Caspasi-3 L'attività nel ratto amigdala Misurato da Spettrofluorimetria dopo infarto miocardico

Abstract

Infarto del miocardio (MI) ha drammatiche a medio e lungo termine conseguenze a livello fisiologici e comportamentali, ma i meccanismi coinvolti sono ancora poco chiari. Il nostro laboratorio ha sviluppato un modello murino di sindrome post-MI che visualizza ridotta funzionalità cardiaca, perdita neuronale nel sistema limbico, deficit cognitivi e segni comportamentali di depressione. A livello neuronale, caspasi-3 attivazione media post-MI apoptosi in diverse regioni limbiche, come l'amigdala - picco di 3 giorni post-MI. Disturbi cognitivi e comportamentali compaiono 2-3 settimane post-MI e questi correlazione statisticamente con misure di caspasi-3 attività. Il protocollo qui descritto è usato per indurre MI, raccogliere tessuti dell'amigdala e misurare caspasi-3 attività utilizzando spettrofluorimetria. Per indurre MI, la coronaria discendente è occlusa per 40 min. Il protocollo per la valutazione della caspasi-3 attivazione inizia 3 giorni dopo MI: i ratti vengono sacrificati e l'amigdala isolato RAPIDLY dal cervello. I campioni vengono congelati rapidamente in azoto liquido e conservati a -80 ° C fino all'analisi attuale. La tecnica eseguita per valutare l'attivazione della caspasi-3 è basato sulla scissione di un substrato (DEVD-AMC) di caspasi-3, che rilascia un composto fluorogenica che può essere misurata mediante spettrofluorimetria. La metodologia è quantitativa e riproducibile ma l'attrezzatura necessaria è costosa e la procedura per quantificare i campioni richiede tempo. Questa tecnica può essere applicata ad altri tessuti, quali il cuore e reni. DEVD-AMC può essere sostituito da altri substrati per misurare l'attività di altre caspasi.

Introduction

Caspasi o proteasi aspartato-diretto cisteina-dipendenti sono una famiglia di enzimi che sono coinvolti in vari omeostasi processess ^1. Caspasi possono essere classificati in base ai loro ruoli in apoptosi o infiammazione. Caspase-1, -4, -5 e -12 sono coinvolte nel processo infiammatorio, mentre coloro che sono impegnati in apoptosi può essere sotto-classificate come caspasi iniziatrici (caspasi-8 e -9) e caspasi boia (caspasi-3, -6 e -7 ).

Caspasi svolgono ruoli significativi in ​​molte patologie, soprattutto nei disordini in cui l'apoptosi può essere eccessivo, come osservato dopo infarto miocardico (IM) o ischemia cerebrale.

Nel modello murino di sindrome post-MI utilizzata nel nostro laboratorio, è accertato che si attiva caspasi-3, non solo nel miocardio ^2, ma anche nel sistema limbico, che è implicato nel controllo dell'umore e le emozioni ^3-6. Si è anche visto che è attivato caspasi-3 in diverse regionidel sistema limbic, come l'amigdala e ippocampo, e questa attivazione picchi intorno 3 giorni dopo insulto ischemico ^4. È interessante notare che, caspasi-3 attività si correla con i danni comportamentali post-MI, e la sua attenuazione attraverso interventi farmacologici e nutrizionali riduce queste lesioni, suggerendo un possibile legame tra caspasi-3 e post-MI depressione ^7-12.

Caspasi-3 attivazione può essere misurata mediante varie tecniche. Western blotting accerta le proprietà enzimatiche delle caspasi e può rilevare enzimi attivi e le loro forme pro-enzima. Western blotting, tuttavia, è semi-quantitativo, e piccole variazioni può essere perso attraverso rapporti deboli segnale-rumore ^13. Una tecnica migliore è basato sulla scissione di un substrato (DEVD-AMC) di caspasi-3 che rilascia un composto fluorogenica e può essere misurata mediante spettrofluorimetria. Caspasi-3 attivazione è un indicatore affidabile di apoptosi. Misura di apoptosi can instabile perché la finestra di tempo di occorrenza è breve, e le cellule confinanti possono fagocitare corpi apoptotici o celle ^14. L'apoptosi può essere ulteriormente confermata da altre tecniche, come Terminal deossinucleotidil transferasi etichettatura fine dUTP nick (TUNEL) test, che rileva la frammentazione del DNA risultante da cascate apoptotici segnalazione ^{6, o} il rapporto di proteine ​​pro / anti-apoptotico, come Bax / Bcl2 ^6.

