Introduction
De mogelijkheid om te gebruiken in vitro model systeem is sterk verbeterd op het gebied van neurobiologie en de neurowetenschappen. Cellen in cultuur zorgen voor een efficiënt platform om eiwitten functionaliteit en moleculaire mechanismen van specifieke verschijnselen te karakteriseren, aan de pathologie van de ziekte en infecties te begrijpen, en de voorlopige drugstests evaluaties uit te voeren. In neurobiologie, de belangrijkste soorten van celcultuur modellen omvatten primaire neuronale culturen afkomstig van ratten en muizen, en neuroblastoma cellijnen zoals ratten B35 cellen 5, Neuro-2A muizencellen 6, en ratten PC12 cellen 7. Hoewel het gebruik van dergelijke cellijnen het veld is aanzienlijke vooruitgang geboekt, zijn er verschillende verstorende factoren die samenhangen met de behandeling van niet-menselijke cellen en weefsels. Deze omvatten begrip soort-specifieke verschillen in metabole processen fenotypen van ziekten manifestatie en pathogenese in vergelijking met mensen. Het is ook belangrijk om op te merken dat dere bestaan aanzienlijke verschillen tussen muis en genexpressie van de mens en transcriptiefactor signalering, aandacht voor de beperkingen van diermodellen en het belang van inzicht in welke trajecten worden geconserveerd tussen knaagdieren en mensen 8-11. Anderen hebben het gebruik van menselijke neuronale cellijnen met inbegrip van de N-Tera-2 (NT2) humane teratocarcinoom cellijn en induceerbare pluripotente stamcellen (iPSCs) toegepast. Deze cellijnen leveren goede modellen in vitro menselijke systemen. Echter, differentiatie NT2 cellen met retinoïnezuur (RA) resulteert in de vorming van een gemengde populatie van neuronen, astrocyten en gliacellen radiale 12, noodzakelijk een extra zuiveringsstap zuivere populaties van neuronen te verkrijgen. Bovendien NT2 cellen vertonen een zeer variabele karyotype 13, met meer dan 60 chromosomen in 72% van de cellen. iPSCs tonen variabiliteit in differentiatie tussen verschillende cellijnen en variëren in differentiatie efficiency 14. Het is daarom wenselijk om een consistente en reproduceerbare menselijke neuronale cellen bij deze alternatieven aanvulling hebben.
SH-SY5Y neuroblast-achtige cellen zijn een subkloon van de ouderlijke neuroblastoma cellijn SK-N-SH. De ouderlijke cellijn werd gegenereerd in 1970 uit een beenmergpunctie dat zowel neuroblast-achtige en epitheliale-achtige cellen 15 bevat. SH-SY5Y cellen een stabiele karyotype bestaande uit 47 chromosomen, en kan worden onderscheiden van een neuroblast-achtige toestand tot volgroeide menselijke neuronen door een aantal verschillende mechanismen waaronder het gebruik van RA, forbolesters, en specifieke neurotrofinen zoals hersen- afgeleide neurotrofe factor (BDNF). Voorgeschiedenis suggereert dat het gebruik van verschillende methoden kan kiezen voor een specifieke neuron subtypen zoals adrenergische, cholinerge en dopaminerge neuronen 16,17. Dit laatste maakt SH-SY5Y cellen bruikbaar voor een veelheid aan neurobiologie experimenten.
NHOUD "> Verschillende studies hebben belangrijke verschillen tussen de SH-SY5Y cellen in hun ongedifferentieerde en gedifferentieerde Staten genoteerd. Bij SH-SY5Y cellen ongedifferentieerd, ze zich snel vermenigvuldigen en lijken niet-gepolariseerde, met zeer weinig, korte processen te zijn. Ze groeien vaak in groepjes en expressie merkers indicatief onvolwassen neuronen 18,19. bij gedifferentieerde, deze cellen verlengen lange, vertakte processen afname in proliferatie, en in sommige gevallen polariseren 2,18. volledig gedifferentieerde SH-SY5Y cellen zijn eerder aangetoond dat een drukken verscheidenheid van de verschillende markers van volwassen neuronen waaronder groei geassocieerd eiwit (GAP-43), neuronale kernen (Neun), synaptophysine (SYN), synaptischeblaasjeseiwit II (SV2), neuron specifieke enolase (NSE) en de microtubule-geassocieerde eiwit (MAP) 2,16,17,20, en de expressie van gliale merkers zoals gliacellen fibrillaire zuur eiwit (GFAP) 4 ontbreekt. In verdere ondersteuning die gedifferentieerde SH-SY5Y cellen VERTEGEnt een homogene neuronale populatie, verwijdering van BDNF resulteert in cellulaire apoptose 4. Dit suggereert dat de overleving van gedifferentieerde SH-SY5Y-cellen is afhankelijk van trofische factoren, vergelijkbaar neuronen rijpen.Gebruik van SH-SY5Y cellen is sinds de subkloon werd in 1978 3. Voorbeelden van hun toepassing omvatten onderzoeken ziekte van Parkinson 17, de ziekte van Alzheimer 21 en de pathogenese van virale infectie, waaronder poliovirus 22, enterovirus 71 (EV71) 23,24 , varicella-zoster virus (VZV) 1, humaan cytomegalovirus 25, en herpes simplex virus (HSV) 2,26. Het is belangrijk op te merken dat verschillende studies met SH-SY5Y cellen zijn deze cellen in hun ongedifferentieerde vorm, met name op het gebied van Neurovirology 27-36. Het verschil in de waargenomen fenotype van ongedifferentieerde versus gedifferentieerde SH-SY5Y cellen roept de vraag op whether de waargenomen progressie van de infectie zou anders in de volwassen gedifferentieerde neuronen zijn. Bijvoorbeeld gedifferentieerde SH-SY5Y cellen een hogere efficiëntie van HSV-1 opname versus ongedifferentieerde, prolifererende SH-SY5Y-cellen, die kunnen worden veroorzaakt door een gebrek aan oppervlaktereceptoren die HSV binden moduleren notitie gedifferentieerde SH-SY5Y cellen 2. Het is daarom van groot belang dat bij het ontwerpen van een experiment gericht op het testen van neuronen in vitro moeten SH-SY5Y-cellen worden gedifferentieerd om de meest nauwkeurige resultaten te vertalen en vergelijking met in vivo modellen te verkrijgen.
