Microperfusion Техника по расследованию Правила микрососудов проницаемость у крыс брыжейки

Abstract

Эксперименты по измерению свойств проницаемости микрососудов индивидуально перфузированных обеспечить мост между расследования молекулярных и клеточных механизмов, регулирующих проницаемость сосудов в культивируемых эндотелиальных монослоев клеток и функциональных свойств обменных целых микрососудистых кровати. Метод, чтобы иглу и заливать венулярного микрососудов брыжейки крыс на и измерения гидравлической проводимости в микрососудов стенки описано. Основное оборудование включает в себя необходимости прижизненной микроскоп с большим модифицированной стадии, которая поддерживает микроманипуляторами позиционировать три различных микроинструментов: (1) скошенной стекла микропипетки, чтобы иглу и заливать микрососудов; (2) стекло микро-обтуратор, чтобы временно блокировать перфузии и позволяют измерять transvascular движения потока воды в измеряемой гидростатического давления, и (3) тупым стеклянной палочкой, чтобы стабилизировать ткань брыжеечной на месте катетеризации. Модифицированный Лэндис микро-окклюзия TechniqUE использует эритроцитов, взвешенных в искусственном перфузат в качестве маркеров transvascular движения жидкости, а также позволяет повторные измерения этих потоков, экспериментальные условия изменились и разницы гидростатического и коллоидного осмотического давления в микрососудах тщательно контролируется. Измерения гидравлической проводимости в первую очередь с использованием управления перфузат, то после повторного катетеризации же микрососудов с тестов perfusates позволяют парных сравнений на ответ микрососудов в этих хорошо контролируемых условиях. Попытки продлить способ микрососудов в брыжейку мышей с генетической модификации ожидаемых изменить проницаемость сосудов были строго ограничены из-за отсутствия длинных прямых и неразветвленных микрососудов в брыжейку мыши, но в последнее время наличие у крыс с аналогичными генетических модификаций, используя CRISPR технологии / Cas9 планируется открыть новые области исследования, когда методы, описанные здесь, могут быть применены.

Introduction

Microperfusion в сосудистой входит установка контролируемый поток искусственного перфузату известного состава с помощью микропипетки в кровеносном сосуде обычно меньше, чем 40 мкм в диаметре. Перфузией судно остается в пределах его нормальных условиях ткани и перфузии животного крови до времени катетеризации. При использовании в сочетании с различными видео изображений или флуорометрическими методов, в месте microperfusion позволяет измерять воды и растворенных веществ протекает через стенки микрососудов в условиях, когда движущие силы для этих потоков известны и свойства проницаемости сосудистой стенки может быть непосредственно оценены. Кроме того, путем регулирования состава жидкости, окружающей микрососудов в ткани (перфузату и superfusate), регулирование проницаемости микрососудов и обмена может быть исследована путем предоставления эндотелиальные клетки, формирующие стенки микрососудов подвергаться различным еXperimental условия (агонисты, модифицированные условия перфузии, люминесцентные индикаторы для измерения внутриклеточного состава и сигнализации) для измеренных именно периоды времени (с до часов). Кроме того, ультраструктурных или цитохимические оценки ключевых клеточных структур, регулирующих молекул барьер может быть исследована в тех же микрососудов, в котором проницаемость измеряется непосредственно. Подход, таким образом, образует мост между расследования клеточных и молекулярных механизмов, чтобы изменить функцию эндотелия барьер в культивируемых эндотелиальных монослоев клеток и расследования в интактных микрососудов. Смотрите следующие обзоры для дальнейшей оценки ^1-6.

Ограничение microperfusion, что он может быть использован только в микрососудистых кровати, которые являются тонкими, прозрачными и имеют достаточную структурную целостность, чтобы позволить катетеризации со стеклянной микропипетки. В то время как ранние исследования использовали лягушачьи микрососудов брыжейки в тонкой кожной и жабы мuscle ^7,8, на сегодняшний день наиболее часто используется в моделях подготовка млекопитающих является крыса брыжейки ^9-15. Большинство исследований были сосредоточены на острых изменений в сосудистой проницаемости исследуемой за периоды 1-4 часов, но более поздние исследования были распространены на измерения на отдельных судов 24-72 ч после первоначального перфузии ^12,16. Недавно разработанная технология CRISPR, который обещает сделать более генетически модифицированные модели крыс для изучения регулирования проницаемости сосудов ¹⁷ следует включить методы, описанные в этой связи должны применяться в венулярного микрососудов брыжейки в этих важных новых моделей крыс.

Метод требует инвертированного микроскопа, оснащенного встроенным микроскопом обычай этапе достаточно большой, чтобы держать и подготовку животных и по крайней мере три микроманипуляторами используется для позиционирования микроинструментов близких к перфузии судна и согласовать перфузии микропипетку с суднаПросвет. Например, пользовательские платформы для стадии ху микроскопа (около 90 × 60 см) могут быть изготовлены из листа толщиной 1 см стального листа с антикоррозийной покрытием. Этап прикреплен к столу инженерно индексом или двух голубей хвост слайды, установленных под прямым углом и поддерживаемых на тефлоновых столбов или шаровые переводов для движения в горизонтальной плоскости. Типичный установка (рисунок 2) имеет много общего с микроскопом и микропозиционированное оборудования, используемого для диапазона прижизненных экспериментов микроциркуляции, таких как те, для измерения одного потока кровеносного сосуда и гематокрита, локальную доставку кислорода кровью перфузии микрососудов, регуляция сосудистого гладкой тонус мышц, и локальное скопление микрососудов флуоресцентных индикаторов, введенных в обращение всей. ^18-26

Принципиальной особенностью метода является измерение объемного расхода (J) через _об области, определенной поверхности (ы) микрососудов стенки. Для достиженияэто через модифицированной методики Landis описанного здесь простой перевернутый микроскоп является адекватной. Небольшое видео камера установлена ​​на порт изображений и видеосигнала, с добавлением временной базы, отображается на видеомониторе и записаны как в цифровом виде на компьютере или в виде цифрового или аналогового сигнала на видеомагнитофоне. После того, как микрососудов канюлировали часть из микрососудов видимой камере, может быть изменена путем перемещения этап и манипуляторы в качестве единицы, не нарушая катетеризации.

