Caspase-3 Aktiviteten i Rat Amygdala Målt Spectrofluorometry etter hjerteinfarkt

Abstract

Hjerteinfarkt (MI) har dramatiske midt-og langsiktige konsekvenser på de fysiologiske og atferdsmessige nivåer, men mekanismene som er involvert er fortsatt uklart. Vårt laboratorium har utviklet en rotte modell av post-MI syndrom som viser nedsatt hjertefunksjon, neuronal tap i det limbiske system, kognitiv svikt og atferdsmessige tegn på depresjon. På den neuronale nivå, medierer caspase-3 aktivering post-MI apoptose i forskjellige limbiske områder, slik som amygdala - med en topp på 3 dager post-MI. Kognitive og atferdsvansker vises 2-3 uker etter MI og disse korrelerer statistisk med tiltak av caspase-3-aktivitet. Protokollen er beskrevet her blir brukt til å indusere MI, samle amygdala vev og måle caspase-3-aktivitet ved hjelp spectrofluorometry. For å indusere MI, blir den nedadstigende koronararterie okkludert i 40 min. Protokollen for evaluering av caspase-3 aktivering begynner 3 dager etter MI: rottene avlivet og amygdala isolert rapiDLY fra hjernen. Prøver blir raskt frosset i flytende nitrogen og oppbevart ved -80 ° C inntil selve analysen. Teknikken utført for å vurdere kaspase-3 aktivering er basert på spaltning av et substrat (DEVD-AMC) av caspase-3, som frigjør en fluorogen forbindelse som kan måles ved spectrofluorometry. Metodikken er kvantitativ og reproduserbar, men utstyret som kreves er dyrt og fremgangsmåten for kvantifisering av prøvene er tidkrevende. Denne teknikken kan brukes til andre vev, slik som hjerte og nyrer. DEVD-AMC kan erstattes av andre substrater for å måle aktiviteten av andre caspaser.

Introduction

Kaspaser eller Cysteine-avhengige aspartat-rettet proteaser er en familie av enzymer som er involvert i ulike homeostase processess ^en. Kaspaser kan grovt klassifiseres i henhold til deres roller i apoptose eller betennelse. Caspase-1, -4, -5 og -12 er involvert i betennelsen, mens de som er engasjert i apoptose kan være under klassifisert som initiativtaker kaspaser (caspase-8 og -9) og bøddel kaspaser (caspase-3, -6 og -7 ).

Kaspaser spille viktige roller i mange sykdommer, hovedsakelig i lidelser hvor apoptose kan være overdreven, som observert etter hjerteinfarkt (MI) eller cerebral iskemi.

I rottemodellen av post-MI syndrom anvendt i vårt laboratorium, blir det fastslått at caspase-3 aktiveres ikke bare i myokard, men også ^to i det limbiske system, som er implisert i kontrollen av humør og følelser ^3-6. Det er også sett at caspase-3 aktiveres i forskjellige regionerav det limbiske system, slik som amygdala og hippocampus, og denne aktiverings toppene rundt 3 dager etter iskemisk fornærmelse ^fire. Interessant, korrelerer caspase-3-aktivitet med post-MI atferdsvansker, og dens demping gjennom farmakologiske og ernæringsmessige intervensjoner reduserer disse skadene, noe som tyder på en mulig sammenheng mellom caspase-3 og post-MI depresjon ^7-12.

Caspase-3 aktivering kan måles ved hjelp av forskjellige teknikker. Western blotting konstaterer de enzymatiske egenskaper av kaspasene, og kan detektere aktive enzymer, så vel som deres pro-enzym former. Western-blotting, imidlertid, er semi-kvantitativ, og små variasjoner kan gå tapt gjennom svake signal-støy-forhold ^13. En bedre metode er basert på spaltning av et substrat (DEVD-AMC) av caspase-3 som frigjør en fluorogen forbindelse, og kan måles ved spectrofluorometry. Caspase-3 aktivering er en pålitelig markør for apoptose. Måling av apoptose can være ustabil fordi tidsvinduet for forekomst er kort, og nabocellene kunne phagocytize apoptotiske legemer eller celler ^14. Apoptose kan ytterligere bekreftet av andre teknikker, slik som terminal deoksynukleotidyltransferase dUTP Nick endemerking (TUNEL) assay, som detekterer DNA-fragmentering som følge av apoptotiske signalkaskader ^6, eller forholdet mellom pro- / anti-apoptotiske proteiner, så som Bax / BCL2 ^6.