De ontwikkeling van een betrouwbare methode voor de menselijke neuronale culturen genereren noodzakelijk om onderzoekers translationele experimenten die het menselijk zenuwstelsel nauwkeurig modelleren voeren. Het protocol hier gepresenteerde is een procedure die 'best practices' afgeleid van de vorige methoden 1-4 bakent te verrijken voor menselijke neuronen die worden onderscheidengebruik retinoïnezuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Algemene overwegingen
- Zie de tabel van Materialen / Apparatuur voor een lijst van noodzakelijke reagentia. Voer alle stappen onder strikte aseptische omstandigheden.
- Gebruik warmte geïnactiveerd foetaal runderserum (hiFBS) voor alle media voorbereidingen die FBS bevatten. Aan hitte-geïnactiveerd, warm een 50 ml aliquot van FBS bij 56 ° C gedurende 30 min, omkeren elke 10 minuten (zie ook tabel 1).
Opmerking: Als FBS wordt zonder warmte-inactivatie, het epitheel fenotype sneller verloopt gedurende kweken van SH-SY5Y-cellen. - Voor gebruik, zodat media opwarmen en equilibreren in een incubator op een juiste pH balans voor elke stap stellen. Bijvoorbeeld, 50 ml medium duurt ongeveer een uur om volledig evenwicht (pH 7, 37 ° C, 5% CO2).
Opmerking: Dit protocol maakt gebruik van een tweestaps splitting die gedeeltelijk gedifferentieerde SH-SY5Y-cellen worden getrypsiniseerd en opnieuw uitgeplaat vereist. Dit is een stressvolleWerkwijze deze bijzonder kwetsbare cellen. Daarom is het belangrijk om de cellen in trypsine geïncubeerd een minimale hoeveelheid tijd. Dit zal zorgen voor de preferentiële lift-off van neuronen, waardoor epitheel-achtige cellen nog steeds verbonden aan het gerecht. - Voer trituratie van gedifferentieerde cellen langzaam met een 10 ml plastic pipet met de tip tegen de onderzijde van de conische buis met de cellen. Voer wrijven bij een lage snelheid, boven en beneden niet meer dan vijf keer.
2. Passage van SH-SY5Y Maintenance Cultures
- Split onderhoud kweken wanneer de cellen 70-80% confluentie hebben bereikt, en niet meer dan 10 tot 15 passages. Culturen moeten meestal worden gepasseerd om de 3-5 dagen (uitgaande kweken niet meer dan 5-voudig verdund in splitting).
- Om passage cellen van een T-75 kolf, zuigen uit de media en spoel na met ongeveer 10 ml 1x PBS.
Let op: Het is niet raadzaam het splitsen van de SH-SY5Y onderhoud culturen further dan 1: 5 tijdens passage, want dit kan ertoe leiden dat de cellen te wijten sterven om lage confluentie. - Zuig PBS, en voeg vervolgens 2,5 ml 0,05% trypsine-EDTA (1x).
- Incubeer in incubator 2-3 min en kantel voorzichtig cellen los van het oppervlak van de kolf.
- Voeg 10 ml Basic Growth Media (zie tabel 2) en vermaal 1-2 keer.
- Spin down gedurende 2 min bij 1000 xg aspiraat media, dan resuspendeer pellet in 5 ml groeimedia Basic.
- Verdun cellen van 1: 3 tot 1: 5 in een totaal volume van 20 ml normale plating in T-75 kolf en tellen en dienblad differentiatie (punt 5).
3. Het invriezen van SH-SY5Y Cells
- Freeze vroege passages van SH-SY5Y neuroblastoomcellen in Basic groeimedia aangevuld met 5% (v / v) DMSO.
- Aanvankelijk bevriezen bij -80 ° C gedurende 24 uur, vervolgens over vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
Opmerking: Ter referentie, een confluente (75-85%), T-75 kolf zal opleveren vijf1 ml porties van SH-SY5Y cellen voor invriezen. Elk van deze porties moet overal 2-5 miljoen cellen in totaal bevatten.
4. Dooi en cultuur gedifferentieerde SH-SY5Y Neuroblastoom Cellen
- Bereid Basic Growth Media.
- Snel ontdooien bevroren cellen in een 37 ° C waterbad (ongeveer 2 min).
- Resuspendeer cellen in 9 ml Basic groeimedia in een 15 ml conische buis en centrifugeer gedurende 2 min bij 1000 x g.
- Zuig het supernatant terwijl ze voorzichtig de gepelleteerde cellen, en voorzichtig resuspendeer cellen niet te storen in 10 ml Basic Growth Media.
- Plaat cellen op een T-25 kolf of 60 mm 2 gerecht.
- De volgende dag, media vervangen om dode huidcellen te verwijderen.
5. Dag 0: Plating Cellen voor differentiatie
- Zie Figuur 1 voor de differentiatie schema.
- Spoel ongedifferentieerde cellen met 1x PBS, aspireren, en vervolgens met behulp van trypsinize 1-2 ml opgewarmd1x 0,05% trypsine-EDTA.
- Wanneer cellen in trypsine, incubeer gedurende ongeveer 3 minuten in een incubator.
- Quench trypsine door toevoeging van 10 ml Basic groeimedia, spoel de zijkanten van de kolf of schaal en zacht tritureer 1-3 keer. Breng de inhoud met een 15 ml conische buis.
- Centrifuge gedurende 2 minuten bij 1000 x g, en zuig de media terwijl ze voorzichtig de pellet te verstoren.
- Resuspendeer pellet in 5 ml Basic Groei Media en vermaal 1-3 keer.
