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Immunology and Infection

La identificación de patógenos bacterianos raras por 16S rRNA gen secuenciación y MALDI-TOF MS

Published: July 11, 2016 doi: 10.3791/53176
Automatic Translation
1, 1, 2, 2
1Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, TU Dresden, 2Institut für Virologie, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, TU Dresden

Abstract

Hay un número de patógenos bacterianos raras y, por lo tanto, se ha descrito suficientemente que se presentan para causar infecciones graves, especialmente en pacientes inmunocomprometidos. En la mayoría de los casos, sólo unos pocos datos, publicados en su mayoría como informes de casos, los cuales están disponibles investigar el papel de los agentes patógenos tales como un agente infeccioso. Por lo tanto, con el fin de aclarar el carácter patógeno de tales microorganismos, es necesario llevar a cabo estudios epidemiológicos que incluyen un gran número de estas bacterias. Los métodos utilizados en un estudio de este tipo de vigilancia tienen que cumplir los siguientes criterios: la identificación de las cepas ha de ser precisa, según la nomenclatura válida, deben ser fáciles de manejar (robustez), económico en el diagnóstico de rutina y tienen que generar comparables resultados entre diferentes laboratorios. En general, hay tres estrategias para la identificación de cepas bacterianas en condiciones de rutina: 1) la identificación fenotípica caracterizar la Biochemical y metabólicas propiedades de las bacterias, 2) técnicas moleculares, tales como la secuenciación de genes 16S rRNA y 3) la espectrometría de masas como un enfoque basado en la novela proteoma. Desde espectrometría de masas y enfoques moleculares son las herramientas más prometedoras para la identificación de una gran variedad de especies bacterianas, se describen estos dos métodos. Se discuten los avances, limitaciones y problemas potenciales cuando se utilizan estas técnicas.

Introduction

Identificación segura de patógenos raras en el diagnóstico de rutina se ve obstaculizada por el hecho de que los métodos de cultivo y bioquímicos clásicos son engorrosos y, a veces cuestionable. Además, un laboratorio de microbiología de diagnóstico tiene que procesar un gran número de patógenos, que van desde unos pocos cientos a varios miles, a diario, lo que requiere el uso de sistemas automatizados. Además de la gestión de un diario de alto rendimiento, se necesita la identificación precisa de especies bacterianas. Esto se justifica ya que difieren en su patrón de susceptibilidad antimicrobiana y, por tanto, la identificación correcta proporciona al médico información esencial para elegir los antibióticos apropiados (por ejemplo, Enterococcus spp., Acinetobacter spp.) 12,43.

Sistemas automatizados de identificación microbiana (AMIS) se aplican conjuntos estandarizados de reacciones enzimáticas para caracterizar las propiedades metabólicas de las bacterias aisladas por ejemplo, 47 en la tarjeta de GN de las AMI utilizado en este estudio 52, esta estrategia permite la identificación segura sólo para un conjunto limitado de bacterias. Por otra parte, la base de datos, un sistema experto avanzado, se centra claramente en la detección de bacterias competentes y altamente relevantes de importancia médica 13,15,16,36. Dos sistemas adicionales, se utiliza ampliamente en los laboratorios, se aplican también este enfoque bioquímico para la identificación de bacterias. Estudios recientes demuestran una exactitud de identificación comparables entre los Amis utilizados en este estudio y uno de los competidores (93,7% y 93,0% respectivamente), mientras que la 3ª Amis tiene una precisión identificación de solamente el 82,4% de las especies de nivel 35. Estas discrepancias pueden ser explicadas por la calidad de las referencias de datos de identificación subyacentes, las versiones de los kits y software, las diferencias de metabolismo y la competencia del personal técnico 35,36.

Se utilizan principalmente dos sistemas automatizados MALDI-TOF MS (sistema de identificación microbiana MALDI-TOF, MMI). Estos sistemas permiten la detección de un gran número de especies bacterianas en función de su proteína de espectros de masas de huellas dactilares. Por ejemplo, la base de datos de los MMIS utilizados contiene 6.000 espectros de referencia. Sistemas de identificación basados ​​en espectrometría de masas ofrecen una detección rápida y fiable de una gran variedad de microorganismos patógenos incluyendo raras 11,48,51. Hasta la fecha sólo unas pocas comparaciones directas están disponibles entre las MMIS utilizados en este estudio y su competidor 19,33. De acuerdo con DÆK et al. Ambos sistemas proporcionan una alta tasa similar de exactitud de identificación, pero los MMIS utilizados en este estudio parece ser más fiable en la identificación de especies 19.

genes distintos Del mismo modo, las técnicas moleculares direccionamiento bien conservadas, sino también ( rpoB) permiten una clara identificación de las especies 3,22,61. Entre estos, el 16S rDNA es la limpieza de genes más ampliamente utilizado debido a su presencia en todas las bacterias 34. Su función se mantiene sin cambios y, por último, con aproximadamente 1.500 pb, que es el tiempo suficiente para ser adecuado para la bioinformática 14,34. Muchos investigadores consideran que el análisis del gen 16S rRNA como el "estándar de oro" para la identificación de bacterias 21. Esto es debido al hecho de que algunos laboratorios utilizan técnicas de hibridación ADN-ADN hasta la fecha para la identificación de bacterias raras o nuevas 14,34. Además, más y más bases de datos están disponibles, que puede ser utilizado para el análisis de genes 16S rRNA 50. Sin embargo, ha de tenerse en cuenta que los sistemas de detección basados ​​16S rDNA tienen una sensibilidad limitada en comparación con protocolos de PCR estándar. Además, el enfoque molecular es sofisticado, consume tiempo y requiere personal altamente capacitado, así comoinstalaciones de los laboratorios dedicados y es, por lo tanto, no se implementan fácilmente en el diagnóstico de rutina 55. Además, se ha demostrado que la combinación de al menos dos métodos diferentes de identificación bacteriana conduce a la identificación de cepas de alta precisión. La combinación de secuenciación de MALDI-TOF MS y 16S rDNA permite la identificación de un gran número de diferentes especies bacterianas con alta precisión. Recientemente se presentó la combinación de análisis de genes MALDI-TOF MS y 16S ARNr de identificación bacteriana estudiar las cuestiones epidemiológicas y patógenos raros 56.