Protocol

Dyr blir håndtert i samsvar med reguleringen av den lokale Animal Care Komiteen i samsvar med retningslinjene i den kanadiske Council on Animal Care. Rotter er plassert individuelt under konstante forhold (temperatur på 21-22 ºC og luftfuktighet på 40-50%), inkludert en 12 timers mørk-lys syklus, som begynner kl 08:00. Chow pellets og vann fra springen er tilgjengelig ad libitum gjennom hele studien. En akklimatiseringsperiode på 3 dager etter levering av leverandøren er tillatt før forsøket. Sprague-Dawley rotter som veier mellom 300-800 g har blitt rutinemessig brukes med denne protokollen.

1. MI Surgery

1. Indusere anestesi med intraperitoneale injeksjoner av ketamin 60 mg / kg og xylazin 10 mg / kg. Bekreft riktig anesthetization ved fravær av refleks når potene blir klemt.
2. Barbere operasjonsstedet. Intubere rotte med endotrakeal slange: kateter (16G 1,77 inches) og plassere dyret i lateral decubitus posisjon. Plasser dyrene på en varmepute for å opprettholde temperaturen rundt 37 ° C. Koble endotrakeale slangen til isofluran 2%.
3. Forbered kirurgiske området med klorheksidinglukonat og isopropylalkohol. Under operasjonen, bruke sterile hansker og steriliserte instrumenter. Påfør ophthalmic salve til begge øynene for å hindre tørrhet mens under anestesi. Sett sterile feltet på dyr og instrumentene på en annen sterile feltet ved siden av dyret.
4. Incise hud med skalpell blad # 10. Skrelle av muskelvev med en hemostatisk klemme. Plasser dyret i ventral decubitus posisjon. Åpne thorax veggen med en hemostatisk klemme og posisjon brystet retractor. Åpen hjerteposen med en hemostatisk klemme.
5. Å produsere koronar okklusjon, loop en 360 mm lang 4-0 silke sutur rundt synkende koronar, passerer gjennom sammenhengende myocardial vev. Sett begge ender av silkesutur til en 14G, 1,25 cm lange plastrør.
6. Trekk begge ender av silke sutur og push røret ned mot arterie å tilstoppe det, for 40 min. Sikker okklusjon ved å klemme plastrøret med en hemostatisk klemme.
7. Etter 40 min, slipper okklusjon ved å slippe den hemostatiske klemmen, fulgt av fjerning av det fleksible rør og silkesutur.
   Merk: Sham kontrollrotter gjennomgå det samme kirurgiske prosedyren minus okklusjon av koronar.
8. Før du lukker brystveggen, plassere en fleksibel kateter (18G, 4,5 cm) gjennom brysthulen for å trekke luft ut av brystkassen med en 5 ml sprøyte for å forhindre pneumothorax.
9. Lukk thorax hulrom med 2-0 sutur, sy muskelen med 4-0 silke sutur og huden med 3-0 silke sutur.
10. Før lukking av huden siste punkt, igjen trekke luft ut av toraks med 5 ml sprøyte gjennom kateteret plassert tidligere i thorax hulrommet.
11. Sutur siste hud punkt. Stopp isofluran ventilasjon.
12. Overvåke rotte oppvåkning. Ikke la et dyr uten tilsyn før den har Rogained tilstrekkelig bevissthet til å opprettholde sternal recumbency.
13. Behandle rotte hver 8 time i 24 timer med et analgetikum (buprenorfin, 0,05 mg / kg ip) og med et antibiotikum (en enkelt dose av duplocillin, 0,2 mg / kg ip).
14. Etter operasjonen, house rotter individuelt inntil tidspunktet for offer, dvs. 3 dager etter MI.
15. Infarktstørrelse, hovedsakelig nekrose, er uttrykt som andelen av infarkt vevet i området med risiko for venstre hjertekammer. Dette kan måles ved hjelp triphenyltetrazolium farge ^11.