Измерение transvascular потоков может быть также в сочетании с более детальных исследований с использованием флуоресцентного микроскопа сложный с соответствующими фильтрами, таких как установок, используемых для измерения растворенного проницаемости, люминесцентного контроля соотношения цитоплазматического кальция или других клеточных механизмов, и конфокальной микроскопии ^{6,12,13, 27.} Ключевым преимуществом всех подходов microperfusion является способность делать повторные меры, на том же судне, При контролируемом изменении движущей силы, такой как гидростатического и онкотического давлений или индуцированного изменения ответов судна в воспалительных состояний. Наиболее распространенной конструкцией является попарное сравнение измеренного гидравлической проводимости _(L P) на том же сосуде с судна первой перфузии с помощью микропипетки, заполненной контрольной перфузату и красной суспензии клеток, чтобы установить состояние базовой линии проницаемости, то со второй пипетки с тестируемым агентом добавлены перфузату. Несколько cannulations возможны цикла повторного после реперфузии с контрольной пипетки.

Настоящий протокол показывает катетеризации и microperfusion из венулярного судна крысы брыжейки записывать потоки воды по всей микрососудов стенки и измерения _L P стенки сосуда, полезную индекс проницаемости общего пути для воды и растворенных веществ через неповрежденный эндотелия барьер. Процедура называется модифицированной Landis TechniqUE потому, что первоначальный принцип Landis использования относительное движение эритроцитов в качестве меры transvascular обмен жидкости после перфузии блокируется сохраняется ^28, но диапазон условий эксперимента (например, гидростатические и альбумина различия онкотического давления на микрососудов стенки) доступны после microperfusion намного больше, чем в крови uncannulated перфузии микрососудов ^8,29.

Protocol

О себе этика: Все процедуры были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу и использованию животного Институциональная.

1. Предварительное изготовление Микропипетки, Restrainers, и блокаторы

1. Извлеките несколько чистые боросиликатного стекла капилляров в половине использованием электронного съемник регулируется таким образом, что, когда тянули, растянутый участок трубки составляет около 1 см в длину и две половинки несколько симметрично. Убедитесь, что конус согласуется с размерами на рисунке 1. Используйте обе половинки для Микропипетки, restrainers и блокаторов.
   1. ФАСКА микропипетки использованием воздушным приводом шлифовального круга ³⁰ 0,5 мкм наждачной бумагой купались в воде. Установите угол держателя микропипетки так, что она составляет около 30 градусов от горизонтали.
   2. Тщательно вымыть и высушить с помощью микропипетки всасывание тянуть чистый ацетон через наконечник и вверх по валу. Осмотрите микропипетки (1А) с помощью небольшой прямой микроскоп с 4 × 40 × и целей, оснащенных держателя микропипетки крокодил и окуляра сетки.
   3. Выберите микропипетки с открытостью около 50 мкм длиной, с фаской, длина которой / ширине между 3.1 и 3.5 и с резко сужающейся точке, которая помогает проникнуть в жесткие коллагеновые волокна в брыжейки.
   4. Храните 15-20 микропипетки на несколько разных размеров в коробке пыли.
2. Сделать restrainers используя вытащил капиллярные трубки, подготовленные в шаге 1.1). Держите вытащил стеклянную капиллярную трубку кратко возле Микропламя сформировать тупой конец (рис 1B). Хранить несколько в коробке пыли.
3. Сделать microoccluders используя вытащил капиллярные трубки, подготовленные в шаге 1.1). Держите вытащил капиллярной трубки под Микропламя и аккуратно согнуть (с помощью адаптера труб., Например, 23G) штраф наконечник (около 4 мм от кончика), чтобы сделать угол близок к 120 градусов к оси (

2. Подготовка животных и хирургии

1. Обезболить самца (350-450 г) или самок крыс Sprague-Dawley (200-300 г) пентобарбиталнатрием (80-100 мг / кг, Sigma-Aldrich, P3761) с помощью подкожной инъекции; защиты брыжейки, не используя внутрибрюшинного введения.
2. В течение хирургических операций и экспериментальных протоколов, поддерживать анестезию путем дополнительных инъекций (30 мг / кг) по мере необходимости. Определите глубину анестезии пальца щепоткой или роговицы рефлекс. После завершения экспериментальной процедуры, эвтаназии крысу через пентобарбиталом передозировки или внутри сердечной инъекции насыщенным раствором хлорида калия под анестезией.

3. Подготовить решения и эритроцитов для использования в качестве маркеров потока

1. Готовят раствор Рингера для млекопитающих superfusate и контроль перфузата раствора (обычно у млекопитающих раствор Рингера, содержащий 10 мг / мл жирной кислотыбесплатно бычий сывороточный альбумин, BSA).
   1. Фильтр Перфузат через 0,2 мкм шприц фильтры для удаления мелких частиц, которые могут блокировать кончик микропипетки; фильтр в небольшом чистом контейнере.
2. Подготовьте эритроциты, опираясь около 0,2 мл крови из хвостовой вены анестезированных крыс в 20G иглы на небольшом шприца, содержащего 0,05 мл гепарина (1000 ед / мл) и переносят в 15 мл центрифужную пробирку, содержащую около 14 мл млекопитающих решение раствор Рингера ,
   1. Центрифуга мягко пакет эритроцитов (около 200 × макс г в течение 7 мин). Откачать супернатант и вновь приостановить эритроциты в растворе Рингера.
   2. После центрифугирования и удаления супернатанта в три раза оставить эритроцитарной в нижней части трубы для последующего использования. Следует отметить, что эта процедура снижает тромбоцитов в конечных perfusates до менее 0,1% от нормальных уровней ^31.