- Aantal cellen met een hemocytometer, verdun behulp Basic groeimedia tot 50.000 cellen / ml.
- Plaat 2 ml cellen per 35 mm schotel 2 voor een totaal van 100.000 cellen per schaal en weer plaatsen incubator.
6. Dag 1: Change Media (Differentiatie Media # 1)
- Aliquot 50 ml Differentiatie media # 1 (zie tabel 2) en incuberen in een 37 ° C waterbad.
- Wanneer media wordt opgewarmd, laat het evenwicht in een incubator (37° C, 5% CO2) gedurende ten minste één uur om een juiste pH balans vóór gebruik vast te stellen.
- Voeg retinoïnezuur (RA) (zie tabel 1) tot verwarmd en geëquilibreerd media direct voor het toevoegen media gerechten.
Opmerking: Retinoïnezuur is lichtgevoelig en moet worden bewaard in een donkere fles bij 4 ° C - Zuig voorzichtig uit oude media en gooi ze weg.
- Voeg 2 ml Differentiatie media # 1 met RA per 35 mm 2 gerecht en terug te keren naar incubator.
7. Dag 3: Change Media (Differentiatie Media # 1)
- Herhaal Sectie 6 (stappen 1-5)
8. Dag 5: Change Media (Differentiatie Media # 1)
- Herhaal Sectie 6 (stappen 1-5)
9. Dag 7: Split Cells 1: 1
- Voeg RA naar opgewarmd en in evenwicht gebracht Differentiatie Media # 1 onmiddellijk voor het toevoegen van media aan gerechten.
- Zuig voorzichtig uit oude media en gooi ze weg.
- Voeg 200 ulverwarmd 0,05% trypsine EDTA 1x per 35 mm schotel 2 en warm in incubator ongeveer 2-3 minuten of totdat cellen zichtbaar opgetild de plaat als waargenomen onder een microscoop.
- Doof de trypsine door toevoeging van 2 ml Differentiatie media # 1 met RA per 35 mm 2 dish en het gebruik van de media om te spoelen resterende neuronale cellen van de plaat. Vervolgens transfer inhoud aan een 50 ml conische buis.
Opmerking: Tijdens behandeling met trypsine stappen, niet trypsinize te veel gerechten tegelijk. Dit draagt ertoe bij neuronale kweken worden geïncubeerd in trypsine niet te lang, die cytotoxisch kan zijn. - Combineer de inhoud van maximaal 10 gerechten in de 50 ml conische buis en voorzichtig vermaal langzaam op en neer niet meer dan vijf keer met een 10 ml plastic pipet.
- Aliquot 2 ml celsuspensie in vers 35 mm 2 gerechten en terug te keren naar incubator.
10. Dag 8: Change Media (Differentiatie Media # 2)
- Voeg RA (zie <strong> tabel 1) om opgewarmd en in evenwicht gebracht media onmiddellijk voor het toevoegen van media aan gerechten.
- Zuig voorzichtig uit oude media en gooi ze weg.
- Voeg langzaam 2 ml Differentiatie Media # 2 (zie tabel 2) met RA per 35 mm 2 gerecht en terug te keren naar incubator. Niet laten neuronen worden blootgesteld aan lucht gedurende een langere tijd omdat zij snel uitdrogen.
11. Dag 9: Bereid extracellulaire matrix (ECM) Coated Gerechten
- Dooi een flacon van de ECM-oplossing op ijs en verdund 1: 100 in koud DMEM.
- Verdeel 2 ml van het mengsel in elke 35 mm 2 gerecht en zorgen voor de hele onderkant van de schotel is bedekt.
- Plaats in een incubator (37 ° C, 5% CO2) gedurende 1 uur of overnacht.
- Zuig het mengsel en laat aan de lucht drogen voor ongeveer 1 uur in een kap. Bewaar bij kamertemperatuur gedurende maximaal 2 maanden.
12. Dag 10: Transfer Cells opECM beklede platen 1: 1
- Voeg RA (zie tabel 1) tot verwarmd en geëquilibreerd media direct voor het toevoegen media gerechten.
- Zuig voorzichtig uit de media en gooi.
- Voeg 200 ul trypsine verwarmd tot elke 35 mm schaal en 2 laten incuberen bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 1-2 minuten of tot neuronen zichtbaar opgetild uit de schaal zoals waargenomen onder een microscoop.
Opmerking: Voer deze stap behandeling met trypsine bij kamertemperatuur om niet over-neuronen geïncubeerd met trypsine en schade veroorzaken. Neuronen bevrijden van platen veel sneller dan epitheel-achtige cellen in dit stadium. - Doof de trypsine door toevoeging van 2 ml Differentiatie media # 2 per 35 mm 2 schaal en gebruik maken van de media te spoelen resterende neuronale cellen van de plaat. Vervolgens transfer inhoud aan een 50 ml conische buis.
- Combineer de inhoud van maximaal 10 gerechten in de 50 ml conische buis en voorzichtig vermaal langzaam op en neer niet meer dan vijf keer meteen 10 ml plastic pipet.
- Verdeel 2 ml celsuspensie in-ECM-gecoate 35 mm 2 gerechten en terug te keren naar incubator.
13. Dag 11: Change Media (Differentiatie Media # 3)
- Voeg RA (zie tabel 1) tot verwarmd en geëquilibreerd media direct voor het toevoegen media gerechten.
- Zuig voorzichtig uit oude media en gooi ze weg.
- Voeg langzaam 2 ml Differentiatie media # 3 (zie tabel 2) met RA per 35 mm schaal 2 en terug naar incubator. Niet laten neuronen worden blootgesteld aan lucht gedurende een langere tijd.
14. Dag 14: Change Media (Differentiatie Media # 3)
- Herhaal Section 13 (stap 1-3)
15. Dag 17: Laatste Media Change (Differentiatie Media # 3)
- Herhaal Section 13 (stap 1-3)
16. Dag 18: neuronale culturen Ready to Use
- Verander media frisse Diffdifferentiatie Media # 3 met RA om de 3 dagen voor de gezondheid neuron te behouden.
