The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.
Expériences pour mesurer les propriétés de perméabilité des microvaisseaux perfusés individuellement fournissent un pont entre l'enquête des mécanismes moléculaires et cellulaires régulant la perméabilité vasculaire dans des monocouches de cellules endothéliales en culture et les propriétés des lits microvasculaires entiers de change fonctionnels. Une méthode pour canuler et perfuser microvaisseaux des veinules de mésentère de rat et de mesurer la conductivité hydraulique de la paroi des microvaisseaux est décrite. L'équipement principal nécessaire comprend un microscope intravitale avec une grande scène modifiée qui prend en charge micromanipulateurs de positionner trois microtools différents: (1) une micro-pipette de verre biseauté à Cathétériser et perfuser l'microvaisseaux; (2) un verre de micro-obturateur pour bloquer temporairement la perfusion et permet la mesure de mouvement d'écoulement d'eau transvasculaire à une pression hydrostatique mesurée, et (3) une tige de verre émoussé pour stabiliser le tissu mésentérique au niveau du site de ponction. La Landis micro-occlusion techniq modifiéeue utilise les globules rouges en suspension dans le liquide de perfusion artificielle comme marqueurs de mouvement fluide transvasculaire, et permet également des mesures répétées de ces flux conditions expérimentales sont modifiées et de la différence de pression osmotique colloïde hydrostatique et à travers les microvaisseaux sont soigneusement contrôlées. Les mesures de conductivité hydraulique première aide d'un liquide de perfusion de commande, puis après une nouvelle ponction de même avec les microvaisseaux perfusats de test permettre des comparaisons de la réponse des microvaisseaux dans ces conditions bien contrôlées jumelés. Les tentatives visant à étendre la méthode de micro-vaisseaux dans le mésentère des souris avec des modifications génétiques prévus pour modifier la perméabilité vasculaire ont été sévèrement limitée à cause de l'absence de longs microvaisseaux droites et non ramifiées dans le mésentère des souris, mais la disponibilité récente des rats avec des modifications génétiques similaires en utilisant la technologie / cas9 CRISPR est prévu d'ouvrir de nouveaux domaines de recherche où les méthodes décrites ici peuvent être appliquées. </p>
Microperfusion dans le système vasculaire consiste à établir un écoulement d'un liquide de perfusion de composition connue artificielle commandé par l'intermédiaire d'une micropipette dans un vaisseau sanguin généralement inférieure à 40 um de diamètre. Le récipient perfusé reste dans son environnement normal et de tissu est perfusé avec du sang de l'animal jusqu'à l'heure de canulation le. Lorsqu'il est utilisé en conjonction avec une gamme de l'imagerie vidéo ou techniques fluorométriques, microperfusion in situ permet de mesurer des débits d'eau et de solutés à travers les murs de microvaisseaux dans des conditions où les forces motrices de ces flux sont connus et les propriétés de perméabilité de la paroi vasculaire peuvent être directement évaluée. De plus, en contrôlant la composition du fluide entourant la microvaisseaux dans le tissu (perfusat et superfusat), la régulation de la perméabilité microvasculaire et l'échange peut être étudiée en activant les cellules endothéliales qui forment la paroi de microvaisseaux à être exposée à une variété de econditions Xperimental (agonistes, conditions de perfusion modifiés, les indicateurs fluorescents pour mesurer la composition et la signalisation intracellulaire) pour des périodes mesurées précisément de temps (sec) à h. En outre, les évaluations ultrastructurales ou cytochimiques de structures moléculaires cellulaires clés régissant la barrière peuvent être étudiés dans les mêmes microvaisseaux dans lequel la perméabilité est mesurée directement. L'approche forme ainsi un pont entre l'enquête des mécanismes cellulaires et moléculaires de modifier la fonction de barrière endothéliale chez les monocouches de cellules endothéliales en culture et enquête microvaisseaux intactes. Voir les commentaires suivants pour une évaluation plus approfondie 1-6.