2. Amygdala Isolation

1. Plasser dyret hodet først i en kjegleformet pose, med sin nese stikker ut av den smale endeåpningen. Sikker rotte for å unngå enhver bevegelse. Plasser hodet riktig på giljotinen, mellom saksebladene. Halshogge dyr.
2. Place leder av rotte i en skål holdt på knust is. Utføre alle prosedyrer for isolering vev på knust is (4 ° C).
3. Klipp opp skull med saks, nøye løsne bein hylser med bein Rongeurs ved å trekke opp og unngå mutilating vevet under.
4. Plasser den flate blad av en spatel mellom bunnen av skallen og bakre ventrale overflaten av hjernen og nøye løsne hjerne fra skallen ved å skyve bladet frem langs bunnen av hodeskallen til hjernen kan sakte løftes opp og ut av hodeskalle. Kast skallen.
5. Plasser hjernen på sin dorsalflaten. Identifisere hypothalamus (struktur foran cerebellum) og kuttet i hjernen coronally foran sin fremre ende og bak sin bakre ende; forkaste de fremre og bakre deler av hjernen hvis ikke nødvendig for annet bruk.
6. Visualisere amygdalas som små kuler under tinninglappene, bilateralt, like ved siden av hypothalamus.
7. Vend hjernen flatt på frontal slutten, dorsalflaten bort fra eksperimentator.
8. Start med venstre eller høyre side av hjernen. Separer hemikuler og deretter cortex fra sammenhengende amygdala. Skjær måte omkring 8 mm i denne løs cortex for å tillate isolering av amygdala. Skjær bort amygdala med skalpell.
9. Isolere basolaterale del av amygdala fra sin centromedial del ved å kutte langs mørke sutur som går på tvers av det, nesten halvt om halvt. Denne strukturen er ikke alltid lett identifiserbare.
10. Sett amygdala subparts i egne identifiserte ampuller og holder på knust is.
11. Gjenta disseksjon prosedyre med den annen halvkule.
12. Dyppe ampuller i flytende nitrogen i 1 min. Oppbevar hetteglasset i -80 ° C fryser inntil nødvendig.

3. Caspase-3 aktivitet

1. Forbered lysis buffer med 0,32 M sukrose, 1% Triton-X-100, 10 mM Tris-HCl, pH 8, 5 mM etylendiamintetraeddiksyre, 2 mM av ditiotreitol, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 10 ug / mL leupeptin , 10 ug / ul av pepstatin A og 10 ug / mL aprotinin.
2. Legg 150 ul lyseringsbuffer til hver prøve (5-10 mg). Hold på is. Sonikere hver prøve på is i 5 sekunder ved maksimal intensitet (40 W). Inkuber vev i lyseringsbuffer på is i 30 min. Vortex hver prøve i 5 minutter.
3. Utføre tre fryse / tine-sykluser ved å plassere prøvene vekselvis i flytende nitrogen, og på en termostatstyrt varmeplate innstilt på 37 ° C. Sentrifuger vev ved 13 000 g (4 ° C) i 10 min. Fjern forsiktig supernatanten og holde røret på is.
4. Lage standardproteinkonsentrasjoner mellom 0 og 10 ug / ml med bovint serumalbumin. Forbered blanks med buffer bare.
5. Tilsett 200 ul av Bradford reagens til hver standard. Les standard på 595 nm. For proteinnivåer, tilsett 5 ul prøve supernatant til 795 pl destillert vann og 200 pl av Bradford-reagens. Les hver prøve ved 595 nm og kvantifisere protein med standardkurve.
6. Forbered reaksjonsbuffer med 50 mM Tris-HCl, pH 7, 5 mM _{MgCl2 <}/ sub>, 1 mM etylenglykol-tetraeddiksyre, 0,1% av 3-cholamidopropyl) dimetylammonio] -1-propansulfonat og 1 mM ditiotreitol.
7. Legg 25 ug protein i reaksjonsbuffer og kaspase-3-substrater for å oppnå positive og negative reaktive prøvene. For negative prøver, legge reaksjon buffer, 25 mikrogram av protein, 0,4 mL av Ac-DEVD-CHO 800 mikrometer og 0,8 mL av Ac-DEVD-AMC 10 mm. For positive prøver, tilsett 25 ug protein i reaksjonsbuffer og 0,8 ul av Ac-DEVD-AMC 10 mM. Prosess alle negative og positive prøver i tre eksemplarer. Fullføre den endelige volum av hver prøve opp til 200 ul ved tilsetning av reaksjonsbuffer.
8. Frembringe negative kontroller ved tilsetning av 188,7 ul reaksjonsbuffer til 0,5 mL av Ac-DEVD-CHO 800 uM, 0,8 mL Ac-DEVD-AMC 10 mM og 10 ul lyseringsbuffer. For positive kontroller, tilsett 189,2 mL av reaksjonsbuffer, 0,8 mL av Ac-DEVD-AMC 10 mm og 10 ul lysisbuffer.
9. Inkuber prøvene ogKontrollene i mørket i 3 timer ved 37 ^o C
10. Stoppe reaksjonen med 600 pl 0,4 M glycin og 0,4 M NaOH (pH 10) i hver prøve og kontroll.
11. Kvantifisere fluorescensen ved spectrofluorometry ved eksitasjonsbølgelengde på 365 nm og emisjonsbølgelengde på 465 nm. Tilsett 2 ml destillert vann til reaksjon i glasset kyvette. Les kontroller og prøver i 10 sek med 1 poeng på hvert sekund.
12. Kvantifisere spesifikke aktivitet i hver prøve: ((Fluorescens av negative prøver minus fluorescens av positive prøver) x volum på 2,8 ml) dividert med (inkubasjonstiden 3 timer x mengden av protein 25 mg).

