Generazione di cancro alla prostata del paziente Derivato modelli di xenotrapianto di cellule tumorali circolanti

Introduction

Paziente xenotrapianti derivati ​​sono modelli sperimentali sempre più popolari utilizzati per la ricerca sul cancro. Essi possono essere utilizzati per la caratterizzazione di biomarcatori e percorsi biologici, valutazione preclinica di efficacia dei farmaci, e la creazione di avatar per terapie antitumorali personalizzate ^1,2. In precedenza, altri gruppi di ricerca hanno sviluppato modelli PDX o impiantando o iniettando sospensioni di cellule tumorali singole o espianti intero tumore in topi immunocompromessi ^1. Questi PDX modelli richiedono raccolta chirurgica del tumore solido fresco, ascite maligna o versamento pleurico da un paziente sottoposto ad un intervento chirurgico che è sia costoso e espone il paziente ad un aumentato rischio di morbilità iatrogena.

Un recente sviluppo significativo nella ricerca sul cancro è stato il rilevamento, l'isolamento e la caratterizzazione di cellule tumorali circolanti. Queste cellule tumorali sfuggono dalla massa tumorale primaria e in circolodove giocano un ruolo critico nella metastasi e recidive, la causa più comune di cancro legato mortalità ^3. La valutazione e la caratterizzazione di CTC da diversi tipi di tumori solidi hanno fornito informazioni cliniche per la diagnosi, la prognosi e il monitoraggio malattia residua ^3. Una varietà di approcci attualmente utilizzati basandosi su entrambe le proprietà fisiche, espressione di marcatori o caratteristiche funzionali di CTC può essere utilizzata per isolare efficacemente CTC ^4. Esistenti macroscala metodi di isolamento CTC includono gradiente di densità centrifugazione, filtrazione fisica con pori del filtro e la separazione contro molecole di superficie. Le metodologie di isolamento CTC più utilizzati sono basati sulla cattura a base di anticorpi di CTC. Sia selezione positiva e negativa di marcatori di superficie cellulare può essere impiegato per isolare CTC dal sangue periferico. Selezione positiva per CTC nella circolazione periferica utilizza comunemente marcatori epiteliali (ad esempio, EpCAM), che unre espresso sulle CTC, ma le cellule non ematopoietiche. Lo svantaggio di questo metodo è che CTCs con potenziale metastatico sono spesso sottoposti epiteliali-to-mesenchymal transizione (EMT), che downregulates marcatori di superficie epiteliali ^3. Per isolare CTC con potenziale metastatico, una metodologia di selezione negativa che impiega il marcatore di superficie ematopoietiche, CD45, per esaurire la popolazione normale di cellule di leucociti può essere usato ^5.

Il cancro alla prostata è il tumore più comunemente diagnosticato e una delle principali cause di decessi correlati al cancro negli uomini ^6. I meccanismi di progressione del tumore e l'aggressività sono state comprese e quindi la generazione e caratterizzazione di modelli sperimentali che ricapitolano l'eterogeneità molecolare del cancro alla prostata sono di notevole interesse. Modelli PDX di carcinoma della prostata sono stati generato in precedenza da attecchimento delle cellule del cancro alla prostata umano in immunocomtopi promesso ^7,8. Tuttavia, la generazione di tali modelli è stata ostacolata dal tasso attecchimento basso di cancro alla prostata in topi immunocompromessi, che viene principalmente attribuito alla natura indolente della malattia. Recentemente, CTC sono stati utilizzati per generare il cancro al seno ^9, il cancro del polmone ^{10 e} il cancro alla prostata ^{11 modelli} PDX. Questi studi proof-of-concept introdotto la possibilità di generare modelli PDX indipendente dalla necessità di raccolta dei campioni chirurgici. In questo articolo si descrive in dettaglio un metodo per la generazione di questo modello sperimentale romanzo.

Protocol

Questo protocollo è stato condotto presso il nostro istituto con l'approvazione del comitato etico della ricerca istituzionale ed è in conformità con tutte le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano.

