Microperfusion techniek te onderzoeken verordening van microvessel permeabiliteit in Rat Mesenterium

Abstract

Experimenten om de permeabiliteit eigenschappen individueel geperfundeerde microvaatjes meten een brug slaan tussen onderzoek naar de moleculaire en cellulaire mechanismen reguleren van vasculaire permeabiliteit in gekweekte endotheliale cel monolagen en de functionele eigenschappen van uitwisseling gehele microvasculaire bedden. Werkwijze voor canule en perfuseren venulaire haarvaten van rat mesenterium en meet de doorlatendheid van het microvaatje wand wordt beschreven. De belangrijkste apparatuur die nodig is voorzien van een intravitale microscoop met een grote aangepaste stadium dat micromanipulators ondersteunt drie verschillende Microtools positioneren: (1) een afgeschuinde glas micropipet om canule en perfuseren de microvessel; (2) een glazen micro-occlusie te transient blokkeren perfusie en maken meting van transvasculaire waterstroom beweging bij een gemeten hydrostatische druk, en (3) een stompe glasstaaf de mesenteriale weefsel stabiliseren op de plaats van de canule. De gemodificeerde Landis micro-occlusie technique gebruikt rode cellen gesuspendeerd in kunstmatige perfusaat als markers van transvasculaire vloeiende beweging, en ook maakt herhaalde metingen van deze stromen als experimentele omstandigheden worden gewijzigd en hydrostatische en colloïd osmotische drukverschil over de microvaatjes worden zorgvuldig gecontroleerd. Metingen van doorlatendheid eerste gebruik van een controlegroep perfusaat, dan na opnieuw canulatie van dezelfde microvessel met de test perfusates vrijgave gepaarde vergelijkingen van de microvessel respons onder deze goed gecontroleerde omstandigheden. Pogingen om de methode uit te breiden tot bloedvaten in het mesenterium van muizen met genetische modificaties wordt naar vasculaire permeabiliteit modificeren waren ernstig beperkt door het ontbreken van lange rechte en onvertakte microvaatjes in de muis mesenterium, maar de recente beschikbaarheid van de ratten met gelijke genetische modificaties behulp het CRISPR / Cas9 technologie zal naar verwachting nieuwe gebieden van onderzoek, waar de hierin beschreven methoden kunnen worden toegepast openen.

Introduction

Microperfusion in het vaatstelsel inhoudt vaststelling gecontroleerde stroom van een kunstmatige perfusaat van bekende samenstelling via een micropipet in een bloedvat gewoonlijk minder dan 40 micrometer in diameter. De geperfuseerde vaartuig blijft in zijn normale omgeving en weefsel wordt geperfuseerd met bloed van het dier tot het moment van de canule. Bij gebruik in combinatie met een reeks van videobeelden of fluorometrische technieken in situ microperfusion maakt meting van water en opgeloste stof stroomt over de wanden van kleine bloedvaten onder omstandigheden waarbij de drijvende krachten van deze stromen zijn bekend en de permeabiliteit eigenschappen van de vaatwand kan worden direct geëvalueerd. Verder, door het regelen van de samenstelling van de vloeistof rond het microvaatje in het weefsel (perfusaat en superfusate), de regulering van microvaatje permeabiliteit en uitwisseling kan worden onderzocht doordat de endotheelcellen die het microvaatje wand te worden blootgesteld aan diverse eXperimental voorwaarden voor nauwkeurig gemeten tijd (sec HR) (agonisten, gewijzigde perfusie voorwaarden, fluorescerende indicatoren intracellulaire samenstelling en signalering te meten). Bovendien kunnen ultrastructurele of cytochemische evaluaties van belangrijke cellulaire moleculaire structuren reguleren van de barrière onderzocht in dezelfde microvaatjes waarin doorlaatbaarheid wordt direct gemeten. De benadering vormt aldus een brug tussen onderzoek naar de cellulaire en moleculaire mechanismen die endotheliale barrièrefunctie passen in gekweekte endotheliale monolagen en onderzoek intacte microvaatjes. Bekijk de volgende beoordelingen voor verdere evaluatie ^1-6.

