Generation von Prostatakrebs-Patienten gewonnen Xenograft-Modelle von zirkulierenden Tumorzellen

Introduction

Patienten abgeleitet Xenotransplantate werden immer beliebter experimentelle Modelle für die Krebsforschung eingesetzt. Sie können für die Charakterisierung von Biomarkern und biologische Pfade, präklinische Bewertung der Wirksamkeit von Medikamenten, und die Schaffung von Avataren für personalisierte Krebstherapien ^1,2 verwendet werden. Zuvor haben andere Forschungsgruppen PDX-Modelle entweder durch Implantation oder Injektion von einzelnen Tumorzellsuspensionen oder ganze Tumor Explantate in immungeschwächten Mäusen ¹ entwickelt. Diese PDX Modelle erfordern chirurgische Sammlung von frischen soliden Tumor, malignen Aszites oder Pleuraerguss von einem Patienten, der sich einem chirurgischen Eingriff, die sowohl teuer ist und setzt den Patienten einem erhöhten Risiko der iatrogenen Morbidität.

Eine signifikante neue Entwicklung in der Krebsforschung ist die Detektion, Lokalisierung und Charakterisierung von zirkulierenden Tumorzellen. Diese Tumorzellen zu entkommen aus dem primären Tumormasse und geben Zirkulationwo sie spielen eine entscheidende Rolle bei der Metastasierung und Rückfall, ist die häufigste Ursache von Krebs bedingte Sterblichkeit ^3. Die Auswertung und Charakterisierung von CTCs aus verschiedenen soliden Tumorarten haben klinische Informationen für die Diagnose, Prognose und Überwachung von Resterkrankung ³ zur Verfügung gestellt. Eine Vielzahl von derzeit verwendeten Ansätze sich auf entweder die physikalischen Eigenschaften, die Expression von Biomarkern oder Gebrauchseigenschaften CTCs kann verwendet werden, um effizient zu isolieren CTCs ⁴ werden. Bestehende Makro CTC Isolationsverfahren beinhalten Dichtegradientenzentrifugation, körperliche Filtration mit Filterporen und Trennung gegen Oberflächenmoleküle. Die am weitesten verbreitete CTC Isolierung Methoden werden auf Antikörper-basierte Erfassung von CTC basiert. Sowohl positive als auch negative Selektion von Zelloberflächenmarkern verwendet werden, um CTCs aus peripherem Blut zu isolieren. Positive Selektion für CTCs im peripheren Kreislauf verwendet allgemein epithelialen Marker (zB EpCAM), die einewieder auf CTCs aber nicht hämatopoetischen Zellen exprimiert. Der Nachteil dieser Methode ist, dass CTCs mit metastatischem Potenzial oft epithelial-to-mesenchymale Transition (EMT), die Epitheloberfläche Marker ³ downregulates zogen. Um CTCs mit metastatischen Potential zu isolieren, eine negative Selektionsmethode, die den blutbildenden Oberflächenmarker CD45 verwendet, um zum Abbau der normalen Zellpopulation von Leukozyten verwendet werden ^5.

Prostatakrebs ist die am häufigsten diagnostizierte Krebs und eine Hauptursache der durch Krebs verursachten Todesfälle bei Männern ^6. Die Mechanismen der Tumorprogression und Aggressivität sind nicht vollständig verstanden, und deshalb die Erzeugung und Charakterisierung von experimentellen Modellen, die die molekulare Heterogenität von Prostatakrebs rekapitulieren sind von großem Interesse. PDX Modelle von Prostatakrebs wurden vorher durch Verpflanzung von menschlichen Prostatakrebszellen erzeugten immunocomversprach Mäusen ^7,8. Jedoch ist die Erzeugung solcher Modelle ist durch die geringe Transplantationsrate von Prostatakrebs in immungeschwächten Mäusen, die im Wesentlichen auf die träge Art der Krankheit zurückzuführen ist behindert. Kurzem CTCs wurden verwendet, um Brustkrebs ^9, Lungenkrebs und Prostatakrebs ^{10 11} PDX Modelle zu erzeugen. Diese Proof-of-Concept-Studien wurde die Möglichkeit eingeführt PDX-Modelle unabhängig von der Notwendigkeit eines chirurgischen Probensammlung zu erzeugen. In diesem Artikel beschreiben wir im Detail ein Verfahren zur Erzeugung dieser neuartigen experimentellen Modell.