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Protocol

1. Extracción de ADN bacteriano

  1. Preparación de la solución PBS
    1. Pesar 1,65 g de Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O, 0,22 g de NaH 2 PO 4 x 2 H 2 O y 8,80 g de NaCl en un matraz y llenar con agua destilada hasta un volumen final de 1.000 ml. Ajustar el pH a 7,4. Para uso final filtrar la solución a través de una prueba de bacterias (0,22 m) de filtro.
  2. Las bacterias Extracción de ADN de bacterias Gram-negativas
    1. Streak el material del paciente en un medio de cultivo apropiado (por ejemplo, Columbia agar sangre), identificar y aislar los patógenos potenciales.
    2. Preparar cultivo puro y llevar a cabo la tinción de Gram para determinar morfotipo y para confirmar la pureza y de la cultura 49.
    3. Elija una sola colonia bacteriana y transferirlo con un 1 l de un solo uso asa de siembra en un tubo de reacción de 2,0 ml estéril que contiene 1 ml de solución de PBS.
    4. Incubar esta suspensión en una thermomixer a 95 ° C durante 10 minutos. Después de la incubación, dejar que el extracto bacteriano (que contiene el ADN disuelto) enfriar a temperatura ambiente y, o bien utilizarla directamente para la amplificación o almacenar a -20 ° C para su uso posterior (Figura 1a).
  3. Las bacterias Extracción de ADN de bacterias Gram-positivas
    1. Streak el material del paciente en un medio de cultivo apropiado (por ejemplo, Columbia agar sangre), identificar y aislar los patógenos potenciales. Realizar tinción de Gram con el fin de confirmar morfotipo de la cultura.
    2. Preparar cultivo puro y llevar a cabo la tinción de Gram para determinar morfotipo y para confirmar la pureza del cultivo.
    3. Elija una sola colonia bacteriana con un asa de siembra estéril y 1 l suspenderlo en 500 l de PBS solución en un tubo de 2,0 ml de reacción.
    4. Añadir 500 l de vidrio-cuentas y transferir el tubo a un homogeneizador oscilante, que funciona a la frecuencia máxima y la amplitud (50 Hz), por 5 min. Utilizar perlas de vidrio de 1,0 mm de diámetropara interrumpir las paredes celulares bacterianas.
    5. Incubar este tubo durante 10 min a 95 ° C y se enfría a temperatura ambiente. El uso del extracto, ya sea directamente para la reacción de PCR o almacenar a -20 ° C para su uso posterior.

2. 16S rDNA PCR

  1. Preparación de Cebadores de amplificación
    1. Utilice la TPU1 cebadores (5'-GTT AGA TGA TCM CTC TGG AG-3 '[M = A / C]) como cebador directo y RTU4 (5'-TAC CAG ATC GGT TGT TAA TCC T-3') como cebador inverso 25. Preparar una solución de imprimación de valores con DNasa y RNasa libre de agua, que tiene una concentración de 100 pmol / l (100 mM) y diluir aún más a una solución de trabajo a las 10 pmol / l. Guarde el archivo de imprimación y la solución de trabajo a -20 ° C o utilizar directamente.
  2. Preparación de la mezcla de reacción PCR
    1. Pipeta de 1 l de cada cebador, 1 l dNTP-mix (100 mM), 2,5 l de extracto de ADN, 5 l de 10x tampón de PCR (que contiene Mg 25 mMCl 2), 0,25 l de Taq-polimerasa (5 unidades / l) y 39,25 l DNasa y RNasa libre de agua de PCR en un tubo de reacción l estéril 200.
  3. Protocolo de PCR
    1. Iniciar el programa de PCR construido de la siguiente manera: En primer lugar, una etapa de incubación inicial a 95 ° C durante 5 min, que es necesario para activar la Taq-polimerasa. En segundo lugar, 35 ciclos de amplificación, que contiene un 1 min. paso de desnaturalización a 95 ° C, a 1 min. paso de reasociación del cebador a 50 ° C, y una etapa de extensión del cebador 1,5 min a 72 ° C. En tercer lugar, una extensión final de 10 min a 72 ° C. Por último, la reacción de PCR se enfría a 4 ° C.
      NOTA: Staphylococcus aureus y H 2 O sirven como control positivo y negativo (Figura 1b).
    2. Se coloca el tubo que contiene la mezcla de reacción de PCR en el termociclador e iniciar el programa.
  4. La purificación del producto de PCR
    NOTA: Con el fin de purificar el producto de la PCR, ya sea varios protocolosSe pueden usar enzimático basado o con una matriz de adsorción de sílice. La PCR de un solo paso de limpieza utilizado aquí utiliza dos reacciones enzimáticas hidrolíticas. Mientras exonucleasa I (Exo I) elimina ADN de cadena sencilla, la fosfatasa alcalina de gamba (SAP) hidroliza dNTPs no incorporados. El segundo procedimiento se basa en una técnica de adsorción de la membrana de sílice con una sal de alta unión rápida - lavar - ciclo de elución baja en sal.
    1. Añadir 1,5 l de una mezcla enzimática que contiene tanto Exo I y SAP para 25 l producto de PCR, mezclar bien y transferir a un termociclador aplicando un protocolo simple de los primeros 15 min a 37 ° C seguido de 15 min a 80 ° C. Almacenar el producto de PCR purificado, ya sea a -20 ° C o usarlo directamente como objetivo para el etiquetado de PCR.

