Активность каспазы-3 в миндалевидного тела крыс Измеряется спектрофлюориметре после инфаркта миокарда

Abstract

Инфаркт миокарда (ИМ) имеет драматические средне- и долгосрочные последствия на физиологических и поведенческих уровнях, но механизмы, участвующие по-прежнему неясны. Наша лаборатория разработала крысиной модели синдрома после ИМ, который отображает нарушениями сердечной функции, потерю нейронов в лимбической системе, познавательные дефициты и поведенческие признаки депрессии. В нейронов уровне, каспазы-3 активации посредником после MI апоптоз в различных лимбических регионах, таких как миндалины - с максимумом на 3-й день после ИМ. Когнитивные и поведенческие нарушения появляются через 2-3 недели после инфаркта миокарда, и эти корреляции статистически с мерами каспазы-3. Протокол, описанный здесь, используется, чтобы вызвать инфаркт миокарда, собирать миндалины ткани и измерить активность каспазы-3 с использованием спектрофлюориметре. Для индукции MI, нисходящая коронарной артерии окклюзии в течение 40 мин. Протокол оценки каспазы-3 активации начинается через 3 дня после инфаркта миокарда: крыс забивали и миндалевидное тело изолированы RAPIжественной от мозга. Образцы быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° С до фактического анализа. Методика Для оценки каспазы-3 активацию на основе расщепления субстрата (DEVD-AMC) по каспазы-3, который выпускает флуорогенный соединение, которое может быть измерено на спектрофлюориметре. Методология количественной и воспроизводимым, но оборудование, необходимое является дорогостоящим и процедура количественной оценки образцов отнимает много времени. Этот метод может быть применен к другим тканей, таких как сердце и почки. DEVD-AMC могут быть заменены другими субстратами для измерения активности других каспаз.

Introduction

Каспазы или цистеин-зависимых аспартат-протеазы направлены семья ферментов, которые участвуют в различных гомеостаза ПРОЦЕССОВ ^1. Каспазы можно подразделить в соответствии с их ролями в апоптозе или воспаления. Каспазы-1, -4, -5 и -12 участвуют в воспалении, тогда как те, кто занимается апоптоза может быть подразделены на инициатора каспаз (каспазы-8 и -9) и палач каспазы (каспазы-3, -6 и -7 ).

Каспазы играют важную роль во многих патологий, в основном, в котором апоптоз расстройств может быть чрезмерным, так как наблюдается после инфаркта миокарда (ИМ) или ишемией головного мозга.

В крысиной модели синдрома после инфаркта миокарда, используемой в нашей лаборатории, будет установлено, что каспазы-3 активируется не только в миокарде ^2, но и в лимбической системы, которая участвует в контроле настроения и эмоций ^3-6. Видно также, что каспазы-3 активируется в различных регионахлимбической системы, такие как миндалины и гиппокампа, и эта активация пиков около 3 дней после ишемического инсульта ^4. Интересно, что активность каспазы-3 коррелирует с постинфарктных поведенческих нарушений, и ее затухание через фармакологических вмешательств и питательные уменьшает эти травмы, предполагая возможную связь между каспазы-3 и пост-MI депрессии ^7-12.

Каспазы-3 активации может быть измерена с помощью различных методик. Вестерн-блоттинг констатирует ферментативные свойства каспаз и может обнаружить активные ферменты, а также их про-фермента формы. Вестерн-блоттинга, однако, полу-количественная и небольшие изменения могут быть потеряны через слабые соотношениях ¹³ сигнал-шум. Более методика основана на расщеплении субстрата (DEVD-AMC) по каспазы-3, которая выпускает флуорогенный соединение и может быть измерена на спектрофлюориметре. Каспазы-3 активации является надежным маркером апоптоза. Измерение апоптоза окп неустойчиво, потому что время появления окна коротка, а соседние клетки могут фагоцитируют апоптоза клеток тела или ^14. Апоптоз может быть дополнительно подтверждено другими методами, такими как терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы дУТФ ник конец маркировка (TUNEL) анализа, который обнаруживает фрагментацию ДНК в результате апоптоза сигнальных каскадов ^6, или отношение про- / Антиапоптозный белков, таких как Bax / Bcl2 ^6.

