前立腺癌患者の発生は、循環腫瘍細胞からの異種移植モデルを派生します

Introduction

患者由来の異種移植片は、癌の研究のために使用ますます人気の実験モデルです。彼らは、バイオマーカーおよび生物学的経路の特性、薬効の前臨床評価、およびパーソナライズされた癌治療のための^1,2のアバターを作成するために使用することができます。以前は、他の研究グループは、免疫不全マウス¹に単一の腫瘍細胞懸濁液または全腫瘍外植片を移植または注入のいずれかによってPDXモデルを開発しました。これらのPDX モデルは高価でもあると医原性罹患のリスク増加に患者を公開し、外科的処置を受けている患者からの新鮮な固形腫瘍、悪性腹水や胸水の外科的コレクションを必要とします。

癌研究における重要な最近の開発は、循環腫瘍細胞の検出、単離および特徴付けされています。これらの腫瘍細胞は、原発腫瘍塊から脱出し、循環に入ります彼らは転移や再発に重要な役割を果たしている場合には、癌の最も一般的な原因は、死亡率^3を関連します。いくつかの固形腫瘍タイプからCTCの評価および特徴付けは、診断、予後、および残留疾患^{3を監視するための}臨床情報を提供しています。物理的特性は、バイオマーカーの発現、またはCTCの機能的特徴のいずれかに依存する現在使用されている様々なアプローチは、効率的に⁴のCTC ^{を単離することができます} 。既存のマクロスケールCTCの単離方法は、密度勾配遠心分離、フィルター孔と表面分子に対する物理的な分離と濾過を含みます。最も広く使用されているCTCの分離方法は、CTCの抗体ベースのキャプチャに基づいています。細胞表面マーカーの正と負の両方の選択は、末梢血からのCTCを単離するために使用することができます。末梢循環中のCTCのための正の選択は、一般的に上皮マーカー （例えば、EpCAMを）を使用しますCTCのではなく、造血細胞上に発現再度。この方法の欠点は、転移の可能性を持つのCTCは、多くの場合、上皮-間葉³上皮表面マーカーを下方制御の移行（EMT）、受けているということです。白血球の正常な細胞集団を枯渇させる、転移の可能性、造血表面マーカー、CD45を用いた負の選択方法でのCTCを単離するために^5を使用することができます。

前立腺癌は、最も一般的に診断される癌、男性⁶における癌関連死の主要な原因です。腫瘍進行及び攻撃性のメカニズムは完全には理解されていないので、発生および前立腺癌の分子不均一性を再現実験モデルの特徴は、かなりの関心があります。前立腺癌のPDXモデルがされています immunocomにヒト前立腺癌細胞の移植によって以前に生成されましたマウス^7,8を約束しました。しかし、このようなモデルの生成は、主に疾患の無痛の性質に起因する免疫不全マウスへの前立腺癌の低い生着率によって妨げられてきました。最近、のCTCは、乳癌^9、肺がん¹⁰および前立腺癌¹¹ PDXモデルを生成するために使用されてきました。これらの概念実証研究では、外科的なサンプル収集の必要性とは無関係に、PDXモデルを生成する可能性を紹介しました。この記事では、具体的にこの新規実験モデルを生成するための方法について説明します。

Protocol

このプロトコルは、制度の研究倫理委員会から承認を得て、私たちの施設で行われ、人間の福祉のためにすべての、機関、国、国際的なガイドラインに準拠しているされています。

進行前立腺癌患者からの末梢血の1コレクション

注：転移性前立腺癌患者を選択します。書面による患者の同意を得て、分離時の年齢と前化学療法とホルモン治療など、患者の臨床的特徴を、記録します。転移性疾患を有する患者は、潜在的に、末梢血中のCTCの最高濃度を持っています。

1. インフォームドコンセントの後、適切な治験審査委員会は、プロトコルを承認の下に血液サンプルを収集します。作業中のラテックス手袋、白衣を着用してください。
2. 25のG翼状針とチューブは、針ホルダに接続します。の面積をきれいにアルコール綿を使用して上腕と前腕の間の肘正中静脈は、その後、患者の上腕に止血帯を適用します。
3. 肘前静脈に翼状針を挿入し、収集を開始するために、ニードルホルダーに採血管を押してください。凝固を防ぐために、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を含有する回収チューブ内の血液の約10 mlのを集めます。
4. 患者から翼状針を外し、1分間静脈穿刺部位の上に滅菌ガーゼパッドで圧力をかけます。滅菌包帯でカバーサイト。