3. ADN en gel de agarosa La electroforesis

  1. Preparación del tampón de electroforesis (TBE-buffer)
    1. Valorar 54,0 g de base TRIS (mM 445), 27,5 g (445 mM) de ácido bórico y 20 ml de una M EDTA 0,5 (10mM) solución a pH 8,0 con NaOH en un matraz y llenarlo con agua destilada hasta un volumen total de 1.000 ml. Luego se diluye este buffer 5x 1:10 con agua destilada (TBE 0,5x) para la electroforesis.
  2. Preparación del tampón de carga
    1. Mezclar 250 mg de azul de bromofenol, 250 mg FF xileno cianol y 15 g de polisucrosa (Tabla de Materiales) en un matraz. Luego llenarlo con tampón TBE 0,5x a un volumen total de 100 ml. Alícuota del colorante de carga de porciones de 1 ml y se almacena a -20 ° C para su posterior uso.
  3. Reparto del gel de agarosa
    1. Pesar 6 g de electroforesis de agarosa estándar de 300 ml de tampón TBE 0,5x (ver sección 3.1.1) en un matraz, para preparar un 2% (w / v) en gel de agarosa. A continuación, poner la mezcla de agarosa en un horno de microondas, calentar punto cerca de ebullición hasta que la agarosa se disuelve completamente y la solución aparece clara.
    2. Deje que los agarosa fundida se enfríe lo suficiente y añadir 10 l de un 1% (w / v) de bromuro de etidio Stock Solución. Verter la solución en un molde y colocar un peine de gel (permitiendo 30 pozos) en el reparto. Retire el peine cuando el gel está completamente solidificado y poner el gel en la cámara de electroforesis que contiene tampón TBE 0,5x.
      NOTA: El bromuro de etidio es tóxico y mutagénico. Por lo tanto, debe manejarse con precaución. Es aconsejable el uso de guantes de nitrilo. Hay manchas de ácidos nucleicos intercalante alternativos que se pueden utilizar como una alternativa no tóxica.
  4. En gel de agarosa La electroforesis de los productos de PCR
    NOTA: Con el fin de verificar el tamaño correcto de los amplicones de PCR y para estimar la concentración de ADN del producto de PCR purificado se separa en un gel de agarosa.
    1. Pipetear 2 l de tampón de carga en un tubo de reacción de PCR y añadir 8 l de producto de PCR. Pipetear esta mezcla en los pocillos del gel. Añadir 8 l de un marcador de tamaño de peso molecular (escalera de ADN) en un pocillo separado para estimar el tamaño del producto de PCR.
    2. Aplicaruna tensión constante a 10 V / cm y detener la electroforesis tan pronto como el marcador de azul de bromofenol ha alcanzado aproximadamente ¾ de la longitud total del gel. Visualizar los fragmentos de PCR separadas utilizando un transiluminador de UV (longitud de onda de 302 nm) y documentarlos mediante un sistema de gel-documentación. Estimar la cantidad de ADN por comparación visual con la escalera de ADN. Utilice aproximadamente 10 ng como objetivo para el etiquetado de PCR.

4. La secuenciación de Sanger

  1. Ciclo de Secuenciación PCR
    NOTA: Realice el etiquetado PCR en una reacción de 10 l usando un kit comercial (Tabla de Materiales).
    1. Añadir 2 l de mezcla maestra de reacción 5x, 2 l de la preparación de ADN, 1,5 l de TPU1 o RTU4 solución de trabajo (10 pmol / l) y 4,5 l de DNasa y RNasa libre de agua.
    2. Ponga esta mezcla de reacción de secuenciación en un termociclador de PCR y ejecutar otro. En total, 25 ciclos de proceso que consiste en una etapa de desnaturalización (96 ° C,10 seg), una etapa de recocido (45 a 60 ° C, 5 segundos) y un paso de extensión (60 ° C, 2 min). Finalmente, se enfría la reacción a 4 ° C.
  2. Purificación de la reacción de secuenciación
    1. Se purifica la mezcla de reacción de marcaje utilizando columnas de centrifugación comerciales de purificación de PCR (Tabla de Materiales).
    2. Carga de 10 l de la reacción de secuenciación en la matriz de filtración en gel pre-hidratado y realizar una etapa de centrifugación a 750 xg durante 3 min.
      NOTA: Por el uso de este procedimiento tintes terminadores no incorporados son retenidas en la matriz de gel.
    3. A continuación, secar el eluato acuoso en un concentrador de vacío. Centrifugar a 2500 xg durante 20 a 30 min a 40 ° C para completar la sequedad.
    4. Añadir 10 l de formamida desionizada altamente continuación desnaturalice a 90 ° C durante 2 min y se enfría la mezcla en hielo. Pipeta de 10 l de las muestras desnaturalizadas en una placa de 96 l. Almacenar el producto de PCR secado y limpiado a -20 ° C si el análisis espara ser llevado a cabo en un momento posterior.
  3. 16S rRNA gene secuenciación y análisis de la secuencia de ADN
    NOTA: Realizar análisis de la secuencia en un secuenciador automatizado (Tabla de Materiales). El secuenciador se usa aquí es un sistema de electroforesis capilar basado en la fluorescencia automatizado que analiza 4 muestras simultáneamente (matriz de 50 cm 4-capilar) con un polímero líquido 67 (Figura 1c).
    1. Coloque la placa de microtitulación en el secuenciador. Escribir una hoja de muestra (placa de registro) como se establece en 2, guardarlo y comenzar la secuencia de arranque / análisis siguiendo los pasos dados en 1.
      NOTA: Duración de una secuencia de ejecución es de 2 horas y proporciona datos de 800 a 1.000 pb.
    2. Abra el software de análisis de secuenciación (Tabla de Materiales). Los datos de secuencia se dan como un archivo de texto (.seq) y un archivo que contiene el electroferograma incluyendo valores de calidad (QV) (.ab1).
      NOTA: Base de llamada es automáticamente porformado por el software de análisis de secuenciación y el electroferograma subyacente se comprueba visualmente (por ejemplo, la altura del pico, la separación de pico) antes de la secuencia se utiliza para otras aplicaciones.
    3. Comparar el archivo de secuencia de ADN almacenada para el algoritmo BLAST nr base de datos NCBI utilizando (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Nucleotide).