Opmerking: De cellen moeten worden onderscheiden in neuronen en vertonen een neuronaal fenotype. Culturen zijn meestal stabiel tot 14 dagen na terminale differentiatie echter duur van neuron levensvatbaarheid afhankelijk passage aantal ongedifferentieerde cellen bij het begin van differentiatie. Hogere passage nummers op gedifferentieerde neuronen met een kortere gebruiksduur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Momenteel zijn er veel gevallen op het gebied van neurobiologie en Neurovirology waarbij gedifferentieerde SH-SY5Y cellen als een functioneel model voor humane neuronen 27-36, en belangrijker nog, ongedifferentieerde cellen missen fenotypes worden gebruikt, zoals virale optimale opname 2 die noodzakelijk voor nauwkeurige interpretatie. Het is essentieel dat bij gebruik van SH-SY5Y cellen of andere in vitro neuronale systeem, cellen gedifferentieerde in neuronen, om gegevens die de best mogelijke weergave van wat kan optreden in neuronen in vivo te verkrijgen. De bovenstaande protocol levert zeer rendabel, homogeen, gedifferentieerde neuronale kweken binnen 18 dagen, die kunnen worden gebruikt voor verdere biochemische en imaging analyses. Ongedifferentieerde SH-SY5Y neuroblastoma cellen vertonen een grote, platte, epitheel-achtige fenotype met tal van korte processen buiten uitstrekt (Figuur 2A), terwijl de gedifferentieerde cels beschikken over een aantal neuritische uitsteeksels die verbinding maken met omringende cellen (Figuur 2B). Het is belangrijk dat bij differentiatie SH-SY5Y-cellen worden cellen geïncubeerd met trypsine gedurende een minimale tijd zodat alleen neuronen vrijkomen uit de schotel. Dit laat achter de ongedifferentieerde epitheliale cellen die anders de gedifferentieerde neuronale celpopulatie zou besmetten. De neuronale eigenschappen van volledig gedifferentieerde SH-SY5Y-cellen worden aangetoond door technieken zoals immunofluorescentie detectie van klassieke neuronale merkers (Figuur 3).
SH-SY5Y cellen vertonen een verschillende fenotypen tijdens differentiatie en het is belangrijk om te kunnen gezonde neuronen identificeren van die welke worden benadrukt. Op differentiatie dag 1 vóór de invoering van differentiatie Media # 1 cellen hebben een platte, teruggetrokken fenotype korte, stompe processen (Figuur 4A).Na 5 dagen van serum deprivatie, SH-SY5Y cellen beginnen te langer projecties ontwikkelen en demonstreren van een neuronaal fenotype (Figuur 4B). Passage is een harde werkwijze voor SH-SY5Y cellen, en op dagen onmiddellijk na passage, cellen blijken ongezond. Dit blijkt uit de cel lichaam klonteren en de aanwezigheid van minder en kortere procedures. (Zie voor foto's: figuren 4C en 4E, en na foto's: de figuren 4D en 4F). Ongeveer 48 uur na een splitsing, cellen blijken te herstellen, en volgroeid, gedifferentieerde neuronen worden verkregen op dag 18 (Figuur 2B). Dit blijkt uit een vermindering cellichaam klonteren en uitbreiding van talrijke dunne, vertakte neuritische processen die vaak verbinding met naburige cellen.
Factoren die essentieel zijn voor het verkrijgen van reproduceerbare en levensvatbare neuronale culturen omvatten het gebruik van door warmte geïnactiveerd FBS, geminimaliseerd trypsine incubatietijd, en zacht trituratie. Belangrijk is dat deze protocol beschrijft de toepassing van vier verschillende media formuleringen met verschillende concentraties hiFBS, waardoor een zachte overgang naar een serum uitgehongerd staat voor de cellen maken. Bij volwassen SH-SY5Y cellen zijn gezond, ze tonen aan een groot aantal projecties die verbinding maken met de omliggende neuronen (figuur 5A). Opgemerkt wordt dat een kenmerkend fenotype epitheliale de neuronale culturen inhalen als ze verkeerd tijdens het differentiatieproces (Figuur 5B). Bovendien, als neuronen beginnen te sterven, neurieten zal intrekken, zal cellichamen beginnen samen te klonteren en ronden, en puin van neuriet degeneratie zal beginnen op te stapelen op en rond celprocessen. Dit proces is vergelijkbaar met wat wordt getoond in de figuren 5C en 5D. Hoewel Figuur 5C toont een natuurlijke progressie van celdood na nutriënt en ongezond milieu,Figuur 5D toont gedifferentieerde SH-SY5Y neuronen 4 uur na infectie met een HSV-1-stam KOS, bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 10 6 PFU. Dit protocol is grondig geoptimaliseerd in het laboratorium en levert reproduceerbare homogene populaties van neuronen, die essentieel zijn voor downstream analyses en experimenten zijn.
Figuur 1:. Tijdschema van differentiatie procedure Het onderscheid bestaat uit 11 stappen verspreid over het verloop van een periode van 18 dagen. Op de eerste dag van de differentiatie protocol (dag 0), zijn tussen 25.000 en 100.000 cellen geplateerd op ongecoate 35 mm schalen. Op dagen 1, 3 en 5, wordt oud medium verwijderd en differentiatie media # 1 wordt toegepast. Op dag 7 worden cellen gesplitst 1: 1 op ongecoat 35mm gerechten Differentiatie Media # 1. Op dag 8 wordt het medium veranderd naar differentiatieMedia # 2, en op dag 10 werden de cellen opnieuw gesplitst 1: 1, maar nu op ECM-gecoate 35 mm schalen in medium Differentiatie # 2. Op dagen 11, 14 en 17, wordt oud medium verwijderd en differentiatie media # 3 wordt toegepast. Op dag 18, gedifferentieerde neuronen zijn klaar om te gebruiken voor downstream-toepassingen.