4. Организовать ткань на животныхЛоток

1. Бритье брюшко под наркозом крысы снизу пупка до мечевидного отростка. Убедитесь, что выбритый участок простирается вокруг правой стороны (для крыс, размещенной на правой стороне), так что волосы не образуют фитиль обратить superfusate из ткани также. Удалить вырезать волосы с увлажненной марлевой салфеткой или тканью.
   1. Держите кожу с тупым зубчатыми щипцами и сделать центр строки разрез (длиной 2-3 см) через кожу, используя надежное ножницы. Использование штрафа (ирис) ножницы сделать подобный разрез через белой линии, поднимая брюшную стенку с зубчатыми щипцами, чтобы избежать повреждения кишечника.
   2. С животного на боку на лотке для животных, осторожно выньте кишки из брюшной полости с помощью хлопка наконечником аппликаторы-(дерево), смоченные палки в растворе Рингера и тупыми зубчатыми щипцами. Упорядочить кишку в ткани и таким образом, чтобы брыжейки накинутой столба для просмотра через микроскоп заботясь, чтобы избежать прикосновения брыжейки (Потьеntially повреждения микрососудов) либо с пинцетом или хлопка.
      Примечание: Лоток для животных (2А) могут быть построены из оргстекла и требует ткани хорошо (Deep около 3 мм), оптически ясно столба (например, полированный кварц около 2 см диаметром и 5 мм.) И потепления площадку регулируется для поддержания температуры животного. Толщина столба не должна превышать рабочее расстояние объектива.
2. Расположите лоток животных на сцене микроскопа так, чтобы брыжейки виден через окуляры.
3. Подставьте самотечных капельного линии постоянно переливать брыжейки раствором Рингера млекопитающих в поддерживаемой при 35-37 ° С. Используйте марлевые тампоны, чтобы держать кишечник в месте, помогают удерживать влагу, и фитиль решение избыточного Рингера с поверхности. Отрегулируйте поток и аспирации стоков для поддержания равномерной толщины superfusate.
4. Определение целевых венулярного микрососудов, которые являютсянеразветвленные сегменты вниз по течению конвергентной потока, один или два отделения дистальных истинных капилляров. Найти неразветвленную сосуд (в идеале, 600 до 1000 мкм в длину), имеющие оживленное кровообращение и свободной от лейкоцитов, торчащие на стенке емкости.
5. Поместите тест микрососудов в центре области микроскопа и переместить фиксатор в положение вблизи выбранного катетеризации сайта.

5. Заполните микропипетки и Гора в держатель

1. Перед cannulating, приостановить эритроциты в перфузат. Добавить 7 мкл эритроцитарной 0,5 мл перфузата в чистом тестовом боросиликатного трубки. Примечание: гематокрита 1-3% может быть использован, но в соответствии гематокрита приведет к последовательной концентрации перфузату любых веществ, поступающих из эритроцитов.
2. Установите 1 мл шприц с адаптером 23G труб и PE 50 труб (5-15 см длиной). Нарисуйте Перфузат / красный смесь клеток в шприц. Обратить шприц для смешивания и изгнать все пузырьки из трубы иАдаптер. Для повышения эффективности, подходят трубки до нескольких шприцев до начала эксперимента и держать их в свободном поле пыли или полиэтиленовый пакет.
3. Заполните микропипетки путем продвижения трубки в большом конце микропипетки, пока она не упрется в трапециевидный участок. Применить нежный быстрый толчок на поршень шприца, чтобы заполнить кончик микропипетки. Примечание: маленький ручеек или капель должна быть видна на кончике, чтобы свидетельствовать полное заполнение.
4. Вывод трубки, мягко нажимая на поршень, чтобы заполнить широкую часть микропипетки вала. Удалить мелкие пузырьки в широком вала тщательно стряхивая микропипетки вал. Примечание: Аналогичная процедура была проиллюстрирована ^32.
5. Поместите микропипетки в держатель пипетки с боковой порт, который позволяет соединение непрерывный жидкости к водяной манометр. Убедитесь, что держатель, который прикреплен к гидравлическим приводом используется для управления очень тонкой продвижение микропипетки, это под небольшим углом (15-25 °)к горизонтали таким образом, чтобы край конуса микропипетки не попал в кишечник или лоток.
6. Установите гидравлический привод на подвижной микроманипулятора, который имеет X, Y, Z и диски для того, чтобы тесную связь с испытательного сосуда (рис 2).
7. Регулировка гидростатическое давление, приложенное к жидкости в микропипетки с помощью шприца или заполненный водой резиновую грушу, чтобы изменить высоту жидкости в толще воды манометра до около 40 CMH _{2 O} выше брыжейки.
8. Иглу микрососудов как можно скорее после заполнения пипетки; эритроциты оседают на дно пипетки, так что после примерно 40 мин очень мало эритроцитов будет течь в сосуд.

6. Microcannulation и Микрососудистой Измерение давления

1. Перед установкой заполненный микропипетки под микроскопом, осторожно нажмите на фиксатор ткани вблизи микрососудов применения достаточную силу для захвата ткани. Нарисуйтефиксатор обратно, слегка растягивая ткань в соответствии с микрососудов, так что напряжения в брыжеечных коллагеновых волокон приведены в соответствие с судна.
   1. Совместите микропипетку с судна и опустите его в поле зрения через окуляры. Поместите наконечник непосредственно перед выбранной катетеризации сайта и опустить его на ткань так, чтобы она частично препятствует потоку внутри емкости, но не закрывают его.
2. Иглу судно при движении пипетки медленно в просвете сосуда, используя гидравлический привод. Будьте осторожны, чтобы не протолкнуть нижней стороне судна.
   Примечание: В микропипетки вводит просвет, перфузат быстро моет крови в сосуде из просвета и перфузату свободно течет в циркуляционном дистальнее животного в испытательную микрососудов, вытесняя некоторые из нормального кровотока в сосудах ниже по течению.
3. Опустите перфузионное давление, регулируя манометр до крови (как указанокрасные клетки животного) втягивается обратно в перфузии сегменте; это определяет давление баланса, где эритроциты аккуратно колеблются в просвете сосуда и измеряет гидростатическое давление микрососудов (Р _с) на дистальном конце микрососудов сегмента. Поддерживать судно перфузии при всех давлениях выше этого давления баланса.

