Caspase-3活性在鼠杏仁核测量用荧光分析法心肌梗死后

Abstract

心肌梗死（MI）具有在生理和行为水平显着中期和长期的后果，但所涉及的机制仍不清楚。我们的实验室已开发出心肌梗死后综合征，显示受损心脏的功能，在边缘系统的神经元丧失，认知障碍和抑郁的行为迹象的大鼠模型。在神经元水平，胱天蛋白酶-3的活化介导的MI后凋亡不同边缘区域，如杏仁核 - 3天达到峰值后心肌梗塞。认知和行为障碍出现2-3周后MI和这些与caspase-3的活性的措施相关统计学。这里描述的协议被用来诱发心肌梗死，收集杏仁核组织和使用荧光分光光度法测定caspase-3活性。为了诱导心肌梗死，所述下行冠状动脉被遮挡40分钟。该协议为caspase-3的活性评价心梗开始后第3天：被处死老鼠和杏仁核中分离RAPI从大脑DLY。样品迅速在液氮中冷冻并保持在-80℃直至实际分析。以评估的caspase-3的激活的技术是基于一个衬底（DEVD-AMC）由胱天蛋白酶-3，释放可通过荧光分光光度法来测量一个荧光化合物的裂解。该方法是定量的和可再现的，但所需要的设备是昂贵的，用于量化样品的过程是耗时的。这一技术可以应用到其他组织中，如心脏和肾脏。 DEVD-AMC可以通过其它基片代替，以测量其他胱天蛋白酶的活性。

Introduction

胱天蛋白酶或半胱氨酸依赖性天冬氨酸定向蛋白酶是一个家族参与各种稳态processess ^1中的酶。胱天蛋白酶可以根据其在细胞凋亡或炎症中的作用被广义地分类。胱天蛋白酶-1，-4，-5和-12参与炎症而那些从事凋亡可以分划为引发剂胱天蛋白酶（胱天蛋白酶-8，-9）和胱天蛋白酶刽子手（胱天蛋白酶-3，-6和-7 ）。

胱天蛋白酶在许多病理发挥显著的作用，主要表现在疾病，其中细胞凋亡能量过大，心肌梗死（MI）或脑缺血后观察到。

在我们的实验中使用的MI后综合征的大鼠模型中，经确定的caspase-3不仅在心肌²而且在其中牵涉情绪和情感^3-6的控制边缘系统激活。它还可以看出，caspase-3的不同区域被激活边缘系统，例如杏仁核和海马，以及局部缺血损伤后⁴约3天内，活化的峰。有趣的是，caspase-3的活性与心肌梗死后的行为障碍，并通过药理和营养干预其衰减减少这些伤害，提示caspase-3和心梗后抑郁^7-12之间可能存在的联系。

Caspase-3的活化可通过各种技术来测量。 Western印迹台确定胱天蛋白酶的酶活性，可检测活性酶以及它们的酶原形式。 Western印迹，但是，是半定量，和小的变化可以通过微弱的信号-噪声比¹³丢失。更好的方法是基于在基板（DEVD-AMC）的由胱天蛋白酶-3，释放一个荧光化合物，并且可以通过荧光分光光度法测量的裂解。 Caspase-3的活化是凋亡的可靠指标。细胞凋亡钙的测定n为不稳定的，因为发生的时间窗口短，和邻近细胞可以吞噬凋亡小体或细胞^14。凋亡可以通过其它技术，如末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）测定法来进一步证实，其检测从凋亡信号传导级联^6，或亲/抗凋亡蛋白的比率，如Bax的/得到的DNA片段BCL2 ^6。

Protocol

动物被遵守处理与当地动物护理委员会规定，按照加拿大委员会关于动物保护的准则。大鼠收容单独在恒定条件下（21-22ºC温度和湿度的40-50％），其中包括一个12小时黑暗的光周期，开始于上午08:00。周小球和自来水在整个研究可随意。的输送由供后3天的环境适应期，实验前是允许的。雄性SD大鼠间300-800克体重已经经常使用该协议。

