 49 (6), 2333-2335 (2011).
  5. Areekul, S., Vongsthongsri, U., Mookto, T., Chettanadee, S., Wilairatana, P. Sphingobacterium multivorum septicemia: a case report. J.Med.Assoc.Thai. 79 (6), 395-398 (1996).
  6. Aydin, T. T., et al. Chryseobacterium indologenes Septicemia in an Infant. Case Rep.Infect.Dis. 2014, 270521 (2014).
  7. Baillie, S., Ireland, K., Warwick, S., Wareham, D., Wilks, M. Matrix-assisted laser desorption/ionisation-time of flight mass spectrometry: rapid identification of bacteria isolated from patients with cystic fibrosis. Br.J.Biomed.Sci. 70 (4), 144-148 (2013).
  8. Benedetti, P., Rassu, M., Pavan, G., Sefton, A., Pellizzer, G. Septic shock, pneumonia, and soft tissue infection due to Myroides odoratimimus: report of a case and review of Myroides infections. Infection. 39 (2), 161-165 (2011).
  9. Bertelli, C., Greub, G. Rapid bacterial genome sequencing: methods and applications in clinical microbiology. Clin.Microbiol.Infect. 19 (9), 803-813 (2013).
  10. Bhuyar, G., Jain, S., Shah, H., Mehta, V. K. Urinary tract infection by Chryseobacterium indologenes. Indian J.Med.Microbiol. 30 (3), 370-372 (2012).
  11. Buchan, B. W., Ledeboer, N. A. Emerging technologies for the clinical microbiology laboratory. Clin.Microbiol.Rev. 27 (4), 783-822 (2014).
  12. Castillo-Rojas, G., et al. Comparison of Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis Strains isolated from water and clinical samples: antimicrobial susceptibility and genetic relationships. PLoS ONE. 8 (4), e59491 (2013).
  13. Chatzigeorgiou, K. S., Sergentanis, T. N., Tsiodras, S., Hamodrakas, S. J., Bagos, P. G. Phoenix 100 versus Vitek 2 in the identification of gram-positive and gram-negative bacteria: a comprehensive meta-analysis. J.Clin.Microbiol. 49 (9), 3284-3291 (2011).
  14. Clarridge, J. E. Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clin.Microbiol.Rev. 17 (4), 840-862 (2004).
  15. Crowley, E., et al. Evaluation of the VITEK 2 Gram-negative (GN) microbial identification test card: collaborative study. J.AOAC Int. 95 (3), 778-785 (2012).
  16. Crowley, E., et al. Evaluation of the VITEK 2 gram positive (GP) microbial identification test card: collaborative study. J.AOAC Int. 95 (5), 1425-1432 (2012).
  17. Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Applications of MALDI-TOF mass spectrometry in clinical diagnostic microbiology. FEMS Microbiol.Rev. 36 (2), 380-407 (2012).
  18. Crum-Cianflone, N. F., Matson, R. W., Ballon-Landa, G. Fatal case of necrotizing fasciitis due to Myroides odoratus. Infection. 42 (5), 931-935 (2014).
  19. Deak, E., et al. Comparison of the Vitek MS and Bruker Microflex LT MALDI-TOF MS platforms for routine identification of commonly isolated bacteria and yeast in the clinical microbiology laboratory. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 81 (1), 27-33 (2015).
  20. DeMarco, M. L., Ford, B. A. Beyond identification: emerging and future uses for MALDI-TOF mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. Clin.Lab.Med. 33 (3), 611-628 (2013).
  21. Deng, J., et al. Comparison of MALDI-TOF MS, gene sequencing and the Vitek 2 for identification of seventy-three clinical isolates of enteropathogens. J.Thorac.Dis. 6 (5), 539-544 (2014).
  22. Drancourt, M., Berger, P., Raoult, D. Systematic 16S rRNA gene sequencing of atypical clinical isolates identified 27 new bacterial species associated with humans. J.Clin.Microbiol. 42 (5), 2197-2202 (2004).
  23. Fenselau, C., Demirev, P. A. Characterization of intact microorganisms by MALDI mass spectrometry. Mass Spectrom.Rev. 20 (4), 157-171 (2001).
  24. Freney, J., et al. Septicemia caused by Sphingobacterium multivorum. J.Clin.Microbiol. 25 (6), 1126-1128 (1987).
  25. Funke, G., Frodl, R., Sommer, H. First comprehensively documented case of Paracoccus yeei infection in a human. J.Clin.Microbiol. 42 (7), 3366-3368 (2004).
  26. Funke, G., Funke-Kissling, P. Evaluation of the new VITEK 2 card for identification of clinically relevant gram-negative rods. J.Clin.Microbiol. 42 (9), 4067-4071 (2004).
  27. Funke, G., Funke-Kissling, P. Performance of the new VITEK 2 GP card for identification of medically relevant gram-positive cocci in a routine clinical laboratory. J.Clin.Microbiol. 43 (1), 84-88 (2005).
  28. Gaillot, O., et al. Cost-effectiveness of switch to matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry for routine bacterial identification. J.Clin.Microbiol. 49 (12), 4412 (2011).