単核細胞の単離2。

注：ステップ1から採取した血液は、単核のCTCに加えて、末梢血単核細胞（PBMC）（例えば、リンパ球および単球）が含まれています。

1. 5ミリリットル血清学的ピペットで50mlポリスチレンコニカルチューブにピペットの全血を1にハンクス平衡塩溶液（HBSS）を追加：1の比率。静かにピペット混合物を均質化します。
2. 空の50 mlのポリスチレンコニカルチューブに低速密度勾配遠心分離により、血液成分を分離するために、商業的に調製した溶液（フィコール - パック）を15mlを加えます。
3. 静かに明確なトップ層を形成するために、ステップ2.2からポリスチレンチューブに、ステップ2.1から、全血およびHBSS混合物をピペット。溶液の混合を最小限にするために、最も低い設定に設定ピペット、これは、効率的な分離を確実にします。
4. RT（25℃）で30分間、400×gで遠心分離します。分離後の溶液の混合を防止するために、最も低い設定に設定減速度。加速度を任意の速度に設定してもよいです。
5. 遠心分離した後、チューブの底の上部と分離ソリューションにプラズマとの間の層に挟まPBMCおよびCTCの薄い白灰色のストライプを識別します。
6. プラスチック製トランスファーピペットを用いて50mLのポリスチレンチューブにステップ2.5でホワイトグレーストライプから細胞を収集します。
7. PBMCおよびCTCをとCで50mlポリスチレンコニカルチューブにHBSSを追加10分RTは洗浄するために、400×gで再びentrifuge。
8. 洗浄するために、室温で3分間400×gで再びHBSSと遠心50mlの液体再懸濁ペレットをデカントします。
9. 上清を捨て、赤血球溶解緩衝液5mlで残ったペレットを再懸濁し、室温で5分間この溶液をインキュベートします。
10. RTで3分間、400×gでの遠心分離によって赤血球溶解緩衝液を除去します。
11. 上清を捨て、1mlのPBS 1Xでペレットを再懸濁前に抗体染色にブロックするために、10％ウシ胎児血清（FBS）を補充しました。

蛍光活性化細胞選別（FACS）のためのCD45-FITC抗体で染色3.単核細胞

1. 血球計数器または自動細胞カウンターを用いて（ステップ2.11）から実行可能（トリパンブルー陰性）細胞の数を定量化します。 （10％FBSを含むPBS 1Xで）1×10 ^6細胞 / mlの懸濁液を調製し、1時間氷の上に置きます。
2. 定量化を配布2つのチューブに前のステップからの細胞懸濁液。制御およびCD45染色などのラベルチューブ。
3. 250：コントロールチューブでは、1の希釈でIgG1κ型-FITC（2.5μgの/ ml）を追加します。 CD45染色チューブでは、1の希釈でCD45 FITC（2.5 / mlの）結合一次抗体を追加します。250、30分間氷上で細胞懸濁液をインキュベートします。 CD45抗原の標識は、造血細胞を排除するために使用されます。
4. 4℃で3分間400×gで細胞を遠心分離し、上清を捨てます。
5. 滅菌1×PBSで各ペレットを懸濁させることによって、細胞を2回洗浄し、4℃で3分間、400×gで遠心分離し、10％FBSを補充しました。
6. 10μg/ mlの濃度の4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を含むPBS 1×1mlの溶液中に細胞を再懸濁。
7. 12ミリメートル×75ミリメートルのポリスチレン管に35μmのストレーナーキャップを通して最終的なソリューションをフィルタリングします。

前立腺CTCの4単離することによってFACS

注：ライブCD45負のCTCを収集するために、フローサイトメーターを利用しています。

1. 「コントロールを。」と表示されたチューブからの細胞を使用して補償制御を設定
2. 破片や、適切な前方散乱および側方散乱パラメータを使用して、細胞のクラスターを除外ゲートを作成します。
3. ラベルされたチューブから、細胞懸濁液を用いて、FITCゲートを確立する「CD45-FITC。」
4. パシフィックブルーチャンネルを用いたゲート実行可能（DAPI陰性）細胞。
5. ロズウェルパーク記念研究所（RPMI）1640の2ミリリットルを含む滅菌15ミリリットルポリスチレンコニカルチューブにCD45陰性集団を収集し、10％FBSを補充しました。
6. 10％FBSを補充したRPMI500μlの - 遠心3分間400×gでソートされた前立腺腫瘍細胞懸濁液は、その後、200でペレットを再懸濁します。