Protocol

Dieses Protokoll wurde an unserer Hochschule mit Genehmigung durch die institutionellen Forschungsethikkommission durchgeführt und ist in Übereinstimmung mit allen institutionellen, nationalen und internationalen Richtlinien für das menschliche Wohlergehen.

1. Erhebung der peripheren Blut von Patienten mit fortgeschrittenem Prostatakrebs

Hinweis: Wählen Sie Patienten mit metastasierendem Prostatakrebs. Eine schriftliche Einwilligung des Patienten und notieren klinischen Merkmale der Patienten, einschließlich Alter, in Isolation und vorherige Chemotherapie und Hormonbehandlungen. Patientinnen mit metastasiertem Brustkrebs wird potenziell höchste Konzentration von CTCs im peripheren Blut.

1. Sammeln von Blutproben nach der informierten Einwilligung und unter einer geeigneten Institutional Review Board genehmigten Protokoll. Latexhandschuhe und Laborkittel während des gesamten Verfahrens zu tragen.
2. Schließen Sie 25 G Butterfly-Nadel und Schlauch mit Nadelhalter. Verwenden Sie einen Alkoholtupfer zur Reinigung BereichAntekubitalvene zwischen Bizeps und Unterarm, dann gelten Tourniquet um Patienten Oberarm.
3. Legen Schmetterling Nadel in Antekubitalvene und schieben Blutentnahmeröhrchen in die Nadelhalter zur Sammlung zu beginnen. Sammeln ca. 10 ml Blut in Blutentnahmeröhrchen Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), um ein Gerinnen zu verhindern, enthalten.
4. Entfernen Schmetterlingsnadel von Patient und Druck mit steriler Gaze über Ort der Venenpunktion für 1 min. Abdeckung Seite mit einem sterilen Verband.

2. Isolierung von mononukleären Zellen

Anmerkung: Die in Schritt 1 gesammelten Blut werden periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) (zB Lymphozyten und Monozyten) zusätzlich zu den mononukleären CTCs enthalten.

1. Pipette Vollblut in 50 ml konischen Röhrchen Polystyrol mit einer 5 ml serologische Pipette und fügen Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) in einem Verhältnis 1: 1. Gently Pipette Mischung zu homogenisieren.
2. 15 ml eines kommerziell hergestellten Lösung (Ficoll-Paque), um Blutkomponenten durch niedrige Geschwindigkeit Dichtegradientenzentrifugation getrennt in einen leeren 50 ml konischen Röhrchen Polystyrol.
3. Pipette vorsichtig Vollblut und HBSS Mischung aus Schritt 2.1, in die Polystyrol-Röhrchen aus Schritt 2.2, um unterschiedliche obere Schicht zu bilden. Set Pipette auf niedrigste Einstellung zu minimieren Durchmischung von Lösungen, wird dies zu gewährleisten effiziente Trennung.
4. Zentrifuge bei 400 × g für 30 min bei RT (25 ° C). Stellen Verzögerung auf niedrigste Einstellung Mischung von Lösungen nach der Trennung zu verhindern. Beschleunigung kann auf jede Geschwindigkeit eingestellt werden.
5. Nach dem Zentrifugieren identifizieren den dünnen weißgrauen Streifen von PBMCs und CTCs klemmt Schicht zwischen Plasma auf der Oberseite und Trennlösung am Boden des Röhrchens.
6. Sammeln Sie die Zellen von der weiß-grauen Streifen in Schritt 2.5 in ein 50 ml Polystyrolröhrchen mit einem Kunststofftransferpipette.
7. In HBSS auf 50 ml konischen Röhrchen Polystyrol mit PBMCs und CTCs und centrifuge wieder bei 400 × g für 10 min RT zu waschen.
8. Dekantier-Flüssigkeit und Pellet in 50 ml HBSS und Zentrifuge wieder bei 400 × g für 3 min bei RT waschen.
9. Überstand verwerfen, resuspendieren verbleibende Pellet mit 5 ml Lyse der roten Blutkörperchen Puffer und Inkubation der Lösung für 5 min bei RT.
10. Entfernen der roten Blutkörperchen Lysepuffer durch Zentrifugation bei 400 × g für 3 min bei RT.
11. Der Überstand verworfen und das Pellet in 1 ml PBS 1x mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt werden, um vor der Antikörperfärbung blockieren.