Een beperking van microperfusion is dat het alleen in microvasculaire bedden die dun, transparant zijn en voldoende structurele integriteit cannulatie met een glazen micropipet mogelijk kan worden gebruikt. Terwijl de vroege onderzoeken gebruikt kikker bloedvaten in mesenterium en dun cutane pectoris muscle ^7,8, verreweg het meest gebruikte preparaat in zoogdierlijke modellen de ratten mesenterium ^9-15. De meeste onderzoeken hebben zich gericht op acute veranderingen in vasculaire permeabiliteit bestudeerd over een periode van 1-4 uur, maar meer recente onderzoeken zijn uitgebreid tot metingen aan individuele vaartuigen 24-72 uur na een initiële perfusie ^12,16. De recent ontwikkelde CRISPR technologie, die belooft om meer genetisch gemodificeerde rat modellen beschikbaar te stellen voor het bestuderen van de vasculaire permeabiliteit regelgeving ¹⁷ moeten de in deze mededeling beschreven methoden kunnen worden toegepast in venulaire microvaten van het mesenterium in deze belangrijke nieuwe rat modellen.

De werkwijze vereist een omgekeerde microscoop uitgerust met een op maat gebouwde microscooptafel groot genoeg is om zowel de dieren preparaat en ten minste drie micromanipulators gebruikt om positie microtools nabij geperfundeerde vat en een perfusie micropipet passen aan het vat houdenlumen. Bijvoorbeeld een aangepaste platform voor een xy microscoop podium (ongeveer 90 × 60 cm) kunnen worden vervaardigd uit een 1 cm dikke stalen plaat met een rust-proof coating. Het podium is om een ​​technische index tafel of twee dove-tail dia's gemonteerd in een rechte hoek en ondersteund op Teflon pilaren of een bal transfers voor beweging in het horizontale vlak bevestigd. Een typische rig (zie figuur 2) heeft veel gemeen met de microscoop en micropositionering apparatuur die wordt gebruikt voor een reeks van intravitale microcirculatie experimenten zoals die tot enkele bloedvat flow en hematocriet, lokale zuurstof levering van bloed perfusie haarvaten, regulering van de vasculaire gladde meten spierspanning, en de lokale microvasculaire ophoping van fluorescerende tracers geïnjecteerd in de hele omloop. ^18-26

Het fundamentele aspect van de techniek is het meten van de volumestroom (J _v) over een bepaald oppervlak (S) van het microvaatje wand. Volbrengendit via de gemodificeerde Landis techniek hierin beschreven een eenvoudige omgekeerde microscoop voldoende. Een kleine videocamera gemonteerd op de afbeelding poort en het videosignaal, met een toegevoegde tijdbasis, wordt weergegeven op een videomonitor en geregistreerd in digitale vorm op een computer of een digitaal of analoog signaal op een videorecorder. Zodra de canule microvaatje wordt het gedeelte van het microvaatje zichtbaar voor de camera kan worden veranderd door bewegen van de manipulatoren en fase als een eenheid zonder verstoring van de canule.

Meting van transvasculaire stromen kunnen ook worden gecombineerd met uitgebreide onderzoekingen met een gesofisticeerde fluorescentiemicroscoop met geschikte filters zoals installaties voor metingen van opgeloste permeabiliteit, fluorescent verhouding bewaking van cytoplasmatisch calcium of andere cellulaire mechanismen en confocale beeldvorming ^{6,12,13, 27.} Een belangrijk voordeel van microperfusion aanpak is de mogelijkheid om herhaalde metingen maken op hetzelfde vaartuig, Onder gecontroleerde verandering van de drijvende kracht, zoals hydrostatische en oncotische drukken, of geïnduceerde verandering in het vat reacties op ontstekingen. De meest voorkomende ontwerp is een gepaarde vergelijking van gemeten doorlatendheid _(Lp) op hetzelfde vaartuig met het vaartuig eerst geperfuseerd via een micropipet gevuld met een controle perfusaat en de rode celsuspensie een basislijn permeabiliteit staat vast, daarna met een tweede pipet het testmiddel toegevoegd aan het perfusaat. Meerdere canuleringen zijn mogelijk met de cyclus herhaald na reperfusie de controle pipet.

Het onderhavige protocol toont de infusen en microperfusion van een venular vaartuig rat mesenterium water fluxen over het microvaatje wand nemen en te meten het L _p van de vaatwand, een bruikbare index van de permeabiliteit van de gemeenschappelijke route voor water en opgeloste stoffen tussen de intacte endotheliale barrière. De procedure wordt de gewijzigde Landis techniq genoemdUE omdat de oorspronkelijke Landis principe van het gebruik van de relatieve beweging van rode cellen als maat van transvasculaire vloeistofuitwisseling na perfusie geblokkeerd bewaard ^28, maar het aantal experimentele condities (bijvoorbeeld de hydrostatische en albumine oncotische drukverschillen over het microvaatje wand) beschikbaar na microperfusion is veel groter dan in uncannulated bloed perfusie microvaten ^8,29.