マウスおよび異種移植片の成長のモニタリングにCTCの5インジェクション

注意：制度的動物管理委員会により承認されたプロトコルに準拠したすべての動物の手順を実施します。このプロトコルは、すべての関連する規制や制度機関、規制やガイドラインに従ってやコンプライアンスに私たちの動物ケア委員会によって承認された特定の動物を使用する議定書の下で私たちの施設で行われています。

1. 氷上で1比と場所：1で、細胞外マトリックスとソートされた前立腺腫瘍細胞懸濁液を混ぜます。
2. 酸素を1L /分で5％（v / v）の吸入イソフルランを供給するチャンバで皮下移植する前に、マウスを麻酔。マウスでは、角膜やつま先反射の消失を確認することにより、適切な麻酔を確認してください。
3. 25 G針および1mlシリンジを用いて、8~10週齢の雄の免疫不全マウスの両方の上部側面に前立腺腫瘍細胞および細胞外マトリックスの細胞懸濁液を皮下の250μLを注入します。注入量をiとして関係なく、CTCの濃度の250μLを注入mportant値。マウスの最大のSQ投与はわずか1 mlです。  
4. 皮下結節性密度の成長のためのマウスの注射部位の毎週触診を行うことによって、および週2回、マウスの体重を測定することにより、マウスを監視します。
5. 腫瘍の大きさは、分子分析および連続継代のために十分な腫瘍組織を確実にするために、以上0.5 cmであり、最大直径が1cm未満である場合に頸椎脱臼および収穫皮下ヒト前立腺癌異種移植片に続く二酸化炭素窒息によりマウスを安楽死させます。無腫瘍にもかかわらず、苦痛または15％の体重減少の徴候を有するマウスを安楽死さが触知可能です。

Representative Results

このプロトコルは、単離されたCD45陰性の前立腺癌のCTCからPDXモデルの生成につながります。我々のプロトコルで使用されるネガティブ選択法に基づいて、それはDAPI染色を用いて死細胞を排除することが必要です。フローサイトメトリーにより検出されたCD45陰性細胞の割合は可変であり、患者（ 図1A）の腫瘍量に依存します。白い矢印（ 図1B）に示されるように、CD45及びDAPI（細胞核を識別するために）を使用してソートされていない細胞の免疫蛍光染色は、CD45陰性細胞を明らかにする。 図1Cに 、皮下結節密度は、マウスの両脇腹に見ることができます。各結節密度は、異種移植片の成長を示し、それは、マウスの背側筋から突出し、質感でより強固であるように、健康な組織から区別できるように理解することができます。注入および異種移植片の開発との間の時間間隔はpatieのCTC負担に応じて大きく異なる場合がありますNTサンプル、移植された細胞の数と、CTCの生物学的攻撃性。 CTCから生成された前立腺PDXは、ヘマトキシリンおよびエオシン染色によって示されるように、ヒト前立腺腫瘍を再現し、そのようなアンドロゲン受容体（AR）および前立腺特異的膜抗原（PSMA）（ 図1D）のような前立腺特異的細胞マーカーについての免疫組織化学による。

ヒト前立腺癌のCTCから前立腺がんPDXモデルの1世代図。 （A）は、前立腺癌患者の末梢血から特定 ​​のCD45染色細胞集団をフローサイトメトリープロットを示します。正のDAPI染色を有する細胞は死んでのみ生存可能な細胞が単離されていることを確認するためにゲートすることによって除外されてソートされていない人口の（B）CD45の免疫蛍光染色は、CD45の存在を確認する^{- 。}細胞（白矢印）（C）。 は 、インビボで、腫瘍の収穫後の代表PDX腫瘍を示し、（D）は、従来のヘマトキシリンおよびエオシンを使用して、CTC PDXモデルと特定の前立腺マーカーの分析。アンドロゲン受容体（AR）および前立腺特異的膜抗原（PSMA）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

Discussion

この原稿は、CTCのから前立腺癌PDXモデルを生成するための方法を説明します。 PDXを生成するためのCTCの使用 既存の方法と比較した場合のモデルはいくつかの潜在的な重要な利点を有します。まず、末梢血からのCTCのアクセスコレクションは、異なる疾患段階で同じ患者からの実験モデルを生成することができます。第二に、血液採取は、腫瘍細胞の収集のための外科的処置を必要とする既存の方法と比較すると、腫瘍細胞を単離するために安全で安価な方法を表します。

