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Introduction
来自患者的异种移植物是用于癌症研究日益流行的实验模型。它们可用于生物标志物和生物学途径,药物疗效的临床前评估,并创建化身个性化癌症疗法1,2的表征。此前,其他研究小组已经开发出PDX机型无论是通过植入或注射单个肿瘤细胞悬液或全肿瘤植到免疫小鼠1。这些PDX 模型需要外科收集新鲜实体瘤,恶性腹水或从患者经历外科手术这既昂贵又暴露病人医源性发病的危险性增加胸腔积液。
在癌症研究显著最近的发展一直循环肿瘤细胞检测,分离和鉴定。从原发肿瘤肿块这些肿瘤细胞逃逸,并进入循环在那里他们在转移和复发发挥关键作用,癌症的最常见的原因有关的死亡率3。的CTC从几个实体瘤类型的评估和表征提供了临床信息进行诊断,预后,监测和残留病3。多种目前使用的方法依赖于任一物理性质,生物标志物的表达,或的CTC的功能特性可以用来有效地分离的CTC 4。现有宏观尺度四氯化碳的分离方法包括密度梯度离心,带过滤器的孔的物理过滤和分离针对表面分子。最广泛使用的CTC隔离方法是基于的CTC的基于抗体的捕获。两个阳性和阴性选择的细胞表面标记物可以用来从外周血分离的CTC。阳性选择为在外围循环的CTC通常使用上皮标记(例如,EpCAM的),其一个重新表达的CTC而不是造血干细胞。这种方法的缺点是,的CTC转移性潜力经常经历上皮至间质转变(EMT),该下调上皮表面标志3。为了分离的CTC转移性潜力,负选择方法,它采用了造血表面标记,CD45,耗尽白细胞的正常细胞群可以使用5。
前列腺癌是最常见的诊断的癌症和癌症相关死亡的男性6的一个主要原因。肿瘤进展和侵略性的机制尚未完全了解,因此,产生和实验模型概括前列腺癌的分子异质性的表征是显著兴趣的。前列腺癌的PDX机型已经 由人前列腺癌细胞的植入先前产生成immunocom承诺小鼠7,8。然而,这样的模式的产生受到阻碍低植入率前列腺癌到免疫小鼠,这主要归因于疾病的性质无痛。最近,的CTC已经用于生成乳腺癌9,肺癌10和前列腺癌11 PDX模型。概念验证的这些研究引入生成的需要手术样品收集PDX模型独立的可能性。在本文中,我们详细描述了这个新的实验模型的生成方法。
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Protocol
该协议已在我们的机构,从体制研究伦理委员会的批准,已进行并符合对人类福利的所有机构,国家和国际准则。
从晚期前列腺癌1.采集外周血
注意:选择治疗转移性前列腺癌。获得书面患者同意,并记录患者的临床特征,包括年龄在隔离和以前的化疗和激素治疗。转移性肿瘤患者将有可能拥有的CTC的外周血中含量最高。
- 知情同意书后,并在适当的机构审查委员会批准的协议采集血液样本。戴乳胶手套和试验服整个过程。
- 连接25摹蝴蝶针和管针持有人。用酒精棉签擦拭的面积二头肌和前臂的肘静脉,然后应用止血带患者的上臂。
- 将蝴蝶针插入肘静脉推采血管为持针器开始收集。收集大约10毫升的血液中含有乙二胺四乙酸(EDTA)以防止凝固收集管。
- 从患者除去蝴蝶针和用消毒纱布垫施加压力超过现场静脉穿刺的1分钟。盖部位用无菌绷带。
2.分离单个核细胞
注意:从第1步收集的血液将包含外周血单核细胞(PBMC)(例如,淋巴细胞和单核细胞),除了单核的CTC。
- 吸移管的全血到50ml聚苯乙烯锥形管用5 ml的血清吸液管和添加Hanks平衡盐溶液(HBSS)以1:1的比例。轻轻吸管混合均匀化。
- 加入15mL可商制备的溶液(菲可 - 帕克)由低速密度梯度离心来分离血液成分为空50毫升聚苯乙烯锥形管中。
- 轻轻吸取全血和HBSS混合物,从步骤2.1,到聚苯乙烯管从步骤2.2,以形成不同的顶层。设置吸管以减少溶液混合的最低设置,这将确保有效的分离。
- 离心机在400×g离心30分钟,在室温(25℃)。设置减速到最低设置,以防止分离后的溶液混合。加速度可以被设置为任何速度。
- 离心后,确定在顶部和分离溶液等离子体之间PBMC和的CTC夹层的薄白灰色条纹在管的底部。
- 收集来自白灰色条纹在步骤2.5的细胞分化成使用塑料移液管50毫升的聚苯乙烯管中。
- 加入HBSS至50ml聚苯乙烯锥形管PBMC和检验中心和c再次entrifuge在400 XG 10分钟RT洗。
- 再次滗析液重悬沉淀在50ml的HBSS和离心机在400×g离心3分钟,在室温洗。
- 弃去上清液,重悬其余沉淀用5ml红细胞裂解缓冲液孵育5分钟,在室温的溶液中。
- 除去离心的红细胞裂解缓冲液在400×g离心3分钟,在RT。
- 弃上清,重悬沉淀在1ml的PBS 1×补充有10%胎牛血清(FBS),以阻止前抗体染色。
3.染色单个核细胞CD45-FITC抗体进行荧光活化细胞分选(FACS)
- 量化使用血球或自动细胞计数器上可行的(台盼蓝阴性)细胞(来自步骤2.11)的数量。制备1×10 6个细胞/ ml的悬浮液(在PBS中1×有10%FBS),并放置在冰上1小时。
- 分发量化来自前一步骤的两试管细胞悬浮液。标签管作为对照和CD45染色。
- 250:在控制管,在一个稀释的1加IgG1κ-FITC(2.5微克/毫升)。在CD45染色管中,加入CD45 FITC(2.5微克/毫升)的共轭初级抗体的稀释度为1:250和在冰上孵育细胞悬浮液30分钟。 CD45抗原标记用于排除造血细胞。