5. MALDI-TOF MS

NOTA: El espectrómetro de masas utiliza un 337 nm N 2 de láser y es operado por un software específico de control (Tabla de Materiales). Los espectros se registraron en el modo lineal y un intervalo de masas entre 2.000 a 20.000 Da está cubierto. Interpretación de los datos y la asignación de las puntuaciones de las muestras se lleva a cabo en tiempo real mediante un software de análisis (Tabla de Materiales) (Figura 1d).

  1. Preparación de las bacterias por MALDI-TOF MS análisis
    1. Cultivar las bacterias de interés (por ejemplo, Myroides odoratimimus) en Colagar sangre Umbia que contiene sangre de caballo 5% a 37 ° C durante 18 a 24 horas, dependiendo de la cepa bacteriana (Figura 2a). Realizar tinción de Gram para verificar el morfotipo del organismo bajo investigación, así como la pureza de la cultura.
    2. Utilice un palillo de madera para la transferencia de una sola colonia bacteriana a un pocillo de una diana de acero de 96 pocillos (Figura 2b y 2c). Punto 1 l de ácido fórmico al 70% en la parte superior del organismo se secó al aire en la diana de acero y dejar secar durante aproximadamente 2-3 minutos.
    3. Entonces, superponer el punto con una solución de matriz de 1 l, que contiene 50 mg / ml CHCA (α-ciano-4-hidroxicinámico) en un disolvente orgánico (50% de acetonitrilo, ácido trifluoroacético 2,5%, 47,5% H 2 O).
      NOTA: El método de superposición de ácido (en el método de preparación de la placa) se puede utilizar para mejorar la calidad de los espectros de masas. Se ha demostrado que para las bacterias Gram-positivas tales como un "ataque ácido" aumenta la puntuación de VAlues de los espectros medidos 45.
      NOTA: Como alternativa, un sistema de preparación automática de muestras (Tabla de Materiales) se puede usar en el que los puntos de contacto libre de 1 l 70% de solución de ácido fórmico y, después de un primer ciclo de secado, la solución de matriz de 1 l se aplican en el frotis bacteriano. Las muestras se secan a continuación en condiciones estandarizadas a 60% de humedad relativa y están listos para usar para el análisis.
    4. Deje que el frotis con matriz superpuesta de secado al aire de nuevo durante unos 5 minutos en una campana. Este frotis bacteriana con la matriz aplicada es ahora estable durante muchas horas.
      NOTA: frotis bacteriana sin matriz puede no ser estable debido a la degradación de proteínas.
  2. Realizar el análisis MS MALDI-TOF
    1. Introducción de muestras
      1. Abra el software de control de nuestros MMIS Materiales (Tabla).
      2. Airear el puerto de carga de muestra del espectrómetro de masas pulsando el botón IN / OUT del instrumento.
      3. Abra la puerta de carga después de un clic e introduzca la placa diana MALDI-TOF MS con la mancha bacteriana seca más la matriz.
      4. Cerrar el puerto y evacuar de nuevo. Observar al vacío y cuando llega a 4,5 x 10 -6 mbar iniciar la medición.
    2. Análisis de las muestras
      1. Abra el software de análisis de nuestros MMIS (Tabla de Materiales) y haga clic en el menú "Archivo". Seleccione "Nueva clasificación" y un nuevo "asistente de clasificación en tiempo real MALDI Biotyper" ventana se abre. Escriba el nombre del proyecto, por ejemplo "Proyecto_1 medición Myroides, en el campo" Nombre del proyecto "y pulse el botón" Nuevo ". Bajo el nuevo cuadro de diálogo llamado" Nuevo proyecto "nombre del proyecto de verificación y proceder pulsando el botón" OK ".
      2. En el "asistente de clasificación Biotyper MALDI tiempo real" observar la ventana de "colocación de analitos" abierta. Seleccione posiciones de destino (por ejemplo, A1, A2, A3 ...), haga click cualquier posición seleccionada (indicado por un cuadrado azul) y seleccionar "Añadir muestras". En la vista de tabla de tipo abierto automáticamente en nombre de la muestra, identificación de la muestra y, opcionalmente, un comentario. Haga clic en el botón "Siguiente" para continuar.
      3. En el "asistente de clasificación Biotyper MALDI tiempo real" observar la ventana "Selección de métodos MALDI Biotyper" abierta. Seleccione "Bruker Taxonomía" de "proyectos de tamaño mediano de los árboles de la taxonomía" y haga clic en "Siguiente" para continuar.
      4. En el "asistente de clasificación Biotyper MALDI tiempo real" observar la ventana "Resumen del proyecto" abierto. Compruebe las entradas insertadas dadas anteriormente para el proyecto actual clasificación. Comience la clasificación ejecutar pulsando el botón "Finalizar" (Figura 2d - f). La medición se inicia automáticamente cuando se alcanza el vacío apropiado.
      5. Siga la carrera de clasificación hasta que la medida se ha realizado correctamente. Ver la tabla de resultados en tque "MALDI Biotyper Realtime Myroides Proyecto de Clasificación de medición Proyecto_1" abrir el menú "Ver" y haga clic en "Resultados".
      6. Ver las "Bruker MALDI Daltonics Biotyper Clasificación Resultados" como archivo HTML en el navegador web por defecto. Imprimir y guardar los resultados.
    3. Medir una norma de prueba diariamente antes de análisis de la muestra para calibrar el instrumento y realizar instrumento semanal de validación (instrumento de auto-test).
      NOTA: Durante la medición MALDI-TOF espectros se analizó en tiempo real por el software de análisis (Tabla de Materiales). Una lista de las diez especies con sus respectivos puntajes se da y se introduce en el sistema de información de laboratorio (LIS) para la presentación de informes.
    4. Evaluar críticamente los resultados de MALDI-TOF MS (ver resultados representativos) y, en su caso, se incluyen otras pruebas, tales como perfiles de susceptibilidad a los antibióticos y biochemical- o secuenciación del gen 16S rRNA y, si es necesario, para la tinción de Gramla asignación de una especie bacteriana al informe microbiológico.

