Generering av Prostate Cancer Patient Avledet xenotransplantat Modeller fra Sirkulasjonstumorceller

Introduction

Pasient avledet xenografts blir stadig mer populære eksperimentelle modeller som benyttes for kreftforskning. De kan brukes for karakterisering av biomarkører og biologiske pathways, pre-klinisk evaluering av legemidlets effekt, og etableringen av avatarer for personlig kreftbehandling ^1,2. Tidligere har andre forskningsmiljøer utviklet PDX modeller enten ved å implantere eller injisere enkelttumorcellesuspensjoner eller hele tumor eksplantater inn immunsupprimerte mus ^1. Disse PDX modeller krever kirurgisk samling av fersk solid tumor, maligne ascites eller plevravæske fra en pasient som gjennomgår et kirurgisk inngrep som er både kostbart og utsetter pasienten til økt risiko for iatrogen sykelighet.

En betydelig nyere utvikling i kreftforskning har vært deteksjon, isolering og karakterisering av sirkulerende tumorceller. Disse tumorceller flykte fra primærtumormasse og skriv sirkulasjonhvor de spiller en avgjørende rolle i metastase og tilbakefall, den vanligste årsaken til kreftrelatert dødelighet ^tre. Evalueringen og karakterisering av CTCS fra flere solide tumortyper har gitt klinisk informasjon for diagnose, prognose, og overvåke restsykdom ^tre. En rekke for tiden anvendte fremgangsmåter som baserer seg på enten den fysiske egenskaper, ekspresjon av biomarkører, eller funksjonelle egenskaper CTCS kan brukes for effektivt å isolere CTCS ^4. Eksisterende mesoklimatisk CTC isoleringsmetoder inkluderer tetthetsgradient-sentrifugering, fysisk filtrering med filterporene og separasjon mot overflatemolekyler. De mest brukte CTC isolasjon metoder er basert på antistoffbasert fangst av CTCS. Både positive og negative utvalg av celleoverflatemarkører kan anvendes for å isolere CTCS fra perifert blod. Positiv utvelgelse for CTCS i den perifere sirkulasjonen ofte bruker epiteliale markører (f.eks EpCAM) som enre uttrykt på CTCS men ikke hematopoetiske celler. Ulempen med denne metoden er at CTCS med metastatisk potensiale har ofte gjennomgått epitelial-til-mesenchymale overgang (EMT), som nedregulerer epiteliale markører overflate ^3. For å isolere CTCS med metastatisk potensial, til en negativ seleksjon metode som anvender hematopoetiske overflatemarkør, CD45, utarme normal cellepopulasjon av leukocytter kan anvendes ^5.

Prostatakreft er den vanligste diagnosen kreft og en viktig årsak til kreft dødsfall hos menn ^6. Mekanismene for tumorprogresjon og aggressivitet er ikke helt forstått, og derfor generering og karakterisering av eksperimentelle modeller som rekapitulere den molekylære heterogenitet av prostatakreft er av betydelig interesse. PDX modeller av prostatakreft har vært generert tidligere av engraftment av menneskelige prostata kreft celler i immunocomlovet mus ^7,8. Imidlertid genereringen av slike modeller har vært hemmet av den lave innpoding frekvensen av prostatakreft i immunkompromitterte mus, som er i hovedsak knyttet til lat sykdommens art. Nylig har CTCS blitt brukt til å generere brystkreft ^9, lungekreft ¹⁰ og prostatakreft ¹¹ PDX-modeller. Disse proof-of-concept studier introduserte muligheten for å skape PDX modeller uavhengig av behovet for kirurgisk prøvetaking. I denne artikkelen beskriver vi i detalj en fremgangsmåte for generering av denne nye eksperimentelle modellen.

Protocol

Denne protokollen er blitt utført ved vår institusjon med godkjenning fra institusjonelle forskningsetiske styret og er i samsvar med alle institusjonelle, nasjonale og internasjonale retningslinjer for menneskelig velferd.