Protocol

Ethiek Verklaring: Alle procedures werden beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite goedgekeurd.

1. Voorafgaande Fabrication van Micropipetten, fixeren en blokkers

1. Trek verscheidene schone borosilicaatglas capillairen doormidden met een elektronische puller ingesteld dat, wanneer teruggetrokken, de gestrekte deel van de buis ongeveer 1 cm in lengte en de twee helften enigszins symmetrisch. Zorg dat de tapsheid in overeenstemming met de afmetingen in figuur 1. Gebruik beide helften van micropipetten, restrainers en blockers.
   1. Bevel de micropipetten met behulp van een lucht aangedreven slijpschijf ³⁰ met 0,5 micrometer schuurpapier gebaad met water. Stel de hoek van de micropipet houder, zodat het ongeveer 30 graden van horizontaal.
   2. Grondig te wassen en drogen van de micropipetten met behulp van zuigkracht om schone aceton trekken door de tip en de schacht. Inspecteer de micropipetten (Figuur 1A) met behulp van een kleine rechtopstaande microscoop met 4 × en 40 × doelstellingen voorzien van een alligator clip micropipet houder en een oculair dradenkruis.
   3. Selecteer micropipetten met tip opening ongeveer 50 micrometer lang met een schuine kant waarvan de lengte / breedte verhouding is tussen de 3.1 en 3.5 en met een sterk taps toelopende punt dat helpt doordringen in de taaie collageen vezels in het mesenterium.
   4. Slaan 15-20 micropipetten van lichtjes verschillende grootte in een stofvrije doos.
2. Maak restrainers met getrokken capillaire buisjes bereid in stap 1.1). Houd een getrokken glas capillair kort bij een MICROVLAM een stomp uiteinde (Figuur 1B) te vormen. Opslaan meerdere in een stofvrije doos.
3. Maak microoccluders met getrokken capillaire buisjes bereid in stap 1.1). Houd een getrokken capillaire buis onder een MICROVLAM buigt (met een slang adapter, bijv., 23G), de dunne stift (ongeveer 4 mm van top) tot een hoek van bijna 120 graden maakt met de as (

2. Animal Voorbereiding en Chirurgie

1. Verdoven mannelijke (350-450 g) of vrouwelijke Sprague-Dawley-ratten (200-300 g) met pentobarbital natrium (80-100 mg / kg, Sigma-Aldrich, P3761) via subcutane injectie; beschermen mesenterium door geen intraperitoneale injectie.
2. Gedurende chirurgische procedures en experimentele protocollen houden verdoofd door aanvullende injecties (30 mg / kg) indien nodig. Bepaal de diepte van de anesthesie door teen knijpen of cornea reflex. Na voltooiing van de experimentele procedure, euthanaseren de rat via overdosis pentobarbital of intracardiale injectie van een verzadigde kaliumchloride onder verdoving.

3. Bereid Solutions en Erythrocyten voor gebruik als Flow Markers

1. Bereid zoogdieren Ringer's oplossing voor superfusate en controle perfusaat oplossing (kenmerkend zoogdieren Ringer's oplossing bevattende 10 mg / ml vetzuurvrij runderserumalbumine, BSA).
   1. Filter perfusaat door 0,2 um spuit filters om minuscule deeltjes die de micropipet tip kunnen blokkeren te verwijderen; filter in kleine schone container.
2. Bereid erytrocyten door trekken ongeveer 0,2 ml bloed uit de staartader van de verdoofde rat in een 20G naald op een kleine spuit met 0,05 ml heparine (1000 U / ml) en overbrengen naar een 15 ml centrifugebuis bevattende ongeveer 14 ml zoogdier oplossing van Ringer-oplossing .
   1. Centrifuge zachtjes pak rode cellen (ongeveer max 200 xg gedurende 7 min). Trekken uit het supernatant en resuspendeer de rode cellen in Ringer-oplossing.
   2. Na centrifugeren en verwijderen van supernatant driemaal verlaten het verpakte rode cellen op de bodem van de buis voor later gebruik. Merk op dat deze procedure kan bloedplaatjes in het uiteindelijke perfusates tot minder dan 0,1% van het normale niveau ^31.

