Генерация пациента рака простаты Производные ксенотрансплантат модели от циркулирующих опухолевых клеток

Introduction

Пациент, полученные ксенотрансплантаты становятся все более популярными экспериментальные модели, используемые для исследования рака. Они могут быть использованы для определения характеристик биомаркеров и биологических путей, доклинической оценки эффективности лекарственного средства, а также создание аватаров для персонализированного лечения рака ^1,2. Ранее другие исследовательские группы разработали модели PDX либо путем имплантации или инъекции суспензии отдельных клеток или опухоль вся опухолевых эксплантов в ослабленным иммунитетом мышей ^1. Они PDX модели требуют хирургического коллекцию свежих твердой опухоли, злокачественные асцит или плевральный выпот у пациента, перенесших хирургическую процедуру, которая дорогостоящим и подвергает пациента повышенному риску заболеваемости ятрогенной.

Значительная недавнее развитие в исследованиях рака был обнаружение, выделение и характеристика циркулирующих опухолевых клеток. Эти опухолевые клетки уйти от первичной опухоли и массы ввести циркуляциюгде они играют ключевую роль в метастазировании и рецидива, наиболее распространенной причиной рака смертности, связанной с ^3. Оценка и характеристика ЦОК из нескольких солидных опухолей предоставили клиническую информацию диагнозе, прогнозе и мониторинга остаточной болезни ^3. Разнообразие используемых в настоящее время подходов, опирающихся на любых физических свойств, экспрессии биомаркеров, или функциональных характеристик ЦОК можно использовать для эффективного выделения ЦОК ^4. Существующие методы изоляции макромасштабные CTC включают центрифугирования в градиенте плотности, физического фильтрацию с фильтром поры и разделение против поверхностных молекул. Наиболее широко используемые методики изоляции CTC основаны на основе антител захвата ЦОК. Положительные и отрицательные выбор маркеров клеточной поверхности могут быть использованы для выделения CTCs из периферической крови. Положительный отбор ЦОК в периферической крови обычно использует маркеры эпителиальных (например, EpCam) которыхвновь выразил на ЦОК, но не гемопоэтических клеток. Недостатком этого способа является то, что ЦОК с метастатическим потенциалом часто претерпела эпителиально-мезенхимального к переходу (EMT), который подавляет эпителиальные маркеры ^{поверхности} 3. Для того чтобы выделить CTCs с метастатическим потенциалом, отрицательным методологию выбора, который использует поверхностный маркер кроветворных CD45,, истощать нормальный клеточной популяции лейкоцитов может быть использован ^5.

Рак предстательной железы является наиболее часто диагностируется рак и является основной причиной, связанных с раком смертей у мужчин ^6. Механизмы опухолевой прогрессии и агрессивности не совсем понятны и, следовательно, генерация и характеристика экспериментальных моделей, которые воспроизводят молекулярной гетерогенности рака простаты представляют значительный интерес. Модели PDX рака предстательной железы было генерируется ранее приживления человека клеток рака простаты в immunocomобещанные мышей ^7,8. Однако для получения таких моделей было затруднено из-за низкой скорости приживления рака простаты в ослабленным иммунитетом мышей, которым в первую очередь отнести к ленивым природы заболевания. Недавно были ЦОК используется для генерации рак молочной железы ^9, рак легких и ¹⁰ рак простаты ^{11 моделей} PDX. Эти доказательства правильности концепции исследования введена возможность генерации PDX модели независимо от необходимости хирургического сбора проб. В этой статье мы подробно описать метод для генерации этого нового экспериментальной модели.

Protocol

Этот протокол был проведен в нашем учреждении с одобрения институциональных исследований по этике совета и в соответствии со всеми институциональными, национальных, и международных руководящих принципов для человеческого благосостояния.