7. Microocclusion и сбор данных

1. Необязательный шаг: Перед использованием микро-окклюдер блокировать судно, нажмите его в ткани в неиспользуемом области брыжейки далеко от судна так, чтобы кончик накапливается штраф площадку ткани, которая защищает экспериментальную судно во время повторного микро- окклюзии.
2. Поместите блокатор выше перфузии судна вблизи нижнего края области микроскопа.
3. Запишите следующее с видео и аудио.
   1. Устно записать расположение блока сайте и нижний края экрана, как показано на окуляр визира.
   2. С кончикаблокатора размещены чуть выше микрососудов, использовать мелкий контроль г в микроманипулятора мягко опустите блокиратор, пока поток в сосуде не поглощается. Обратите внимание на давление манометра _{(Р) об} аудио. Применить окклюзии, как правило, 3-10 сек, а затем отпустите, восстановление бесплатный перфузии. Перемещение сайт загромождать судна в направлении кончика пипетки в 5-10 мкм шагов в зависимости от времени (> 5 мин после первоначального блока на сайте), количество включений (3-5), чтобы предотвратить повреждение сосудов стенки при блоке сайта ,

8. Анализ данных и измерения L _{р (Водопроницаемость)}

1. Во время воспроизведения видео, определить начальную расстояние (l ₀₎ из маркера эритроцитов к окклюзии сайта с помощью изображением микрометра и известных положений на изображениях. Определить начальную скорость (dℓ / DT) маркера клетки от его положения в нескольких кадрах в течение 3-10 сек записанных изображений. Удерживатьмой радиус сосуда (г) из снимков, сделанных во время окклюзии (рис 3).
2. Рассчитать J _{V / S} для каждого окклюзии как (dℓ / DT) × (1 / л ₀₎ × (R / 2). Рассчитать _L P при постоянном давлении в (J _{V / S),} деленное на давление вождения в (микрососудов давления - эффективного осмотического давления коллоидной; см Обсуждение).

Representative Results

На рисунке 4 показаны результаты от измерения временной ход изменений в L _р у крысы венул микрососудов канюлированную последовательно четыре perfusates. ³³ Величина _L P, рассчитанной при постоянном давлении, использовали в качестве показателя изменений микрососудов стенки проницаемости, прежде в контрольной состоянии с перфузатом, содержащего 1% бычьего сывороточного альбумина, то, когда судно подвергается противовоспалительное средство брадикинина (BK) с использованием второго микропипетки, содержащий 10 нМ Bk. Брадикинин вызвало кратковременное повышение L _р, вернулся к значению контроль над последующим 10-15 мин. Сосуд затем повторно перфузию управления перфузату в течение 30 мин, чтобы восстановить стабильный базовый уровень в. Когда микрососудов вливают помощью четвертой микропипетки с той же концентрацией Bk, а также 1 мкМ сфингозин-1-фосфат (S1P) в перфузат, ответ на Bk значительно ослабляется. СтепеньОслабление при Bk и S1P перфузировались одновременно было установлено, что аналогично измеряли в других экспериментах, где S1P был добавлен в перфузату до 20 мин перед воздействием Bk. Эти результаты демонстрируют мощь в состоянии сделать несколько измерений _L P на одном судне, и показать, что действие агента, такого как S1P, чтобы стабилизировать стенку сосуда в присутствии воспалительного агента может быть решена с периодами по времени порядка нескольких секунд. В отдельных сосудов контроль исследования проводились с аналогичной протокола в отсутствие S1P, чтобы показать, что затухание реакции Bk не из-за анафилаксии.

Для некоторых экспериментальных конструкций важно оценить как растворенный коэффициент отражения для макромолекулы (о) и L _р. Это достигается путем измерения лучше J _V на нескольких давлений на каждом отдельном микрососудов. 5 показан эксперимент яп, и _L P и эффективное онкотического давления 5% альбумина в перфузат (π = 27 _{альбумина} CMH _{2 O} при 37 ° С) оценивали в условиях, когда не было альбумина в ткани, окружающие крысы микрососудов. В этих экспериментах J _{V / S} была измерена в трех различных давлениях. The L _р наклон связи между J _{V / S} и давления, а также перехват на оси давления является эффективным разница онкотического давления на стенки сосуда (σΔπ).

Рисунок 1. микроинструментов для перфузии отдельных микрососудов. (A) микропипетка для катетеризации крысы микрососудов с скошенным наконечником. (Б) фиксатор для проведения брыжейки ткани стабильную недалеко от места пункции. (C) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2. прижизненной Рог для microperfusion. (А) Обзор животного лоток микроманипуляторами и микроинструментов ориентированных над стеклянной стойке. (Б) Большая сцена металла монтируется на инженерной столом и опорными подшипниками. (С) анестезированной крыс с микроинструментов в положении для microperfusion о наличии микрососудов. (D) Крупный план брыжейки во время эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное FIGU число рейнольдса