1. Innsamling av perifert blod fra pasienter med avansert prostatakreft

Merk: Velg pasienter med metastatisk prostatakreft. Innhente skriftlig pasienten samtykke og registrere kliniske kjennetegn ved pasientene, inkludert alder på isolasjon og tidligere kjemoterapi og hormonelle behandlinger. Pasienter med metastatisk sykdom vil potensielt ha høyest konsentrasjon av CTCS i perifert blod.

1. Samle blodprøver etter informert samtykke og under en passende Institutional Review Board godkjent protokollen. Bruk gummihansker og en laboratoriefrakk hele prosedyren.
2. Koble 25 G butterfly nål og slange til p holderen. Bruk en spritserviett til å rense områdetantecubital venen mellom bicep og underarm, deretter bruker tourniquet til pasientens overarm.
3. Sett butterfly nål inn antecubital venen og presse blod samling rør inn nålholderen å starte samlingen. Samle ca. 10 ml blod i prøverør som inneholder etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) for å forhindre koagulering.
4. Fjern butterfly nål fra pasient og press med steril kompress over nettstedet av venen punktering i 1 min. Cover nettsted med en steril bandasje.

2. Isolering av mononukleære celler

Merk: blod oppsamlet fra trinn 1 vil inneholde perifere mononukleære blodceller (PBMC) (f.eks, lymfocytter og monocytter) i tillegg til de mononukleære CTCS.

1. Pipetter av fullblod i 50 ml polystyren konisk rør med en 5 ml serologisk pipette og tilsett Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) i en 1: 1-forhold. Forsiktig pipette blandingen å homogenisere.
2. Tilsett 15 ml av en kommersielt fremstilte løsning (Ficoll-Paque) for å separere blodkomponenter ved lav hastighet tetthetsgradient-sentrifugering til et tomt 50 ml polystyren konisk rør.
3. Forsiktig pipette fullblod og HBSS blandingen, fra trinn 2.1 og inn i polystyrenrør fra trinn 2,2, for å danne distinkte topplag. Sett pipetten til laveste innstilling for å minimere blanding av løsninger, vil dette sikre effektiv separasjon.
4. Sentrifuger ved 400 xg i 30 minutter ved romtemperatur (25 ° C). Still retardasjon til laveste innstilling for å hindre blanding av løsninger etter separasjon. Akselerasjon kan settes til alle hastigheter.
5. Etter sentrifugering identifisere den tynne, hvite-grå ​​stripe av PBMC og CTCS klemt lag mellom plasma på toppen og separasjon løsning i bunnen av røret.
6. Samle cellene fra hvit-grå stripe i trinn 2,5 i et 50 mL polystyren-rør ved hjelp av en plast overføring pipette.
7. Legg HBSS til 50 ml polystyren konisk rør med PBMC og CTCS og centrifuge igjen ved 400 xg i 10 min RT å vaske.
8. Dekanter væsken og resuspender pelleten i 50 ml HBSS og sentrifuger på nytt ved 400 x g i 3 minutter ved RT for å vaske.
9. Kast supernatanten, resuspender den gjenværende pellet med 5 ml av røde blodcellelyseringsbuffer og inkuber løsningen i 5 min ved RT.
10. Fjern det røde blodcellelyse buffer ved sentrifugering ved 400 x g i 3 minutter ved romtemperatur.
11. Kast supernatanten og resuspender pelleten i 1 ml PBS 1x supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) for å blokkere før antistoffarging.