  29. Gilchrist, C. A., Turner, S. D., Riley, M. F., Petri, W. A., Hewlett, E. L. Whole-genome sequencing in outbreak analysis. Clin.Microbiol.Rev. 28 (3), 541-563 (2015).
  30. Holland, R. D., et al. Rapid identification of intact whole bacteria based on spectral patterns using matrix-assisted laser desorption/ionization with time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun.Mass Spectrom. 10 (10), 1227-1232 (1996).
  31. Holmes, B., Owen, R. J., Hollis, D. G. Flavobacterium spiritivorum, a new species isolated from human clinical specimens. Int.J.Syst.Bacteriol. 32 (2), 157-165 (1982).
  32. Holmes, B., Owen, R. J., Weaver, R. E. Flavobacterium multivorum, a new species isolated from human clinical specimens and previously known as group IIk, biotype 2. Int.J.Syst.Bacteriol. 31 (1), 21-34 (1981).
  33. Jamal, W., Albert, M., Rotimi, V. O. Real-time comparative evaluation of bioMerieux VITEK MS versus Bruker Microflex MS, two matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry systems, for identification of clinically significant bacteria. BMC Microbiol. 14 (1), 289 (2014).
  34. Janda, J. M., Abbott, S. L. 16S rRNA gene sequencing for bacterial identification in the diagnostic laboratory: pluses, perils, and pitfalls. J.Clin.Microbiol. 45 (9), 2761-2764 (2007).
  35. Jin, W. Y., et al. Evaluation of VITEK 2, MicroScan, and Phoenix for identification of clinical isolates and reference strains. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 70 (4), 442-447 (2011).
  36. Jossart, M. F., Courcol, R. J. Evaluation of an automated system for identification of Enterobacteriaceae and nonfermenting bacilli. Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis. 18 (12), 902-907 (1999).
  37. Karas, M., Hillenkamp, F. Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons. Anal.Chem. 60 (20), 2299-2301 (1988).
  38. Koh, Y. R., et al. The first Korean case of Sphingobacterium spiritivorum bacteremia in a patient with acute myeloid leukemia. Ann.Lab.Med. 33 (4), 283-287 (2013).
  39. Kok, J., Chen, S. C., Dwyer, D. E., Iredell, J. R. Current status of matrix-assisted laser desorption ionisation-time of flight mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory. Pathology. 45 (1), 4-17 (2013).
  40. Koljalg, S., et al. First report of Wohlfahrtiimonas chitiniclastica from soft tissue and bone infection at an unusually high northern latitude. Folia Microbiol.(Praha). , (2014).
  41. Krishnamurthy, T., Ross, P. L. Rapid identification of bacteria by direct matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometric analysis of whole cells. Rapid Commun.Mass Spectrom. 10 (15), 1992-1996 (1996).
  42. Ktari, S., et al. Nosocomial outbreak of Myroides odoratimimus urinary tract infection in a Tunisian hospital. J.Hosp.Infect. 80 (1), 77-81 (2012).
  43. Lim, Y. M., Shin, K. S., Kim, J. Distinct antimicrobial resistance patterns and antimicrobial resistance-harboring genes according to genomic species of Acinetobacter isolates. J.Clin.Microbiol. 45 (3), 902-905 (2007).
  44. Marinella, M. A. Cellulitis and sepsis due to sphingobacterium. JAMA. 288 (16), 1985 (2002).
  45. McElvania, T. E., Shuey, S., Winkler, D. W., Butler, M. A., Burnham, C. A. Optimizing identification of clinically relevant Gram-positive organisms by use of the Bruker Biotyper matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system. J Clin.Microbiol. 51 (5), 1421-1427 (2013).
  46. Mellmann, A., et al. Evaluation of matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight mass spectrometry in comparison to 16S rRNA gene sequencing for species identification of nonfermenting bacteria. J.Clin.Microbiol. 46 (6), 1946-1954 (2008).
  47. Mignard, S., Flandrois, J. P. 16S rRNA sequencing in routine bacterial identification: a 30-month experiment. J.Microbiol.Methods. 67 (3), 574-581 (2006).
  48. Nomura, F. Proteome-based bacterial identification using matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS): A revolutionary shift in clinical diagnostic microbiology. Biochim.Biophys.Acta. , (2014).
  49. Opota, O., Croxatto, A., Prod'hom, G., Greub, G. Blood culture-based diagnosis of bacteraemia: state of the art. Clin.Microbiol.Infect. 21 (4), 313-322 (2015).
  50. Patel, J. B. 16S rRNA gene sequencing for bacterial pathogen identification in the clinical laboratory. Mol.Diagn. 6 (4), 313-321 (2001).
  51. Patel, R. MALDI-TOF MS for the Diagnosis of Infectious Diseases. Clin.Chem. , (2014).
  52. Pincus, D. H. Ch. 1. Encyclopedia of Rapid Microbiological Methods. Miller, M. J. , PDA, DHI. Baltimore; River Grove. 1-32 (2005).