Protocol

Gli animali sono trattati in conformità al regolamento del comitato locale di cura degli animali, in conformità con le linee guida del Consiglio canadese cura degli animali. I ratti sono alloggiati individualmente in condizioni costanti (temperatura di 21-22 ° C e l'umidità del 40-50%), tra cui un 12 hr ciclo luce-buio, con inizio alle 08:00. Pellet Chow e acqua di rubinetto sono disponibili ad libitum durante lo studio. Un periodo di acclimatazione di 3 giorni dopo la consegna da parte del fornitore è consentito prima dell'esperimento. Ratti maschi Sprague-Dawley di peso compreso tra 300-800 g sono stati regolarmente utilizzati con questo protocollo.

1. MI Chirurgia

1. Indurre anestesia con iniezioni intraperitoneali di ketamina 60 mg / kg e xilazina 10 mg / kg. Verificare il corretto anestesia dall'assenza di riflessi quando le zampe sono schiacciati.
2. Shave sito chirurgico. Intubare ratto con tubo endotracheale: catetere (16G 1.77 pollici) e porre animali in decubito laterale. Mettere gli animali su una piastra elettrica per mantenere la temperatura intorno ai 37 ° C. Collegare il tubo endotracheale per Isoflurano 2%.
3. Preparare sito chirurgico con clorexidina gluconato e alcool isopropilico. Durante l'intervento chirurgico, utilizzare guanti sterili e strumenti sterilizzati. Applicare pomata oftalmica per entrambi gli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. Mettere campo sterile su animali e gli strumenti su un altro campo sterile accanto all'animale.
4. Incidere la pelle con bisturi # 10. Staccare il tessuto muscolare con un morsetto emostatico. Posto l'animale in decubito ventrale. Aperto parete toracica con una pinza e la posizione emostatico divaricatore petto. Aprire pericardio con un morsetto emostatico.
5. Per produrre l'occlusione coronarica, un anello 360 mm lungo sutura di seta 4-0 intorno all'arteria coronaria discendente, passando attraverso il tessuto miocardico contigua. Inserire entrambe le estremità della sutura di seta in un 14G, 1,25 cm lungo tubo di plastica.
6. Tirare entrambe le estremità della sutura di seta e push il tubo obliquo contro l'arteria per occludere esso, per 40 min. Occlusione sicuro, fissando il tubo di plastica con un morsetto emostatico.
7. Dopo 40 min, rilasciare l'occlusione rilasciando il morsetto emostatico, seguita dalla rimozione del tubo flessibile e seta sutura.
   Nota: ratti di controllo Sham subiscono la stessa procedura chirurgica meno l'occlusione dell'arteria coronaria.
8. Prima di chiudere la parete toracica, posizionare un catetere flessibile (18G, 4,5 cm) attraverso la cavità toracica per aspirare aria dal torace con una siringa da 5 ml per evitare pneumotorace.
9. Chiudi torace cavità con 2-0 sutura, punto il muscolo con 4-0 sutura di seta e la pelle con 3-0 sutura di seta.
10. Prima di chiudere l'ultimo punto pelle, ancora aspirare aria dal torace con siringa da 5 ml attraverso il catetere posizionato precedentemente nella cavità toracica.
11. Suturare ultimo punto pelle. Smettere di ventilazione isoflurano.
12. Monitorare ratto risveglio. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha regained coscienza sufficiente per mantenere decubito sternale.
13. Trattare rat ogni 8 ore per 24 ore con un analgesico (buprenorfina, 0,05 mg / kg ip), e con un antibiotico (una dose singola di duplocillin, 0,2 mg / kg ip).
14. Dopo l'intervento chirurgico, i ratti casa individualmente fino al momento del sacrificio, cioè, 3 giorni dopo l'MI.
15. Infartuale, principalmente necrosi, è espressa come percentuale di tessuto infartuato nella zona a rischio del ventricolo sinistro. Questo può misurato con trifeniltetrazolio colorazione ^11.