1. Сбор периферической крови у пациентов с раком простаты

Примечание: Выберите больных с метастатическим раком предстательной железы. Получить письменное согласие пациента и записывать клинические характеристики пациентов, в том числе в возрасте в изоляции, а также предыдущий химиотерапии и гормональной терапии. Пациенты с метастазами будет иметь потенциально высокую концентрацию циркулирующих опухолевых клеток в периферической крови.

1. Соберите образцы крови после информированного согласия и под соответствующий Экспертный совет утвердил протокол. Носите латексные перчатки и лабораторный халат на протяжении всей процедуры.
2. Подключите 25 G бабочки иглу и трубки для держателя иглы. Используйте спиртовой тампон, чтобы очистить площадьлоктевой вены между бицепс и предплечья, а затем применить жгут, чтобы предплечье пациента.
3. Вставьте иглу в бабочку локтевой вены и нажмите пробирку крови в держатель иглы, чтобы начать коллекцию. Собирают примерно 10 мл крови в пробирках для сбора, которые содержат этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), чтобы предотвратить свертывание.
4. Удалить бабочка иглы от пациента и оказать давление стерильной марлевой салфеткой в ​​течение сайт вены прокола в течение 1 мин. Обложка сайт с стерильную повязку.

2. Выделение мононуклеарных клеток

Примечание: кровь, собранная с шага 1 будет содержать мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК) (например, лимфоцитов и моноцитов) в дополнение к мононуклеарных ЦОК.

1. Пипетка цельной крови в 50 мл коническую пробирку из полистирола с 5 мл серологической пипеткой и добавить Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) в соотношении 1: 1. Аккуратно пипетки смесь для гомогенизации.
2. Добавить 15 мл коммерчески приготовленного раствора (Ficoll-Paque), чтобы отделить компоненты крови с низкой скоростью центрифугирования в градиенте плотности в пустую 50 мл коническую пробирку полистирола.
3. Аккуратно пипетки всю кровь и HBSS смесь со стадии 2.1, в полистирола трубки с шага 2.2, чтобы сформировать четкую верхний слой. Набор пипетки на минимальное значение, чтобы минимизировать перемешивания растворов, это обеспечит эффективное разделение.
4. Центрифуга при 400 х г в течение 30 мин при комнатной температуре (25 ° C). Установите торможение до минимального значения, чтобы предотвратить смешивание растворов после разделения. Ускорение может быть установлено на любой скорости.
5. После центрифугирования определить тонкую белую-серую полоску РВМС и ЦОК зажатой между слоем плазмы на верхней и разделения раствора в нижней части трубки.
6. Сбор клеток из бело-серого полосой на шаге 2.5 в 50 мл полистирола трубки с помощью пластиковой пипетки передачи.
7. Добавить HBSS до 50 мл коническую трубку полистирола с МНПК и ЦОК и Centrifuge снова при 400 мкг в течение 10 мин RT мыть.
8. Декантировать жидкость и ресуспендируют осадок в 50 мл HBSS и центрифуге при 400 раз мкг в течение 3 минут при комнатной температуре, чтобы вымыть.
9. Жидкость над осадком сливают, ресуспендируют осадок оставшийся 5 мл красных кровяных буфера для лизиса клеток и инкубируют раствор в течение 5 мин при комнатной температуре.
10. Снимите красных кровяных клеток буфер лизиса путем центрифугирования при 400 мкг в течение 3 мин при комнатной температуре.
11. Жидкость над осадком сливают и вновь суспендируют таблетку в 1 мл PBS 1X, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), чтобы блокировать до окрашивания антител.