- 离心细胞,在400×g离心3分钟,在4℃下,并弃去上清液。
- 洗涤细胞两次,悬浮每个粒料用无菌1×PBS中补充了10%FBS的随后离心,在400×g离心3分钟,在4℃。
- 悬浮在1毫升溶液含4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)以10μg/ ml的浓度的PBS 1×的细胞。
- 过滤器通过35微米的过滤器盖的最终解决方案,为12毫米×75毫米聚苯乙烯管。
4.隔离前列腺检验中心通过FACS
注:利用流式细胞仪来收集实时CD45阴性检验中心。
- 采用细胞标记,管道组补偿控制“控制”。
- 创建排除碎片和集群使用适当的正向散射和侧向散射参数细胞的大门。
- 建立使用从标记的管中,细胞悬浮液的FITC门“CD45-FITC”。
- 门可行的(DAPI阴性)使用太平洋蓝色的通道细胞。
- 收集CD45阴性人口到无菌的15 ml的聚苯乙烯锥形管含有2毫升罗斯韦尔园区纪念研究所(RPMI)1640补充有10%FBS中。
- 离心机的排序前列腺肿瘤细胞悬浮液在400×g离心3分钟,然后重悬在粒料200 - 500微升的RPMI补充有10%FBS中。
5.注射的CTC入小鼠移植瘤生长和监控
注意:开展所有动物的程序符合批准的机构动物保护委员会的协议。该协议已在我们的制度下,根据和遵守所有相关的监管和体制机构,法规和准则经我们的动物保护委员会的特定动物使用协议进行的。
- 混合排序前列腺肿瘤细胞悬浮液与细胞外基质以1:1的比例,并置于冰上。
- 麻醉小鼠之前皮下植入的腔室在1L供给5%(体积/体积)吸入异氟烷的氧气/分钟。通过检查角膜和脚趾反射小鼠丧失确保适当的麻醉。
- 使用地下25针和1ml注射器,注入250微升前列腺肿瘤细胞和细胞外基质的细胞悬浮液皮下注射到一个8-10周龄雄性免疫缺陷小鼠的两个上侧翼。注入无论四氯化碳浓度的250微升作为喷射体积是第important值。在小鼠最大SQ施用是不超过1毫升
- 通过执行鼠标注射部位为皮下结节密度生长每周触诊并通过每周测量小鼠体重两次监测小鼠。
- 安乐死的小鼠通过二氧化碳窒息颈椎脱位和收获皮下人前列腺癌异种移植物当肿瘤大小超过0.5厘米和小于1厘米的最大直径,以确保有足够的肿瘤组织进行分子分析和连续传代。安乐死小鼠困扰或体重减轻15%的迹象,尽管未见肿瘤是显而易见的。
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Representative Results
该协议将导致从孤立的CD45阴性前列腺癌的CTC的产生PDX机型。根据我们的协议中使用的负选择方法,有必要用DAPI染色来排除死细胞。 CD45阴性细胞通过流式细胞术检测到的百分比是可变的并且取决于患者(图1A)的肿瘤负荷。使用CD45和DAPI未分选的细胞的免疫荧光染色(鉴别细胞核)揭示了CD45阴性细胞中,由白色箭头(图1B)所指示的。 在图1C中,皮下结节密度可以看出在鼠标的两个侧腹部。每个结节密度表示异种移植物的生长并作为它伸在小鼠的背部肌肉,是质地更牢固可以理解区别于健康组织。植入和移植发展之间的时间间隔可能相差很大取决于不稳定型心绞痛患者的CTC负担nt的样品,将细胞植入的数目和的CTC的生物攻击性。从生成的CTC前列腺PDX概括人前列腺肿瘤所看到的苏木精和曙红染色,并通过免疫组织化学对特定前列腺细胞标记,如雄激素受体 (AR)和前列腺特异性膜抗原(PSMA)(图1D)。
图1.新一代前列腺癌PDX模型从人前列腺癌的CTC。 (一)流式细胞仪曲线图,展示的前列腺癌患者的外周血中的具体CD45染色的细胞群。 。细胞阳性DAPI染色死亡,排除通过门控,以确保只有活细胞被分离无序人口(B)CD45免疫荧光染色证实CD45存在-细胞(白色箭头)(C) 在体内与肿瘤收获后使用常规HE染色和前列腺特异性标志物CTC PDX机型(D)分析。雄激素受体 (AR)和前列腺特异性膜抗原(PSMA)。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
这份手稿描述了从检验中心的新一代前列腺癌PDX模型的方法。对于PDX一代的使用检验中心的 时相比,现有方法的模型有几个潜在的重要的优点。首先,访问集合的CTC的外周血使实验模型的产生来自同一患者在不同疾病阶段。第二,血液采集代表一个更安全和更便宜的方法相比,需要外科手术收集的肿瘤细胞的现有方法以分离肿瘤细胞。
CTC富集多种方法已经被描述然而许多人无法接触到每一个实验室由于资金和资源限制。我们寻求发展在我们的实验室的检测,可以利用在使用流式细胞仪,对许多实验室一个方便,实惠和方便的方法的。这种方法的一个潜在限制是不足的灵敏度检测稀有细胞这可能限制使用这个协议来患者的高肿瘤负荷。其中采用上皮细胞的物理或生物性质几个附加技术可用于通过减轻此限制,并增加该稀有细胞群4的检测和隔离。该方法在本协议中所描述的CTC富集采用阴性选择; CD45 +白细胞被丢弃和CD45 -的CTC被保留。重要的是要除去潜在的污染的CD45 -从细胞悬浮液术通过流式细胞分选时元素 (例如,非活细胞)。具体地,使用红血细胞裂解液和遗漏无活力细胞的DAPI染色是关键的考虑因素。虽然这些措施可能会不能保证非四氯化碳元件不会污染CD45 -群体,我们之前的研究表明,所期望的单元population充分富含这些方法11。可能的是在四氯化碳人口的纯度可以通过阳性选择使用抗体与细胞表面标记特有的前列腺癌细胞3加以改进,。此外,四氯化碳异质样品中存在的上皮细胞和数量可以用EpCAM的或其他适当的污渍进行测试。然而外周血样品的附加的处理可以最终提高纯度,同时降低总产率。