4. Schik de Tissue op de AnimalDienblad

1. Scheren de buik van de verdoofde rat van onder de navel tot zwaardvormig proces. Zorg ervoor dat het geschoren gebied strekt zich uit rond de rechterzijde (voor rat geplaatst aan de rechterkant), zodat haar niet vormen een lont aan de superfusate trekken uit van het weefsel ook. Verwijder gesneden haren met een natgemaakte gaasje of weefsel.
   1. Houd de huid met een stompe getande pincet en een middellijn incisie (2-3 cm lang) door de huid met behulp van een stevige schaar. Met een fijne (iris) schaar maken een soortgelijke incisie door de linea alba, het opheffen van de buikwand met gekartelde tang om te voorkomen dat schade aan de darmen.
   2. Met het dier op zijn kant op het dier lade, trek de darmen uit de buikholte met behulp van wattenstaafje applicators (houten stok) gedrenkt in Ringer's oplossing en stompe gekartelde tang. Schik de darm in het weefsel goed, zodat het mesenterium is gedrapeerd over de pilaar voor het bekijken door de microscoop (pote zorg om te voorkomen dat het aanraken van het mesenteriumntially beschadigen microvaten) met ofwel een tang of katoen.
      Opmerking: Het dier tray (figuur 2A) kan worden geconstrueerd uit plexiglas en vereist een weefsel vormt (ongeveer 3 mm diep), een optisch helder pijler (bijvoorbeeld gepolijst kwarts ongeveer 2 cm diameter en 5 mm hoog.), En een verwarmingskussen aangepast aan de temperatuur van het dier te handhaven. De dikte van de pijler mag niet hoger zijn dan de werkafstand van de doelstelling.
2. Plaats het dier lade op de microscooptafel zodat het mesenterium zichtbaar door de oculairs.
3. Positioneer een zwaartekracht gevoede infuus lijn continu superfuse het mesenterium met zoogdieren Ringer's oplossing gehandhaafd op 35-37 ° C. Gebruik gaasjes aan de darm zijn plaats te houden, helpen vocht vasthouden, en lont overtollige Ringer's oplossing van het oppervlak. Pas de doorstroming en zuig het effluent een consistente superfusate dikte behouden.
4. Identificeren doel venulaire haarvaten, dievertakte segmenten benedenstrooms van convergerende stroming, één of twee vertakkingen distaal true capillairen. Vind een onvertakte vat (idealiter 600 tot 1000 urn lang) met stevige bloedstroom en vrij van witte bloedcellen plakken op de vaatwand.
5. Positioneer de test microvaatje in het midden van het veld microscoop en zet de restrainer in positie in de buurt van de gekozen cannulatie website.

5. Vul Micropipet en Mount in Holder

1. Net voordat cannuleren, schorten de rode cellen in het perfusaat. Voeg 7 pl erytrocytenconcentraat met 0,5 ml perfusaat in een schone reageerbuis boorsilicaat. Opmerking: hematocriet van 1-3% kunnen worden gebruikt, maar consistente hematocriet leiden tot consistente perfusaat concentraties van stoffen die vrijkomen uit de erytrocyten.
2. Breng een 1 ml spuit met een 23G slangadapter en PE-50 buizen (5-15 cm lengte). Trek het perfusaat / rode cel mengsel in de spuit. Omkeren spuit te mengen en te verdrijven alle luchtbellen uit slangen enadapter. Voor een hogere efficiëntie, pasvorm slang aan verschillende spuiten voor het experiment begint en bewaar ze in een stofvrije doos of plastic zak.
3. Vul het micropipet door het bevorderen van de slang in het grote einde van de micropipet totdat het aanligt tegen de taps toelopende regio. Breng een zachte snelle druk op de zuiger om de micropipet tip vullen. Opmerking: Een kleine stroom of een druppeltje moet zichtbaar zijn op de tip om volledige vulling bewijs.
4. Trek de buis, terwijl zachtjes te duwen op de zuiger om het bredere deel van de micropipet as te vullen. Verwijder kleine belletjes in de brede as door voorzichtig flicking de micropipet as. Opmerking: Een soortgelijke procedure is geïllustreerd ^32.
5. Plaats de micropipet in een pipet houder met een zijpoort die een continue vloeistof verbinding met een water manometer maakt. Opdat de houder, die een hydraulische aandrijving worden gebruikt om zeer fijne voortbeweging van de micropipet controle is bevestigd is onder een kleine hoek (15-25 °)de horizontale zodat de rand van de micropipet tapsheid heeft de darm of bak niet raken.
6. Monteer de hydraulische aandrijving op een beweegbare micromanipulator, waarin x, y en z-drives moet nauwe afstemming op de proef vat (figuur 2) in te schakelen.
7. Stel de hydrostatische druk waarbij de vloeistof in de micropipet met een injectiespuit of met water gevulde rubberen bol om de hoogte van de vloeistof verandert de waterkolom van de manometer tot ongeveer 40 cmH ₂ O boven het mesenterium.
8. Canule het microvaatje zo snel mogelijk na het vullen van de pipet; rode cellen naar de bodem van de pipet, zodat na ongeveer 40 min weinig rode cellen stroomt in het vat.