3. Окрашивание мононуклеарных клеток с CD45-FITC антитела для флуоресцентной Активированный сортировки клеток (FACS)

1. Определить число жизнеспособных (трипанового синего-отрицательный) клеток (со стадии 2.11) с помощью гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток. Подготовьте 1 х 10 ⁶ клеток / мл суспензии (в PBS 1x 10% FBS) и поместите его на льду в течение 1 часа.
2. Раздайте количественноСуспензию клеток из предыдущего шага в две пробирки. Этикетка трубки, как контроль и окрашивания CD45.
3. В контрольную пробирку, добавить IgG1κ-FITC (2,5 мкг / мл) в разведении 1: 250. В CD45 окрашивание трубки, добавить CD45 FITC (2,5 мкг / мл) конъюгированный первичного антитела в разведении 1: 250 и инкубируют клеточные суспензии на льду в течение 30 мин. Антиген CD45 маркировки используется для исключения кроветворных клеток.
4. Центрифуга клетки при 400 х г в течение 3 мин при 4 ° С, и отбросить супернатант.
5. Промыть клетки дважды, путем суспендирования каждый шарик стерильной 1 х PBS с добавлением 10% FBS с последующим центрифугированием при 400 х г в течение 3 мин при 4 ° С.
6. Ресуспендируют клеток в растворе PBS 1X, содержащих 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) в концентрации 10 мкг / мл 1 мл.
7. Фильтр окончательное решение через сито 35 мкм шапки в 12 мм х 75 мм полистирола труб.

4. Выделение простаты ЦОК поFACS-

Примечание: Использование проточного цитометра, чтобы собрать живые CD45 негативные CTCs.

1. Установить контроль компенсации с использованием клеток из пробирку, "контроль".
2. Создать ворота, которые исключают мусора и скопления клеток, используя соответствующие вперед-рассеяния и бокового рассеяния параметров.
3. Создание ФИТЦ ворота, используя клеточные суспензии из пробирку, "CD45-FITC."
4. Ворота жизнеспособные (DAPI-отрицательных) клетки, использующие Pacific Blue-канала.
5. Сбор CD45 отрицательное население в стерильный 15 мл коническую пробирку полистирола, содержащую 2 мл Roswell Park Memorial института (RPMI) 1640 с 10% FBS.
6. Центрифуга сортируются простаты подвески опухолевых клеток при 400 мкг в течение 3 мин, а затем ресуспендируют гранул в 200 - 500 мкл RPMI с добавлением 10% FBS.

5. Введение ЦОК в мышах и мониторинга ксенотрансплантата роста

Примечание:Провести все процедуры животных в соответствии с протоколами, утвержденными институциональной комитета по уходу за животными. Этот протокол был проведен в нашем учреждении в рамках конкретного использования животных протоколом, утвержденным нашего Комитета животных помощи в соответствии с и с соблюдением всех соответствующих нормативных и институциональных учреждений, правил и руководств.

1. Смешайте отсортированный простаты подвески опухолевых клеток с внеклеточным матриксом в соотношении 1: 1 и помещают на лед.
2. Обезболить мышь до подкожной имплантации в камере подачи 5% (объем / объем) вдыхании изофлуран в 1 л / мин кислорода. Обеспечить соответствующее анестезии, проверяя потери роговицы и ног рефлекса у мышей.
3. Использование 25 г иглы и шприца на 1 мл, вводят 250 мкл опухоли простаты клетки и внеклеточного матрикса клеточной суспензии подкожно в оба бока верхних в 8-10-недельных самцов мышей с иммунодефицитом. Вводите 250 мкл, независимо от концентрации CTC, как объем впрыска является яmportant значение. Не Максимальная администрация SQ в мыши не более 1 мл.  
4. Монитор мышей, выполняя еженедельно пальпацию мыши местах инъекций для роста подкожных узловых плотности и измерения мышей вес в два раза в неделю.
5. Эвтаназии мышей от удушья диоксида углерода с последующим смещением шейных позвонков и урожай подкожных ксенотрансплантатов рака простаты, когда человек размер опухоли более 0,5 см и менее 1 см в диаметре, чтобы наибольший обеспечить достаточно ткани опухоли для молекулярных анализов и последовательный проход. Эвтаназии мышей с признаками бедствия или потери веса на 15%, несмотря на отсутствие опухоли ощутима.

