Generación del paciente con cáncer de próstata Derivado modelos de xenoinjertos de células tumorales circulantes

Introduction

Paciente xenoinjertos derivados son modelos experimentales cada vez más populares utilizados para la investigación del cáncer. Pueden ser utilizados para la caracterización de biomarcadores y vías biológicas, la evaluación pre-clínica de la eficacia del fármaco, y la creación de avatares para terapias contra el cáncer personalizados ^1,2. Anteriormente, otros grupos de investigación han desarrollado modelos PDX ya sea mediante la implantación o la inyección de suspensiones de células tumorales individuales o explantes tumorales en ratones inmunocomprometidos conjunto ^1. Estos PDX modelos requieren colección quirúrgica del tumor sólido fresca, ascitis maligna o derrame pleural de un paciente sometido a un procedimiento quirúrgico que es costoso y expone al paciente a un mayor riesgo de morbilidad iatrogénica.

Un reciente desarrollo significativo en la investigación del cáncer ha sido la detección, aislamiento y caracterización de células tumorales circulantes. Estas células tumorales escapan de la masa del tumor primario y entran en la circulacióndonde juegan un papel crítico en la metástasis y la recaída, la causa más común de cáncer de la mortalidad relacionada ^3. La evaluación y caracterización de CTC de varios tipos de tumores sólidos han proporcionado información clínica para el diagnóstico, el pronóstico y el seguimiento de la enfermedad residual ^3. Una variedad de enfoques que se utilizan actualmente que dependen de cualquiera de las propiedades físicas, la expresión de biomarcadores, o características funcionales de las CTC se puede utilizar para aislar de manera eficiente CTC ^4. Métodos existentes macroescala de aislamiento CTC incluyen centrifugación en gradiente de densidad, filtración físico con poros del filtro y la separación contra moléculas de la superficie. Las metodologías de aislamiento CTC más utilizados se basan en la captura basada en anticuerpos de los CTC. Tanto selección positiva y negativa de los marcadores de la superficie celular puede emplearse para aislar CTC partir de sangre periférica. La selección positiva para las CTC en la circulación periférica utiliza comúnmente marcadores epiteliales (por ejemplo, EpCAM), que unare expresado en los CTC, pero las células no hematopoyéticas. La desventaja de este método es que las CTC con potencial metastásico a menudo han sido objeto de epitelio-mesenquimal transición (EMT), que regula a la baja marcadores de superficie ³ epiteliales. Con el fin de aislar las CTC con potencial metastásico, una metodología de selección negativa que emplea el marcador de superficie hematopoyético, CD45, para agotar la población celular normal de leucocitos se puede utilizar ^5.

El cáncer de próstata es el cáncer más comúnmente diagnosticado y la principal causa de muerte por cáncer en los hombres ^6. Los mecanismos de la progresión del tumor y la agresividad no se conocen y por lo tanto la generación y caracterización de modelos experimentales que recapitular la heterogeneidad molecular de cáncer de próstata son de gran interés. Modelos PDX de cáncer de próstata han sido generada previamente por injerto de células de cáncer de próstata humanos en immunocomratones prometidos ^7,8. Sin embargo la generación de tales modelos se ha visto obstaculizada por la baja tasa de injerto de cáncer de próstata en ratones inmunocomprometidos, que se atribuye principalmente a la naturaleza indolente de la enfermedad. Recientemente, las CTC se han utilizado para generar el cáncer de mama ^9, cáncer de pulmón y cáncer de próstata ^{10 11 modelos} PDX. Estos estudios de prueba de concepto introducido la posibilidad de generar PDX modelos independientes de la necesidad de la recolección de la muestra quirúrgica. En este artículo se describe con detalle un método para la generación de este nuevo modelo experimental.

Protocol

Este protocolo se ha realizado en nuestra institución con la aprobación del comité de ética de investigación institucional y cumple con todas las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano.

1. Recolección de sangre periférica de pacientes con cáncer de próstata avanzado

Nota: Seleccione pacientes con cáncer de próstata metastásico. Obtener el consentimiento escrito del paciente y registrar las características clínicas de los pacientes, incluyendo la edad en el aislamiento y la quimioterapia previa y tratamientos hormonales. Los pacientes con enfermedad metastásica serán potencialmente tienen mayor concentración de CTC en sangre periférica.

1. Recoger muestras de sangre después de consentimiento informado y bajo una Junta de Revisión Institucional adecuado protocolo aprobado. Use guantes de látex y una bata de laboratorio durante todo el procedimiento.
2. Conecte 25 G aguja de mariposa y el tubo de soporte de la aguja. Utilice un algodón con alcohol para limpiar el área devena antecubital entre el bíceps y el antebrazo, a continuación, aplicar torniquete en el brazo del paciente.
3. Inserte la aguja en la vena antecubital mariposa y empuje el tubo de extracción de sangre en el soporte de la aguja para comenzar colección. Recoger aproximadamente 10 ml de sangre en tubos de recogida que contienen ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) para evitar la coagulación.
4. Retire la aguja de mariposa de paciente y aplicar presión con una gasa estéril sobre el sitio de la punción de la vena durante 1 min. Sitio de la cubierta con un vendaje estéril.

2. Aislamiento de células mononucleares

Nota: La sangre recogida desde el paso 1 contendrá las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) (por ejemplo, linfocitos y monocitos) además de las CTC mononucleares.

1. Toda Pipetear 50 ml de sangre en tubo cónico de poliestireno con un 5 ml pipeta serológica y añadir Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) en una proporción de 1: 1. Suavemente mezcla pipeta para homogeneizar.
2. Añadir 15 ml de una solución preparada comercialmente (Ficoll-Paque) para separar componentes de la sangre por la baja velocidad de centrifugación en gradiente de densidad a un tubo cónico de 50 ml de poliestireno vacío.
3. Pipeta suavemente sangre entera y mezcla de HBSS, desde el paso 2.1, en el tubo de poliestireno desde el paso 2.2, para formar la capa superior distinta. Set pipeta para ajuste más bajo para reducir al mínimo la mezcla de soluciones, esto asegurará la separación eficiente.
4. Centrifugar a 400 xg durante 30 min a TA (25 ° C). Establecer desaceleración valor más bajo para evitar la mezcla de las soluciones después de la separación. La aceleración puede ser ajustado a cualquier velocidad.
5. Después de la centrifugación, identificar la delgada franja de color gris blanco de la capa de PBMC y CTC intercalado entre el plasma en la solución de la parte superior y la separación en la parte inferior del tubo.
6. Recoger las células de la raya blanco-gris en el paso 2.5 en un tubo de 50 ml de poliestireno usando una pipeta de transferencia de plástico.
7. Añadir HBSS a 50 ml tubo cónico de poliestireno con PBMCs y CTC y centrifuge de nuevo a 400 xg durante 10 min RT para lavar.
8. Decantar pellet líquido y resuspender en 50 ml de HBSS y se centrifuga de nuevo a 400 xg durante 3 min a TA para lavar.
9. Descartar el sobrenadante, resuspender el sedimento restante con 5 ml de glóbulos rojos Tampón de lisis y se incuba la disolución durante 5 min a TA.
10. Retire la célula de sangre roja tampón de lisis por centrifugación a 400 xg durante 3 min a TA.
11. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 1 ml de PBS 1x suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS) para bloquear antes de la tinción de anticuerpos.

3. Las células mononucleares de tinción con CD45-FITC anticuerpos de fluorescencia de células activadas (FACS)

1. Cuantificar el número de células viables (azul de tripano negativas) (del paso 2,11) utilizando un hemocitómetro o un contador de células automatizado. Prepare un 1 x 10 ⁶ células / ml suspensión (en PBS 1x con 10% de SFB) y colocarlo en hielo durante 1 hora.
2. Distribuya el cuantificadosuspensión de células de la etapa anterior en dos tubos. Tubos de etiqueta como el control y la tinción de CD45.
3. En el tubo de control, añadir IgG1k-FITC (2,5 mg / ml) a una dilución de 1: 250. En el tubo de tinción CD45, CD45 añadir FITC (2,5 mg / ml) conjugado anticuerpo primario a una dilución de 1: 250 y se incuban las suspensiones de células en hielo durante 30 min. Etiquetado antígeno CD45 se utiliza para excluir células hematopoyéticas.
4. Centrifugar las células a 400 xg durante 3 min a 4 ° C y descartar el sobrenadante.
5. Lavar las células dos veces, mediante la suspensión de cada sedimento con PBS estéril 1 x suplementado con 10% FBS seguido de centrifugación a 400 xg durante 3 min a 4 ° C.
6. Resuspender las células en una solución de 1 ml de 1x PBS que contenía 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) a una concentración de 10 mg / ml.
7. Filtrar la solución final a través de las tapas colador 35 micras a 12 mm tubos de poliestireno x 75 mm.

4. Aislamiento de próstata por CTCFACS

Nota: Utilice un citómetro de flujo para recoger CTC negativos en vivo CD45.

1. Controles de ajustar la compensación utilizando células del tubo etiquetado, "Control".
2. Crear puertas que excluyen escombros y grupos de células que utilizan parámetros de dispersión frontal y lateral de dispersión adecuados.
3. Establecer las puertas FITC utilizando las suspensiones de células del tubo etiquetado ", CD45-FITC."
4. Células viables (Gate-DAPI negativo) con el Pacífico azul-Un canal.
5. Recoger negativo de la población CD45 en un tubo cónico estéril de 15 ml de poliestireno que contiene 2 ml de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado con 10% de FBS.
6. Centrifugar la suspensión de células tumorales de próstata ordenados a 400 xg durante 3 min, a continuación, volver a suspender los gránulos en 200 - 500 l de RPMI suplementado con 10% FBS.

5. La inyección de CTC en ratones y Monitoreo de Crecimiento Xenoinjerto

Nota:Realizar todos los procedimientos con animales en el cumplimiento de los protocolos aprobados por el comité de cuidado de los animales institucional. Este protocolo se ha realizado en nuestra institución bajo un uso Protocolo específico Animal aprobado por nuestro Comité de Cuidado de Animales de conformidad y el cumplimiento de todas las normativas e institucionales agencias, regulaciones y directrices pertinentes.

1. Mezclar la suspensión de células tumorales de próstata ordenados con la matriz extracelular en una proporción de 1: 1 y el lugar en hielo.
2. Anestesiar ratón antes de la implantación subcutánea en una cámara de suministro de 5% (v / v) isoflurano inhalado en 1 L / min de oxígeno. Asegurar la anestesia adecuada mediante la comprobación de la pérdida de la córnea y la punta reflejo en el ratón.
3. Usando una aguja de 25 G y una jeringa de 1 ml, inyectar 250 l de células tumorales de próstata y la matriz extracelular por vía subcutánea suspensión celular en ambos flancos superiores de 8-10 semanas de edad de ratón inmunodeficiente masculino. Inyectar 250 l independientemente de la concentración de CTC como el volumen de inyección es la ivalor mportante. Administración Máxima SQ en el ratón no es más de 1 ml.  
4. Monitorear los ratones mediante la realización de la palpación semanal de los sitios de inyección de ratón para el crecimiento de las densidades nodulares subcutáneas y midiendo el peso ratones dos veces a la semana.
5. La eutanasia a los ratones mediante asfixia con dióxido de carbono seguido por dislocación cervical y cosecha subcutáneos xenoinjertos de cáncer de próstata humano cuando el tamaño del tumor es más de 0,5 cm y menos de 1 cm en su mayor diámetro para asegurar el tejido tumoral suficiente para los análisis moleculares y el paso en serie. La eutanasia a los ratones con signos de sufrimiento o pérdida de peso del 15% a pesar de ningún tumor es palpable.

Representative Results

Este protocolo dará lugar a la generación de modelos de PDX aislados CD45 próstata negativa CTC cancerosas. Basado en el método de selección negativa utilizado en nuestro protocolo es necesario para excluir las células muertas usando DAPI mancha. El porcentaje de células CD45 negativas detectado por citometría de flujo es variable y depende de la carga del tumor del paciente (Figura 1A). La tinción inmunofluorescente de células no clasificadas utilizando CD45 y DAPI (para identificar los núcleos celulares) revela células CD45 negativas, como se indica por las flechas blancas (Figura 1B). En la Figura 1C, densidades nodulares subcutáneas se pueden ver en ambos flancos del ratón. Cada densidad nodular representa un crecimiento de xenoinjerto y se puede apreciar a diferencia de tejido sano ya que sobresale de la musculatura dorsal del ratón y es más firme en la textura. El intervalo de tiempo entre la implantación y el desarrollo de xenoinjertos puede variar mucho dependiendo de la carga de CTC del Patiemuestra nt, el número de células implantadas y la agresividad biológica de los CTC. PDX próstata generado a partir de CTC recapitular tumor de próstata humano como se ve por tinción con hematoxilina y eosina, y por inmunohistoquímica para marcadores celulares específico de la próstata, tales como el receptor de andrógenos (AR) y el antígeno prostático específico de membrana (PSMA) (Figura 1D).

Figura 1. Generación de Modelos de cáncer de próstata PDX de cáncer de próstata humano CTC. (A) La citometría de flujo gráfico que ilustra poblaciones específicas de células CD45 tinción de sangre periférica de un paciente con cáncer de próstata. . Las células con tinción DAPI positivo están muertos y excluidos por la compuerta para asegurar que sólo las células viables se aíslan tinción (B) inmunofluorescencia CD45 de la población no seleccionada confirma presencia de CD45 ^-. Células (flechas blancas) (C) in vivo y después de la cosecha del tumor (D) Análisis de los modelos de CTC PDX utilizando hematoxilina y eosina y convencional los marcadores prostáticos específicos.; receptor de andrógenos (AR) y el antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Este manuscrito describe un método para la generación de modelos de cáncer de próstata a partir de PDX CTC. El uso de CTC para la generación de PDX modelos tiene varias ventajas potenciales importantes en comparación con los métodos existentes. En primer lugar, la colección accesible de CTC de la sangre periférica permite la generación de modelos experimentales del mismo paciente en diferentes estadios de la enfermedad. En segundo lugar, la recogida de sangre representa un método más seguro y barato para aislar las células tumorales en comparación con las metodologías existentes que requieren procedimientos quirúrgicos para la recogida de las células tumorales.

Múltiples métodos de enriquecimiento de CTC se han descrito sin embargo muchos no son accesibles a todos los laboratorios debido a la financiación y los recursos limitaciones. Hemos tratado de desarrollar un ensayo en el laboratorio que pueden capitalizar en el uso de la FACS, una metodología práctica, asequible y accesible para muchos laboratorios. Una limitación potencial de esta metodología esla sensibilidad inadecuada para la detección de células raras que podría limitar el uso de este protocolo para pacientes con alta carga tumoral. Varias tecnologías adicionales que emplean propiedades físicas o biológicas de las células epiteliales pueden ser utilizados para mitigar más de esta limitación y aumentar la detección y el aislamiento de esta población de células raras ^4. El método para el enriquecimiento de CTC se describe en este protocolo emplea selección negativa; CD45 ⁺ leucocitos se descartan y CD45 ^- se conservan los CTC. Es importante eliminar potencialmente contaminantes CD45 ^- elementos de las suspensiones celulares al ordenar por citometría de flujo (por ejemplo, células no viables.). En particular, el uso de tampón de lisis de glóbulos rojos y la omisión de las células no viables mediante tinción con DAPI son consideraciones críticas. Si bien estas medidas no pueden garantizar que los elementos no-CTC no contaminan el CD45 ^- población, nuestros estudios anteriores sugieren que la célula deseada población está suficientemente enriquecido con estos métodos ^11. Es posible que la pureza de la población CTC podría mejorarse a través de la selección positiva, usando anticuerpos a la celda marcadores de superficie únicas a las células de cáncer de próstata ^3. Además, CTC heterogeneidad y número de células epiteliales presentes en la muestra pueden ser probados usando EpCAM u otras manchas adecuadas. Sin embargo procesamiento adicional de la muestra de sangre periférica puede en última instancia, aumentar la pureza mientras que la disminución de rendimiento global.