1. Raccolta di sangue periferico di pazienti affetti da cancro alla prostata avanzato

Nota: Selezionare i pazienti con carcinoma della prostata metastatico. Ottenere il consenso scritto del paziente e registrare le caratteristiche cliniche dei pazienti, tra cui l'età di isolamento e la chemioterapia precedente e trattamenti ormonali. I pazienti con malattia metastatica saranno potenzialmente avere più alta concentrazione di CTC nel sangue periferico.

1. Raccogliere i campioni di sangue dopo consenso informato e sotto un appropriato Institutional Review Consiglio ha approvato il protocollo. Indossare guanti in lattice e un camice da laboratorio durante tutta la procedura.
2. Collegare 25 G farfalla ago e tubo alla porta aghi. Utilizzare un tampone imbevuto di alcool per pulire un'area divena periferica tra il bicipite ed avambraccio, quindi applicare laccio emostatico al braccio del paziente.
3. Inserire l'ago a farfalla nella vena antecubitale e spingere il tubo di raccolta del sangue in porta aghi per avviare la raccolta. Raccogliere circa 10 ml di sangue in provette per il prelievo che contengono acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) per prevenire la coagulazione.
4. Rimuovere ago a farfalla da paziente e applicare pressione con garza sterile su sito di puntura della vena per 1 min. Sito Coprire con una benda sterile.

2. Isolamento di cellule mononucleate

Nota: Il sangue raccolto dal passaggio 1 conterrà cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) (ad esempio, linfociti e monociti) oltre ai CTC mononucleari.

1. Pipettare sangue intero in 50 ml tubo conico in polistirene con un 5 ml pipetta sierologica e aggiungere Hanks soluzione salina bilanciata (HBSS) in un rapporto 1: 1. Delicatamente miscela pipetta per omogeneizzare.
2. Aggiungere 15 ml di una soluzione preparati commercialmente (Ficoll-Paque) per separare componenti del sangue da bassa velocità di centrifugazione in gradiente di densità in una provetta conica da 50 ml in polistirolo vuoto.
3. Delicatamente pipetta sangue intero e la miscela di HBSS, dal punto 2.1, nel tubo di polistirolo dal punto 2.2, in modo da formare strato superiore distinta. Set pipetta di valore più basso per ridurre al minimo la miscelazione di soluzioni, questo garantirà la separazione efficiente.
4. Centrifugare a 400 xg per 30 min a temperatura ambiente (25 ° C). Impostare la decelerazione a valore più basso per evitare la miscelazione di soluzioni dopo la separazione. L'accelerazione può essere impostato su qualsiasi velocità.
5. Dopo centrifugazione, identificare la banda bianco-grigio sottile strato PBMC e CTCs sandwich tra plasma sulla soluzione superiore e la separazione sul fondo della provetta.
6. Raccogliere le cellule della striscia bianco-grigio al punto 2.5 in una provetta da 50 ml in polistirolo con una pipetta di plastica trasferimento.
7. Aggiungi HBSS a 50 ml tubo conico in polistirene con PBMC e CTC ecentrifuge nuovamente a 400 xg per 10 min a RT lavare.
8. Decantare pellet liquido e risospendere in 50 ml di HBSS e centrifugare di nuovo a 400 xg per 3 minuti a temperatura ambiente per lavare.
9. Eliminare il surnatante, risospendere il pellet rimanente con 5 ml di globuli rossi Lysis buffer e incubare la soluzione per 5 minuti a temperatura ambiente.
10. Rimuovere il globulo rosso tampone di lisi per centrifugazione a 400 xg per 3 minuti a temperatura ambiente.
11. Eliminare il surnatante e risospendere il pellet in 1 ml di PBS 1x supplementato con 10% di siero fetale bovino (FBS) per bloccare prima di colorazione degli anticorpi.