3. Farging mononukleære celler med CD45-FITC antistoff for fluorescensaktivert Cell Sorting (FACS)

1. Kvantifisere antallet levedyktige (trypanblått-negative) celler fra trinn (2,11) ved hjelp av et hemocytometer eller automatisk celleteller. Forbered en 1 x 10 ⁶ celler / ml suspensjon (i PBS 1x med 10% FBS) og plassere den på is i en time.
2. Fordel kvantifisertcellesuspensjonen fra det foregående trinn i to rør. Merk rør som kontroll og CD45 flekker.
3. I kontrollrøret, tilsett IgG1κ-FITC (2,5 ug / ml) ved en fortynning på 1: 250. I CD45-farging røret, tilsett CD45 FITC (2,5 ug / ml) konjugert primært antistoff ved en fortynning på 1: 250 og inkuberes cellesuspensjoner på is i 30 min. CD45 antigen merking benyttes for å ekskludere hematopoetiske celler.
4. Sentrifuger cellene ved 400 x g i 3 minutter ved 4 ° C, og supernatanten kastes.
5. Vask cellene to ganger, ved å suspendere hver pellet med sterilt 1 x PBS supplert med 10% FBS, etterfulgt av sentrifugering ved 400 x g i 3 minutter ved 4 ° C.
6. Suspender cellene i en 1 ml oppløsning av PBS inneholdende 1 x 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) ved en konsentrasjon på 10 ug / ml.
7. Filtrere den endelige løsningen gjennom 35 mikrometer sil caps inn 12 mm x 75 mm polystyrenrør.

4. Isolering av Prostate CTCS avFACS

Merk: Bruk en flowcytometer å samle live-CD45 negative CTCS.

1. Sett kompensasjon kontroller ved hjelp av celler fra røret merket, "Control".
2. Lag porter som utelukker rusk og klynger av celler ved hjelp av egnede fremtids scatter og side-spredningsparametere.
3. Etablere FITC portene ved hjelp av cellesuspensjoner fra røret merket "CD45-FITC."
4. Gate levedyktige (DAPI-negative) celler ved hjelp av pacific blue-kanal.
5. Samle CD45 negativ populasjon i et sterilt 15 ml konisk rør inneholdende polystyren 2 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 supplert med 10% FBS.
6. Sentrifuger sortert prostata tumorcellesuspensjon ved 400 x g i 3 min, deretter resuspender pelleten i 200 - 500 ul av RPMI supplert med 10% FBS.

5. Injeksjon av CTCS inn Mus og overvåking av Xenotransplantat Vekst

notat:Gjennomføre alle prosedyrer dyr i samsvar med protokoller godkjent av institusjonelle dyr omsorg komiteen. Denne protokollen er blitt utført ved vår institusjon under en bestemt Animal Bruk protokoll godkjent av vår Animal Care komité i samsvar og samsvar med alle relevante regulatoriske og institusjonelle etater, forskrifter og retningslinjer.

1. Bland sortert prostata tumorcellesuspensjon med ekstracellulære matriks ved et 1: 1 forhold og sted på is.
2. Bedøve mus forut for subkutan implantering i et kammer å tilføre 5% (v / v) inhalert isofluran i 1 l / min oksygen. Sikre hensiktsmessig anestesi ved å sjekke for tap av hornhinnen og tå refleks i musen.
3. Ved å bruke en 25 G nål og en 1 ml sprøyte, injisere 250 ul av prostatatumorceller, og ekstracellulær matriks cellesuspensjon subkutant inn i begge de øvre flanker av en 8-10 uker gamle mus immunsvikt. Injisere 250 mL uavhengig av CTC konsentrasjon som injeksjonsvolum er jegmportant verdi. Maksimal SQ administrering på mus er ikke mer enn 1 ml.  
4. Overvåke mus ved å utføre ukentlig palpasjon museinjeksjonsstedene for vekst av subkutane nodulær tettheter og ved å måle mus vekt to ganger i uken.
5. Avlive mus ved karbondioksid kvelning fulgt av halsdislokasjon og høste subkutane menneskelig prostatakreft xenografts når tumorstørrelse er mer enn 0,5 cm og mindre enn 1 cm i største diameter for å sikre nok svulstvev for molekylære analyser og serie passasje. Avlive mus med tegn på stress eller vekttap på 15% til tross for ingen svulst er følbar.