6. Microcannulation en microvasculaire Pressure Measurement

1. Voor het positioneren van de gevulde micropipet onder de microscoop, druk de weerhouder op het weefsel nabij het microvaatje toepassing van voldoende kracht te grijpen het weefsel. Teken desteunkorven rug enigszins uitrekken het weefsel in overeenstemming met de microvaatjes, zodat de spanningen in het mesenteriale collageenvezels zijn afgestemd op het vat.
   1. Lijn de micropipet met het schip en laat deze in het oog door de oculairs. Plaats de punt juist stroomopwaarts van de gekozen canulatieplaats en laat deze op het weefsel, zodat deze gedeeltelijk belemmert stroming binnen het vat, maar niet te verstoppen.
2. Canule het schip door het rijden van de pipet langzaam in het vat lumen met behulp van de hydraulische aandrijving. Wees niet te duwen door de onderkant van het schip.
   Opmerking: Als de micropipet komt het lumen, het perfusaat snel wast het bloed in het vat buiten het lumen en perfusievloeistof vrij stroomt in omloop distaal van het dier op de proef microvaatje, verplaatsen van sommige van de normale doorbloeding in de downstream vaten.
3. Verlaag de perfusiedruk door aanpassing van de manometer totdat het bloed (zoals aangegevendoor het dier rode bloedcellen) wordt terug getrokken in de perfusie segment; Dit bepaalt de balans druk waarbij de erytrocyten voorzichtig oscilleren in het lumen van het vat en meet de hydrostatische microvaatje druk _(Pc) aan het distale uiteinde van het microvaatje segment. Onderhouden schip perfusie bij elke druk boven deze balans druk.

7. Microocclusion en verzameling van gegevens

1. Optionele stap: Voor het gebruik van de micro-occluder om het schip te blokkeren, druk in het weefsel in een niet-gebruikte gedeelte van mesenterium ver van een schip, zodat de punt accumuleert een boete pad van weefsel dat de experimentele vaartuig beschermt tijdens herhaalde micro- afsluitingen.
2. Plaats de blocker boven de geperfuseerde vat nabij de onderrand van het veld microscoop.
3. Noteer de volgende met video en audio.
   1. Verbaal noteer de locatie van de blokkadelocatie en onderste schermrand zoals op het oculair reticule.
   2. Met de puntvan de blocker geplaatst boven het microvaatje, met de fijne z controle van de micromanipulator voorzichtig lager de blocker totdat de stroming in het vat is afgesloten. Let op de manometer druk _(Pc) met audio. Solliciteer occlusie meestal voor 3-10 seconden, en dan los, het herstel van gratis perfusie. Verplaats de blokkadelocatie het vaartuig naar de pipetpunt in 5-10 micrometer stappen basis van tijd (> 5 min na de initiële blok op een plaats), het aantal occlusies (3-5), om vaatwand schade aan de blokkadelocatie voorkomen .

8. Analyse van de gegevens en de meting van L _{p (waterdoorlaatbaarheid)}

1. Tijdens het afspelen, bepalen de beginafstand (ℓ ₀₎ een marker rode cel om de occlusie plaats door toepassing van een beeld van een micrometer en de bekende posities van de afbeeldingen. Bepaal de beginsnelheid (dl / dt) van de marker cel van haar positie in een aantal frames tijdens de 3-10 seconden van de opgenomen beelden. Afschrikkenmine vat de straal (r) van de beelden genomen tijdens occlusie (figuur 3).
2. Bereken J _v / S voor elke occlusie als (dl / dt) x (1 / ℓ ₀₎ x (r / 2). Bereken _Lp bij een constante druk (J _v / S) gedeeld door de aandrijvende druk (microvaatje druk - effectieve colloïd osmotische druk; zie bespreking).