Protocol

Животные обрабатываются в соответствии с постановлением местного комитета по уходу за животными, в соответствии с Руководством Канадского совета по уходу за животными. Крысам помещают отдельно при постоянных условиях (температура 21-22 ° С и влажность 40-50%), в том числе 12 ч темно-светло-цикл, начиная с 08:00. Чау гранулы и водопроводную воду можно вволю на протяжении всего исследования. Период акклиматизации 3 дней после родов со стороны поставщика допускается до эксперимента. Самцов крыс Sprague-Dawley весом 300-800 г между были обычно используется с этим протоколом.

1. М. Хирургическое

1. Индуцировать анестезию с внутрибрюшинных инъекций кетамина 60 мг / кг и ксилазина 10 мг / кг. Подтвердите правильное обезболивания отсутствием рефлекса, когда лапы прижаты.
2. Бритье хирургического сайт. Интубировать крысу эндотрахеальной трубки: катетер (16G 1,77 дюйма) и поместите животное в боковом положении пролежни, Поместите животных на грелку, чтобы поддерживать температуру около 37 ° C. Подключите трубки эндотрахеальной в Isoflurane 2%.
3. Подготовьте место операции с глюконата хлоргексидина и изопропилового спирта. Во время операции, использовать стерильные перчатки и стерилизованные инструменты. Применить глазной мази в оба глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом. Положите стерильное поле на животных и инструментов на другой стерильной поле рядом с животным.
4. Надрезать кожу скальпелем # 10. Лупиться мышечной ткани с гемостаза зажима. Поместите животное в брюшной позиции пролежни. Открыть грудной стенки с гемостаза зажим и положение груди втягивающим. Открыть перикарда с гемостаза зажима.
5. Для получения окклюзии коронарной артерии, петля 360 мм длиной 4-0 шелковой нити вокруг нисходящей артерии, проходя через ткани миокарда смежных. Вставьте оба конца шелковой нити в 14G, 1,25 см длинной пластиковой трубкой.
6. Потяните оба конца шелковой нити и гнояч трубка вниз против артерии для окклюзии его, в течение 40 мин. Безопасный окклюзия зажима пластиковую трубку с зажимом гемостаза.
7. Через 40 мин, отпустите окклюзии, выпустив кровоостанавливающее зажим, с последующим удалением гибкой трубки и шелковой нитью.
   Примечание: Sham контрольные крысы пройти тот же хирургическую процедуру минус окклюзии коронарной артерии.
8. Перед закрытием грудной стенки, поместите гибкий катетер (18G, 4,5 см) через грудной полости, чтобы привлечь воздух из грудной клетки с 5 мл шприц, чтобы предотвратить пневмоторакс.
9. Закрыть грудная клетка полость с 2-0 шва, сшить мышцы с 4-0 шелковой нити и кожу 3-0 шелковой нити.
10. Перед закрытием последнюю точку кожи, раз обратить воздух из грудной клетки с 5-мл шприц через катетер, введенный ранее в полости грудной клетки.
11. Шовный последнюю точку кожи. Стоп ИФ вентиляцию.
12. Монитор крыс пробуждение. Не оставляйте без присмотра животное, пока он не имеет Regained достаточно, чтобы поддерживать сознание грудины лежачее положение.
13. Treat крысе каждый 8 ч в течение 24 ч с анальгетик (бупренорфин, 0,05 мг / кг внутрибрюшинно) и с антибиотиком (разовой дозы duplocillin, 0,2 мг / кг внутрибрюшинно).
14. После операции, крыс дома индивидуально до времени жертвы, т.е. 3 дня после ИМ.
15. Инфаркт размер, главным образом, некроз, выражается как доля инфаркта ткани в зоны риска левого желудочка. Это может измеряется с помощью трифенилтетразолия окраску ^11.