Representative Results

Amygdala ble isolert i 8 sham (kontroll) og 8 MI rotter tre dager etter induksjon av ischemi / reperfusjon protokollen. Caspase-3-aktivitet ble målt i dette vev ved hjelp av en fluorokrom som kan spaltes ved hjelp av aktiv caspase-3, og detekteres av spectrofluorometry. Positive og negative målinger (se trinn 3.11, 3,12 og 3,16) ble utført i triplikat og måles i løpet av 10 sekunder, med ett punkt i hvert sek. Forskjeller mellom positive og negative kontroller ble beregnet, og gjennomsnittet av forskjellene for alle sham vev utført i løpet av dette forsøket ble satt til 100%. Resultater fra MI rotter ble redusert i henhold til denne referansen, og Figur 1 illustrerer de endelige resultater: det indikerer en betydelig høyere aktivitet i MI rotter sammenlignet med sham (p <0,05).

Figur 1. Caspase-3aktivitet i amygdala av MI rotter, uttrykt i prosent av gjennomsnittlig aktivitet i sham kontroller, satt til 100% (8 rotter pr gruppe). * Indikerer signifikant forskjell mellom gruppene (p <0,05). Dataene er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM.

Discussion

Vår erfaring med denne protokollen i løpet av de siste 10 årene ført til identifisering av kritiske metodiske problemstillinger. For det første er hurtig hjerne disseksjon i en petriskål på knust is viktig for å opprettholde forberedelse kvalitet. For det andre må man være klar over at vevet sonication er kortere for cerebral amygdala sammenlignet med andre typer vev, for eksempel i hjertet (10 sek) eller nyrene (20 sek). Tredje, stor forsiktighet bør tas for å nøye blande underlaget før du legger det til prøvene. Vi møtte variable signaler når blande sekvensen var utilstrekkelig. For det fjerde bør ingen bobler være til stede i kvartscelle ved lesing av prøvene. Ellers kan signalet endres.

Vi har gjort en endring i de siste årene for å øke reproduserbarheten av resultatene: øke substrat volum for å unngå volum mindre enn 1 mL. Likevel kan små variasjoner forekomme mellom suksessive analyser, og minst 3 kontrollprøver skal brukes til åkontroll for variasjoner. Fluorescens tiltak av disse kontrollene er gjennomsnitt, og gjennomsnittlig er satt til 100%. Fluorescens tiltak i eksperimentelle prøvene blir forvandlet i prosent av kontrollprøver.

En annen begrensning av teknikken er at bare en del av vev blir brukt, og derfor kan caspase-3 aktivitet undervurderes. Faktisk, er den tidsvindu av apoptose kort i en gitt celle, og kan bli savnet, selv om det forekommer i naboområder på tidspunktet for prøvetaking ^1,4,15. Det omvendte er også mulig: apoptose kan være særlig intens i deler av vev, noe som resulterer i overestimering av caspase-3 aktivitet. Vi anbefaler bruk av gjenværende vev (amygdala) for komplementære teknikker, for eksempel tunel analyser eller Bax / BCL2 ratio (se Innledning).

Spectrofluorometry har minst to fordeler i forhold til Western blotting. Først genererer den direkte kvantitative data. For det andre, måler det enzymatisk enctivity selv heller enn proteiner eller RNA-ekspresjon, noe som kan være irrelevant, og det er kjent at protein ekspresjon kan økes uten noen endring i enzymatisk aktivitet. Videre kan spectrofluorometry utføres på andre vev eller med forskjellige dyrearter, og kan justeres til andre kaspase subtyper, med forskjellige substrater, slik at trygge sammenligninger kan gjøres.

Som konklusjon, viser dette dokumentet ved bruk av spectrofluorometry å måle caspase-3 aktivitet i amygdala, gir bevis for at apoptose oppstår i denne region av det limbiske system 3 dager etter MI.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectroflurometer	Photon technology Instrument (now Horiba)	Ratiomaster M-40	with DeltaRAM  Random Access Monochromator
Respirator	Harvard apparatus	683	small animal ventilation
Glass cuvette	NSG precision cells	3G10	Optical Glass (340-2,500 nm) 10 mm path
Sonicator	Cole Parmer	4710  series
Spectrometer	Varian	Cary 50 Bio