3. Cellule mononucleate colorazione con CD45-FITC anticorpi per fluorescenza cellulare Attivato (FACS) Ordinamento

1. Quantificare il numero di (Trypan Blue-negativo) cellule vitali (dal punto 2.11) utilizzando un emocitometro o contatore di cellule automatizzati. Preparare un 1 x 10 ^{6 cellule} / ml sospensione (in PBS 1x con il 10% FBS) e posizionarlo sul ghiaccio per 1 ora.
2. Distribuire il quantificatosospensione cellulare dal passo precedente in due tubi. Etichettare le provette come il controllo e CD45 colorazione.
3. Nella provetta di controllo, aggiungere IgG1κ-FITC (2,5 mcg / ml) alla diluizione di 1: 250. Nel tubo colorazione CD45, CD45 FITC aggiungere (2,5 mcg / ml) anticorpo primario coniugato alla diluizione di 1: 250 e incubare le sospensioni cellulari in ghiaccio per 30 min. Etichettatura antigene CD45 è utilizzato per escludere le cellule ematopoietiche.
4. Centrifugare le cellule a 400 xg per 3 min a 4 ° C e scartare il surnatante.
5. Lavare le cellule due volte, sospendendo ogni pellet con 1 x PBS sterile supplementato con 10% FBS seguita da centrifugazione a 400 xg per 3 min a 4 ° C.
6. Risospendere le cellule in una soluzione di PBS contenente 1x 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) ad una concentrazione di 10 ug / ml 1 ml.
7. Filtrare la soluzione finale attraverso tappi colino 35 micron in 12 millimetri tubi in polistirolo x 75 mm.

4. Isolamento dei prostata CTC perFACS

Nota: Utilizzare un citofluorimetro per raccogliere in tempo reale CTC negativi CD45.

1. Controlli di compensazione SET utilizzando cellule dal tubo etichettato, "Control".
2. Creare cancelli che escludono detriti e gruppi di cellule utilizzando opportuni parametri previsionali scatter e side-scatter.
3. Stabilire le porte FITC utilizzando le sospensioni di cellule dal tubo etichettato, "CD45-FITC."
4. Vitali (DAPI-negativo), le cellule cancello utilizzando il Pacific Blue-Un canale.
5. Raccogliere popolazione negativa CD45 in una sterile tubo da 15 ml in polistirolo contenente 2 ml di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 integrato con il 10% FBS.
6. Centrifugare la sospensione di cellule tumorali della prostata filtrate a 400 xg per 3 min, quindi risospendere il pellet in 200 - 500 ml di RPMI supplementato con 10% FBS.

5. L'iniezione di CTC in topi e il monitoraggio dei xenotrapianto crescita

Nota:Condurre tutte le procedure animali in conformità con i protocolli approvati dal comitato di cura degli animali istituzionale. Questo protocollo è stato condotto presso la nostra istituzione, in virtù di un uso specifico protocollo animale approvato dal nostro Comitato Animal Care in conformità e il rispetto di tutte le pertinenti normative e istituzionali agenzie, regolamenti e linee guida.

1. Mescolare la prostata sospensione cellulare tumorale filtrate con matrice extracellulare in un rapporto 1: 1 e posto sul ghiaccio.
2. Anestetizzare topo prima dell'impianto sottocutaneo in una camera di alimentazione 5% (v / v) isoflurano inalato in 1 L / min di ossigeno. Assicurare anestesia appropriata controllando per la perdita dei riflessi della cornea e punta nel topo.
3. Utilizzando un ago G 25 e una siringa da 1 ml, iniettare 250 ml di cellule tumorali della prostata e della matrice extracellulare sospensione cellulare per via sottocutanea in entrambi i fianchi superiori di 8-10 settimane vecchio mouse immunodeficienti maschile. Iniettare 250 microlitri indipendentemente dalla concentrazione di CTC come il volume di iniezione è l'iValore mportante. Amministrazione massima SQ nel topo non è superiore a 1 ml.  
4. Monitorare topi eseguendo la palpazione settimanale di siti di iniezione del mouse per la crescita della densità nodulari sottocutanei e misurando topi peso due volte a settimana.
5. Euthanize topi di anidride carbonica asfissia seguita da dislocazione cervicale e raccolta sottocutaneo prostata umano xenotrapianti tumorali quando la dimensione del tumore è più di 0,5 cm e meno di 1 cm di diametro per assicurare tessuto tumorale sufficiente per analisi molecolari e di passaggio seriale. Euthanize topi con segni di sofferenza o di perdita di peso del 15%, nonostante nessun tumore è palpabile.