3. Die Färbung mononukleären Zellen mit CD45-FITC Antikörper für Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

1. Quantifizierung der Zahl der lebensfähigen (Trypanblau-negative Zellen) (aus Schritt 2.11) mit einer Zählkammer oder automatisierten Zellzähler. Bereiten Sie eine 1 x ¹⁰ 6 Zellen / ml Suspension (in PBS 1x mit 10% FBS) und legen Sie sie auf Eis für 1 Stunde.
2. Verteilen Sie die quantifiziertZellsuspension aus dem vorherigen Schritt in zwei Röhrchen. Label Rohre als Kontrolle und CD45-Färbung.
3. In dem Steuerrohr, fügen IgG1κ-FITC (2,5 ug / ml) in einer Verdünnung von 1: 250. In der CD45-Färbung Rohr, fügen CD45 FITC (2,5 ug / ml) konjugierte primäre Antikörper bei einer Verdünnung von 1: 250 und Inkubation der Zellsuspensionen auf Eis für 30 min. CD45-Antigen Kennzeichnung wird verwendet, um hämatopoetische Zellen auszuschließen.
4. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 × g für 3 min bei 4 ° C, und den Überstand verwerfen.
5. Zweimaliges Waschen der Zellen durch Suspendieren jedes Pellet mit sterilem 1 x PBS, ergänzt mit 10% FBS, gefolgt von Zentrifugation bei 400 × g für 3 min bei 4 ° C.
6. Resuspendieren der Zellen in einer 1 ml Lösung von PBS 1x enthaltend 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) in einer Konzentration von 10 ug / ml.
7. Filtern Sie die endgültige Lösung durch 35 & mgr; m Sieb Kappen in 12 mm x 75 mm Polystyrolröhrchen.

4. Isolierung von Prostata CTCs durchFACS

Hinweis: Nutzen Sie eine Durchflusszytometer, um Live-CD45 negativen CTCs zu sammeln.

1. Stellen Kompensationssteuerungen unter Verwendung von Zellen aus dem Röhrchen beschriftet, "Control".
2. Erstellen Tore, die Trümmer und Cluster von Zellen unter Verwendung von geeigneten Vorwärtsstreu und Seitenstreuparameter aus.
3. Stellen Sie die FITC-Gates mit den Zellsuspensionen aus dem Röhrchen markiertem "CD45-FITC."
4. Tor lebensfähigen (DAPI-negative) Zellen unter Verwendung des Pacific Blue-A-Kanal.
5. Sammeln CD45 negativen Population in einen sterilen 15 ml konischen Röhrchen Polystyrol, das 2 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 mit 10% FBS ergänzt.
6. Zentrifuge nach der Prostatatumorzellsuspension bei 400 × g für 3 min, dann Resuspendieren des Pellets in 200 bis 500 ul RPMI, supplementiert mit 10% FBS.

5. Die Injektion von CTCs in Mäusen und Überwachung von Xenograft Wachstum

Hinweis:Führen Sie alle Tierverfahren in Übereinstimmung mit den Protokollen von der Institutional Animal Care Committee genehmigt. Dieses Protokoll wurde an unserem Institut wurde im Rahmen eines spezifischen Tier Verwenden Protokolls durch unsere Animal Care Committee in Übereinstimmung und Einhaltung aller relevanten rechtlichen und institutionellen Agenturen, Vorschriften und Richtlinien zugelassen durchgeführt.

1. Mischen Sie die sortiert Prostatatumorzellsuspension mit der extrazellulären Matrix in einem Verhältnis 1: 1 und auf Eis.
2. Betäuben Maus vor subkutaner Implantation in einer Kammer, Zuführen von 5% (v / v) inhalierten Isofluran in 1 l / min Sauerstoff. Eine angemessene Betäubung, indem für den Verlust der Hornhaut und Zehenreflex in der Maus.
3. Verwendung einer 25 G-Nadel und einer 1 ml Spritze, Injizieren 250 ul Prostatatumorzellen und extrazellulärer Matrix Zellsuspension subkutan in beide oberen Flanken einer 8-10 Wochen alten männlichen immundefizienten Maus. Volumina von 250 ul unabhängig von CTC-Konzentration als das Injektionsvolumen ist das important Wert. Maximale SQ Verwaltung in der Maus nicht mehr als 1 ml.  
4. Überwachen Mäusen durch Ausführen wöchentliche Palpation der Maus Injektionsstellen für das Wachstum von subkutanen noduläre Dichten und durch Messen Mäusen Gewicht zweimal pro Woche.
5. Euthanize Mäuse durch Ersticken mit Kohlendioxid, gefolgt durch Genickbruch und der Ernte subkutanen menschlichen Prostatakrebs-Xenotransplantaten, wenn die Tumorgröße mehr als 0,5 cm und weniger als 1 cm größter Durchmesser ausreichend Tumorgewebe für molekularbiologische Untersuchungen und die serielle Passage zu gewährleisten. Euthanize Mäusen mit Anzeichen von Leiden oder Gewichtsverlust von 15%, obwohl keine Tumor ist spürbar.

Representative Results

Dieses Protokoll wird auf die Erzeugung von PDX-Modelle von isolierten CD45 negativen Prostatakrebs CTCs führen. Basierend auf der in unserem Protokoll verwendeten negativen Selektionsverfahrens ist es notwendig, um tote Zellen auszuschließen unter Verwendung von DAPI-Färbung. Der Prozentsatz von CD45-negativen Zellen durchflusszytometrisch erfasst ist variabel und hängt von der Tumorbelastung des Patienten (1A). Immunfluoreszenzfärbung von unsortierten Zellen mit CD45 und DAPI (Zellkerne identifiziert) zeigt, CD45-negativen Zellen, wie durch die weißen Pfeile (1B) angegeben. In 1C können subkutane noduläre Dichten auf beiden Flanken der Maus zu sehen. Jede Kugeldichte repräsentiert Xenotransplantat Wachstum und können im Gegensatz zu gesundem Gewebe erkannt werden, wie sie sich aus der Rückenmuskulatur der Maus vorsteht und fester in der Textur. Das Zeitintervall zwischen der Implantation und Xenotransplantat Entwicklung kann stark in Abhängigkeit von der Last des CTC patie variierennt Probe, Anzahl der Zellen implantiert und die biologische Aggressivität des CTC. Prostata PDX von CTCs erzeugt rekapitulieren menschlichen Prostatatumor durch Hämatoxylin und Eosin-Färbung zu sehen ist, und durch Immunhistochemie für Prostata-spezifische zelluläre Marker, wie Androgenrezeptor (AR) und Prostata-spezifisches Membran-Antigen (PSMA) (1D).