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Representative Results

MALDI-TOF MS es una novela, método rápido y barato para el diagnóstico de rutina microbiológicos. La identificación de especies bacterianas mediante MALDI-TOF MS produce espectros compuesto principalmente de proteínas ribosomales, sino también otras proteínas muy conservadas "con funciones de mantenimiento de la casa afectadas en grado mínimo y por las condiciones ambientales" .El 17 de la base de datos de este MMIS contiene un amplio conjunto de espectros de referencia e incluso las bacterias que rara vez se encuentran en cepas clínicas pueden identificarse de forma segura 7,56,57. Puntuación valores muestran la fiabilidad de las especies identificadas. Las puntuaciones por encima de 2.300 representan una identificación de especies altamente probable, una puntuación de entre 2.000 y 2.300 indica una identificación de las especies seguro, una puntuación de entre 1.700 y 2.000 puestos de identificación de especies probable y una puntuación por debajo de 1.700 no es fiable. En el caso de más de una especie de ser identificado con una puntuación superior a 2.000, TES adicionalests tienen que aplicarse y esta es la razón por la cual hemos combinado diferentes métodos tales como la secuenciación del 16S rDNA, API y técnicas que abordan la morfolina y / o fenotipo bacteriana tales como la tinción de Gram, la movilidad, etc. En el caso en que la puntuación es inferior a 1.700 las pruebas mencionadas anteriormente tienen que ser utilizados para lograr la identificación de especies fiable. Una combinación de MALDI-TOF MS y la secuenciación del 16S rDNA se ha demostrado recientemente 56-58. Cabe señalar que las directrices claras para la determinación de las especies sobre la base de 16S rDNA homologías de secuencia que aún no existan 22,61. Para la interpretación práctica, homologías de ≥97%, según lo propuesto por Stackebrandt y Göbel 61, se utilizan 56. Los avances en la secuenciación del ADN permiten la determinación de genomas bacterianos enteros mediante técnicas de nueva generación en el coste relativamente bajo y, por lo tanto, en principio, la identificación de bacterias en función de su secuencia del genoma. Esta técnica ya se ha utilizado engestión del brote del genoma basado en la epidemiología o 9,29. Sin embargo, la limitación más fuerte hoy en día es la falta de fácil de usar paquetes de software para el usuario final 65.

Siete ejemplos de bacterias que se producen raras, aisladas de las muestras de paciente durante el diagnóstico de rutina y analizados por tanto MALDI-TOF secuenciación de genes MS y 16S rRNA se enumeran en la Tabla 1. MALDI-TOF espectros de la cepa # 1 a # 6 se muestra en la Figura 3 y un espectro de la cepa # 7, Sphingobacterium spiritivorum, se muestra en la Figura 1e. Todos los aislados muestran altas puntuaciones en el análisis MALDI-TOF MS y 99 a 100% 16S rDNA homologías de secuencia. Por lo tanto, las dos técnicas conducen a asegurar género y especie de identificación. Sin embargo, como se ha señalado en una reciente publicación en la comparación de los métodos de identificación de Myroides sp., La combinación de secuenciación de genes MALDI-TOF MS y 16S rRNA llevó a r más fiableesultados 56. Estos datos ilustran que un solo método utilizado puede no ser siempre suficiente para lograr un resultado de identificación fiable. La combinación de dos métodos independientes conduce a una mayor precisión y se expande la base de datos comercial MALDI-TOF MS con en-casa entradas resultaron en una identificación inequívoca especies 56.

Strain # 1 fue identificado como Chryseobacterium gleum (puntuación de MALDI-TOF MS 2.490, de homología de secuencia 99%). Chryseobacteria son fermentación no bacilos Gram negativos, y en relación con Myroides spp. Chryseobacterium spp. son considerados como patógenos emergentes, asociados con la septicemia, neumonía e infecciones del tracto urinario. El Chryseobacterium género comprende un gran número de especies y de las especies mejor estudiadas es indologenes Chryseobacterium. Similar a las infecciones causadas por Myroides sp., Los pacientes inmunocomprometidos se ven afectados principalmente6,10,60. Cepa # 2 fue identificado como Myroides odoratimimus (puntuación de MALDI-TOF MS 2.436, de homología de secuencia del 99%) y la cepa # 3 como Myroides odoratus (puntuación de MALDI-TOF MS 2.237, de homología de secuencia del 99%) Myroides sp. son Gram-negativas, cañas fermentadoras, que están asociados con enfermedades graves como sepsis, celulitis o neumonía. Mayormente pacientes inmunocomprometidos con enfermedades hematológicas o oncológicos subyacentes se ven afectados 8,18,42. Cepa # 4 fue identificado como Sphingobacterium multivorum 32,71 (MALDI-TOF MS anotar 2.092, de homología de secuencia del 99%).