Representative Results

Denne protokollen vil føre til generasjon PDX modeller fra isolerte CD45 negative prostatakreft CTCS. Basert på det negative seleksjonsmetode som brukes i vår protokollen er det nødvendig å ekskludere døde celler ved å bruke DAPI flekken. Prosentandelen av CD45-negative celler detektert ved strømningscytometri er variabel og avhenger av tumorbelastning hos pasienten (figur 1A). Immuno-fluorescensfarging av usorterte celler ved hjelp av CD45 og DAPI (for å identifisere cellekjerner) avslører CD45-negative celler, som indikert med hvite piler (figur 1B). I figur 1C, kan subkutane nodulær tettheter sees på begge flankene av musen. Hver knutetetthet representerer xenotransplantat vekst og kan bli verdsatt til forskjell fra friskt vev som det stikker ut fra ryggmuskulaturen av musen og er fastere i konsistens. Tidsintervallet mellom implantasjon og xenotransplantat utvikling kan variere sterkt avhengig av CTC byrden av Patient prøven, antall celler implantert og den biologiske aggressivitet CTCS. Prostata PDX genereres fra CTCS rekapitulere human prostatatumor som sett av hematoxylin og eosin-farging og ved immunhistokjemi for prostata spesifikt cellulære markører, slik som androgenreseptoren (AR) og prostata-spesifikt membran antigen (PSMA) (figur 1D).

Figur 1. generasjon av Prostate Cancer PDX Modeller fra Menneskelig Prostate Cancer CTCS. (A) Strømningscytometri plott som illustrerer spesifikke CD45-farging cellepopulasjoner fra perifert blod fra en pasient med prostatakreft. . Celler med positive DAPI flekken er døde og ekskludert av gating å sikre at bare levende celler er isolert (B) CD45 immunfluorescens farging av usortert befolkningen bekrefter tilstedeværelsen av CD45 ^-. Celler (hvite piler) (C) in vivo og etter svulst høsting (D) Analyse av CTC PDX modeller ved hjelp av konvensjonelle Hematoxylin og eosin og de ​​spesifikke prostata markører.; androgen reseptor (AR) og prostata-spesifikt membranantigen (PSMA). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Dette manuskriptet beskriver en metode for generering av prostatakreft PDX modeller fra CTCS. Bruken av CTCS for generering av PDX modellene har flere mulige viktige fordeler sammenlignet med eksisterende metoder. For det første muliggjør samling av tilgjengelige CTCS fra perifert blod generering av eksperimentelle modeller fra samme pasient ved forskjellige sykdomsstadier. Andre representerer blodoppsamlings en sikrere og billig metode for å isolere tumorceller sammenlignet med eksisterende metoder som krever kirurgiske prosedyrer for innsamling av tumorceller.

Flere metoder for CTC berikelse har blitt beskrevet men mange er ikke tilgjengelige for alle laboratorier grunnet finansiering og ressursmessige begrensninger. Vi har søkt å utvikle en analyse i vårt laboratorium som kan utnytte i bruk av FACS, en enkel, rimelig og tilgjengelig metode for mange laboratorier. En potensiell begrensning ved denne metoden erutilstrekkelig sensitivitet for påvisning av sjeldne celler som kan begrense bruken av denne protokollen til pasienter med stor tumorbyrde. Flere andre teknologier som benytter fysiske og biologiske egenskaper av epitelceller kan brukes til over redusere denne begrensning og øke påvisning og isolering av denne sjeldne cellepopulasjon ^4. Fremgangsmåte for anrikning CTC beskrevet i denne protokoll benytter negativ seleksjon; CD45 ⁺ leukocytter blir kastet og CD45 ^- CTCS beholdes. Det er viktig å fjerne potensielt forurensende CD45 ^- elementer fra cellesuspensjoner ved sortering ved strømningscytometri (f.eks, ikke-levedyktige celler.). Spesielt ved bruk av røde blodceller lyseringsbuffer og utelatelse av ikke-levedyktige celler ved DAPI farging er viktige betraktninger. Selv om disse tiltak ikke kan garantere at ikke-CTC-elementene ikke forurense CD45 ^- populasjonen, våre tidligere studier tyder på at den ønskede celle population er tilstrekkelig beriket med disse metodene ^11. Det er mulig at renheten av den CTC befolkningen kan forbedres ved positiv seleksjon, ved anvendelse av antistoffer til celleoverflatemarkører som er unike for prostatakreftceller ^3. I tillegg kan CTC heterogenitet og antall epitelceller som er tilstede i prøven testes ved hjelp EpCAM eller andre passende flekker. Men ytterligere behandling av perifer blodprøve kan til slutt øke renheten samtidig redusere samlet utbytte.