  53. Potvliege, C., et al. Flavobacterium multivorum septicemia in a hemodialyzed patient. J.Clin.Microbiol. 19 (4), 568-569 (1984).
  54. Rebaudet, S., Genot, S., Renvoise, A., Fournier, P. E., Stein, A. Wohlfahrtiimonas chitiniclastica bacteremia in homeless woman. Emerg.Infect.Dis. 15 (6), 985-987 (2009).
  55. Risch, M., et al. Comparison of MALDI TOF with conventional identification of clinically relevant bacteria. Swiss Med.Wkly. 140, 13095 (2010).
  56. Schröttner, P., Rudolph, W. W., Eing, B. R., Bertram, S., Gunzer, F. Comparison of VITEK2, MALDI-TOF MS, and 16S rDNA sequencing for identification of Myroides odoratus and Myroides odoratimimus. Diagn.Microbiol.Infect.Dis. 79 (2), 155-159 (2014).
  57. Schröttner, P., Rudolph, W. W., Taube, F., Gunzer, F. First report on the isolation of Aureimonas altamirensis from a patient with peritonitis. Int.J.Infect.Dis. 29, 71-73 (2014).
  58. Schröttner, P., et al. Actinobacillus equuli ssp. haemolyticus in a semi-occlusively treated horse bite wound in a 2-year-old girl. Ger.Med.Sci. 11, Doc14 (2013).
  59. Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin.Infect.Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
  60. Shahul, H. A., Manu, M. K., Mohapatra, A. K., Chawla, K. Chryseobacterium indologenes pneumonia in a patient with non-Hodgkin's lymphoma. BMJ Case.Rep. 2014, (2014).
  61. Stackebrandt, E., Göbel, B. M. Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology. Int.J.Syst.Bacteriol. 44, 846-849 (1994).
  62. Tan, K. E., et al. Prospective evaluation of a matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry system in a hospital clinical microbiology laboratory for identification of bacteria and yeasts: a bench-by-bench study for assessing the impact on time to identification and cost-effectiveness. J.Clin.Microbiol. 50 (10), 3301-3308 (2012).
  63. Tanaka, K. The origin of macromolecule ionization by laser irradiation (Nobel lecture). Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 42 (33), 3860-3870 (2003).
  64. Thaiwong, T., Kettler, N. M., Lim, A., Dirkse, H., Kiupel, M. First report of emerging zoonotic pathogen Wohlfahrtiimonas chitiniclastica in the United States. J.Clin.Microbiol. 52 (6), 2245-2247 (2014).
  65. Török, M. E., Peacock, S. J. Rapid whole-genome sequencing of bacterial pathogens in the clinical microbiology laboratory--pipe dream or reality. J.Antimicrob.Chemother. 67 (10), 2307-2308 (2012).
  66. Toth, E. M., et al. Wohlfahrtiimonas chitiniclastica gen. nov., sp. nov., a new gammaproteobacterium isolated from Wohlfahrtia magnifica (Diptera: Sarcophagidae). Int.J.Syst.Evol.Microbiol. 58, (Pt 4) 976-981 (2008).
  67. Tristezza, M., Gerardi, C., Logrieco, A., Grieco, F. An optimized protocol for the production of interdelta markers in Saccharomyces cerevisiae by using capillary electrophoresis. J.Microbiol.Methods. 78 (3), 286-291 (2009).
  68. Valentine, N. B., Wahl, J. H., Kingsley, M. T., Wahl, K. L. Direct surface analysis of fungal species by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Rapid Commun.Mass Spectrom. 16 (14), 1352-1357 (2002).
  69. van Veen, S. Q., Claas, E. C., Kuijper, E. J. High-throughput identification of bacteria and yeast by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry in conventional medical microbiology laboratories. J.Clin.Microbiol. 48 (3), 900-907 (2010).
  70. Verma, R. K., Rawat, R., Singh, A., Singh, D. P., Verma, V. Sphingobacterium multivorum causing fatal meningoencephalitis: a rare case report. Int.J.Res.Med.Sci. 2 (4), 1710-1712 (2014).
  71. Yabuuchi, E., Kaneko, T., Yano, I., Moss, C. W., Miyoshi, N. Sphingobacterium gen. nov., Sphingobacterium spiritivorum comb. nov., Sphingobacterium multivorum comb. nov., Sphingobacterium mizutae sp. nov., and Flavobacterium indologenes sp. nov.: Glucose-nonfermenting Gram-negative rods in CDC groups IIK-2 and IIb. Int.J.Syst.Bacteriol. 33 (3), 580-598 (1983).

Tags

عدوى، العدد 113، البكتيريا، تحديد الهوية، 16S الريباسي التسلسل الجيني، MALDI-TOF MS، مسببات الأمراض النادرة، مقارنة طرق التشخيص وعلم الأحياء المجهرية
تحديد مسببات الأمراض البكتيرية النادرة التي 16S الريباسي جين تسلسل وMALDI-TOF MS
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schröttner, P., Gunzer, F.,… More

Schröttner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS. J. Vis. Exp. (113), e53176, doi:10.3791/53176 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter