전립선 암 환자의 발생은 종양 세포를 순환에서 이종 이식 모델을 파생

Introduction

환자 유래의 이종 이식은 암 연구에 사용되는 점점 더 인기를 실험 모델입니다. 이들은 생체 생물학적 경로, 전임상 약효 평가, 및 개인화 된 암 치료를위한 ^1,2- 아바타의 생성 특성에 사용될 수있다. 이전에, 다른 연구 그룹은 주입 또는 면역 저하 된 마우스 ^(1)에 단일 종양 세포 현탁액 또는 전체 종양 이식편을 주입함으로써 어느 PDX 모델을 개발 하였다. 이 PDX 모델은 신선한 고형 종양의 수술 수집, 악성 복수 또는 비용이 많이 드는 둘과 인성 사망률의 증가 위험에 환자를 노출하는 수술을받은 환자에서 흉막 삼출이 필요합니다.

암 연구 분야에서 최근의 발전은 상당한 종양 세포 순환의 검출, 분리 및 특성화되었다. 이들 종양 세포가 일차 종양 덩어리에서 탈출하고 순환을 입력그들은 전이 및 재발에 중요한 역할을하는 경우, 암의 가장 흔한 원인은 ^관련 사망률 ^3. 여러 고형암 유형에서 CTCS의 평가 및 특성 진단, 예후, 잔류 병 ^(3)를 모니터링하기위한 임상 정보를 제공하고 있습니다. 어느 물성, 바이오 마커의 발현 또는 CTCS의 기능적 특성에 의존하는 현재 사용되는 방법의 다양한 효율적 CTCS ⁴ 분리하는데 사용될 수있다. 기존 거시적 CTC 분리 방법은 표면 분자에 대해 밀도 구배 원심 분리, 필터 기공 물리적 여과 및 분리를 포함한다. 가장 널리 사용되는 CTC 분리 방법론 CTCS 항체 기반의 캡처에 기초한다. 두 세포 표면 마커의 양성 및 음성 선택은 말초 혈액으로부터 CTCS를 분리하는데 이용 될 수있다. 말초 순환에 CTCS에 대한 긍정적 인 선택은 일반적으로 상피 마커 (예를 들어,는 EpCAM)를 사용하는CTCS하지만 조혈하지 세포에서 발현 다시. 이 방법의 단점은 전이 가능성이있는 CTCS 자주 상피 - 투 - 중간 엽 ³ 상피 표면 마커를 downregulates 전이 (EMT),받은 것입니다. 전이성 잠재력 CTCS를 분리하기 위해, 조혈 표면 마커 CD45을 채용 음성 선별 방법은, 백혈구의 정상 세포 집단 ⁵ ​​사용될 수 고갈.

전립선 암은 가장 일반적으로 암 진단 및 남성 ^6의 암 관련 사망의 주된 원인이다. 종양 진행 및 공격성의 메커니즘은 완전히 이해되지 않으며, 따라서 생성 및 전립선 암의 분자 이질성 요점을 되풀이 실험 모델의 특성은 중요한 관심사이다. 전립선 암 PDX 모델왔다 immunocom에 인간 전립선 암 세포의 생착에 의해 이전에 생성 된약속 마우스 ^7,8. 그러나, 이러한 모델의 생성은 주로 병의 무통 성질에 기인 마우스에 면역이 전립선 암의 생착 낮은 속도에 의해 방해되어왔다. 최근 CTCS 유방암 ^9, 폐암 및 전립선 암 ^{10 11} PDX 모델을 생성하는 데 사용되어왔다. 이러한 개념 증명 연구는 수술 시료 채취의 필요성 PDX 모델 독립적 발생의 가능성을 소개했다. 이 문서에서 우리는 구체적으로이 소설의 실험 모델의 생성하는 방법을 설명합니다.

Protocol

이 프로토콜은 기관 연구 윤리 보드에서 승인을 우리의 기관에서 수행과 인간의 복지에 대한 모든, 기관, 국가, 국제 지침을 준수하고 있습니다.

고급 전립선 암 환자에서 말초 혈액 1. 컬렉션

참고 : 전이성 전립선 암 환자를 선택합니다. 기록 된 환자의 동의를 얻어 격리 연령 이전 화학 요법과 호르몬 치료를 포함하여 환자의 임상 적 특징을 기록한다. 전이성 질환을 가진 환자는 잠재적으로 말초 혈액에서 CTCS의 가장 높은 농도를해야합니다.

1. 동의 후 적절한 임상 시험 심사위원회가 프로토콜을 승인하에 혈액 샘플을 수집합니다. 라텍스 장갑 및 절차 전반에 걸쳐 실험실 코트를 착용 할 것.
2. 바늘 홀더에 25 G 나비 바늘과 튜브를 연결합니다. 의 영역을 청소하기 위해 알코올 면봉을 사용하여이두와 팔뚝 사이의 전주 정맥 후 환자의 상완에 지혈대를 적용합니다.
3. 전주 정맥에 나비 바늘을 삽입하고 수집을 시작하기 위해 바늘 홀더에 혈액 수집 튜브를 밀어 넣습니다. 혈액 응고를 방지하기 위해 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)을 함유 수집 튜브에 혈액의 약 10 ㎖를 수집한다.
4. 환자에서 나비 바늘을 제거하고 1 분 동안 정맥 천자의 사이트를 통해 멸균 거즈 패드에 압력을 적용합니다. 멸균 붕대로 커버 사이트.

단핵 세포의 분리 (2)

주 : 1 단계에서 수집 된 혈액 단핵 CTCS 이외에 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) (예 : 림프구 및 단핵구)를 포함 할 것이다.

1. : 1 비율 피펫 전체 5 ㎖의 혈청 학적 피펫 50ml의 폴리스티렌 원뿔 튜브에 혈액과는 1 행크스 균형 소금 솔루션 (HBSS)를 추가합니다. 조심스럽게 피펫 혼합물 균질화한다.
2. 빈 50 ml의 폴리스티렌 원뿔 관에 저속 밀도 구배 원심 분리하여 혈액 성분을 분리하기 위해 상업적으로 준비된 솔루션 (피콜 - 페이크)의 15 ML을 추가합니다.
3. 부드럽게 별개 상부층을 형성하는 단계에서 2.2 폴리스티렌 튜브에, 단계 2.1에서, 전혈 및 HBSS 혼합물을 피펫. 솔루션의 혼합을 최소화하기 위해 낮은 설정으로 설정 피펫이 효율적인 분리를 보장합니다.
4. RT에서 30 분 동안 400 XG (25 °의 C)에서 원심 분리한다. 가장 낮은 설정으로 감속 분리 후 솔루션의 혼합을 방지합니다. 가속도가 어떤 속도로 설정 될 수있다.
5. 원심 분리 후, 튜브의 하단에 상단과 분리 솔루션에 플라즈마 사이의 PBMC를하고 CTCS 끼워 층의 얇은 흰색 - 회색 스트라이프를 식별합니다.
6. 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 50 ㎖ 폴리스티렌 튜브에 단계 2.5에서 흰색 - 회색 스트라이프에서 세포를 수집합니다.
7. PBMC를하고 CTCS와 C 50 ml의 폴리스티렌 원뿔 관에 HBSS 추가10 분 RT는 씻어 400 XG에 다시 entrifuge.
8. 씻어 실온에서 3 분 동안 400 XG에 다시 HBSS 원심 분리기 50 ml의 액체에 resuspend 펠렛을 가만히 따르다.
9. 상층 액을 버리고, 적혈구 용해 버퍼의 5 ㎖로 나머지 펠렛을 재현 탁하고 실온에서 5 분 솔루션을 품어.
10. RT에서 3 분 동안 400 XG에서 원심 분리하여 적혈구 용해 완충액을 제거한다.
11. 상층 액을 제거하고 종래 항체 염색 차단 10 % 소 태아 혈청 (FBS) 보충 된 1 ml의 PBS 1X에 펠렛을 재현 탁.

정렬 형광 활성 세포에 대한 CD45-FITC 항체 3. 염색 단핵 세포 (FACS)

1. 혈구 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 (단계 2.11)에서 실행 가능한 (트리 판 블루 음성) 세포의 수를 정량화. (10 % FBS와 PBS 1X)에 1 × ¹⁰⁶ 세포 / ㎖ 현탁액을 준비하고 1 시간 동안 얼음에 놓습니다.
2. 정량 배포두 튜브에 이전 단계에서 세포 현탁액. 제어 및 CD45 염색 등의 레이블 튜브.
3. 250 : 제어 튜브에서, (1)의 희석 IgG1κ-FITC (2.5 μg의 / ㎖)을 추가한다. CD45 염색 튜브에서, (1)의 희석 CD45 FITC (2.5 μg의 / ㎖) 차 항체 컨쥬 게이트를 추가한다 (250)와 30 분 동안 얼음에 세포 현탁액을 배양한다. CD45 항원 라벨링은 조혈 세포를 배제하기 위해 사용된다.
4. 4 ℃에서 3 분 동안 400 XG에서 세포를 원심 분리기, 상층 액을 버린다.
5. 멸균 1 X PBS로 각 펠렛을 일시 중단에 의해 두 번 세포를 씻으은 4 ℃에서 3 분 동안 400 XG에서 원심 분리 한 다음 10 % FBS와 보충.
6. 10 μg / ml의 농도 4 ', 6-diamidino -2- 페닐 인돌 (DAPI)을 함유하는 PBS의 1 배의 1 ml의 용액 중에 세포를 재현 탁.
7. 12mm X 75mm의 폴리스티렌 튜브에 35 μm의 여과기 캡을 통해 최종 솔루션을 필터링합니다.

전립선 CTCS 4. 분리하여FACS

참고 : 라이브 CD45 부정적인 CTCS를 수집하는 사이토 흐름을 활용합니다.

1. 레이블 튜브에서 세포를 사용하여 설정 보상 컨트롤 "제어."
2. 파편과 적절한 앞​​으로 산란과 측면 산란 매개 변수를 사용하여 세포의 클러스터를 제외 게이트를 만듭니다.
3. 표지 된 튜브에서 세포 현탁액을 이용하여 FITC 게이트 확립 "CD45-FITC를."
4. 태평양 블루 채널을 사용하여 게이트 가능한 (DAPI 음성) 세포.
5. 10 % FBS가 보충 된 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 1640 2 ㎖를 함유하는 멸균 15 ml의 폴리스티렌 튜브에 원추형 CD45 네가티브 인구를 수집한다.
6. 10 % FBS가 보충 된 RPMI 500 μL - 3 분 동안 원심 분리기 (400)에서 정렬 XG 전립선 종양 세포 현탁액을, 다음 200에서 펠렛을 재현 탁.

이종 이식 성장의 마우스 및 모니터링에 CTCS 5. 주입

노트 :기관 동물 관리위원회에 의해 승인 된 프로토콜을 준수하여 모든 동물 절차를 실시한다. 이 프로토콜은 모든 관련 규제 및 제도 기관, 규정 및 지침에 따라 준수에 우리의 동물 관리위원회의 승인을 특정 동물을 사용 의정서에 따라 우리 기관에서 진행되고있다.

1. 얼음에 1 비율 및 장소 : 1에서 세포 외 기질로 분류 전립선 종양 세포 현탁액을 섞는다.
2. 산소 / 분 1 L의 5 % (v / v)로 흡입 이소 플루 란을 공급 챔버 내에 피하 주입하기 전에 마우스를 마취. 마우스 각막과 발가락 반사의 손실을 확인하여 적절한 마취를 확인합니다.
3. 25 G 바늘과 1 ML의 주사기를 사용하여, 8~10주 세 남자 면역 결핍 마우스의 양쪽 상단 측면에 전립선 종양 세포와 세포 외 기질 세포 현탁액의 피하 250 μl를 주입. 주입 부피는 I 인 250 μL없이 CTC 농도 주입mportant 값. 마우스에 최대 SQ 정부는 더 이상 1 ml를하지 않습니다.  
4. 피하 결절 밀도의 성장을위한 마우스 주사 부위의 주간 촉진을 수행함으로써 일주일에 두 번 마우스의 무게를 측정하여 마우스를 모니터링합니다.
5. 종양의 크기가 분자 분석 및 직렬 통로 충분한 종양 조직을 위해 0.5 cm 및 최대 직경 미만 1cm 때 경추 탈구 수확 피하 인간 전립선 암을 이종 이식 한 다음 이산화탄소 질식에 의해 쥐 안락사. 더 종양에​​도 불구하고 고통 또는 15 %의 체중 감소의 징후와 쥐를 안락사는 만져서입니다.

Representative Results

이 프로토콜은 절연 CD45 네가티브 전립선 암에서 CTCS PDX 모델의 생성을 초래할 것이다. 우리의 프로토콜에서 사용되는 음성 선별 방법에 따라 그 DAPI 염색을 이용하여 사균을 배제 할 필요가있다. 유동 세포 계측법에 의해 검출 CD45 음성 세포의 비율은 가변적이며 환자 (도 1a)의 종양 부담에 따라 달라진다. 흰색 화살표 (도 1b)로 표시된 바와 같이 (세포 핵을 식별) CD45 및 DAPI를 사용하여 정렬되지 않은 세포의 면역 형광 염색, CD45 음성 세포를 보여준다. 도 1C에서, 피하 결절 밀도 마우스의 양쪽 측면에 알 수있다. 각 결절 밀도는 이종 이식의 성장을 나타내며,이 마우스의 등 근육에서 돌출과 질감에서 확고한 같이 건강한 조직에서 별개로 감상 할 수 있습니다. 주입 및 이종 이식 개발 사이의 시간 간격은 patie의 CTC 부담에 따라 크게 달라질 수 있습니다NT 샘플, 이식 된 세포의 수와 CTCS의 생물학적 공격성. CTCS로부터 생성 전립선 PDX는 헤 마톡 실린과 에오신 염색 된 것과 같이 인간 전립선 종양 요점을 되풀이하고, 같은 안드로겐 수용체 (AR) 및 전립선 특이 적 막 항원 (PSMA) (도 1D)와 같은 전립선 특이 세포 마커에 대한 면역 조직 화학에 의해.

인간의 전립선 암 CTCS에서 전립선 암 PDX 모델의 1 세대를 그림. (A) 전립선 암 환자의 말초 혈액에서 CD45 염색 특정 세포 집단을 도시 한 플롯 유동 세포 계측법. . 긍정적 인 DAPI 얼룩 세포가 죽은 만 가능한 세포가 분리되어 보장하기 위해 게이팅에 의해 제외 된 분류되지 않은 인구 (B) CD45의 면역 염색은 CD45의 존재 확인 ^-. 세포 (흰색 화살표) (C) 생체 내 종양 수확 후 대표 PDX 종양을 보여줍니다 기존의 헤 마톡 실린 및 에오신 및 특정 전립선 마커를 사용하여 CTC PDX 모델 (D) 분석.; 안드로겐 수용체 (AR) 및 전립선 특이 막 항원 (PSMA). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이 원고 CTCS에서 전립선 암 PDX 모델 생성 방법을 설명한다. PDX의 생성을위한 CTCS의 사용 기존의 방법에 비해 여러 가지 잠재적 모델 중요한 이점을 갖는다. 첫째, 말초 혈액에서 CTCS의 접근 컬렉션 다른 질병 단계에서 동일 환자에서 실험 모델의 생성을 가능하게한다. 둘째, 채혈은 종양 세포의 수집을위한 수술을 필요로 기존 방법에 비해 종양 세포를 분리하기 위해 안전하고 저렴한 방법을 나타낸다.

CTC 농축 여러 방법이 많은 인해 자금과 자원의 한계로 모든 실험실에 액세스 할 수 없습니다 그러나 기술되었다. 우리는 외과, 많은 실험실, 편리 저렴하고 접근 방법의 사용에 활용할 수있는 우리의 실험실에서 분석을 개발하기 위해 노력했다. 이러한 방법의 잠재적 인 제한은높은 종양 환자에게 부담이 프로토콜의 사용을 제한 할 수 희귀 세포의 검출 감도가 불충분. 상피 세포의 물리적 또는 생물학적 특성을 사용하는 기술은 여러 가지 추가 이상이 제한을 완화하고,이 희귀 세포 집단 ^(4)의 검출 및 분리를 증가시키기 위해 사용될 수있다. 이 프로토콜에 설명 된 CTC 농축하는 방법은 음의 선택을 사용한다; CD45 ⁺ 백혈구 폐기 및 CD45된다 ^- CTCS이 유지됩니다. 요소 세포 현탁액에서 유동 세포 계측법에 의해 정렬 할 때 (예를 들어, 비 생존 세포를.) ^- 그것은 CD45 오염 가능성 제거하는 것이 중요합니다. 특히, 적혈구 용해 완충 용액의 사용 및 DAPI 염색으로 생존 할 셀 생략 중요한 고려 사항이다. 이러한 조치는 비 CTC 요소가 CD45 오염시키지 않도록 보장 할 수 있지만 ^- 인구, 우리의 이전 연구 제안이 원하는 세포 Population 충분히 이러한 방법 ^(11)이 풍부합니다. 그것은 CTC 인구의 순도는 전립선 암 세포 ^(3)에 고유 한 표면 마커를 셀에 항체를 사용하여, 양성 선별을 통해 개선 될 수 있다는 것이 가능하다. 또한, 시료에 존재하는 상피 세포의 CTC 얼룩이 및 개수는 EpCAM 또는 다른 적절한 얼룩을 사용하여 테스트 할 수있다. 전체 수율을 감소시키면서 그러나 말초 혈액 샘플의 추가 처리는 궁극적으로 순도를 증가시킬 수있다.