Las bacterias son bacilos Gram-negativos no fermentadores, que pueden causar septicemia en pacientes inmunocomprometidos 5,24,44,53. Además, un caso de meningoencefalitis mortales ha informado 70. Las manchas # 5 (MALDI-TOF MS puntuación de 2.282, la homología de secuencia del 100%) y # 6 (MALDI-TOF MS puntuación de 2,289, homólogo de la secuenciay el 100%) fueron identificados como Wohlfahrtiimonas chitiniclastica. Estas bacterias son cortos, no móvil, bacilos Gram-negativos que se aislaron por primera vez de las larvas del parásito de la mosca wohlfahrtia magnifica y que se describen en el año 2008 66. Estas bacterias zoonóticas son considerados como patógenos emergentes y agentes causantes de bacteriemia, septicemia o infecciones de tejidos blandos 4,40,64. Curiosamente, la mayoría de los pacientes informados fueron ya sea sin hogar y / o sufrido de alcoholismo y, por lo tanto, la aparición de estos patógenos raros se puede explicar por la mayor tasa de ectoparásitos en la población sin hogar 4,54. Strain # 7, Sphingobacterium spiritivorum (MALDI-TOF MS puntuación de 2,269, de homología de secuencia 100%), es un patógeno raro. Puede causar infecciones en pacientes inmunocomprometidos y los primeros aislamientos humanos fueron descritos en 1982 31,71. Un reciente informe identifica como agente causal Sphingobacterium spiritivorum para un caso fatal de bacteremia y sepsis en un paciente con leucemia mieloide aguda 38.

Figura 1
Figura 1:. Flujo de trabajo para el ácido nucleico y / o la detección basada en espectrometría de masas de bacterias clínicamente relevantes en el laboratorio de microbiología médica A partir de un cultivo puro (a), el ADN diana se amplifica en un termociclador (b). Amplicones de PCR se secuenciaron en un secuenciador de cuatro capilar utilizando la tecnología de Sanger (c). Secuenciación resultados se determinan como porcentaje de homologías de secuencias de consulta a entradas de la base de la comparación asistida por ordenador. Un segundo, proteómica método basado, utiliza la espectrometría de masas (d) y en el centro un resultado espectroscópico de masas de la cepa # 1 en la Tabla 1, Sphingobacterium spiritivorum, incluido su nivel de MALDI-TOF MS, se da (e </ Strong>). Una combinación de espectrometría de masas y secuenciación del gen 16S rRNA puede ser necesario, con el fin de lograr una identificación de las especies más fiable y preciso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2:. Análisis procedimiento usando MALDI-TOF MS para la identificación de bacterias clínicamente relevantes Un operador toma el material bacteriana de células enteras (a) con un palillo de dientes a partir de un cultivo puro (b) y coloca frotis bacterianas en una diana de acero (c). El objetivo de acero se inserta en el puerto de carga del espectrómetro de masas. Cuando se alcanza el vacío apropiado de 5 x 10 -6 mbar, el objetivo se mueve a la cámara de ionización. El uso de un -lase N 2r, los iones son creados por desorción suave que luego se aceleran en un campo electrostático (d) y se separó en el tubo de vuelo (e). El tiempo de vuelo (TOF) que se necesita para los iones para alcanzar el detector del tubo de vuelo (F) está directamente relacionada con su masa y forma la base de los cálculos posteriores de picos de masa. Software específico de identificación (Tabla de Materiales) a continuación, asigna valores de puntuación de la huella digital espectro de masas de proteínas bacterianas ionizados. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figura 3
Figura 3: MALDI-TOF espectros y asignados decenas de agentes patógenos raros en esta figura, los espectros de MALDI-TOF representativo de los primeros seis patógenos lis raras.Ted en la Tabla 1 se muestran. Nombre de la especie y la puntuación de MALDI-TOF MS correspondiente se indican en cada espectro. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

# 3
Tensión identificación MALDI El marcador MALDI Resultado 16s rDNA homología BLAST
# 1 gleum Chryseobacterium 2.211 gleum Chryseobacterium 99% de identidad
# 2 Myroides odoratimimus 2.397 Myroides odoratimimus 99% de identidad
Myroides odoratus 2.237 Myroides odoratus 99% de identidad
# 4 Sphingobacterium multivorum 2,093 Sphingobacterium multivorum 99% de identidad
# 5 chitiniclastica Wohlfahrtiimonas 2.282 chitiniclastica Wohlfahrtiimonas 100% de identidad
# 6 chitiniclastica Wohlfahrtiimonas 2.289 chitiniclastica Wohlfahrtiimonas 100% de identidad
# 7 Sphingobacterium spiritivorum 2.269 Sphingobacterium spiritivorum

Tabla 1: Resultados de Representante MALDI-TOF de bacterias que ocurren raras en comparación con la secuencia 16S rRNA gen.

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Discussion

Tanto MALDI-TOF MS y la secuenciación de genes 16S rRNA ofrecen la posibilidad de identificar un gran número de diferentes bacterias. MALDI-TOF MS es un método rápido y barato, que es fácil de manejar y de grandes bases de datos de espectros de masa bacteriana están disponibles. Por esta razón, MALDI-TOF MS es un método eficaz y fiable rápida, el costo de llevar a cabo estudios de cribado se centraron en patógenos bacterianos raras 17,20,39,51. En un estudio prospectivo comparando MALDI-TOF MS con otros métodos de identificación fenotípicos, Seng y col. Coste efectividad demostrada y velocidad de MALDI-TOF MS 59 y Tan et al. Informaron una reducción del coste de los reactivos y de trabajo para la identificación de bacterias en su entorno de laboratorio un 56,9% al año 62. Tales reducciones de costos son soportados por una nota de Gaillot et al. 28