Abbildung 1. Erzeugung von Prostatakrebs PDX-Modelle von menschlichen Prostatakrebs CTC. (A) Durchflusszytometrie Diagramm, welches spezifische CD45-Färbung Zellpopulationen aus dem peripheren Blut eines Patienten mit Prostatakrebs. . Zellen mit positiven DAPI-Färbung sind tot und durch Gating, um sicherzustellen, nur lebensfähige Zellen werden isoliert ausgeschlossen (B) CD45 Immunfluoreszenzfärbung von unsortiertem Bevölkerung bestätigt die Anwesenheit von CD45 ^-. Zellen (weiße Pfeile) (C) in vivo und nach Tumor Ernte (D) Analyse von CTC PDX-Modelle mit herkömmlichen Hämatoxylin und Eosin und die spezifischen Prostata-Marker. Androgen-Rezeptor (AR) und Prostata-spezifischen Membran-Antigen (PSMA). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Diese Handschrift beschreibt ein Verfahren zur Erzeugung von Prostatakrebs PDX Modelle CTCs. Die Verwendung von CTCs zur Erzeugung von PDX Modelle hat mehrere wichtige potenzielle Vorteile gegenüber bestehenden Verfahren. Zuerst zugängliche Sammlung von CTCs aus dem peripheren Blut ermöglicht die Erzeugung von experimentellen Modellen des gleichen Patienten in verschiedenen Krankheitsstadien. Zweitens stellt der Blutentnahme eine sicherere und kostengünstiges Verfahren, um Tumorzellen zu isolieren, wenn im Vergleich zu bestehenden Methoden, die chirurgische Verfahren für die Sammlung von Tumorzellen erforderlich.

Mehrere Methoden der CTC-Anreicherung wurden jedoch beschrieben worden ist vielen nicht zugänglich sind jedem Labor durch Finanzierung und Ressourcenbeschränkungen. Wir versuchten, einen Test in unserem Labor, die bei der Verwendung von FACS, eine bequeme, erschwingliche und zugängliche Methode für viele Labors profitieren könnte zu entwickeln. Ein potentieller Nachteil dieser Methodik istdie unzureichende Empfindlichkeit für den Nachweis seltener Zellen, die die Verwendung dieses Protokolls, um Patienten mit einer hohen Tumorbelastung begrenzen könnte. Mehrere zusätzliche Technologien, die physikalische oder biologische Eigenschaften von Epithelzellen einsetzen können verwendet werden, um über diese Einschränkung zu mindern und erhöhen die Detektion und Isolation von dieser seltenen Zellpopulation ⁴ werden. Das Verfahren in diesem Protokoll beschriebenen CTC Bereicherung beschäftigt negative Selektion; CD45 ⁺ Leukozyten werden verworfen und CD45 ^- CTCs werden beibehalten. Es ist wichtig, um potentiell verunreinigende CD45 ^- Elemente von den Zellsuspensionen bei der Sortierung mittels Durchflusszytometrie (zB nicht-lebensfähige Zellen.). Insbesondere die Verwendung von roten Blutkörperchen die Lyse-Puffer und das Weglassen der nicht lebensfähigen Zellen durch DAPI-Färbung kritische Überlegungen. Während diese Maßnahmen können nicht garantieren, dass nicht-CTC-Elemente nicht die CD45 kontaminieren ^- Bevölkerung deuten unsere früheren Studien, dass die gewünschte Zelle population ausreichend mit diesen Methoden ¹¹ angereichert. Es ist möglich, dass die Reinheit des CTC Population könnte durch positive Selektion verbessert werden, unter Verwendung von Antikörpern gegen Oberflächenmarker spezifisch für Prostata-Krebszellen ^{3 Zellen.} Zusätzlich kann CTC Heterogenität und die Anzahl der in der Probe vorhandenen Epithelzellen mit EpCAM oder anderen geeigneten Flecken getestet werden. Jedoch eine zusätzliche Verarbeitung des peripheren Blutprobe kann letztendlich zu erhöhen Reinheit bei verringerten Gesamtausbeute.