1. MI手术

1. 诱导麻醉的氯胺酮60 mg / kg和赛拉嗪10mg / kg的腹膜内注射。通过无反射确认适当麻醉时，爪子被挤压。
2. 剃手术部位。插管大鼠气管内管：导管（16G1.77英寸），然后将动物侧卧位。放置在加热垫上动物保持温度37℃左右。连接气管内管异氟醚2％。
3. 准备手术部位与葡萄糖酸洗必泰和异丙醇。在手术过程中，使用无菌手套和消毒器械。应用眼药膏双眼防止干燥，而在麻醉下。把无菌区对动物和旁边的动物另一个无菌区的仪器。
4. 切开皮肤，手术刀片＃10。剥离肌肉组织用止血钳夹。发生在腹卧位动物。打开胸壁用止血钳和定位胸部拉钩。打开心包用止血钳夹。
5. 以产生冠状动脉阻塞，循环中的下行冠状动脉周围360毫米长的4-0丝线缝合，通过连续的心肌组织。插入丝线的两端成14G，1.25厘米长的塑料管。
6. 拉动丝线缝合及脓液的两端小时管向下靠着动脉以阻塞它，进行40分钟。安全闭塞夹紧塑料管与止血钳夹。
7. 40分钟后，通过释放止血钳，接着除去软管和丝线释放闭塞。
   注意：深水对照大鼠经历相同的手术过程减去冠状动脉的闭塞。
8. 前闭合胸壁，放置一个柔性导管（18G，4.5厘米）至胸腔将空气抽出胸部用5-ml注射器，以防止气胸。
9. 关闭胸腔腔2-0缝合，缝合肌肉用4-0丝线缝合，用3-0丝线缝合皮肤。
10. 前关闭最后一个皮肤点，再通过导管在胸部空腔先前放置抽离空气，用5-ml注射器的胸部。
11. 最后缝合皮肤点。停止异氟醚通气。
12. 监测大鼠的觉醒。不要让动物无人看管，直到它有倍健ð足够的意识，以保持胸骨斜卧。
13. 治疗的大鼠，每8小时24小时用镇痛药（丁丙诺啡，0.05毫克/千克IP）中，用抗生素（duplocillin的单次剂量，0.2毫克/千克IP）。
14. 手术后，房子只单独直到时间的牺牲， 即后3天心肌梗死。
15. 梗塞大小，主要坏死，表示为梗塞组织的该区域在左心室的风险比例。这可以通过使用三苯基着色¹¹测量。

2.杏仁核隔离

1. 首先将动物头锥形袋，用它的鼻子伸出的窄端光圈。安全的大鼠，以避免任何运动。上断头台正确地定位它的头，剪刀的刀片之间。斩首的动物。
2. 在培养皿中的老鼠的贴装头保持在碎冰。上执行碎冰（4℃）中组织分离的所有过程。
3. 剖开SKULL用剪刀，小心地拉起，避免下毁损的组织分离骨鞘骨咬骨钳。
4. 放置头骨底部和脑的后腹侧表面之间的刮刀的平头刀刃，并仔细分离大脑从颅骨轻轻沿头骨底部向前推动刀片直到大脑可以慢慢举起出的头骨。丢弃的头骨。
5. 将大脑在它的背部表面。确定下丘脑（结构小脑前），减少大脑冠在其前端的和后端的前后;丢弃大脑的前部和后部部分，如果没有必要用于其他用途。
6. 可视化的杏仁核小球颞叶下方，两侧，毗邻下丘脑。
7. 翻转大脑平在其正面年底，背水面离实验者。
8. 开始与脑的左侧或右侧。分开半球，然后从相邻的杏仁核皮层。切方式约8mm这种松散皮质以允许扁桃体的隔离。切掉扁桃体与手术刀。
9. 通过沿暗缝线横跨它运行时，几乎各半切割隔离从其centromedial部扁桃体的基底部分。这种结构并不总是容易辨认。
10. 将杏仁核子部分单独确定的小瓶中，并保持在碎冰。
11. 重复解剖过程与其他半球。
12. 浸入液氮小瓶1分钟。保持小瓶在-80℃的冰箱中待用。