Figuur 2:. Morfologische weergave van gedifferentieerde en gedifferentieerde SH-SY5Y cellen (A) gedifferentieerde SH-SY5Y cellen een platte fenotype met weinig uitsteeksels terwijl (B) gedifferentieerde SH-SY5Y neuronen demonstreren uitgebreide en langwerpig neuritische uitsteeksels. Beelden werden verkregen in fase bij 20x vergroting met een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop.
Figuur 3:Markers van neuronale differentiatie. Immunofluorescentie verlicht neuronale kenmerken van volledig gedifferentieerde SH-SY5Y cellen. (A) Anti-SMI31 (groen) kleurt het gefosforyleerd neurofilament H in het uitgebreide netwerk van neurieten. (B) Anti-MAP2 (rood) etiketten microtubule-geassocieerd eiwit 2, het openbaren van de neuronale soma en proximale gedeelte van neurieten. image deze fase voor elk immunofluorescentie paneel wordt getoond aan de rechterkant. Beelden werden verkregen bij 10x vergroting met behulp van een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop. Schaal bar, 100 micrometer.
Figuur 4: Intermediate stappen van de differentiatie protocol (A) Dag 1 van differentiatie.. Cellen behouden een teruggetrokken fenotype met korte projecties. (B) Dag 5 van differentiatie. Cellen werden blootgesteld aan 5 dagens van serum deprivatie (Differentiatie Media # 1). De overlevende cellen beginnen te verlengen en te vormen langere processen die verbinden met naburige cellen. (C) Dag 7 differentiatie vóór splitsen. Cellen vertonen hoge aantal lange processen met minder aantal cellen waaruit een epitheelachtige fenotype. (D) Dag 8 van differentiatie, één dag na de eerste doorgang. Na splitsing, cellichamen vormen klonten en processen verschijnen kort als gevolg van de passage procedure. (E) Dag 10 van differentiatie, voorafgaand aan het splitsen op-ECM beklede platen. Cellen vertonen meer processen die verbindingen met de nabijgelegen cellen te maken. Cel lichaam clustering is ook duidelijk. (F) Dag 11 van differentiatie, één dag na de tweede split. De cellen worden benadrukt na de tweede passage en veel neuronen uiteindelijk verloren. De overblijvende populatie levensvatbaar, homogeen en neuronale fenotype. Cellichamen produceren lArger clusters en processen beginnen te zenden vanaf de basis van de clusters.
Figuur 5:. Epitheliale overgroei en neuronale dood - twee alternatieve uitkomsten van het differentiatieproces (A) gezonde, volwassen SH-SY5Y neuronen aangetoond diffuse axonale uitsteeksels verbinden met naburige cellen. (B) In sommige gevallen cellen met een epitheelachtige fenotype inhalen onderhoud culturen. Dit overbevolking van epitheel-achtige cellen kunnen als gevolg van occasionele passage onderhoud culturen. Deze kweken worden gebruikt omdat de epitheel-achtige cellen blijven neuronen overtreffen. Pijlen duiden epitheel-achtige cellen. (C) Wanneer SH-SY5Y cellen ongezond en af te sterven, cellichamen en processen ronden afgebroken, waardoor een aanzienlijke hoeveelheid afval. (D 6 PFU.
| bestanddeel | Details | Voorraad | instructies | ||||
| 10 uM RA | All-trans retinoïnezuur | 5 mM | Resuspendeer 50 mg RA in 33,3 ml 95% EtOH. RA is gevoelig voor warmte, licht en lucht. Houd in een donkere fles en bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal 6 weken. Gebruik bij 1: 500 verdunning en verdun tot differentiatie media vlak voor gebruik | ||||
| (300,44 g / mol) | |||||||
| 1x B-27 | B-27 Supplement | 50x | Ontdooi flesje 1-10 ml en de hoeveelheid resterende activiteiten in eenmalig gebruik 1 ml porties en bewaar bij -80 ° C. WINKEL 10 ml flesjes bij -20 ° C | ||||
| 20 mM KCl | Kaliumchloride | 1 M | Voeg 250 ml water tot 18,6 g KCl en steriel filter. Bewaren bij kamertemperatuur | ||||
| (74,55 g / mol) | |||||||
| 2 mM db-cAMP | dibutyryl cyclisch AMP | 1 M | Resuspendeer volle fles door toevoeging van 2,04 ml water tot 1 g db-cAMP. Gevoelig voor licht en vocht. Bewaren in aliquots van 100 pi of 200 ul bij -20 ° C of -80 ° C | ||||
| (491,37 g / mol) | |||||||
| 50 ng / ml BDNF | BDNF (BDNF) | - | Centrifuge flacon tot poeder te krijgen naar beneden.60; Resuspendeer 10 ug flacon in 1 ml Neurobasal + 1x B27 of 5 ug flacon in 0,5 ml Neurobasal + 1 x B27 tot 10 ug / ml te krijgen. Gebruik bij 1: 200 verdunning. Opslag werken aliquots bij -80 ° C (ex: 250 pl) | ||||
| hiFBS | Hitte-geïnactiveerd foetaal runderserum | - | Aliquot ontdooid FBS in 50 ml conische buizen. Verhit bij 56 ° C in een waterbad gedurende 30 min. Verwijderen en bevriezen werken aliquots bij -20 ° C | ||||
Tabel 1: De oplossingen en componenten.