Рисунок 3. Измерение скорости фильтрации на единицу площади, используя модифицированный метод Landis. Эта схема показана одна микрососудов канюлировали микропипетки и окклюзионного стержня расположена над судна. Сразу же после окклюзии микрососудов, расстояние (l ₀₎ между маркером RBC следуют по осевой линии закупоренной микрососудов и места окклюзии записывается так, что траектория клеток можно проследить в течение 5-10 с после окклюзии. Исходное положение (ℓ ₀₎ и начальная скорость (dℓ / дт) клетки используются для расчета средней скорости фильтрации на единицу площади стенки микрососудов между маркером клеток и месте закупорки. Microoccluder затем поднял и бесплатно перфузии установлено до дополнительные измерения.ком / файлы / ftp_upload / 53210 / 53210fig3large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4. Типичные данные показывают, что сфингозин-1-фосфат (S1P) ингибирование действует очень быстро брадикинина (BK; 10 нм). Вызвало кратковременное повышение микрососудов _L P. С1Ф применяться как одновременно с испытанием второй брадикинина (BK) ингибирует острое Bk отклика по отношению к первой кн. Эти данные показывают, что время воздействия тестируемого агента может быть модифицирован, чтобы оценить кинетику активации ингибирующего отклика. В частности, С1Ф применяется CONCURRENT только с Вк сильно тормозил ответ Бк. С1Ф был 1 мкм и Вк было 10 нМ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5. Измерение J _{V / S} на нескольких давлений позволяет как _L P и эффективное онкотического давления должна быть измерена. Поток фильтрования, J _{V / S,} была измерена в этом сосуде при различных гидростатических давлений микрососудов при перфузии с BSA (50 мг мл ^{- 1;} π = 27 КМЗ _{2 O),} в то время как брыжейки купалась с безбелковой раствор Рингера. Наклон отношения между J _{V / S} и давления является _L P и пересечение на оси давления указывает эффективную разницу онкотического давления на стенки сосуда. В этом эксперименте было Лп 1,2 × 10 ^-7 см (сек ^-1 КМЗ _{2 O} ^-1) и σΔπ был 24 КМЗ ₂ О. <HREF = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53210/53210fig5large.jpg" целевых = "_blank"> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Подробная информация о L расчетов _стр. Несмотря на то, transvascular движение жидкости происходит в то время как судно свободно перфузии, такой обмен слишком мал, чтобы быть измерена в свободное перфузии, потому что это, как правило, меньше, чем 0,01% от стоимости перфузии сосудов. Однако, когда перфузия временно остановлен окклюзии микрососудов, transvascular поток (т.е. фильтрации) измеряется от движения маркерных эритроцитов в просвете как столба жидкости между маркером эритроцитов и месте окклюзии сокращает, как показано на Рисунок 3. В зависимости от сложности и длины экспериментального протокола неразветвленную сосуда необходимо 600 до 1000 мкм в длину.

Когда судно не перекрываемого и давление манометром ведет поток через микрососудов, перепад давления кончика пипетки велика, так что давление микрососудов в свободное перфузии, как правило, лишьмало КМЗ ₂ 0 выше выходного давления. В противоположность этому, во время окклюзии перепад давления пипетки очень мала из-за жидкости медленно ввод просвет сосуда, чтобы заменить фильтрации жидкости через стенки сосуда. Таким образом, при окклюзии гидростатическое давление в просвете сосуда (Р _с) равна, что набор по манометру. Онкотического давления в ткани брыжеечной незначительна, поэтому сразу же после окклюзии, transvascular плавные движения от маркерных эритроцитов измеряется, когда гидростатическое давление, как известно, и онкотического давления в просвете сосуда равна времени, установленного на перфузату. С последовательных измерений L _р, длина судна теряется каждый раз, когда блок-сайт является передовой. Кроме того, последовательное recannulation уменьшает доступную длину судна.

Transvascular потока жидкости на единицу площади стенки сосуда (Дж _{V / S)} оценивают по скорости, что измеренная длина столба воды в microvЭссел просвет между маркером эритроцитов и сайте окклюзии или уменьшения (чистая фильтрации) или увеличение (нетто). реабсорбции Предполагается, что нейтральную плавучесть эритроциты движущиеся вдоль центральной просвета сосуда может быть использован для отслеживания средней скорости в толще воды, окружающей клетку (отношение скорости эритроцитов, чтобы средняя скорость воды близка к 1,8 для 6 мкм красных клеток диаметром 30 мкм судна в). ^8,14 Таким образом, если скорость маркера клетки (в мкм / сек) в направлении блокатор V мкм / сек по сравнению с первым 2-5 сек после окклюзии, а радиус судно г, объем жидкости фильтруется через стенку микрососудов между этой эритроцитов и месте окклюзии (J _В) πr ^{2 В} мкм ³ / сек при условии, микрососудов имеет цилиндрическую. Далее площадь цилиндрической микрососудов (S) между этой маркера клетки и окклюзии сайта 2πrℓ, где ℓ начальное расстояние между маркером клеткии окклюзия сайт. Таким образом, средняя начальная поток transvascular на единицу площади (J _{V / S)} в установленном воды манометром VR / (2ℓ) давления.

Простейший оценка сосуд _L P выполнен если онкотического давления перфузату был установлен ниже по сравнению с давлением микрососудов (обычно 3,6 CMH _{2 O,} в онкотического давления бычьего сывороточного альбумина в концентрации 10 мг / мл и капилляр Давление больше, чем 30 CMH ₂ O). _L P рассчитывается как (J _{V / S)} / _(Р С -3) см / сек / см _Н 2 О, потому что коэффициент альбумин отражения (σ _{альбумин)} в состоянии управления близка к 0,9. При таком подходе быстрых изменений в L _р с временным разрешением порядка 1 мин может быть измерена путем установления свободного потока между последовательными мерами J _{V / S} при постоянном давлении, как показано в представительных результатов на рисунке 4. Такой подход мкгNORES небольшие изменения в онкотического давления альбумина, которые попадают в менее чем 1 КМЗ _{2 O,} когда коэффициент отражения падает ниже 0,5, но ошибка в оценке _L P остается менее 5% при _Р С больше, чем 30 КМЗ _{2 O} ,

Когда точное измерение как _L P и коэффициента отражения требуется, J _{V / S} измеряется в серии микрососудов давлениях ниже ожидаемого эффективного онкотического давления испытуемого макромолекулы. Наклон отношения между J _{V / S} и измеряет давление L _{р и} перехват на оси давлений, когда чистый приток равен нулю меры, оп (Рисунок 5). Демонстрация того, что СП линейно зависит от давления, также является важным проверка использования измерений одном давлении с использованием простой протокол, описанный выше (фиг.4), когда разность онкотического давление низкое по отношению к гидростатического прессаЮр.