Representative Results

Этот протокол будет приводить к генерации моделей PDX из изолированных CD45 ЦОК рака простаты отрицательный. На основании отрицательного метода отбора, используемого в нашем протоколе необходимо исключить мертвые клетки с помощью DAPI пятно. Процент CD45-отрицательных клеток обнаружено с помощью проточной цитометрии является переменной и зависит от нагрузки опухоли пациента (фиг.1А). Иммунофлуоресцентного окрашивания несортированных клеток с использованием CD45 и DAPI (для идентификации клеточные ядра) показывает, CD45-отрицательных клеток, как указано белыми стрелками (Фигура 1В). На рисунке 1С, подкожные узелковые плотности можно увидеть на обоих флангах мыши. Каждый шаровидным плотности представляет рост ксенотрансплантата и могут быть оценены в отличие от здоровой ткани, как она выступает из дорсальной мускулатуры мыши и тверже в текстуре. Временной интервал между имплантацией и развитием ксенотрансплантата могут значительно варьироваться в зависимости от бремени CTC в patieNT образец, количество имплантированных клеток и биологическая агрессивность ЦОК. Простаты PDX генерируется из ЦОК повторять опухоль простаты человека, как видно по гематоксилин и эозином, и иммуногистохимии для простаты конкретных клеточных маркеров, таких как рецептора андрогена (AR) и простата-специфического антигена (мембранный ПСМА) (рис 1D).

Рисунок 1. Генерация Рак простаты PDX Модели из человека рака простаты ЦОК. (А) Проточная цитометрия график, иллюстрирующий конкретных групп окрашивание CD45 клеток из периферической крови пациента с раком простаты. . Клетки с положительной DAPI пятно мертвы и исключены стробирования для обеспечения только жизнеспособные клетки изолированы (Б) CD45 иммунофлюоресценции окрашивание несортированным населения подтверждает наличие CD45 ^-. Клеток (белые стрелки) (С) в естественных условиях и после сбора урожая опухоли (D) Анализ моделей CTC PDX использованием обычного гематоксилином и эозином и специфические маркеры простаты. рецептора андрогена (AR) и простата-специфический мембранный антиген (ПСМА). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Эта рукопись описывает метод для генерации моделей рака простаты PDX от ЦОК. Использование ЦОК для генерации PDX Модели имеет несколько потенциальных преимуществ при важных сравнению с существующими методами. Во-первых, доступны коллекция ЦОК из периферической крови позволяет поколение экспериментальных моделях от того же пациента на разных стадиях заболевания. Во-вторых, сбор крови представляет собой безопасный и недорогой метод, чтобы изолировать раковые клетки по сравнению с существующими методиками, которые требуют хирургических процедур для сбора опухолевых клеток.

Несколько методов обогащения КТК были описаны однако многие не являются доступными для каждой лаборатории из-за финансовых и ресурсных ограничений. Мы стремились разработать анализа в нашей лаборатории, которые могли бы выгоду в использовании FACS, удобный, недорогой и доступный методологии многих лабораториях. Потенциальным ограничением данной методики являетсянедостаточное чувствительности для обнаружения редких клеток, которые могли бы ограничить использование этого протокола для пациентов с высоким бременем опухоли. Несколько дополнительных технологий, которые используют физические или биологические свойства эпителиальных клеток может быть использована для более снизить это ограничение и увеличить обнаружение и выделение этого редкого клеточной популяции ^4. Способ обогащения СТС, описанной в данном протоколе используется негативный отбор; CD45 ⁺ лейкоциты отбрасывают и CD45 ^- ЦОК сохраняются. Важно, чтобы удалить потенциально загрязняющих CD45 ^- элементы из клеточных суспензий при сортировке с помощью проточной цитометрии (например, нежизнеспособных клеток.). В частности, использование красного буфера для лизиса клеток крови и пропуск нежизнеспособных клеток окрашиванием DAPI критические соображения. В то время как эти меры не могут гарантировать, что элементы без CTC не загрязняют CD45 ^- население, наши предыдущие исследования показывают, что желаемый клеток рopulation достаточно обогащен этих методов ^11. Вполне возможно, что чистота населения CTC можно улучшить путем позитивной селекции с использованием антител к клеточной поверхности маркеры, уникальные для клеток рака простаты ^3. Кроме того, СТС неоднородность и количество эпителиальных клеток, присутствующих в образце может быть проверена с помощью EpCAM или другие соответствующие пятна. Однако дополнительная обработка периферической образец крови может повысить чистоту, в конечном счете, уменьшая общий выход.