Representative Results

Figuur 4 toont de resultaten van het meten van het tijdsverloop van veranderingen in _Lp in een rat venulaire microvaatje achtereenvolgens canule met vier perfusates. ³³ De omvang van _Lp berekend bij een constante druk werd gebruikt als een maat voor veranderingen in microvaatje permeabiliteit, eerste in de controle staat van een perfusievloeistof met 1% runderserumalbumine toen het vat werd blootgesteld aan het ontstekingsmiddel bradykinine (Bk) met een tweede micropipet met 10 nM Bk. Bradykinine een voorbijgaande toename _Lp die geretourneerd aan de controle waarde gedurende de volgende 10-15 min. Het vat werd vervolgens opnieuw geperfuseerd met control perfusaat gedurende 30 min om opnieuw een stabiele basislijn. Wanneer de microvaatjes werd geperfuseerd via een 4 micropipet met dezelfde concentratie Bk en 1 pM sfingosine-1-fosfaat (S1P) in het perfusaat, werd de reactie op Bk aanzienlijk verzwakt. De mate vandemping bij Bk en S1P werden geperfuseerd tegelijkertijd bleek vergelijkbaar met die gemeten in andere experimenten waarbij S1P het perfusaat was toegevoegd tot 20 minuten vóór de blootstelling aan Bk zijn. Deze resultaten tonen het vermogen van de mogelijkheid om meerdere metingen van _Lp maken op een schip, en laten zien dat de werking van een middel zoals S1P de bloedvatwand bij aanwezigheid van een inflammatoir middel stabiliseren kunnen worden opgelost tijdsperioden op de orde van enkele seconden. In afzonderlijke vaten control studies werden uitgevoerd met een soortgelijk protocol in afwezigheid van S1P uitgevoerd om aan te tonen dat de verzwakking van de Bk reactie niet het gevolg was anafylaxie.

Voor sommige experimentele modellen is het belangrijk te schatten zowel de opgeloste stof reflectiecoëfficiënt voor een macromolecule (σ) en _Lp. Dit wordt het beste bereikt door het meten J _v op verschillende drukken op elke afzonderlijke microvaatje. Figuur 5 toont een experiment in die zowel _p en L de effectieve oncotische druk van 5% albumine in het perfusaat (π _albumine = 27 cmH ₂ O bij 37 ° C) werden geschat onder omstandigheden waarin er geen albumine in het weefsel rondom het microvaatje rat. In deze experimenten J _v / S werd gemeten bij drie verschillende drukken. De _Lp is de helling van de relatie tussen J _v / S en druk, en het snijpunt van de druk as de effectieve oncotic drukverschil over de vaatwand (σΔπ).

Figuur 1. Microtools voor perfusie van individuele microvaten. (A) een micropipet voor canulatie van rat microvaatjes met een afgeschuinde punt. (B) een demper voor het vasthouden mesenterium weefsel stabiel dichtbij de plaats van de canule. (C) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Intravitale rig voor microperfusion. (A) Overzicht van dierlijke dienblad met micromanipulators en microtools georiënteerde over glas pijler. (B) Grote metalen podium gemonteerd op techniek tafel en het ondersteunen van lagers. (C) verdoofd rat met microtools in positie voor microperfusion van een microvessel. (D) Sluit het oog van mesenterium tijdens een experiment. Klik hier om een grotere versie van deze Figu bekijken opnieuw.