Por otro lado, la secuenciación del 16S rDNA es más lento, laborioso y garantiza p especializadaERSONAL para realizar el análisis 34. Sin embargo, ambos enfoques son adecuados para el diagnóstico de rutina y se pudo demostrar que la combinación de estos dos métodos conduce a una mayor fiabilidad y la precisión de identificación más seguro, que es especialmente beneficioso en caso de resultados dudosos 56. Por lo tanto, se propone la combinación de ambos métodos como el mejor método para verificar la identificación de bacterias que ocurren raras en el diagnóstico de rutina. Para la identificación de especies fiable, es absolutamente imperativo el uso de cultivos bacterianos puros debido a cultivos mixtos impiden la determinación de las especies. Como prueba de plausibilidad, la identificación de especies obtenerse ya sea con MALDI TOF MS o secuenciación 16S rDNA tiene que estar de acuerdo con los resultados de la tinción de Gram, la caracterización bioquímica y la presentación clínica 49.

La espectrometría de masas como herramienta analítica para la identificación bacteriana fue propuesto por primera vez en 197551. Sin embargo, hubo que esperar hasta finales de 1980 para establecer un enfoque práctico para el análisis de proteínas. La tecnología "desorción ionización suave" fue introducido por Koichi Tanaka en 1985 63, que recibió el Premio Nobel de Química en 2002, lo que permite el análisis de proteínas intactas. Al mismo tiempo, el tiempo de ionización asistida por matriz de espectrometría de masas de vuelo fue introducido por Hillenkamp y Karas, ya que fueron los primeros en utilizar un ácido orgánico para analizar biomoléculas 37 y este es el método que todavía se utiliza hoy en día. Aunque la tecnología MALDI se ha utilizado esporádicamente 23,30,41, hubo que esperar hasta 2004, cuando Bruker Daltonics introdujo su sistema de Microflex MALDI Biotyper (Conferencia y Exposición Pittcon de 2004, comunicado de prensa), que la identificación microbiana basada MALDI-TOF MS se convirtió en una rutina técnica de diagnóstico 46. Enfoques recientes en las técnicas de MALDI-TOF MS dieron la oportunidad de identificar las levaduras, detectar bacterias multirresistentesy realizar las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos 17,51. Por otra parte, ciertos procedimientos que ofrecen la posibilidad de analizar directamente las bacterias de muestras primarias, tales como orina o de sangre culturas 17,51.

Aunque el uso de este sistema es principalmente fácil, hay algunas trampas que pueden influir en los resultados. La edad de los microorganismos, por ejemplo afecta a la expresión de la proteína bacteriana y por lo tanto la reproducibilidad de los resultados. En primer lugar, las condiciones de crecimiento pueden ser un problema. Como ejemplo, enterobacterias tales como Escherichia coli crecen más rápido que las bacterias no fermentadores (por ejemplo, Pseudomonas aeruginos a) y por lo tanto tienen que ser analizados anteriormente 17. En segundo lugar, la matriz utilizada para MALDI-TOF MS consiste en pequeñas moléculas de ácidos orgánicos que tienen una fuerte absorción óptica láser para la longitud de onda del láser utilizado. Antes del análisis, se añade la matriz a la muestra y los dos componentes se someten a una crystallizatioproceso n formación de una solución sólida.

Esto explica por qué los cambios en la matriz puede afectar a la precisión de la identificación de bacterias 17. Por lo tanto, las soluciones de matriz, no mayores de 7 días recién preparada, se debe utilizar. En tercer lugar, el medio de la que se recogen las bacterias pueden influir en la identificación resulta 17,68. Por ejemplo, violeta de cristal, que es un componente de agar MacConkey, interfiere con espectros de masa 17. Además, muchas bacterias aplicadas en la diana de acero dará lugar a puntuaciones más bajas y por lo tanto afectar a la precisión de identificación. Por lo tanto, es conveniente definir criterios claros en cuanto a cómo el análisis se lleva a cabo. Sin embargo, resultados erróneos realizados por MALDI-TOF MS se deben principalmente a los espectros de referencia insuficiente contenida en la base de datos. (En la actualidad la base de datos contiene> 6.000 entradas.) Esto es especialmente siendo el caso para la identificación de bacterias anaerobias 17. Sin embargo, unaLos espectros taria puede ser añadido por el usuario. Biblioteca MALDI-TOF MS, por ejemplo, contiene 98 espectros de referencia adicional de aislamientos que no se abordan adecuadamente por la base de datos original, tales como Mycoplasma sp., Myroides sp., Legionella sp., Roseomonas sp., Comamonas sp. Y Chryseobacterium sp. En consecuencia, los espectros de referencia adicional dará lugar a una mayor precisión en la identificación 59,69. Por último, en algunos casos, los espectros de diferentes especies son muy similares. Esto puede conducir a errores de identificación en casos tales como la discriminación de Escherichia coli y Shigella spp. o Streptococcus pneumoniae y Streptococcus mitis 17,51.

La secuenciación del 16S rDNA y genes adicionales tales como rpoB han simplificado la identificación molecular de las bacterias raros o desconocidos. Estos genes son comunes en la mayoría de las bacterias y su función individual esidéntico. Sin embargo, ya que poseen suficiente variabilidad genética para producir resultados que permiten una diferenciación en género y nivel de especies, que pueden ser utilizados para la identificación de bacterias 34. Según Stackebrandt y Göbel, homologías <97% representan diferentes especies 61. Sin embargo, las homologías> 97% no conducen necesariamente a una identificación de las especies seguro 34,47. Estas incertidumbres tienen varias razones.