| Basic Growth Media | ||
| bestanddeel | Volume 500 ml | Verdunning |
| EMEM | 415 ml EMEM | |
| 15% hiFBS | 75 ml hiFBS | |
| 1x Pen / Strep | 5 ml Pen / Strep | 1: 100 |
| 2 mM Glutamine | 5 ml Glutamine | 1: 100 |
| * Houd voor maximaal 6 weken | ||
| Differentiatie Media # 1 | ||
| bestanddeel | Volume 50 ml | Verdunning |
| EMEM | 48 ml EMEM | |
| 2,5% hiFBS | 1,3 ml hiFBS | |
| 1x Pen / Strep | 500 ul Pen / Strep | 1: 100 |
| 2 mM Glutamine | 500 gl Glutamine | 1: 100 |
| 10 uM RA | 100 ul RA (5 mM voorraad) | 1: 500 |
| * Houd maximum voor 2 weken en voeg RA onmiddellijk voorafgaandgebruiken | ||
| * Heeft extra media zodra RA wordt toegevoegd niet te houden - RA is onstabiel | ||
| Differentiatie Media # 2 | ||
| bestanddeel | Volume 50 ml | Verdunning |
| EMEM | 49 ml EMEM | |
| 1% hiFBS | 500 gl hiFBS | |
| 1x Pen / Strep | 500 ul Pen / Strep | 1: 100 |
| 2 mM Glutamine | 500 gl Glutamine | 1: 100 |
| 10 uM RA | 100 ul RA (5 mM voorraad) | 1: 500 |
| * Laat maximum 2 weken en voeg RA onmiddellijk vóór gebruik | ||
| * Geen extra media niet houdence RA wordt toegevoegd - RA is onstabiel | ||
| Differentiatie Media # 3 | ||
| bestanddeel | Volume 50 ml | Verdunning |
| Neurobasal | 47 ml Neurobasal | |
| 1x B-27 | 1 B-27 ml (50X voorraad) | 01:50 |
| 20 mM KCl | 1 ml KCl (1M voorraad) | 01:50 |
| 1x Pen / Strep | 500 ul Pen / Strep | 1: 100 |
| 2 mM GlutamaxI | 500 ul GlutamaxI (100x voorraad) | 1: 100 |
| 50 ng / ml BDNF | 250 pl stock BDNF (10 ug / ml) | 1: 200 |
| 2 mM dibutyryl cyclisch AMP (db-cAMP) | 100 pi db-cAMP (1M voorraad) | 1: 500 |
| 10 uM RA | 100 pi RA (5 mM voorraad) | 1: 500 |
| * Laat maximum 2 weken en voeg RA onmiddellijk vóór gebruik | ||
| * Heeft extra media zodra RA wordt toegevoegd niet te houden - RA is onstabiel | ||
Tabel 2: Media recepten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het bovenstaande protocol voorziet in een eenvoudige en reproduceerbare methode om homogene en levensvatbare menselijke neuronale culturen te genereren. Dit protocol maakt gebruik van technieken en praktijken die een aantal eerder gepubliceerde werkwijzen 1-4 en doelstellingen te integreren om de best practices van elkaar af te bakenen. Differentiatie van SH-SY5Y cellen berust op een geleidelijke serum deprivatie; de toevoeging van retinoïnezuur, neurotrofe factoren en extracellulaire matrixeiwitten; en seriële splitsen om te selecteren op gedifferentieerde volwassen aanhangend neuronen. Deze cellijn begint als een heterogene populatie van hechtende en zwevende cellen. Dit protocol is bedoeld om zowel de bevolking te behouden door het achterhouden van PBS wast voor passage of media veranderen, maar enig verlies van gesuspendeerde cellen is noodzakelijk om het verwijderen van de dode epitheelcellen toe te staan. De onderhavige methode produceert een homogene populatie van gedifferentieerde menselijke SH-SY5Y neuronen voor verdere experimenten.
Hoewel other middelen kunnen worden gebruikt om de differentiatie van neuronen leiden tot een cholinerge of adrenerge fenotype 16,17, het gebruik van RA onderscheid SH-SY5Y cellen is eerder gebruikt om neuronen te produceren met een dopaminergische fenotype 37,38. Toevoeging van RA is aangetoond dat cellulaire differentiatie te induceren door een aantal mechanismen, zoals de arrestatie van voortgang van de celcyclus van G0 / G1, verhogen van de expressie van het cycline-afhankelijke kinase (CDK) remmers p21 en p27 Kip1 en het anti-apoptotische eiwit Bcl -2 en Bcl-xL, en verbetering PI3K / AKT activiteit die een rol spelen bij ontwikkeling en differentiatie neurieten 39 speelt.
Het is noodzakelijk tijdens de uitvoering van dit protocol om zacht en steriele hantering technieken, zoals SH-SY5Y cellen zijn zeer gevoelig voor plotselinge verandering. Het is vanwege deze gevoeligheid dat de geleidelijke serumdeprivatie protocol voorkeur boven protocollen vereisen om snelle veranderingen in media samenstelling. Bij het splitsen cellen op dag 7 en 10, is het belangrijk om de hoeveelheid tijd dat de gedeeltelijk gedifferentieerde neuronen brengen in trypsine minimaliseren. Dit vermindert de kans op beschadiging van neuronen en bevordert de preferentiële afgifte van neuronen versus epitheelcellen, die langer duren los. Dit helpt om een homogene neuronale populatie cellen vast te stellen en verontreiniging met de prolifererende en ongedifferentieerde epitheliale cellen minimaliseren. Het is ook belangrijk op te merken reagentia gebruikt voor de kweek en differentiatie van SH-SY5Y cellen dient regelmatig en niet vervangen onbeperkt worden bewaard. Zo kan Basic groeimedia worden gehouden 6 weken terwijl Differentiatie media moeten uitsluitend tot 2 weken bewaard. Hierdoor reagentia zoals dbcAMP en BDNF vers en stabiel. Bovendien, bereid RA mag alleen worden bewaard tot 6 weken in het donker voor een nieuwe lading moet worden. We hebben een grotere samenhang van neuronale uitkomsten w waargenomenet deze voorzorgsmaatregelen.