Figuur 3. Meting van de filtratiesnelheid per oppervlakte-eenheid met behulp van gemodificeerde Landis techniek. Dit schema toont een enkele microvessel canule met een micropipet en een afsluitende stang geplaatst boven het schip. Direct na het afsluiten van de microvaatje, de afstand (ℓ ₀₎ tussen de markering RBC reizen op de hartlijn van de afgesloten microvaatje de occlusieplaats opgenomen zodat de cel traject kan worden gevolgd 5-10 sec na occlusie. De beginpositie (ℓ ₀₎ en beginsnelheid (dl / dt) van de cel worden gebruikt om de gemiddelde filtratiesnelheid per oppervlakte-eenheid van microvaten wand tussen de markering cel en de plaats van occlusie berekenen. De microoccluder wordt vervolgens verhoogd, en gratis perfusie gevestigd voordat aanvullende metingen worden verricht.com / files / ftp_upload / 53.210 / 53210fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. Representatieve gegevens tonen aan dat sfingosine-1-fosfaat (S1P) remming werkt zeer snel bradykinine (Bk; 10 nM). Veroorzaakte een tijdelijke toename van microvaatjes _Lp. S1P toegepast gelijktijdig met tweede bradykinine (Bk) -test remde de acute Bk respons ten opzichte van de eerste Bk. Deze gegevens tonen aan dat de tijd van blootstelling aan een testmiddel kan worden aangepast aan de kinetische eigenschappen van een remmende respons te evalueren. Specifiek, S1P toegepast gelijktijdige alleen Bk sterk remde de Bk respons. S1P was 1 uM en Bk was 10 nM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5. Meting van J _v / S op verschillende drukken maakt zowel _Lp en de effectieve oncotische druk te meten. De filtratieflux, J _v / S, gemeten in het vat bij verschillende microvaatje hydrostatische drukken tijdens perfusie met BSA (50 mg ml ^{- 1;} π = 27 cmH _{2 O),} terwijl het mesenterium baadde met proteïnevrij Ringer-oplossing. De helling van de relatie tussen J _v / S en druk is de _Lp en het snijpunt van de druk as de effectieve oncotic drukverschil over de vaatwand. In dit experiment werd de Lp 1,2 x 10 ^-7 (cm sec ^-1 cmH O ₂ ^-1) en de σΔπ was 24 cmH ₂ O. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53210/53210fig5large.jpg" target = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Details van _Lp berekeningen. Hoewel transvasculaire vloeistofbeweging optreedt terwijl het vaartuig vrij geperfundeerd, die uitwisseling veel te klein om te worden gemeten tijdens vrije perfusie omdat het meestal minder dan 0,01% van het vaartuig perfusiesnelheid. Wanneer echter perfusie transiënt wordt gestopt door afsluiten van het microvaatje, transvasculaire stroom (dwz filtratie) wordt gemeten door de beweging van marker rode cellen in het lumen de vloeistofkolom tussen een marker rode cel en de plaats van occlusie kortere zie Figuur 3. Afhankelijk van de complexiteit en de duur van het experimentele protocol een onvertakte vaartuig 600 tot 1000 urn in lengte nodig.

Wanneer het vaartuig niet afgesloten en de manometerdruk rijdt stroming door het microvaatje, de drukval over de pipetpunt is groot zodat microvaatje druk tijdens vrije perfusie is typisch slechts eenEnkele cmH ₂ 0 boven de stroomafwaartse druk. Daarentegen, tijdens een occlusie van de drukval over de pipet is zeer klein vanwege vocht langzaam invoeren van het vat lumen te filtreren vloeistof over de vaatwand te vervangen. Zo tijdens occlusie de hydrostatische druk in het vat lumen (P _c) gelijk door de manometer die set. De oncotische druk in de mesenteriale weefsel is te verwaarlozen, zodat onmiddellijk na occlusie, worden transvasculaire vloeiende bewegingen van marker rode bloedcellen gemeten waar de hydrostatische druk is bekend en de oncotische druk in het lumen van het vat is gelijk aan die set in het perfusaat. Opeenvolgende metingen van L _p wordt scheepslengte verloor elke keer het blok site is gevorderd. Bovendien opeenvolgende recannulation vermindert beschikbare lengte vat.

De transvasculaire vloeistofstroming per oppervlakte-eenheid van de vaatwand (J _v / S) wordt geschat uit het tarief dat een gemeten lengte van de waterkolom in de microvEssel lumen tussen een marker rode cel en de occlusie website ofwel verkort (netto filtratie) en verlengt (netto reabsorptie). De aanname is dat een neutraal drijfvermogen rode cellen bewegen langs de middellijn van het lumen van het vat kan worden gebruikt om de gemiddelde snelheid van de waterkolom rondom de cel (de verhouding van rode bloedcellen velocity watersnelheid betekenen spoor ligt vlakbij 1,8 voor een 6 pm rode bloedcellen in een vat 30 urn diameter). ^8,14 Indien dus de snelheid van een marker cel (in um / sec) naar blocker V um / sec in de eerste 2-5 sec na occlusie, en de straal vaartuig r, het vloeistofvolume gefiltreerd over het microvaatje wand tussen die rode cel en de plaats van occlusie (J _v) is πr ² V ³ pm / sec veronderstelling dat de microvaatjes is cilindrisch. Verdere het gebied van een cilindrische microvaatje (S) tussen deze merker cel en de occlusieplaats is 2πrℓ, waarbij ℓ de initiële afstand tussen de cel markeren de occlusieplaats. Zo is de gemiddelde initiële transvasculaire stroom per oppervlakte-eenheid (J _v / S) tegen de door het water manometer Vr / (2ℓ) ingestelde druk.