В этом протоколе мы провели подкожной инъекции изолированных ЦОК, который позволяет для легкой имплантации и мониторинга развивающихся опухоли. Тем не менее, подкожные модели имеют недостаточный запас питания, которые могут поставить под угрозу приживление опухоли и потери опухолевых клеток субпопуляций. Альтернативные инъекции сайты, такие как простаты мыши (ортотропного), что способствует микросреду простаты, и субренальную инъекции капсулы, что повышает Successful приживления и сохраняет опухоли неоднородности, может быть выполнена на основе предпочтений исследователя ^1,2. Оптимально, NOD / SCID / IL2λ-рецептора NULL (NSG) мышиные модели должны быть использованы для увеличения скорости ксенотрансплантата приживления ^12, однако другие штаммы ослабленным иммунитетом мышей (NOD / SCID или, Ню, SCID / бежевый) также были успешно использованы при генерации плотной опухоли происходит моделей PDX ^1. Созданные модели PDX может быть последовательно пассировать и стабильность исходных характеристик опухоли контролируется с помощью генетических методов, установленных ^9-11,13.

Восстановление большого числа жизнеспособным рака простаты ЦОК зависит от стадии заболевания. Успешное поколение моделей PDX лучше конечно когда ЦОК изолированы от крови пациентов с высоким метастатическим нагрузки. Мы успешно создали модели PDX из образцов крови с диапазоне от 100 до 10000 ЦОК. По нашему опыту, это необходимо для хорошо подготовленных рабочей силыAtory персонала для выполнения протокола часто для того, чтобы обеспечить успешное изоляции ЦОК простаты из образцов крови. Мы рекомендуем, чтобы персонал лаборатории первоначально подготовку в этом протоколе, используя образцы крови от здоровых лиц с шипами клеток опухолевых клеточных линий. Отсутствие или малое количество ЦОК в начальной рака простаты может ограничить использование этой методологии к метастатическим раком предстательной железы.

Способ генерации КТК получены модели PDX, описанные в данном протоколе впоследствии могут быть использованы во многих исследовательских приложений, включая молекулярной характеристики рака простаты, скрининге лекарственных ответ мониторинга терапии, развитие биомаркеров, а также другие достижения в области персональной терапии рака.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640	Gibco Life Technologies	11875-093
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco Life Technologies	10437-028
Penicillin Streptomycin	Gibco Life Technologies	15140-122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning Cell Gro	21-031-CM
35 µm Cell Strainer	BD Falcon	352340
50 ml polystyrene conical tube	Crystalgen	23-2263
Red blood cell lysing buffer	Sigma	R7757
DAPI	Invitrogen	d3571
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440
12 mm x 75 mm Polystyrene tubes with cell strainer cap	BD Falcon	352235
BD Vacutainer Lavender Blood Collection Tubes with EDTA
BD Winged Blood Collection Set with Push Button Retract Needle 23 gauge
BD Vacutainer One Use Needle Holder
Disposable Latex Tourniquet
Latex or non-latex gloves
alcohol swabs
2 x 2 cotton gauze pads
Adhesive bandage
25 G needle
1 ml syringe