2. Amygdala Isolamento

1. Mettere la testa di animale prima in una borsa a forma di cono, con il suo naso sporgente dell'apertura estremità più stretta. Ratto sicura per evitare qualsiasi movimento. Posizionare la testa in modo appropriato sulla ghigliottina, tra le lame delle forbici. Decapitate animale.
2. Inserire la testa del topo in un piatto tenuta in ghiaccio tritato. Eseguire tutte le procedure per l'isolamento dei tessuti su ghiaccio tritato (4 ° C).
3. Tagliare sk apertoull con le forbici, staccare con cura guaine ossei con Rongeurs osso tirando ed evitando mutilare il tessuto sottostante.
4. Posizionare la lama piatta di una spatola tra il fondo del cranio e la superficie ventrale posteriore del cervello e staccare accuratamente cervello dai cranio spingendo delicatamente la lama in avanti lungo la parte inferiore del cranio, fino al cervello può essere lentamente sollevato dal cranio. Eliminare il cranio.
5. Posizionare cervello sulla sua superficie dorsale. Identificare ipotalamo (struttura di fronte cervelletto) e tagliare il cervello coronale di fronte alla sua estremità anteriore e dietro la sua estremità posteriore; scartare le parti anteriore e posteriore del cervello se non necessario per altri usi.
6. Visualizza le amigdale come piccole sfere di sotto dei lobi temporali, a livello bilaterale, proprio accanto l'ipotalamo.
7. Capovolgere il piano cervello alla sua estremità anteriore, superficie dorsale dalla sperimentatore.
8. Inizia con il lato sinistro o destro del cervello. Separare la emisfere e quindi la corteccia dal amigdala contigua. Tagliare modo circa 8 mm di questa corteccia sciolto per consentire l'isolamento dell'amigdala. Tagliare amigdala con bisturi.
9. Isolare la parte basolaterale dell'amigdala dalla sua parte centromedial tagliando lungo la sutura scura che l'attraversa, quasi metà e metà. Questa struttura non è sempre facilmente identificabili.
10. Mettere sottoparti amigdala in fiale identificati separati e tenere su ghiaccio tritato.
11. Procedura dissezione Ripeti con l'altro emisfero.
12. Immergere le fiale in azoto liquido per 1 min. Tenere fiala in -80 ° C freezer fino al momento.

3. caspasi-3 Attività

1. Preparare tampone di lisi con 0,32 M di saccarosio, 1% Triton-X-100, 10 mM di Tris-HCl, pH 8, 5 mM di acido etilendiamminotetraacetico, 2 mM di ditiotreitolo, 1 mM di fluoruro phenylmethylsulfonyl, 10 mg / mL di leupeptina , 10 mg / mL di pepstatina A e 10 mg / mL di aprotinina.
2. Aggiungere 150 ml di tampone di lisi per ogni campione (5-10 mg). Continuate a ghiaccio. Sonicare ogni campione in ghiaccio per 5 secondi a massima intensità (40 W). Incubare tessuto in tampone di lisi in ghiaccio per 30 min. Vortex ogni campione per 5 min.
3. Eseguire 3 cicli di congelamento / scongelamento collocando alternativamente campioni in azoto liquido e su una piastra di riscaldamento termostatato a 37 ° C. Tessuto Centrifugare a 13.000 g (4 ° C) per 10 min. Rimuovere con attenzione il surnatante e tenere in provetta su ghiaccio.
4. Preparare concentrazioni di proteine ​​standard tra 0 e 10 ug / ml con albumina di siero bovino. Preparare spazi vuoti con il solo tampone.
5. Aggiungere 200 ml di Bradford reagente ogni standard. Leggi di serie a 595 nm. Per livelli di proteine, aggiungere 5 ml di campione surnatante a 795 ml di acqua distillata e 200 ml di Bradford reagente. Leggi ogni campione a 595 nm e quantificare proteina con curva standard.
6. Preparare tampone di reazione con 50 mM Tris-HCl, pH 7, 5 mM MgCl _{2 <}/ sub>, 1 mM di glicole etilenico tetraacetico, 0,1% di 3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate e 1 mM di ditiotreitolo.
7. Aggiungere 25 mg di proteine ​​di tampone di reazione e caspasi-3 substrati per ottenere campioni reattivi positivi e negativi. Per i campioni negativi, aggiungere tampone di reazione, 25 mg di proteine, 0,4 ml di Ac-DEVD-CHO 800 micron e 0,8 ml di Ac-DEVD-AMC 10 mm. Per i campioni positivi, aggiungere 25 mg di proteina per tampone di reazione e 0,8 ml di Ac-DEVD-AMC 10 mm. Elaborare tutti i campioni negativi e positivi in ​​triplice copia. Completare il volume finale di ciascun campione fino a 200 ml aggiungendo tampone di reazione.
8. Produrre controlli negativi con l'aggiunta di 188,7 ml di buffer di reazione a 0,5 l di Ac-DEVD-CHO 800 micron, 0,8 microlitri Ac-DEVD-AMC 10 mm e 10 ml di tampone di lisi. Per i controlli positivi, aggiungere 189.2 ml di tampone di reazione, 0,8 ml di Ac-DEVD-AMC 10 mm e 10 ml di tampone di lisi.
9. Incubare i campioni econtrolli al buio per 3 ore a 37 ^{° C.}
10. Arrestare reazione con 600 microlitri glicina 0,4 M e 0,4 M NaOH (pH 10) in ciascun campione e controllo.
11. Quantificare fluorescenza spettrofluorimetria a eccitazione lunghezza d'onda di 365 nm ed emissione lunghezza d'onda di 465 nm. Aggiungere 2 ml di acqua distillata a reazione in cuvetta vetro. Leggi i controlli ei campioni per 10 secondi con 1 punto in ogni sec.
12. Quantificare attività specifica in ciascun campione: ((fluorescenza di campioni negativi meno fluorescenza dei campioni positivi) x il volume di 2,8 ml) diviso per (tempo di incubazione 3 ore x quantità di proteine ​​25 mg).