La calidad de las bases de datos que se utilizan para calcular las homologías es a veces cuestionable 34. En los casos en los que existen altas homologías a nivel 16S rDNA, incertidumbres pueden dar lugar a la identificación de especies. Una combinación de diferentes regiones genéticas, por tanto, puede dar lugar a resultados más seguros. Por otra parte, no existen pautas generales para la interpretación del 16S rDNA 22,34,61 datos de secuenciación. Sin embargo, aumentar la fiabilidad de las bases de datos existentes dará lugar a una mayor ACCUmordaz para la identificación bacteriana usando este enfoque molecular 34. En cuanto a la reacción de secuenciación tenemos que mencionar que la exactitud de los resultados de la secuenciación se basa principalmente en la calidad de la PCR subyacente. Por otra parte, ya que los resultados se obtuvieron mediante la comparación con las indicaciones que figuran en las bases de datos públicas, la calidad de la secuencia de entradas y el mantenimiento de los datos es de crucial importancia.

En general, aunque ambos enfoques, MALDI-TOF MS y 16S rRNA secuenciación de genes, tienen ventajas también tienen puntos débiles. La combinación de ambos métodos, sin embargo, conduce a una alta precisión para la identificación bacteriana. Por ejemplo, en un estudio anterior podríamos demostrar que MALDI-TOF MS es capaz de distinguir entre Myroides odoratimimus y Myroides odoratus 56. En unos pocos casos la puntuación MALDI sugirió la identificación de especies poco fiable, mientras que los resultados obtenidos por secuenciación de 16S rDNA podría confirmar la especieidentidad. huellas espectrales de masas de estos aislamientos se crearon entonces y se introducen en nuestra base de datos espectros de referencia MALDI. La investigación futura se centra en otras bacterias raras puede demostrar la aplicabilidad de la estrategia propuesta.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
CHROMASOLV, HPLC grade water, 1 L Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany 270733
Tissue Lyser LT Qiagen, Hilden, Germany 85600 Oscillating homogenizer
Glass-beads 1.0 mm VWR International, Darmstadt, Germany 412-2917
Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg, Germany 2050-100-05
QIAamp DNA Mini Kit (250) Qiagen, Hilden, Germany 51306
Taq PCR Core Kit (1,000 U) Qiagen, Hilden, Germany 201225
Forward Primer TPU1 (5´-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’) biomers.net, Ulm, Germany  -
Reverse Primer RTU4 (5´-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3´) biomers.net, Ulm, Germany  -
Mastercycler  Eppendorf, Hamburg, Germany -  Thermocylcer
Reaction tube 1.5 ml SARSTEDT, Nümbrecht, Germany 72,692
Reaction tube 2 ml SARSTEDT, Nümbrecht, Germany 72,693,005
PCR 8er-CapStrips Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 711040X
PCR 8er-SoftStrips Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 711030X
Sharp R-ZV11  Sharp Electronics, Hamburg, Germany - Microwave
Titriplex III (EDTA Na2-salt dehydrate; 1 kg) Merck, Darmstadt, Germany 1084211000
SeaKem LE Agarose Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 849006
SmartLadder SF - 100 to 1,000 bp Eurogentec, Lüttich, Belgium MW-1800-04
Bromophenol blue (25 g) Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany B0126
Xylene cyanol FF (10 g) Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany X4126
ComPhor L Maxi  Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany -
Ethidium bromide solution 1% (10 ml) Carl Roth, Karlsruhe, Germany 2218.1
Gel Doc 2000 Bio-Rad Laboratories, München, Germany - Gel-documentation system 
ExoSAP-IT (500 reactions) Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, United Kingdom 78201
Buffer (10x) with EDTA  Life Technologies, Darmstadt, Germany 402824
BigDye Terminator Kit v1.1 Life Technologies, Darmstadt, Germany 4337450
Hi-Di formamide (25 ml) Life Technologies, Darmstadt, Germany 4311320
DyeEx 2.0 Spin Kit (250) Qiagen, Hilden, Germany 63206
3130 Genetic Analyzer Life Technologies, Darmstadt, Germany - Sequencer
MicroAmp optical 96-well reaction plate with barcode Life Technologies, Darmstadt, Germany 4306737
3130 Genetic Analyzer, plate base 96-well Life Technologies, Darmstadt, Germany 4317237
3130 Genetic Analyzer, plate retainer 96-well Life Technologies, Darmstadt, Germany 4317241
3130 Genetic Analyzer, well plate septa Life Technologies, Darmstadt, Germany 4315933
3130 Genetic Analyzer, POP-7 Polymer, 7 ml Life Technologies, Darmstadt, Germany 4352759
3130 Genetic Analyzer, 4-Capillary Array, 50 cm Life Technologies, Darmstadt, Germany 4333466
Sequencing Analysis Software 5.4 Life Technologies, Darmstadt, Germany -
microflex Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Our mMIS
VITEK MS bioMérieux, Nürtingen, Germany  2nd mMIS
flexControl 3.4 Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Device control software
Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC) Bruker Daltonik, Bremen, Germany - Analysis software
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA, 1 g Bruker Daltonik, Bremen, Germany 201344
Peptide Calibration Standard II Bruker Daltonik, Bremen, Germany 222570
MSP 96 target polished steel Bruker Daltonik, Bremen, Germany 8224989
peqGREEN peqlab  37-5010
MALDI Biotyper Galaxy  Bruker Daltonik, Bremen, Germany Part No. 1836007  Automated sample preparation system
Vitek 2  bioMérieux, Nürtingen, Germany  Our aMIS
MicroScan  Beckman Coulter, Krefeld, Germany 2nd aMIS
BD Phoenix™ Automated Microbiology System BD, Heidelberg, Germany 3rd aMIS
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC® 25923™) American Type Culture Collection (ATCC), LGC Standards, Molsheim, France Positive control for PCR 

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La identificación de patógenos bacterianos raras por 16S rRNA gen secuenciación y MALDI-TOF MS
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Schröttner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS. J. Vis. Exp. (113), e53176, doi:10.3791/53176 (2016).

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