Возможные источники ошибок. Есть несколько проблем, которые ставят под угрозу точное измерение. Неправильное закупоривать сосуд или повреждение стенки сосуда на результаты окклюзии сайта в утечке жидкости мимо места окклюзии, и движения маркеров клеток к окклюзии сайт быстрее, чем из-за transvascular обмена. В то время как маркер клетки обычно медленно двигаться в сторону места окклюзии, но не достигают его, утечка указывается, если маркер клетки отследить весь путь к окклюдером. С другой стороны, отказ, чтобы запечатать пипетки в микрососудов просвет в катетеризации сайте Результаты в недооценке J _{V / S.} Жидкость утечки из пипетки на superfusate или к просвета сосуда вверх по течению катетеризации сайта вызывает значительное падение давления в пипетки. Такое обнаружении утечки, когда клетки в потоке микропипетки наконечник в более высокой скорости, чем те, в нижнем лу судналюди закупоренной судна. Тщательное репозиционирование микропипетку обычно запечатывает такой утечки. Другой вопрос возникает, если _L P стенки сосуда не является равномерным, как правило, имеющие один или несколько участков локализованного повреждения или воспаления. Маркер клетки отслеживать на сайте, если большинство поток transvascular сосредоточена там. Красный движение клеток по-прежнему измеряет поток transvascular, но мера J _{V / S} не является представителем большинства площади стен в тестовом сегменте.

Значение метода в отношении существующих методов. Два наиболее часто используемых метода для исследования регулирование эндотелиального барьера проницаемости и transvascular обмен: (1) в пробирке измерение обмен через культивируемых монослоев эндотелиальных клеток и (2) Измерение накопления примеси в образец ткани после метки вводится внутривенно в целого животного. Эксперименты в культуре эндотелиальных монослоев клеточных Favored поскольку клеточные функции могут быть более непосредственно изменены и имеется достаточно клеточный материал для подробной оценки молекулярных событий в эндотелиальных клетках. Однако в большинстве условий культивирования эндотелиальные клетки обычно не образуют барьер представителя проницаемости сосудов в естественных условиях. Модифицированный метод Лэндис описано выше было показано, чтобы быть надежным и надежная техника для расследования регулирование функции эндотелия барьер в интактных венулярного микрососудов. В руках опытного следователя в паре измерений проницаемости под контроля и испытаний условиях, когда некоторые из подходов, используемых в культуре клеток (например, изображения клеточных компонентов, изменение сигнальных путей) могут быть применены. Важность экспериментов в интактных микрососудов была продемонстрирована, показывая значительные различия между механизмами, которые регулируют проницаемость барьера в отдельности перфузии microvessels и те часто описывается в культивируемых эндотелиальных монослоев. Примеры включают в себя ответы на сдвиг, экспозицию тромбина, и вклад механизмов сократительных к образованию воспалительных зазора ^2-6,9,16. Измерения накопления примеси в неповрежденной сосудистого русла сохраняет больше нормальной физиологической функции, но прямое следствие реальных изменений в сосудистой проницаемости под угрозу из-за накопления Индикатор может увеличиваться в результате увеличения перфузии (увеличенной площадью поверхности для обмена) с или без увеличения в Проницаемость стенки. Таким образом, степень увеличения проницаемости может быть завышена, когда расширение сосудов увеличивает количество перфузии сосудов и тем самым общее накопление растворенного вещества больше, чем за счет увеличения только ³⁴ проницаемости сосудов.

Будущие приложения. Диапазон вариантов, чтобы изменить клеточную структуру и функции при тех же условиях, в Инди проницаемостидуальные судов измеряется непосредственно во время microperfusion, как ожидается, увеличится. Кроме того, ожидается, что применение методов в генетически модифицированных крыс брыжейки может решить долгосрочные проблемы, которая существовала для генетически модифицированных мышей. В частности, когда генетически модифицированные мыши стали доступны ожидалось, что microperfusion может быть продлен по расследованию микрососудов в их сосудов брыжейки. В то время как некоторые microperfusion эксперименты были проведены в микрососудах мыши брыжейки ^35, мышей, как правило, меньше микрососудов в их брыжеечной ткани, чем у крыс, и эти сосуды часто короткие и сильно разветвленные, в отличие от более подходящие длинные (> 500 мкм) прямые сосуды, можно найти у крыс. Таким образом, эксперименты по исследованию модуляции transvascular обмен генетически мышей полагались на анализы, такие как Miles ³⁴ или технически сложных, но более надежных экспериментов, которые трассирующих мерыизменения в обоих сосудистых и внесосудистой накопления флуоресцентного меченых зондов ³⁶ тестов.

Модификации метода. В приведенных выше протоколов, изменения в составе перфузата требуется изменение микропипетки. Альтернативный подход, чтобы пополнить микропипетки на месте с помощью дозаправки аппарат. Эта процедура была выполнена как описано подробно ^37. Ограничение состоит в том, что время, чтобы изменить состав перфузату в пипетки не так быстро, как достигнуто путем замены пипетки, но процедура особенно полезна, если необходимо заливать в микрососудов в течение длительных периодов времени.

То же самое microperfusion подошел может быть продлен для измерения коэффициентов проницаемости для флуоресцентно меченных растворенное вещество ^31,38-40. В этом случае одна стволом микропипетки заменен двойным стволом (тета) пипетки ⁴¹ и сосуд перфузиипопеременно с тест флуоресцентного вещества для измерения ткани накопления относительно просвета содержание, и то же самое Перфузат без флуоресцентного вещества для очистки ткани и позволяют повторное измерение накопления растворенного вещества. При измерения transvascular водных потоков должны быть объединены с измерениями коэффициента проницаемости растворенных веществ с использованием флуоресцентно меченных тестовые растворы, флуоресцентные показатели внутриклеточного состава, или конфокальной микроскопии клеточных компонентов, более сложные компьютерным управлением флуоресцентный микроскоп требуется. Поскольку эти исследования обычно требуют линзы с высоким увеличением и более короткий рабочий расстоянии, кварц столб используется для хранения брыжейки заменяется скольжением стеклянной крышкой, приклеенной к опоре оргстекла в ткани также на микроскопа лотка. Повышенная доступность 3-D принтеры, позволит высокой точности изготовления заказных лотков, которые отвечают узкий допуск, необходимый для позиционирования больший diameteг объективы с более коротким рабочим расстоянием по отношению к выбранным микрососудов.