Une limitation de microperfusion est qu'il peut être utilisé que dans des lits microvasculaires qui sont minces, transparentes et ayant une intégrité structurelle suffisante pour permettre une canule avec une micropipette de verre. Alors que les premières enquêtes utilisées microvaisseaux de grenouilles dans mésentère et mince cutanée angine muscle 7,8, de loin la préparation la plus couramment utilisée dans les modèles de mammifères est le mésentère de rat 9-15. La plupart des enquêtes ont porté sur les changements aigus de la perméabilité vasculaire étudié sur des périodes de 1-4 heures, mais des études plus récentes ont été étendus à des mesures sur les navires individuels 24-72 h après une première perfusion 12,16. La technologie CRISPR récemment mis au point, qui promet de faire des modèles de rats plus génétiquement modifiés disponibles pour l'étude de la régulation de la perméabilité vasculaire 17 devrait permettre aux méthodes décrites dans la présente communication à appliquer dans les microvaisseaux des veinules du mésentère dans ces nouveaux modèles importants de rat.
La méthode nécessite un microscope inversé équipé d'une platine de microscope construite sur mesure assez grand pour contenir à la fois la préparation des animaux et au moins trois micromanipulateurs utilisé pour positionner microtools à proximité de la cuve perfusé et d'aligner une micropipette de perfusion avec le navirelumen. Par exemple, une plate-forme de commande pour un étage xy de microscope (environ 90 × 60 cm) peut être fabriqué à partir d'une plaque d'acier 1 cm d'épaisseur avec un revêtement anti-rouille. La scène est attaché à une table d'index d'ingénierie ou deux diapositives en queue d'aronde montés à angle droit et reposant sur des piliers en téflon ou les transferts de billes pour le déplacement dans le plan horizontal. Une installation typique (voir la figure 2) a beaucoup en commun avec l'équipement de microscope et micropositionnement utilisée pour toute une gamme d'expériences de la microcirculation intravitale tels que ceux de mesurer seul flux sanguin du navire et de l'hématocrite, la livraison d'oxygène locale par le sang perfusé microvaisseaux, réglementation des lisses vasculaires le tonus musculaire, et l'accumulation de micro-vasculaire local des traceurs fluorescents injectés dans l'ensemble de la circulation. 18-26
L'aspect fondamental de la technique est la mesure de débit volumique (J v) sur une zone de surface définie (S) de la paroi de microvaisseaux. Accomplirce par la technique de Landis modifié décrit ici un microscope inversé simple, est adéquat. Une petite caméra vidéo est montée sur l'orifice de l'image et le signal vidéo, avec une base de temps supplémentaire, est affichée sur un moniteur vidéo et enregistrés soit sous forme numérique sur un ordinateur ou sous forme de signal numérique ou analogique sur un enregistreur vidéo. Une fois que la canule microvaisseaux est la partie de la microvaisseaux visible par la caméra peut être modifiée par déplacement de la platine et les manipulateurs en tant qu'unité sans perturber la canulation.
Mesure des flux de transvasculaires peut également être combiné avec des études plus détaillées à l'aide d'un microscope à fluorescence avec filtres appropriés sophistiqués tels que les plates utilisées pour les mesures de perméabilité soluté, la surveillance de la fluorescence du calcium cytoplasmique rapport ou d'autres mécanismes cellulaires, et l'imagerie confocale 6,12,13, 27. Un avantage clé de toutes les approches de microperfusion est la capacité de faire des mesures répétées, sur le même navire, Sous changement contrôlé de la force motrice telles que des pressions hydrostatiques et oncotiques, ou changement induit dans les réponses des navires à des conditions inflammatoires. La conception la plus commune est une comparaison par paires de la conductivité hydraulique mesurée (L p) sur le même navire avec le premier récipient perfusées via une micropipette remplie d'un liquide de perfusion de contrôle et la suspension de globules rouges à établir un état de référence de perméabilité, puis avec un second pipette avec l'agent de test ajouté au perfusat. Canulations multiples sont possibles avec le cycle répété après reperfusion avec la pipette de commande.