CTCの濃縮の複数の方法は、しかし多くは資金とリソース制限のために、すべての研究室にアクセスすることはできません記載されています。私たちは、FACS、多くの研究室のために、便利な手頃​​な価格でアクセス可能な方法論を使用することに生かすことができ、私たちの研究室でのアッセイを開発しようとしました。この方法の潜在的な制限があります高い腫瘍負荷を有する患者にこのプロトコルの使用が制限される可能性が希少細胞の検出のための不十分な感度。上皮細胞の物理的または生物学的特性を利用するいくつかの追加の技術が上にこの制限を緩和し、このまれな細胞集団⁴の検出および単離を増加させることができます。このプロトコルに記載のCTC濃縮のための方法は、負の選択を採用。 ^CD45 +白血球は破棄され、CD45 ^-のCTCが保持されます。フローサイトメトリーによってソートするとき細胞懸濁液からの要素（ 例えば、非生存細胞。） ^-それは、潜在的に汚染CD45を除去することが重要です。具体的には、DAPI染色による赤血球溶解緩衝液と非生存細胞の省略を使用することは、重要な検討事項です。これらの措置は、非CTC要素がCD45汚染しないことを保証しないかもしれないが^-人口を、我々の以前の研究は、所望のセルPopulationは十分にこれらの方法¹¹で濃縮されています。これは、CTC集団の純度は、前立腺癌細胞³に特有の細胞表面マーカーに対する抗体を用いて、ポジティブ選択によって改善することが可能です。また、試料中に存在する上皮細胞のCTCの数が不均一とのEpCAMまたは他の適切な汚れを用いて試験することができます。全収率を減少させながらしかし、末梢血試料のさらなる処理は、最終的に純度を高めることができます。

このプロトコルでは、我々は簡単に移植し、開発腫瘍の監視を可能に分離されたCTCの皮下注射を行いました。しかし、皮下モデルは、腫瘍の生着および腫瘍細胞の亜集団の損失を損なう可能性が不十分な栄養供給を持っています。そのようなSUCCを高め、前立腺微小環境を促進するマウス前立腺（直交異方性）、および腎被膜下​​注入、などの代替注入部位essful移植腫瘍の不均一性を保持するには、治験責任医師の好み^1,2に基づいて行うことができます。最適には、NOD / SCID /IL2λレセプターヌル（NSG）マウスモデルは、しかし、免疫不全マウス（ヌードNOD / SCIDまたは、SCID /ベージュ）の他の株もまた、首尾よく使用されている、異種移植片生着¹²の速度を増加させるために使用されるべきです固形腫瘍の発生にPDXモデル^1を導出しました。生成されたPDXモデルは、連続的に継代することができ、元の腫瘍の特性の安定性は、確立された遺伝子的方法^9-11,13を使用して監視します。

実行可​​能な前立腺癌CTCの高い数の回復は、病期に依存しています。 CTCのは、高転移性の負担の患者の血液から分離されたときに、PDXモデルの成功の世代は、最良の保証です。我々は成功した100〜10,000 CTCの範囲で血液サンプルからPDXモデルを生成しました。我々の経験では、それはよく訓練された労働者のために必要ですatory人員は、血液サンプルからの前立腺CTCの単離に成功を保証するために頻繁にプロトコルを実行します。我々は、実験者は、最初の腫瘍細胞株由来の細胞でスパイク健常個体から血液サンプルを使用して、このプロトコルで訓練されることをお勧めします。不在または原発性前立腺癌におけるCTCの数が少ない転移性前立腺癌に対するこの方法の利用を制限することができます。

CTCの生成のための方法は、このプロトコルに記載PDXモデルはその後パーソナライズ癌治療における前立腺癌、薬物スクリーニング、モニタリング治療応答、バイオマーカーの開発、および他の進歩の分子特性を含む多くの研究用途で使用することができる派生しました。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640	Gibco Life Technologies	11875-093
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco Life Technologies	10437-028
Penicillin Streptomycin	Gibco Life Technologies	15140-122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Corning Cell Gro	21-031-CM
35 µm Cell Strainer	BD Falcon	352340
50 ml polystyrene conical tube	Crystalgen	23-2263
Red blood cell lysing buffer	Sigma	R7757
DAPI	Invitrogen	d3571
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440
12 mm x 75 mm Polystyrene tubes with cell strainer cap	BD Falcon	352235
BD Vacutainer Lavender Blood Collection Tubes with EDTA
BD Winged Blood Collection Set with Push Button Retract Needle 23 gauge
BD Vacutainer One Use Needle Holder
Disposable Latex Tourniquet
Latex or non-latex gloves
alcohol swabs
2 x 2 cotton gauze pads
Adhesive bandage
25 G needle
1 ml syringe