在这个协议中,我们进行皮下注射分离的CTC它可以很容易地植入和监测肿瘤发展的。然而,皮下车型有营养供应不足,可能会危及肿瘤移植和肿瘤细胞亚群的损失。替代注射部位,如小鼠前列腺(正交异性),促进前列腺微环境,和肾包膜下注射,从而提高SUCCessful植入和蜜饯肿瘤的异质性,可以根据研究者的偏好1,2-来执行。最佳地,NOD / SCID /IL2λ受体空(NSG)小鼠模型应该被用来增加异种移植物植入12的速度,但是免疫受损小鼠(NOD / SCID或,裸体,SCID /米色)的其它菌株也已成功地用于在实体瘤的产生来源PDX车型1。生成的PDX机型可连续传代,并利用建立的遗传方式9-11,13的原发肿瘤特性的稳定性进行监测。
高数可行前列腺癌的CTC的恢复取决于疾病阶段。成功代PDX模型最好保证时的CTC从患者血中高转移负担隔离。我们已经成功地产生PDX模型从血液样品与射程100至10,000的CTC。在我们的经验,有必要对训练有素劳动atory人员,以保证从血样前列腺的CTC的成功分离频繁地执行该协议。我们建议实验室工作人员进行初步培训,该协议通过血液样本与正常健康个体掺入从肿瘤细胞系细胞。缺乏或原发性前列腺癌的CTC数量低可能会限制使用这种方法来转移性前列腺癌。
该方法用于反恐委员会的产生导出该协议随后可用于许多研究中的应用,包括前列腺癌的分子特征,药物筛选,监测治疗反应,生物标志物的发展,个性化癌症治疗等进展说明PDX机型。
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Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Life Technologies | 10437-028 | |
Penicillin Streptomycin | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning Cell Gro | 21-031-CM | |
35 µm Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | |
50 ml polystyrene conical tube | Crystalgen | 23-2263 | |
Red blood cell lysing buffer | Sigma | R7757 | |
DAPI | Invitrogen | d3571 | |
Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440 | |
12 mm x 75 mm Polystyrene tubes with cell strainer cap | BD Falcon | 352235 | |
BD Vacutainer Lavender Blood Collection Tubes with EDTA | |||
BD Winged Blood Collection Set with Push Button Retract Needle 23 gauge | |||
BD Vacutainer One Use Needle Holder | |||
Disposable Latex Tourniquet | |||
Latex or non-latex gloves | |||
alcohol swabs | |||
2 x 2 cotton gauze pads | |||
Adhesive bandage | |||
25 G needle | |||
1 ml syringe |
References
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Tags
医药,第104,前列腺癌,患者来源的异种移植,循环肿瘤细胞,肿瘤内的异质性,临床前模型,人体组织样本Erratum
Formal Correction: Erratum: Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells
Posted by JoVE Editors on 12/01/2015.
Citeable Link.
A correction was made to Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells. There was a spelling error in one of the authors' surname. The author's name was corrected from:
Veronica Rodriquez-Bravo
to:
Veronica Rodriguez-Bravo