이 프로토콜에서 우리는 쉽게 주입 및 개발 종양의 모니터링을 허용 고립 CTCS의 피하 주사를 시행 하였다. 그러나, 피하 모델은 종양 생착 및 종양 세포 개체군의 손실을 손상시킬 수 불충분 한 영양 공급을 갖는다. 이러한 SUCC 향상 전립선 미세 촉진 마우스 전립선 (직교), 및 캡슐 subrenal 주입, 주입과 같은 대체 부위essful 생착 종양 이질성 보존은 조사자 선호도 ^1,2에 기초하여 수행 될 수있다. 최적으로, NOD / SCID / IL2λ 수용체 널 (NSG) 마우스 모델은 그러나 면역 쥐 (누드 NOD / SCID 또는, SCID / 베이지)의 다른 변형이 또한 성공적으로 사용되어, 이종 이식 생착 ^(12)의 속도를 증가시키기 위해 사용되어야 고형 종양의 발생에 PDX 모델 ^(1)를 산출했다. 생성 PDX 모델은 연속적 계대 될 수 있으며, 원래의 종양 특성 안정성이 확립 유전 ^{9-11,13 방법을} 사용하여 모니터.

가능한 전립선 암 CTCS의 높은 숫자의 회복은 질병의 단계에 따라 달라집니다. CTCS 높은 전이성 부담 환자의 혈액에서 분리 될 때 PDX 모델의 성공적인 세대는 가장 보장된다. 우리는 성공적으로 100 내지 10,000의 범위 CTCS로 혈액 샘플에서 PDX 모델을 생성 하였다. 우리의 경험에서, 잘 훈련 된 노동에 필요한atory 요원은 혈액 샘플에서 전립선 CTCS의 성공적인 차단을 보장하기 위해 자주 프로토콜을 수행한다. 우리 기관 담당자가 초기 종양 세포주에서 세포 아군 정상적인 건강한 사람의 혈액 샘플을 사용하여이 프로토콜 훈련 것을 추천한다. 부재 또는 차 전립선 암에서의 낮은 숫자 CTCS 전이성 전립선 암이 방법의 사용을 제한 할 수있다.

CTC의 생성을위한 방법은 이후에 분자 전립선 암의 특성, 약물 스크리닝, 모니터링 된 치료 반응, 바이오 마커 개발 및 맞춤 암 치료의 다른 진보를 포함하여 많은 연구 프로그램에서 이용 될 수있다이 프로토콜에서 설명 PDX 모델을 산출했다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640	Gibco Life Technologies	11875-093
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco Life Technologies	10437-028
Penicillin Streptomycin	Gibco Life Technologies	15140-122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning Cell Gro	21-031-CM
35 µm Cell Strainer	BD Falcon	352340
50 ml polystyrene conical tube	Crystalgen	23-2263
Red blood cell lysing buffer	Sigma	R7757
DAPI	Invitrogen	d3571
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440
12 mm x 75 mm Polystyrene tubes with cell strainer cap	BD Falcon	352235
BD Vacutainer Lavender Blood Collection Tubes with EDTA
BD Winged Blood Collection Set with Push Button Retract Needle 23 gauge
BD Vacutainer One Use Needle Holder
Disposable Latex Tourniquet
Latex or non-latex gloves
alcohol swabs
2 x 2 cotton gauze pads
Adhesive bandage
25 G needle
1 ml syringe