3，caspase-3活性

1. 制备裂解缓冲液与蔗糖的0.32M，1％的Triton-X-100的Tris-HCl，pH值8，5mM的乙二胺四乙酸，二硫苏糖醇的2毫米，苯甲基磺酰氟1mM的，10微克/微升亮肽素的10毫和10微克/微升胃蛋白酶抑制素A的10微克/μL抑肽酶。
2. 添加150微升裂解缓冲液至每个样品（5-10毫克）。置于冰上。超声处理在冰上每个样品进行5秒，最大强度（40瓦）。孵育组织在裂解缓冲液在冰上30分钟。涡旋每个样品5分钟。
3. 通过将样本交替地在液氮中，并在恒温控制的加热板设定为37℃，进行3次冷冻/解冻循环。在13000克离心机组织（4 ℃）10分钟。小心取出上清液，保持管冰。
4. 制备在0和10微克/毫升牛血清白蛋白标准品的蛋白浓度。准备空白，只有缓冲区。
5. 加入200μlBradford试剂到每个标准。阅读在595nm处的标准。对于蛋白水平，加入5微升样品上清液至795微升蒸馏水和200μl的Bradford试剂的。读每个样品在595nm处并量化蛋白标准曲线。
6. 准备反应缓冲液，用50mM的Tris-HCl，pH值7，5mM的_MgCl 2的的_</次>，乙二醇四乙酸为1mM，3-胆酰胺丙基0.1％）二甲基铵基] -1-丙磺酸盐和二硫苏糖醇1mM的。
7. 补充蛋白质的25微克至反应缓冲液和caspase-3底物，以获得正和负反应性样品。对于阴性样品中，添加反应缓冲液，25微克蛋白质，0.4微升AC-DEVD-CHO 800μM和0.8微升AC-DEVD-AMC的10mM的。对于阳性样品，加25微克蛋白质反应缓冲液和0​​.8微升AC-DEVD-AMC的10mM的。处理所有阴性和阳性样品一式三份。通过添加反应缓冲液完成每个样品的最终体积达到200微升。
8. 通过加入188.7微升反应缓冲液0.5微升AC-DEVD-CHO 800微米的，0.8微升AC-DEVD-AMC的10mM和10μl的裂解缓冲液产生阴性对照。对于阳性对照，加入189.2微升反应缓冲液，0.8微升AC-DEVD-AMC的10mM和10μl的裂解缓冲液。
9. 孵育样品和在^37℃。在黑暗中3小时对照
10. 停止与600微升甘氨酸0.4 M和氢氧化钠0.4 M（pH为10），每个样品和控制反应。
11. 荧光定量荧光分光光度法在365 nm，发射465纳米波长的激发波长。加入2毫升蒸馏水，以在玻璃试管反应。阅读对照和样品10秒，1分每一秒。
12. 量化具体活动每个样品中：（（阴性样品减去阳性样品的荧光）2.8毫升×容积荧光）由（的蛋白质25毫克孵化3小时×数量时）划分。

Representative Results

扁桃体分离出8假（对照）和8 MI大鼠缺血/再灌注协议诱导后三天。使用可以由活性的caspase-3被裂解并通过荧光分光光度法检测出的荧光caspase-3的活性测定在这个组织上。正和负的测量（见步3.11，3.12和3.16），一式三份在10秒进行测量和，用1点在每个秒。阳性和阴性对照之间的差异，计算和的差异为这个实验期间进行的所有假组织的平均设定在100％。结果从MI大鼠根据本参考文献被缩放的， 图1示出了最后的结果：它表明相比假（P <0.05）中的MI大鼠显著更高的活性。

图1. Caspase-3的在心肌梗死大鼠杏仁核活性，表示为平均活性的假对照百分比，设定为100％（8只大鼠每组）。 *表示显著的组间差异（P <0.05）。数据表示为平均值±SEM表示。

Discussion

我们与此协议在过去10年的经验导致了关键的方法问题的鉴定。首先，在碎冰上培养皿快速大脑解剖重要的是要保持制剂的质量。第二，必须认识到，组织超声处理较短的脑杏仁核相对于其他类型的组织，如心脏（10秒）或肾脏（20秒）。第三，大应注意在添加到样品之前仔细混合基板。我们遇到变量信号当混合顺序是不充分的。第四，读取样品时无气泡应该存在于石英池中。否则，该信号可能被改变。

我们提出在过去的几年中的变化，以增加可重复性的结果：增加衬底体积，以避免体积小于1微升。仍然，小变化可以连续测定之间发生，和至少3个对照样品应当用于控制的变化。这些控件的荧光措施被平均，平均为100％。实验样品在荧光措施转化在对照样品的百分比。

该技术的另一个限制是，组织只有一部分使用，因此，caspase-3的活性可能被低估。事实上，细胞凋亡的时间窗口短于任何给定的细胞，即使它出现在相邻区域处的采样^1,4,15的时间可能被错过。反过来也是可能的：细胞凋亡可能是在组织中的某些部分特别强烈，导致胱天蛋白酶-3活性的高估。我们建议使用剩余的组织（杏仁核）的互补性技术，如TUNEL法或Bax蛋白/ Bcl2的比例（参见导言）的。

荧光分析法具有至少两个优点Western印迹。首先，它直接生成的量化数据。第二，它可以测量酶促一个ctivity本身而不是蛋白质或RNA的表达，这可能是不相关的，并且已知的是蛋白表达可以在没有中酶活性的任何变化增加。此外，荧光分光光度法可以在其它组织或用不同的动物物种中进行，并且可以为其它蛋白酶亚型进行调节，以不同的底物，从而使安全可以用比较的。

总之，本文件说明了如何使用荧光分光光度法来测量胱天蛋白酶-3活性在杏仁核，提供凋亡发生在边缘系统的这个区域的MI后3天的证据。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectroflurometer	Photon technology Instrument (now Horiba)	Ratiomaster M-40	with DeltaRAM  Random Access Monochromator
Respirator	Harvard apparatus	683	small animal ventilation
Glass cuvette	NSG precision cells	3G10	Optical Glass (340-2,500 nm) 10 mm path
Sonicator	Cole Parmer	4710  series
Spectrometer	Varian	Cary 50 Bio