Zodra de cellen zijn gedifferentieerd tot rijpe neuronen, kunnen ze gedurende maximaal 2 weken na terminale differentiatie en gebruikt voor experimenten. Naar aanleiding van terminale differentiatie, moet de media om de 3-4 dagen worden gewijzigd (Differentiatie Media # 3). In tegenstelling tot gedifferentieerde neuronen, kan het onderhoud kolven die ongedifferentieerde SH-SY5Y celculturen dan worden gehouden vele weken met regelmatige passage. Het is belangrijk om passage onderhoud culturen regelmatig voorkomen overbevolking van epitheelachtige cellen die niet meer in staat te differentiëren tot neurons. Wanneer deze cellen talrijker zijn dan mensen met neuro-potentieel, zal serum uithongering onevenredig veel celdood veroorzaken. Ongedifferentieerde culturen kunnen alleen worden gehandhaafd gedurende maximaal ongeveer 15 passages. Zodra de cultuur overschrijdt rond 15 passages, ongedifferentieerde cellen af te sterven en een ruwe, ongezond uiterlijk. Daarnaast differentiatie van hoge passage SH-SY5Y cellen is moeilijker als minder cellen elk split zullen overleven, en die dat wel doen aggregeren vaak zowel cellichamen en axonen, waardoor de daaropvolgende analyses moeilijker.
Er is een duidelijke afname van het aantal cellen in het differentiatieproces zoveel cellen verloren zijn gegaan of niet overleven het splitsingsproces. Daarom aan het begin van elke experiment met gedifferentieerde SH-SY5Y cellen, moet men vertegenwoordigen ~ 30-40% verlies van neuronen, en een correcte aantal cellen uitgeplaat bij het begin van de gewenste opbrengst te bereiken. Terwijl plating 100.000 cellen produceert tal van gezonde, volwassen SH-SY5Y neuronen, kunnen minder of grotere aantallen in eerste instantie worden verzilverd, afhankelijk van de experimentele nodig.
Het is duidelijk dat volledig gedifferentieerde SH-SY5Y neuronen zorgen voor een nauwere onderlinge aanpassing van volwassen menselijke neuronen gevonden in vivo dan hun ongedifferentieerde voorlopercellen cel tegenhangers (figuur 2). Deze neuronen voordelige model voor toekomstige karakteriseringen hun neurobiologie, voor de studie van neurotrope virussen, of om te screenen op chemotherapeutische toxiciteit in neuronen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B-27 | ThermoFisher Scientific | 17504-044 | See Table 1 for preparation |
| Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) | Sigma | SRP3014 (10 μg)/B3795 (5 μg) | See Table 1 for preparation |
| dibutyryl cyclic AMP (db-cAMP) | Sigma | D0627 | See Table 1 for preparation |
| DMSO | ATCC | 4-X | - |
| Minimum Essential Medium Eagle (EMEM) | Sigma | M5650 | - |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | See Table 1 for preparation |
| GlutamaxI | Life Technologies | 35050-061 | - |
| Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | - |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-1 | See Table 1 for preparation |
| MaxGel Extracellular Matrix (ECM) solution | Sigma | E0282 | See step 11 of the protocol |
| Neurobasal | Life Technologies | 21103-049 | - |
| Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Life Technologies | 15140-122 | - |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | Should be stored in the dark at 4 °C because this reagent is light sensitive |
| SH-SY5Y Cells | ATCC | CRL-2266 | - |
| 0.5% Trypsin + EDTA | Life Technologies | 15400-054 | - |
| Falcon 35 mm TC dishes | Falcon (A Corning Brand) | 353001 | - |
References
- Christensen, J., Steain, M., Slobedman, B., Abendroth, A. Differentiated Neuroblastoma Cells Provide a Highly Efficient Model for Studies of Productive Varicella-Zoster Virus Infection of Neuronal Cells. Journal of Virology. 85 (16), 8436-8442 (2011).
- Gimenez-Cassina, A., Lim, F., Diaz-Nido, J. Differentiation of a human neuroblastoma into neuron-like cells increases their susceptibility to transduction by herpesviral vectors. Journal of Neuroscience Research. 84 (4), 755-767 (2006).
- Biedler, J. L., Roffler-Tarlov, S., Schachner, M., Freedman, L. S. Multiple Neurotransmitter Synthesis by Human Neuroblastoma Cell Lines and Clones. Cancer Research. 38 (11 Pt 1), 3751-3757 (1978).
- Encinas, M., Iglesias, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2000).
- Otey, C. A., Boukhelifa, M., Maness, P. B35 neuroblastoma cells: an easily transfected, cultured cell model of central nervous system neurons. Methods in Cell Biology. 71, 287-304 (2003).
- LePage, K. T., Dickey, R. W., Gerwick, W. H., Jester, E. L., Murray, T. F. On the use of neuro-2a neuroblastoma cells versus intact neurons in primary culture for neurotoxicity studies. Critical Reviews in Neurobiology. 17 (1), 27-50 (2005).
- Shafer, T. J., Atchison, W. D. Transmitter, ion channel and receptor properties of pheochromocytoma (PC12) cells: a model for neurotoxicological studies. Neurotoxicology. 12 (3), 473-492 (1991).
- Yue, F., Cheng, Y., et al. A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome. Nature. 515 (7527), 355-364 (2014).
- Cheng, Y., Ma, Z., et al. Principles of regulatory information conservation between mouse and conservation between mouse and human. Nature. 515 (7527), 371-375 (2014).
- Stergachis, A. B., Neph, S., et al. Conservation of trans-acting circuitry during mammalian regulatory evolution. Nature. 515 (7527), 365-370 (2014).
- Lin, S., Lin, Y., et al. Comparison of the transcriptional landscapes between human and mouse tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (48), 17224-17229 (2014).
- Coyle, D. E., Li, J., Baccei, M. Regional Differentiation of Retinoic Acid-Induced Human Pluripotent Embryonic Carcinoma Stem Cell Neurons. PLoS ONE. 6 (1), e16174 (2011).
- Mostert, M. M., van de Pol, M., et al. Fluorescence in situ hybridization-based approaches for detection of 12p overrepresentation, in particular i(12p), in cell lines of human testicular germ cell tumors of adults. Cancer Genetics and Cytogenetics. 87 (2), 95-102 (1996).
- Hu, B. -Y., Weick, J. P., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (9), 4335-4340 (2010).