Наличие полезных микрососудов брыжейки в варьируется от возраста, пола и деформации. Таким образом, выбор штамма крысы и использования мужского или женского пола будет зависеть от конкретных вопросов решаются. Для многих из наших недавних исследований мы использовали крыс-самцов Sprague-Dawley, которые акклиматизировались в нашем вивария, по крайней мере за неделю до использования в возрасте около 3-4 месяцев на котором мы находим у них вообще есть свободные длинные, прямые брыжеечные микрососудов. Напротив, наши коллеги успешно использовали женщин Спрэг Dawley крыс 2-3 месячного возраста ^13.

Роль эритроцитов. Основная роль эритроцитов, как описано выше, чтобы отслеживать движение воды transvascular предполагая клетка действовала в качестве инертного, нейтральную плавучесть показатели потоков воды после микрососудов были окклюзии. В дополнение к этому фундаментальной роли, егоВ настоящее время признано, что эритроциты способствовать стабильности барьера путем подачи S1P в перфузат, когда альбумина в настоящее ^31,42,43. Есть несколько важных последствия этих наблюдений. При отсутствии эритроцитов или с использованием альтернативных маркеров потоке инертного базовый проницаемости, вероятно, будет менее стабильным. Рекомендуется измерения S1P должны быть сделаны в всех perfusates, используемых в microperfusion экспериментов.

Acknowledgments

Эта работа была выполнена при поддержке Национального института здравоохранения грантов HL44485 и HL28607.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MICROSCOPE, TABLE AND STAGE
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Olympus	CK-40	try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Leica	DMIL	try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
narrow diameter, long working distance objective: example	Nikon	Nikon E Plan 10×/0.25 LWD
stage platform--1/2 inch or 1 cm sheet steel	welding shop		this should be heavy to reduce vibration
Unislide x-y table: dove tail slides	Velmex	AXY4006W1
VIDEO
CCD video camera: example	Pulnix	TM-7CN (no longer available)	no color needed
video capture system with audio--generic
video playback system (completely still frame, single frame motion)
small microphone
MICROMANIPULATORS, HOLDERS
micromanipulator, XYZ (3)	Prior/Stoelting (no longer available)		look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning
hydraulic probe drive, one way	FHC	50-12-1C	need to buy either manual drive or electronic drive
manual drum drive	FHC	50-12-9-02
or hydraulic drive, 3 way	Siskiyou Corporation	MX610 (1-way) or MX630 (3-way)	great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years
connectors/rods/holders	Siskiyou Corporation	MXC-2.5, MXB etc.
pin vise	Starrett	162C	to hold restrainer
pipette holder	World Prescision Instruments	MPH3
water manometer ~120 cm
MICROSCOPE TRAY
clear Plexiglas for microscope tray for animal
3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall	Quartz Scientific Inc.	custom	(or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective
Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)
medical adhesive for tissue well	NuSil	MED-1037
All-purpose silicone rubber heat mat, 5" L x 2" W	Cole Parmer	EW-03125-20	heater for microscope tray--needs cord and controller--240V version available
Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC	Cole Parmer	EW-03122-75
STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out	Cole Parmer	EW-01575-00
PIPET MANUFACTURE
vertical pipette puller	Sutter Instrument Company	P-30 with nichrome filament
1.5 mm OD thin wall capillary tubing	Sutter Instrument Company	B150-110-10
pipette grinder air stone and dissection microscope--see reference in text			or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments
RX Honing Machine, System II	RX Honing Machine Corporation	MAC-10700 Rx System II Machine	alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle
with ceramic sharpening disc	RX Honing Machine Corporation		use "as is" or attach lapping film
lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um	3M	part no. 051144 80827	268X Imperial lapping film sheets with adhesive back--can be purchased from Amazon