Representative Results

Questo protocollo porterà alla generazione di modelli PDX da isolati CD45 prostata negativo CTC cancro. Sulla base del metodo di selezione negativa utilizzata nel nostro protocollo è necessario escludere le cellule morte mediante colorazione DAPI. La percentuale di cellule CD45 negative rilevata mediante citometria di flusso è variabile e dipende dal carico tumorale del paziente (Figura 1A). Immunofluorescenza di cellule CD45 e non ordinati utilizzando DAPI (per identificare nuclei cellulari) rivela cellule CD45 negative, come indicato dalle frecce bianche (Figura 1B). In Figura 1C, densità nodulari sottocutanee possono essere visti su entrambi i fianchi del mouse. Ogni densità nodulare rappresenta la crescita xenotrapianto e può essere apprezzato come distinto dal tessuto sano come si sporge dalla muscolatura dorsale del mouse e è più solida nella struttura. L'intervallo di tempo tra l'impianto e sviluppo xenotrapianto può variare notevolmente a seconda del carico del CTC Patiecampione nt, il numero di cellule impiantate e l'aggressività biologica di CTC. PDX prostata generato da CTC ricapitolare tumore prostatico umano visto da ematossilina e eosina, e mediante immunoistochimica per marcatori cellulari prostatico specifico, come il recettore degli androgeni (AR) e la membrana antigene prostatico specifico (PSMA) (Figura 1D).

Figura 1. Generazione di cancro alla prostata PDX modelli di Human Prostate Cancer CTC. (A) citometria a flusso trama illustrare specifiche popolazioni cellulari CD45 colorazione da sangue periferico di un paziente affetto da cancro alla prostata. . Le cellule con macchia DAPI positiva sono morti ed escluso dalla gating per garantire solo le cellule vitali sono isolate (B) CD45 immunofluorescenza della popolazione non differenziati conferma la presenza di CD45 ^-. Le cellule (frecce bianche) (C) in vivo e dopo la raccolta del tumore (D) Analisi dei modelli PDX CTC con ematossilina convenzionale e eosina e marcatori della prostata specifici.; recettore degli androgeni (AR) e prostatico specifico di membrana antigene (PSMA). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Questo manoscritto descrive un metodo per la generazione di cancro della prostata modelli PDX da CTC. L'uso di CTC per la generazione di PDX modelli ha diversi vantaggi potenziali importanti rispetto ai metodi esistenti. Innanzitutto, raccolta accessibile delle CTC dal sangue periferico consente la generazione di modelli sperimentali dallo stesso paziente a diversi stadi della malattia. In secondo luogo, la raccolta di sangue rappresenta un metodo sicuro ed economico per isolare le cellule tumorali rispetto alle metodologie esistenti che richiedono procedure chirurgiche per la raccolta di cellule tumorali.

Diversi metodi di CTC arricchimento sono stati descritti ma molti non sono accessibili a tutti i laboratori a causa di limitazioni di finanziamento e delle risorse. Abbiamo cercato di sviluppare un test nel nostro laboratorio che potrebbe sfruttare nell'uso di FACS, una metodologia conveniente, economico e accessibile per molti laboratori. Un potenziale limitazione di questo metodo èla sensibilità inadeguata per la rilevazione di cellule rare che potrebbe limitare l'uso di questo protocollo per pazienti con massa tumorale elevata. Diverse altre tecnologie che utilizzano le proprietà fisiche o biologiche delle cellule epiteliali possono essere utilizzati per attenuare oltre questo limite e aumentare il rilevamento e l'isolamento di questa popolazione di cellule rare ^4. Il metodo per CTC arricchimento descritto in questo protocollo si avvale di selezione negativa; CD45 ⁺ leucociti vengono scartati e CD45 ^- CTC vengono mantenuti. E 'importante rimuovere potenzialmente contaminanti CD45 ^- elementi delle sospensioni cellulari durante l'ordinamento mediante citometria di flusso (ad esempio, le cellule non vitali.). In particolare, l'uso di tampone di lisi dei globuli rossi e l'omissione di cellule non vitali da colorazione DAPI sono considerazioni critiche. Mentre queste misure non possono garantire che gli elementi non CTC non contaminare il CD45 ^- della popolazione, i nostri studi precedenti suggeriscono che il p cella desiderataOPOLAZIONE è sufficientemente arricchito con questi metodi ^11. È possibile che la purezza della popolazione CTC potrebbe essere migliorata tramite selezione positiva, utilizzando anticorpi alla cella marcatori di superficie uniche cellule tumorali della prostata ^3. Inoltre, CTC eterogeneità e il numero di cellule epiteliali presenti nel campione possono essere testati utilizzando EpCAM o altre macchie appropriate. Tuttavia ulteriore elaborazione del campione di sangue periferico può infine aumentare la purezza riducendo resa complessiva.