Le présent protocole démontre la canule et microperfusion d'un navire veinulaire dans mésentère de rat pour enregistrer les flux d'eau à travers la paroi des microvaisseaux et mesurer la L p de la paroi de la cuve, un indice utile de la perméabilité de la voie commune pour l'eau et de solutés à travers le intacte barrière endothéliale. La procédure est appelée la techniq modifié Landisue parce que le principe Landis originale d'utiliser le mouvement relatif des globules rouges comme une mesure de l'échange fluide transvasculaire après perfusion est bloqué est préservée 28, mais l'éventail des conditions expérimentales (par exemple, les différences de pression oncotiques hydrostatiques et de l'albumine à travers la paroi des microvaisseaux) disponible après microperfusion est beaucoup plus grande que dans le sang perfusé microvaisseaux uncannulated 8,29.
Détails de L calculs p. Bien que le mouvement du fluide transvasculaire se produit alors que le navire est librement perfusé, tel échange est trop petite pour être mesurée pendant la perfusion libre car elle est généralement moins de 0,01% du taux de perfusion de navire. Toutefois, lorsque la perfusion est temporairement arrêté par occlusion de la microvaisseaux, écoulement transvasculaire (par exemple, filtration) est mesurée à partir de la circulation des globules rouges de mar…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la Santé et des subventions HL44485 HL28607.
MICROSCOPE, TABLE AND STAGE | |||
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example | Olympus | CK-40 | try to place eyepieces higher relative to stage–you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators |
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example | Leica | DMIL | try to place eyepieces higher relative to stage–you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators |
narrow diameter, long working distance objective: example | Nikon | Nikon E Plan 10×/0.25 LWD | |
stage platform–1/2 inch or 1 cm sheet steel | welding shop | this should be heavy to reduce vibration | |
Unislide x-y table: dove tail slides | Velmex | AXY4006W1 | |
VIDEO | |||
CCD video camera: example | Pulnix | TM-7CN (no longer available) | no color needed |
video capture system with audio–generic | |||
video playback system (completely still frame, single frame motion) | |||
small microphone | |||
MICROMANIPULATORS, HOLDERS | |||
micromanipulator, XYZ (3) | Prior/Stoelting (no longer available) | look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning | |
hydraulic probe drive, one way | FHC | 50-12-1C | need to buy either manual drive or electronic drive |
manual drum drive | FHC | 50-12-9-02 | |
or hydraulic drive, 3 way | Siskiyou Corporation | MX610 (1-way) or MX630 (3-way) | great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years |
connectors/rods/holders | Siskiyou Corporation | MXC-2.5, MXB etc. | |
pin vise | Starrett | 162C | to hold restrainer |
pipette holder | World Prescision Instruments | MPH3 | |
water manometer ~120 cm | |||
MICROSCOPE TRAY | |||
clear Plexiglas for microscope tray for animal | |||
3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall | Quartz Scientific Inc. | custom | (or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective |
Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN) | |||
medical adhesive for tissue well | NuSil | MED-1037 | |
All-purpose silicone rubber heat mat, 5" L x 2" W | Cole Parmer | EW-03125-20 | heater for microscope tray–needs cord and controller–240V version available |
Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC | Cole Parmer | EW-03122-75 | |
STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out | Cole Parmer | EW-01575-00 | |
PIPET MANUFACTURE | |||
vertical pipette puller | Sutter Instrument Company | P-30 with nichrome filament | |
1.5 mm OD thin wall capillary tubing | Sutter Instrument Company | B150-110-10 | |
pipette grinder air stone and dissection microscope–see reference in text | or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments | ||
RX Honing Machine, System II | RX Honing Machine Corporation | MAC-10700 Rx System II Machine | alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle |
with ceramic sharpening disc | RX Honing Machine Corporation | use "as is" or attach lapping film | |
lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um | 3M | part no. 051144 80827 | 268X Imperial lapping film sheets with adhesive back–can be purchased from Amazon |