Representative Results

L'amigdala è stato isolato in 8 sham (controllo) e 8 MI ratti tre giorni dopo l'induzione del protocollo ischemia / riperfusione. Caspasi-3 è stata misurata l'attività in questo tessuto utilizzando un fluorocromo che può essere scisso dalla caspasi-3 attiva e rilevato da spettrofluorimetria. Misure positive e negative (vedere i passi 3.11, 3.12 e 3.16) sono stati eseguiti in triplice copia e misurate durante 10 secondi, con 1 punto in ogni sec. Differenze tra controlli positivi e negativi sono stati calcolati e la media delle differenze per tutti i tessuti sham eseguita durante questo esperimento è stato fissato a 100%. I risultati di ratti MI sono stati regolati secondo questo riferimento e Figura 1 illustra i risultati finali: indica un'attività significativamente maggiore nei ratti MI rispetto a sham (p <0,05).

Figura 1. Caspase-3attività dell'amigdala di ratti MI, espresso come percentuale dell'attività media nei controlli farsa, impostato a 100% (8 ratti per gruppo). * Indica una differenza significativa tra i gruppi (p <0,05). I dati sono espressi come media ± SEM.

Discussion

La nostra esperienza con questo protocollo nel corso degli ultimi 10 anni ha portato all'identificazione di questioni metodologiche critiche. Innanzitutto, rapida dissezione cervello in piastre di Petri su ghiaccio tritato è importante per mantenere la qualità di preparazione. In secondo luogo, si deve tener presente che il tessuto è più breve sonicazione per l'amigdala cerebrale rispetto ad altri tipi di tessuti, quali il cuore (10 sec) o reni (20 sec). In terzo luogo, grande attenzione deve prestare attenzione a miscelare con cura il substrato prima di aggiungerlo ai campioni. Abbiamo incontrato i segnali variabili quando la sequenza di miscelazione è stata inadeguata. Quarto, nessun bolle devono essere presenti nella cella di quarzo durante la lettura dei campioni. Altrimenti, il segnale potrebbe essere alterata.

Abbiamo fatto un cambiamento negli ultimi anni per aumentare la riproducibilità dei risultati: crescente volume del substrato per evitare volume inferiore 1 ml. Ancora, possono verificarsi piccole variazioni tra dosaggi successivi, e almeno 3 campioni di controllo devono essere utilizzati perControllo per le variazioni. Misure di fluorescenza di questi controlli viene calcolata la media e la media è fissato a 100%. Misure di fluorescenza in campioni sperimentali sono trasformati in percentuale dei campioni di controllo.

Un'altra limitazione della tecnica è che viene utilizzata solo una parte di tessuto e, quindi, della caspasi-3 attività potrebbe essere sottostimato. Infatti, la finestra temporale di apoptosi è breve in qualsiasi data cellula e potrebbe mancare anche se si verifica nelle zone limitrofe al momento del campionamento ^1,4,15. L'inverso è anche possibile: apoptosi potrebbe essere particolarmente intensa in porzioni di tessuto, con conseguente sovrastima della caspasi-3 attività. Si consiglia l'uso di tessuti rimanenti (amigdala) per le tecniche complementari, come test TUNEL o il rapporto Bax / Bcl2 (vedi introduzione).

Spettrofluorimetria ha almeno due vantaggi rispetto Western blotting. Innanzitutto, esso genera direttamente dati quantitativi. In secondo luogo, una misura enzimaticactivity se piuttosto che proteine ​​o RNA espressione, che può essere correlato, ed è noto che l'espressione della proteina può essere aumentata senza alcun cambiamento di attività enzimatica. Inoltre, spettrofluorimetria può essere eseguita su altri tessuti o con differenti specie animali e può essere regolato per altri sottotipi caspasi, con differenti substrati, tale che i confronti sicurezza può essere fatto.

In conclusione, questo documento illustra l'utilizzo di spettrofluorimetria per misurare caspasi-3 attività dell'amigdala, fornendo prove che l'apoptosi si verifica in questa regione del sistema limbic 3 giorni dopo MI.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectroflurometer	Photon technology Instrument (now Horiba)	Ratiomaster M-40	with DeltaRAM  Random Access Monochromator
Respirator	Harvard apparatus	683	small animal ventilation
Glass cuvette	NSG precision cells	3G10	Optical Glass (340-2,500 nm) 10 mm path
Sonicator	Cole Parmer	4710  series
Spectrometer	Varian	Cary 50 Bio