In questo protocollo abbiamo effettuato l'iniezione sottocutanea di CTC isolati che consente un facile fissaggio e il monitoraggio del tumore in via di sviluppo. Tuttavia, i modelli hanno sottocutaneo alimentazione nutrizione inadeguata che potrebbe compromettere l'attecchimento del tumore e la perdita di sottopopolazioni di cellule tumorali. Siti di iniezione alternativi come la prostata mouse (ortotropi), che promuove un microambiente della prostata, e sottorenale iniezione capsula, che migliora succattecchimento essful e conserva tumore eterogeneità, possono essere eseguite sulla base di investigatore preferenza ^1,2. In modo ottimale, NOD / SCID / IL2λ recettore nullo (NSG) modelli murini dovrebbero essere utilizzati per aumentare il tasso di xenotrapianto attecchimento ^12, ma altri ceppi di topi immunocompromessi (NOD / SCID o, nudo, SCID / beige) sono state usate con successo nella generazione di tumore solido derivato modelli PDX ^1. Modelli PDX generate possono essere in serie diversi passaggi e la stabilità delle caratteristiche del tumore originale monitorati con metodi genetici stabiliti ^9-11,13.

Il recupero di un numero elevato di cancro alla prostata praticabile CTC dipende stadio della malattia. La generazione di successo dei modelli PDX è meglio garantita quando CTC sono isolati dal sangue di pazienti con elevata pressione metastatico. Abbiamo generato con successo modelli PDX da campioni di sangue con una gamma di 100 a 10.000 CTC. Nella nostra esperienza, è necessario che lavoro ben formatapersonale Atory per eseguire il protocollo frequentemente per assicurare l'isolamento successo di CTC prostata da campioni di sangue. Si consiglia di personale di laboratorio sono inizialmente formati in questo protocollo, utilizzando campioni di sangue di individui sani a spillo con le cellule di linee cellulari tumorali. L'assenza o un basso numero di CTC nel cancro alla prostata primario possono limitare l'uso di questa metodologia di carcinoma della prostata metastatico.

Il metodo per la generazione di CTC derivato modelli PDX descritti in questo protocollo può essere successivamente impiegato in molte applicazioni di ricerca, tra cui la caratterizzazione molecolare del cancro alla prostata, il vaglio di farmaci, monitoraggio risposta alla terapia, lo sviluppo di biomarcatori, e di altri progressi in terapie oncologiche personalizzate.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640	Gibco Life Technologies	11875-093
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco Life Technologies	10437-028
Penicillin Streptomycin	Gibco Life Technologies	15140-122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning Cell Gro	21-031-CM
35 µm Cell Strainer	BD Falcon	352340
50 ml polystyrene conical tube	Crystalgen	23-2263
Red blood cell lysing buffer	Sigma	R7757
DAPI	Invitrogen	d3571
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440
12 mm x 75 mm Polystyrene tubes with cell strainer cap	BD Falcon	352235
BD Vacutainer Lavender Blood Collection Tubes with EDTA
BD Winged Blood Collection Set with Push Button Retract Needle 23 gauge
BD Vacutainer One Use Needle Holder
Disposable Latex Tourniquet
Latex or non-latex gloves
alcohol swabs
2 x 2 cotton gauze pads
Adhesive bandage
25 G needle
1 ml syringe