- Biedler, J. L., Helson, L., Spengler, B. A. Morphology and growth, tumorigenicity, and cytogenetics of human neuroblastoma cells in continuous culture. Cancer Research. 33 (11), 2643-2652 (1973).
- Påhlman, S., Ruusala, A. I., Abrahamsson, L., Mattsson, M. E., Esscher, T. Retinoic acid-induced differentiation of cultured human neuroblastoma cells: a comparison with phorbolester-induced differentiation. Cell Differentiation. 14 (2), 135-144 (1984).
- Xie, H., Hu, L., Li, G. SH-SY5Y human neuroblastoma cell line: in vitro cell model of dopaminergic neurons in Parkinson’s disease. Chinese Medical Journal. 123 (8), 1086-1092 (2010).
- Kovalevich, J., Langford, D. Considerations for the use of SH-SY5Y neuroblastoma cells in neurobiology. Methods in Molecular Biology. 1078, Clifton, N.J. 9-21 (2013).
- Påhlman, S., Hoehner, J. C., et al. Differentiation and survival influences of growth factors in human neuroblastoma. European Journal of Cancer. 31 (4), 453-458 (1995).
- Cheung, Y. -T., Lau, W. K. -W., et al. Effects of all-trans-retinoic acid on human SH-SY5Y neuroblastoma as in vitro model in neurotoxicity research. Neurotoxicology. 30 (1), 127-135 (2009).
- Agholme, L., Lindström, T., Kågedal, K., Marcusson, J., Hallbeck, M. An in vitro model for neuroscience: differentiation of SH-SY5Y cells into cells with morphological and biochemical characteristics of mature neurons. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 20 (4), 1069-1082 (2010).
- La Monica, N., Racaniello, V. R. Differences in replication of attenuated and neurovirulent polioviruses in human neuroblastoma cell line SH-SY5Y. Journal of Virology. 63 (5), 2357-2360 (1989).
- Cordey, S., Petty, T. J., et al. Identification of Site-Specific Adaptations Conferring Increased Neural Cell Tropism during Human Enterovirus 71 Infection. PLoS Pathog. 8 (7), e1002826 (2012).
- Xu, L. -J., Jiang, T., et al. Global Transcriptomic Analysis of Human Neuroblastoma Cells in Response to Enterovirus Type 71 Infection. PLoS ONE. 8 (7), e65948 (2013).
- Luo, M. H., Fortunato, E. A. Long-term infection and shedding of human cytomegalovirus in T98G glioblastoma cells. Journal of Virology. 81 (19), 10424-10436 (2007).
- Sun, Z., Yang, H., Shi, Y., Wei, M., Xian, J., Hu, W. Establishment of a cell model system of herpes simplex virus type II latent infection and reactivation in SH-SY5Y cells. Wei Sheng Wu Xue Bao = Acta Microbiologica Sinica. 50 (1), 98-106 (2010).
- Yun, S. -I., Song, B. -H., et al. A molecularly cloned, live-attenuated japanese encephalitis vaccine SA14-14-2 virus: a conserved single amino acid in the ij Hairpin of the Viral E glycoprotein determines neurovirulence in mice. PLoS pathogens. 10 (7), e1004290 (2014).
- Garrity-Moses, M. E., Teng, Q., Liu, J., Tanase, D., Boulis, N. M. Neuroprotective adeno-associated virus Bcl-xL gene transfer in models of motor neuron disease. Muscle & Nerve. 32 (6), 734-744 (2005).
- Kalia, M., Khasa, R., Sharma, M., Nain, M., Vrati, S. Japanese Encephalitis Virus Infects Neuronal Cells through a Clathrin-Independent Endocytic Mechanism. Journal of Virology. 87 (1), 148-162 (2013).
- Haedicke, J., Brown, C., Naghavi, M. H. The brain-specific factor FEZ1 is a determinant of neuronal susceptibility to HIV-1 infection. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (33), 14040-14045 (2009).
- Xu, K., Liu, X. -N., et al. Replication-defective HSV-1 effectively targets trigeminal ganglion and inhibits viral pathopoiesis by mediating interferon gamma expression in SH-SY5Y cells. Journal of molecular neuroscience: MN. 53 (1), 78-86 (2014).
- Oh, J., Fraser, N. W. Temporal association of the herpes simplex virus genome with histone proteins during a lytic infection. Journal of Virology. 82 (7), 3530-3537 (2008).
- Stiles, K. M., Milne, R. S. B., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J., Krummenacher, C. The herpes simplex virus receptor nectin-1 is down-regulated after trans-interaction with glycoprotein D. Virology. 373 (1), 98-111 (2008).
- Thomas, D. L., Lock, M., Zabolotny, J. M., Mohan, B. R., Fraser, N. W. The 2-kilobase intron of the herpes simplex virus type 1 latency-associated transcript has a half-life of approximately 24 hours in SY5Y and COS-1 cells. Journal of Virology. 76 (2), 532-540 (2002).
- Handler, C. G., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J. Cross-linking of glycoprotein oligomers during herpes simplex virus type 1 entry. Journal of Virology. 70 (9), 6076-6082 (1996).
- Nicola, A. V., Hou, J., Major, E. O., Straus, S. E. Herpes Simplex Virus Type 1 Enters Human Epidermal Keratinocytes, but Not Neurons, via a pH-Dependent Endocytic Pathway. Journal of Virology. 79 (12), 7609-7616 (2005).
- Korecka, J. A., van Kesteren, R. E., et al. Phenotypic characterization of retinoic acid differentiated SH-SY5Y cells by transcriptional profiling. PloS One. 8 (5), e63862 (2013).
- Presgraves, S. P., Ahmed, T., Borwege, S., Joyce, J. N. Terminally differentiated SH-SY5Y cells provide a model system for studying neuroprotective effects of dopamine agonists. Neurotoxicity Research. 5 (8), 579-598 (2004).
- Qiao, J., Paul, P., et al. PI3K/AKT and ERK regulate retinoic acid-induced neuroblastoma cellular differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 424 (3), 421-426 (2012).