2. Изоляция миндалевидного

1. Поместите головку животных сначала в форме конуса мешок с его нос, выступающий из узкого конца апертуры. Безопасный крыса, чтобы избежать любого движения. Расположите голову соответствующим на гильотине, между лопатками ножницами. Обезглавьте животное.
2. Место глава крысы в ​​блюдо продолжал колотым льдом. Выполните все процедуры для изоляции тканей на дробленый лед (4 ° C).
3. Разрежьте SKУлла с ножницами, осторожно отделить кости оболочки с Кость Рейнджерс, потянув вверх и избежать калеча ткани под ней.
4. Поместите плоскую лопасть шпателем между нижней части черепа и задней вентральной поверхности мозга и тщательно отделить мозг от черепа, осторожно толкает лопасть вперед вдоль нижней части черепа, пока мозг не может быть постепенно поднимается вверх из череп. Откажитесь от черепа.
5. Поместите мозг на его спинной поверхности. Определить гипоталамус (структура в передней части мозжечка) и сократить мозг коронки перед его переднем конце и за ее заднему концу; отказаться от передней и задней части мозга, если он не нужен для других целей.
6. Визуализируйте миндалины как небольшие сферы под височных долях, на двусторонней основе, в непосредственной близости от гипоталамуса.
7. Переверните квартиру мозга на его фронтальной конце концов, спинной поверхности от экспериментатора.
8. Начнем с левой или правой стороне мозга. Отделите Hemiсферы и затем коры из смежных миндалины. Вырезать пути около 8 мм этой свободной коры, чтобы изоляция миндалины. Срежьте миндалину скальпелем.
9. Изолировать базолатеральных часть миндалины с его centromedial части путем разрезания вдоль темной нити, которая проходит через него, почти половина на половину. Эта структура не всегда легко идентифицировать.
10. Положите миндалина подразделы в отдельных выявленных флаконах и держать на дробленый лед.
11. Повторите процедуру вскрытия с другом полушарии.
12. Погружают флаконы в жидком азоте в течение 1 мин. Держите флакон в -80 ° C морозильнике до использования.

3. активность каспазы-3

1. Подготовка буфера для лизиса 0,32 М сахарозы, 1% Triton-X-100, 10 мМ Трис-HCl, рН 8, 5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, 2 мМ дитиотреитола, 1 мМ фторофенилметилсульфонил, 10 мкг / мкл лейпептина , 10 мкг / мкл пепстатина А и 10 мкг / мкл апротинина.
2. Добавить 150 мкл буфера для лизиса к каждому образцу (5-10 мг). Держите на льду. Разрушать ультразвуком каждый образец на льду в течение 5 сек при максимальной интенсивности (40 Вт). Инкубируйте ткани в буфере для лизиса на льду в течение 30 мин. Вихревой каждый образец в течение 5 мин.
3. Выполнение цикла 3 циклов замораживание / оттаивание путем размещения образцов поочередно в жидком азоте и на термостатированного нагревательной пластины, установленной при 37 ° С. Центрифуга ткани при 13000 г (4 ° С) в течение 10 мин. Осторожно снимите супернатант и держать в трубке на льду.
4. Подготовка стандартных концентрации белка от 0 до 10 мкг / мл с бычьим сывороточным альбумином. Подготовка заготовок с только буфером.
5. Добавить 200 мкл реагента Брэдфорд каждого стандарта. Читайте стандарт на 595 нм. Для уровней белка, добавить 5 мкл образца супернатанта до 795 мкл дистиллированной воды и 200 мкл реагента Брэдфорда. Read каждого образца при 595 нм и количественно белок с калибровочной кривой.
6. Получают буфер реакции 50 мМ Трис-HCl, рН 7, 5 мМ _MgCl 2 в _</ суб>, 1 мМ этиленгликоль тетрауксусной кислоты, 0,1% 3-холамидопропил) диметиламмонио] -1-пропансульфонат и 1 мМ дитиотреитола.
7. Добавить 25 мкг белка реакционного буфера и каспазы-3 субстратов для получения положительных и отрицательных реактивных образцов. Для отрицательных образцов, добавить буфер для реакции, 25 мкг белка, 0,4 мкл Ас-DEVD-СНО 800 мкм и 0,8 мкл Ас-DEVD-АМС 10 мМ. Для положительных образцов, добавить 25 мкг белка в реакционном буфере и 0,8 мкл Ас-DEVD-АМС 10 мМ. Процесс все негативные и позитивные образцы в трех экземплярах. Заполните конечного объема каждого образца до 200 мкл добавлением буфера реакции.
8. Производят отрицательные контроли при добавлении 188,7 мкл реакционного буфера до 0,5 мкл Ac-DEVD-CHO 800 мкм, 0,8 мкл Ac-DEVD-AMC 10 мм и 10 мкл буфера для лизиса. Для положительного контроля, добавить 189,2 мкл реакционного буфера, 0,8 мкл Ac-DEVD-AMC 10 мм и 10 мкл буфера для лизиса.
9. Выдержите образцы иуправления в темноте в течение 3 ч при 37 ^{о С.}
10. Остановка реакции с 600 мкл 0,4 М глицина и NaOH 0,4 М (рН 10) в каждом образце и контроля.
11. Количественно флуоресценции при длине волны спектрофлюориметре возбуждения 365 нм и длина волны излучения 465 нм в. Добавить 2 мл дистиллированной воды реакции в стеклянной кювете. Читайте образцы и контроли в течение 10 сек с 1 точки в каждой сек.
12. Количественно специфическую активность в каждом образце: ((флуоресценции отрицательных образцов минус флуоресценции положительных образцов) х объем 2,8 мл), разделенных (время инкубации 3 ч х количество белка 25 мг).