In diesem Protokoll durchgeführt wir subkutane Injektion von isolierten CTCs die für eine einfache Implantation und Überwachung der Entwicklung von Tumoren ermöglicht. Allerdings haben Unterhautmodelle unzureichende Ernährung Versorgung, die Tumor-Transplantation und den Verlust von Tumorzellpopulationen beeinträchtigen können. Alternative Injektionsstellen wie der Maus Prostata (orthotrope), die eine Prostata-Mikroumgebung fördert und subrenalen Kapsel Injektion, die succ verbessertessful Verpflanzung und bewahrt Tumorheterogenität, kann auf der Grundlage Ermittler bevorzugt ^1,2 durchgeführt werden. Optimal sollte NOD / SCID / IL2λ-Rezeptor-null (NSG) Mausmodelle verwendet werden, um die Rate der Xenotransplantat engraftment ¹² zu erhöhen, aber andere Stämme von immungeschwächten Mäusen (NOD / SCID oder, Nude, SCID / Beige) wurden ebenfalls erfolgreich eingesetzt bei der Erzeugung von festen Tumor abgeleitete PDX-Modelle ^1. Erzeugt PDX-Modelle können seriell passagiert werden und die Stabilität der ursprünglichen Tumor-Eigenschaften unter Verwendung etablierter genetischer Methoden ^9-11,13 überwacht.

Die Erholung der hohen Anzahl lebensfähiger Prostatakrebs CTCs ist abhängig von Stadium der Erkrankung. Die erfolgreiche Generation von PDX-Modelle wird am besten gewährleistet, wenn CTCs aus Blut von Patienten mit metastasierendem hohen Belastung isoliert. Wir haben erfolgreich generiert PDX-Modelle aus Blutproben mit einem Bereich von 100 bis 10.000 CTC. Nach unserer Erfahrung ist es notwendig, gut ausgebildete ArbeitskräfteAtory Personal, um das Protokoll häufig um die erfolgreiche Isolierung von Prostata CTCs aus Blutproben gewährleisten auszuführen. Wir empfehlen, dass das Laborpersonal zunächst in diesem Protokoll, indem Blutproben von normalen gesunden Personen geschult werden versetzt mit Zellen aus Tumorzelllinien. Das Fehlen oder die geringe Anzahl von CTCs in primären Prostatakrebs kann die Verwendung dieser Methodik zur metastasierendem Prostatakrebs zu begrenzen.

Das Verfahren für die Erzeugung von CTC abgeleitet in diesem Protokoll kann anschließend in vielen Forschungsanwendungen einschließlich molekulare Charakterisierung von Prostata-Krebs, Drogen-Screening, Überwachung von Therapieantwort, Biomarker-Entwicklung, und weitere Fortschritte in der personalisierten Krebstherapien eingesetzt werden beschrieben PDX-Modelle.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640	Gibco Life Technologies	11875-093
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco Life Technologies	10437-028
Penicillin Streptomycin	Gibco Life Technologies	15140-122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning Cell Gro	21-031-CM
35 µm Cell Strainer	BD Falcon	352340
50 ml polystyrene conical tube	Crystalgen	23-2263
Red blood cell lysing buffer	Sigma	R7757
DAPI	Invitrogen	d3571
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440
12 mm x 75 mm Polystyrene tubes with cell strainer cap	BD Falcon	352235
BD Vacutainer Lavender Blood Collection Tubes with EDTA
BD Winged Blood Collection Set with Push Button Retract Needle 23 gauge
BD Vacutainer One Use Needle Holder
Disposable Latex Tourniquet
Latex or non-latex gloves
alcohol swabs
2 x 2 cotton gauze pads
Adhesive bandage
25 G needle
1 ml syringe