I denne protokollen utførte vi subkutan injeksjon av isolerte CTCS som gjør det mulig for enkel implantasjon og oppfølging av utviklings svulst. Men subkutane modeller har utilstrekkelig ernæring forsyning som kan kompromittere svulst engraftment og tap av tumorcelle subpopulasjoner. Alternative injeksjonssteder som for eksempel muse prostata (ortotropiske), som fremmer en prostata mikromiljøet, og subrenal kapsel injeksjon, noe som forbedrer successful engraftment og bevarer svulst heterogenitet, kan utføres basert på etterforsker preferanse ^1,2. Optimalt bør NOD / SCID / IL2λ-reseptor null (NSG) musemodeller brukes til å øke hastigheten på xenograft engraftment ^12, men andre stammer av immunsupprimerte mus (NOD / SCID eller, Nude, SCID / Beige) har også blitt brukt i den generasjonen av solid svulst avledet ^PDX-modeller 1. Generert PDX modeller kan serielt passaged og stabilitet av originale tumor egenskaper overvåkes ved hjelp av etablerte genetiske metoder ^9-11,13.

Utvinningen av høye antallet levedyktige prostatakreft CTCS er avhengig av stadium av sykdommen. Den vellykkede dannelse av PDX-modeller er best sikret når CTCS er isolert fra blodet til pasienter med høy metastatisk belastning. Vi har nå generert PDX modeller fra blodprøver med en rekkevidde på 100 til 10.000 CTCS. I vår erfaring, er det nødvendig for godt trente arbeidskraftAtory personell for å utføre protokollen ofte for å sikre en vellykket isolering av prostata CTCS fra blodprøver. Vi anbefaler at laboratoriepersonell skal i utgangspunktet opplært i denne protokollen ved hjelp av blodprøver fra friske individer tilsatt celler fra tumorcellelinjer. Fravær eller lavt antall CTCS i grunnskolen prostatakreft kan begrense bruken av denne metodikken til metastatisk prostatakreft.

Metoden for generering av CTC avledet PDX modellene som er beskrevet i denne protokollen kan senere benyttes i mange forskningssøknader inkludert molekylær karakterisering av prostatakreft, narkotika screening, overvåking terapi respons, utvikling av biomarkører og andre fremskritt i personlige kreftbehandlingen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640	Gibco Life Technologies	11875-093
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco Life Technologies	10437-028
Penicillin Streptomycin	Gibco Life Technologies	15140-122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning Cell Gro	21-031-CM
35 µm Cell Strainer	BD Falcon	352340
50 ml polystyrene conical tube	Crystalgen	23-2263
Red blood cell lysing buffer	Sigma	R7757
DAPI	Invitrogen	d3571
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440
12 mm x 75 mm Polystyrene tubes with cell strainer cap	BD Falcon	352235
BD Vacutainer Lavender Blood Collection Tubes with EDTA
BD Winged Blood Collection Set with Push Button Retract Needle 23 gauge
BD Vacutainer One Use Needle Holder
Disposable Latex Tourniquet
Latex or non-latex gloves
alcohol swabs
2 x 2 cotton gauze pads
Adhesive bandage
25 G needle
1 ml syringe