En este protocolo se realizó la inyección subcutánea de CTC aislados que permite una fácil implantación y seguimiento del tumor en desarrollo. Sin embargo, los modelos subcutáneos tienen insuficiente suministro de nutrición que puede comprometer el injerto de tumor y la pérdida de subpoblaciones de células tumorales. Sitios alternativos de inyección tales como la próstata del ratón (ortotrópico), que promueve un microambiente de la próstata, y la inyección de la cápsula sub-renal, lo que aumenta succinjerto essful y preserva la heterogeneidad del tumor, pueden llevarse a cabo en base a la preferencia investigador ^1,2. De manera óptima, NOD / SCID / null IL2λ-receptor (NSG) modelos de ratón deben utilizarse para aumentar la tasa de injerto de xenoinjerto de ^12, sin embargo otras cepas de ratones inmunodeficientes (NOD / SCID o, desnudo, SCID / Beige) también se han utilizado con éxito en la generación de modelos de tumor sólido derivado PDX ^1. Modelos PDX generados pueden ser en serie a pases y la estabilidad de las características del tumor originales monitoreados utilizando métodos genéticos establecidos ^9-11,13.

La recuperación de un número elevado de cáncer de próstata viable CTC depende de la etapa de la enfermedad. La generación exitosa de modelos PDX está mejor asegurada cuando las CTC se aíslan de la sangre de los pacientes con alta carga metastásica. Hemos generado con éxito modelos PDX de muestras de sangre con un rango de 100 a 10.000 CTC. En nuestra experiencia, es necesario que la mano de obra bien formadaAtory personal para llevar a cabo el protocolo de frecuencia a fin de asegurar el aislamiento con éxito de CTC de próstata a partir de muestras de sangre. Se recomienda que el personal de laboratorio capacitados inicialmente en este protocolo mediante el uso de muestras de sangre de individuos sanos normales enriquecida con células de líneas celulares tumorales. La ausencia o bajo número de CTC en el cáncer de próstata primario pueden limitar el uso de esta metodología para el cáncer de próstata metastásico.

El método para la generación de CTC deriva modelos PDX descritos en este protocolo se puede emplear posteriormente en muchas aplicaciones de investigación, incluyendo la caracterización molecular de cáncer de próstata, la detección de drogas, la respuesta al tratamiento de monitoreo, el desarrollo de biomarcadores, y otros avances en terapias contra el cáncer personalizados.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640	Gibco Life Technologies	11875-093
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco Life Technologies	10437-028
Penicillin Streptomycin	Gibco Life Technologies	15140-122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning Cell Gro	21-031-CM
35 µm Cell Strainer	BD Falcon	352340
50 ml polystyrene conical tube	Crystalgen	23-2263
Red blood cell lysing buffer	Sigma	R7757
DAPI	Invitrogen	d3571
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440
12 mm x 75 mm Polystyrene tubes with cell strainer cap	BD Falcon	352235
BD Vacutainer Lavender Blood Collection Tubes with EDTA
BD Winged Blood Collection Set with Push Button Retract Needle 23 gauge
BD Vacutainer One Use Needle Holder
Disposable Latex Tourniquet
Latex or non-latex gloves
alcohol swabs
2 x 2 cotton gauze pads
Adhesive bandage
25 G needle
1 ml syringe