References

1. Curry, F. R. Permeability measurements in an individually perfused capillary: the 'squid axon' of the microcirculation. Experimental physiology. 93, 444-446 (2008).
2. Curry, F. R., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
3. Curry, F. R., Adamson, R. H. Tonic regulation of vascular permeability. Acta physiologica. 207, 628-649 (2013).
4. Michel, C. C. Fluid exchange in the microcirculation. The Journal of physiology. 557, 701-702 (2004).
5. Tarbell, J. M., Simon, S. I., Curry, F. R. Mechanosensing at the vascular interface. Annual review of biomedical engineering. 16, 505-532 (2014).
6. Sarelius, I. H., Kuebel, J. M., Wang, J., Huxley, V. H. Macromolecule permeability of in situ and excised rodent skeletal muscle arterioles and venules. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 290, H474-H480 (2006).
7. Curry, F. E., Frokjaer-Jensen, J. Water flow across the walls of single muscle capillaries in the frog, Rana pipiens. The Journal of physiology. 350, 293-307 (1984).
8. Michel, C. C., Mason, J. C., Curry, F. E., Tooke, J. E., Hunter, P. J. A development of the Landis technique for measuring the filtration coefficient of individual capillaries in the frog mesentery. Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 59, 283-309 (1974).
9. Adamson, R. H., Zeng, M., Adamson, G. N., Lenz, J. F., Curry, F. E. PAF- and bradykinin-induced hyperpermeability of rat venules is independent of actin-myosin contraction. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 285, H406-H417 (2003).
10. Huxley, V. H., Rumbaut, R. E. The microvasculature as a dynamic regulator of volume and solute exchange. Clinical and experimental pharmacology, & physiology. 27, 847-854 (2000).
11. Rumbaut, R. E., Wang, J., Huxley, V. H. Differential effects of L-NAME on rat venular hydraulic conductivity. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. , 279-H2023 (2000).
12. Yuan, D., He, P. Vascular remodeling alters adhesion protein and cytoskeleton reactions to inflammatory stimuli resulting in enhanced permeability increases in rat venules. Journal of applied physiology. 113, 1110-1120 (2012).
13. Zhou, X., He, P. Temporal and spatial correlation of platelet-activating factor-induced increases in endothelial [Ca(2)(+)]i, nitric oxide, and gap formation in intact venules. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 301, H1788-H1797 (2011).
14. Adamson, R. H., et al. Oncotic pressures opposing filtration across non-fenestrated rat microvessels. The Journal of physiology. 557, 889-907 (2004).
15. Adamson, R. H., et al. Epac/Rap1 pathway regulates microvascular hyperpermeability induced by PAF in rat mesentery. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 294, H1188-H1196 (2008).
16. Curry, F. E., Zeng, M., Adamson, R. H. Thrombin increases permeability only in venules exposed to inflammatory conditions. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 294, H1188-H1196 (2003).
17. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature. 32, 347-355 (2014).
18. Bagher, P., Davis, M. J., Segal, S. S. Intravital macrozoom imaging and automated analysis of endothelial cell calcium signals coincident with arteriolar dilation in Cx40(BAC) -GCaMP2 transgenic mice. Microcirculation. 18, 331-338 (2011).
19. Duza, T., Sarelius, I. H. Increase in endothelial cell Ca(2+) in response to mouse cremaster muscle contraction. The Journal of physiology. 555, 459-469 (2004).
20. Oshiro, H., et al. L-type calcium channel blockers modulate the microvascular hyperpermeability induced by platelet-activating factor in vivo. Journal of vascular surgery. 22, 732-739 (1995).
21. Chen, W., et al. Atrial natriuretic peptide-mediated inhibition of microcirculatory endothelial Ca2+ and permeability response to histamine involves cGMP-dependent protein kinase I and TRPC6 channels. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 33, 2121-2129 (2013).
22. Harris, N. R., Whitt, S. P., Zilberberg, J., Alexander, J. S., Rumbaut, R. E. Extravascular transport of fluorescently labeled albumins in the rat mesentery. Microcirculation. 9, 177-187 (2002).
23. Yuan, W., Li, G., Zeng, M., Fu, B. M. Modulation of the blood-brain barrier permeability by plasma glycoprotein orosomucoid. Microvascular research. 80, 148-157 (2010).
24. Sugiura, Y., Morikawa, T., Takenouchi, T., Suematsu, M., Kajimura, M. Cilostazol strengthens the endothelial barrier of postcapillary venules from the rat mesentery in situ. Phlebology / Venous Forum of the Royal Society of Medicine. 29, 594-599 (2014).
25. Guo, M., et al. Fibrinogen-gamma C-terminal fragments induce endothelial barrier dysfunction and microvascular leak via integrin-mediated and RhoA-dependent mechanism. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29, 394-400 (2009).
26. Dewar, A. M., Clark, R. A., Singer, A. J., Frame, M. D. Curcumin mediates both dilation and constriction of peripheral arterioles via adrenergic receptors. The Journal of investigative dermatology. 131, 1754-1760 (2011).
27. Lee, J. F., et al. Balance of S1P1 and S1P2 signaling regulates peripheral microvascular permeability in rat cremaster muscle vasculature. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 296, H33-H42 (2009).
28. Landis, E. M. Microinjection studies of capillary permeability. II. The relation between capillary pressure and the rate at which fluid passes through the walls of single capillaries. Am J Physiol. 82, 217-238 (1927).
29. Curry, F. E., Huxley, V. H., Sarelius, I. H. Techniques in cardiovascular physiology Part 1. Linden, R. J. P3/1, Elsevier Scientific Publishers Ireland Ltd. 1-34 (1983).
30. Vurek, G. G., Bennett, C. M., Jamison, R. L., Troy, J. L. An air-driven micropipette sharpener). J Appl Physiol. 22, 191-192 (1967).
31. Curry, F. E., Clark, J. F., Adamson, R. H. Erythrocyte-derived sphingosine-1-phosphate stabilizes basal hydraulic conductivity and solute permeability in rat microvessels. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 303, H825-H834 (2012).
32. Bagher, P., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Microiontophoresis and micromanipulation for intravital fluorescence imaging of the microcirculation. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
33. Adamson, R. H., et al. Attenuation by sphingosine-1-phosphate of rat microvessel acute permeability response to bradykinin is rapidly reversible. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 302, H1929-H1935 (2012).
34. Bates, D. O. Vascular endothelial growth factors and vascular permeability. Cardiovasc Res. 87, 262-271 (2010).
35. Adamson, R. H., et al. Rho and rho kinase modulation of barrier properties: cultured endothelial cells and intact microvessels of rats and mice. The Journal of physiology. 539, 295-308 (2002).
36. Curry, F. R., et al. Atrial natriuretic peptide modulation of albumin clearance and contrast agent permeability in mouse skeletal muscle and skin: role in regulation of plasma volume. The Journal of physiology. 588, 325-339 (2010).
37. Neal, C. R., Bates, D. O. Measurement of hydraulic conductivity of single perfused Rana mesenteric microvessels between periods of controlled shear stress. The Journal of physiology. 543, 947-957 (2002).
38. Adamson, R. H., et al. Albumin modulates S1P delivery from red blood cells in perfused microvessels: mechanism of the protein effect. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 306, H1011-H1017 (2014).
39. Huxley, V. H., Wang, J. J., Sarelius, I. H. Adaptation of coronary microvascular exchange in arterioles and venules to exercise training and a role for sex in determining permeability responses. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 293, H1196-H1205 (2007).
40. Huxley, V. H., Williams, D. A. Basal and adenosine-mediated protein flux from isolated coronary arterioles. Am J Physiol. 271, H1099-H1108 (1996).
41. Davis, M. J., Gore, R. W. Double-barrel pipette system for microinjection. Am J Physiol. 253, H965-H967 (1987).
42. Adamson, R. H., et al. Sphingosine-1-phosphate modulation of basal permeability and acute inflammatory responses in rat venular microvessels. Cardiovasc Res. 88, 344-351 (2010).
43. Zeng, Y., Adamson, R. H., Curry, F. R., Tarbell, J. M. Sphingosine-1-phosphate protects endothelial glycocalyx by inhibiting syndecan-1 shedding. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. , H306-H363 (2014).

Tags

Молекулярная биология выпуск 103 Microperfusion крыса брыжейки гидравлическая проводимость проницаемость Лэндис техника