Representative Results

Миндалина был выделен в 8 обман (управления) и 8 ПБ крыс три дня после индукции протокола ишемии / реперфузии. Активность каспазы-3 была измерена в этой ткани с использованием флуорохром, которые могут расщепляться активного каспазы-3 и обнаруженный на спектрофлюориметре. Положительные и отрицательные измерения (см шаги 3.11, 3.12 и 3.16) были выполнены в трех экземплярах и измеряется в 10 сек, 1 очко в каждой сек. Различия между положительным и отрицательным контролем были вычислены и среднее значение разностей для всех мнимого ткани, выполненной в течение этого эксперимента был установлен на уровне 100%. Результаты ИМ крыс масштабируется в соответствии с этой ссылкой и Рисунок 1 иллюстрирует окончательные результаты: это указывает на значительно более высокую активность в MI крыс по сравнению с обманом (р <0,05).

Рисунок 1. каспазы-3деятельность в миндалине М. И. крыс, выраженная в процентах от средней активности в контроле фиктивных, устанавливается на 100% (8 крыс в каждой группе). * Указывает существенное различия между группами (р <0,05). Данные представлены в виде среднего ± SEM.

Discussion

Наш опыт работы с этим протоколом в течение последних 10 лет привели к выявлению критических методологических вопросов. Во-первых, быстрое рассечение мозга в чашке Петри на дробленый лед является важным для поддержания качества подготовки. Во-вторых, необходимо понимать, что ткани ультразвуком короче для головного миндалины по сравнению с другими типами тканей, таких как сердце (10 сек) или почек (20 сек). В-третьих, большое внимание должно быть принято, чтобы тщательно перемешать субстрат перед добавлением его к образцам. Мы столкнулись переменных сигналов, когда смешивание последовательность была недостаточной. В-четвертых, не было пузырей должен присутствовать в кварцевую кювету при чтении образцы. В противном случае, сигнал может быть изменен.

Мы внесли изменения в последние несколько лет, чтобы увеличить воспроизводимость результатов: увеличение объема субстрата, чтобы избежать объем менее 1 мкл. Тем не менее, небольшие изменения могут возникать между последовательными анализами, и по крайней мере 3 контрольные образцы должны быть использованы дляуправления изменениями. Флуоресцентные меры этих элементов управления в среднем и средняя установлен на 100%. Флуоресцентные меры экспериментальных образцов трансформируются в процентах от контрольных образцов.

Другим ограничением метода является то, что только часть ткани используется, и, следовательно, активность каспазы-3 может быть недооценен. Действительно, временное окно апоптоза коротка в любой данной клетке и может быть пропустил, хотя это происходит в соседних областей во время отбора проб ^1,4,15. Обратное также возможно: апоптоз может быть особенно интенсивным в частях ткани, в результате чего завышению каспазы-3. Мы рекомендуем использовать оставшиеся ткани (миндалины) для дополнительных методов, таких как TUNEL анализов или отношение Вах / Bcl2 (см введение).

Спектрофлюориметре имеет по крайней мере два преимущества перед Вестерн-блоттинга. Во-первых, непосредственно создает количественные данные. Во-вторых, он измеряет ферментативный AСам, а не белка или РНК выражение, которое может быть не связан, и известно, что экспрессия белка может быть увеличена без изменения ферментативной активности ctivity. Кроме того, спектрофлюориметре может быть выполнена на другие ткани или разных видов животных и могут быть приспособлены для других подтипов каспаз, с различными субстратами, так что безопасные сравнения могут быть сделаны.

В заключение, этот документ демонстрирует использование спектрофлюориметре измерить активность каспазы-3 в миндалине, что свидетельствует, что апоптоза в этой области лимбической системы через 3 дня после инфаркта миокарда.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Spectroflurometer	Photon technology Instrument (now Horiba)	Ratiomaster M-40	with DeltaRAM  Random Access Monochromator
Respirator	Harvard apparatus	683	small animal ventilation
Glass cuvette	NSG precision cells	3G10	Optical Glass (340-2,500 nm) 10 mm path
Sonicator	Cole Parmer	4710  series
Spectrometer	Varian	Cary 50 Bio