De eenvoudigste schatting van verblijf _Lp wordt gedaan indien de oncotische druk van het perfusaat werd ingesteld vanaf opzichte van het microvaatje druk (kenmerkend 3,6 cmH ₂ O, de oncotische druk van runderserumalbumine in een concentratie van 10 mg / ml en een capillair druk groter dan 30 cmH ₂ O). L _p wordt berekend als (J _v / S) / (P _c -3) cm / sec / cm _H2O omdat albumine de reflectie coëfficiënt (σ _albumine) in het controlestadium dicht bij 0,9. Met deze benadering snelle veranderingen in _Lp met een tijdsresolutie van de orde van 1 min worden gemeten door vaststelling vrije stroming tussen opeenvolgende metingen van J _v / S bij constante druk zoals aangegeven in de representatieve resultaten in Figuur 4. Bovenstaande aanpak igNores kleine veranderingen in de oncotische druk van albumine die dalen tot minder dan 1 cmH ₂ O wanneer de reflectiecoëfficiënt beneden 0,5, maar de fout in de schatting van _Lp blijft minder dan 5% wanneer _Pc groter is dan 30 cmH ₂ O .

Wanneer nauwkeurige meting van zowel _Lp en reflectiecoëfficiënt vereist, J _v / S wordt gemeten bij een reeks microvaatje drukken beneden de verwachte effectieve oncotische druk van de test macromolecuul. De helling van de relatie tussen J _v / S en druk maatregelen _Lp en het snijpunt op de drukas als netto stroom nul maatregelen σπ (figuur 5). De demonstratie dat Jv lineair gerelateerd is aan de druk is ook een belangrijke validatie van het gebruik van enkelvoudige drukmetingen via het eenvoudiger hierboven beschreven protocol (figuur 4) als de oncotische drukverschil is laag ten opzichte van hydrostatische drukure.

Mogelijke foutbronnen. Er zijn verschillende problemen die nauwkeurige meting compromitteren. Het niet goed afsluiten het vaartuig of beschadiging van de vaatwand bij de afsluitplaats resultaten vloeistoflekkage langs de occlusieplaats en beweging van marker cellen naar de occlusieplaats sneller dan die vanwege transvasculaire wisselen. Dat marker cellen kan rijden langzaam naar de occlusieplaats, maar het niet bereiken, is een lek aangeduid als marker cellen te volgen tot aan de occlusie-inrichting. Aan de andere kant niet de pipet in het microvaatje lumen afdichting op de canulatieplaats resultaten in onderschatting van J _v / S. Vloeistoflekkage uit de pipet om het superfusate of het vat lumen stroomopwaarts van de canule gebied veroorzaakt een aanzienlijke drukval over de pipetpunt. Een dergelijke lekkage wordt gedetecteerd wanneer cellen in de micropipet tip stroom bij een hogere snelheid dan in de stroomafwaartse vat lumannen van het afgesloten vat. Zorgvuldige herpositionering van de micropipet afdicht meestal zo'n lek. Een ander probleem ontstaat als de _Lp van de vaatwand is niet uniform, gewoonlijk met één of meer plaatsen van plaatselijke beschadiging of ontsteking. Marker cellen aan de site als de meeste transvasculaire stroom wordt geconcentreerd. Rode cel beweging meet nog transvasculaire stroom, maar de maatregel J _v / S is niet representatief voor de meeste van de muur gebied binnen de test segment.

Betekenis van de methode met betrekking tot de bestaande methoden. De twee meest gebruikte methoden om de regulering van de endotheliale barrière permeabiliteit en transvasculaire uitwisseling te onderzoeken zijn (1) in vitro meting van de uitwisseling over gekweekte endotheelcellen monolagen en (2) het meten van de tracer accumulatie in een weefselmonster na de tracer wordt intraveneus geïnjecteerd in het gehele dier. Experimenten in gekweekte endotheliale cellen monolagen favored omdat de celfuncties directer kan worden gemodificeerd en voldoende celmateriaal vindt gedetailleerde evaluatie van moleculaire gebeurtenissen in endotheelcellen. Echter onder de meeste kweekomstandigheden de endotheelcellen niet vormen meestal de barrière vertegenwoordiger van vasculaire permeabiliteit in vivo. De gemodificeerde Landis hierboven beschreven techniek is aangetoond dat een robuuste en betrouwbare techniek om de regulering van de endotheliale barrièrefunctie in intacte venulaire haarvaten te onderzoeken. In de handen van een ervaren onderzoeker gepaarde metingen van permeabiliteit onder controle en testcondities waar sommige van de benaderingen in celkweek (bijvoorbeeld beeldvorming van cellulaire componenten, modificatie van signaaltransductiewegen) kunnen worden toegepast. Het belang van experimenten in intacte microvaatjes is aangetoond toont aanzienlijke verschillen tussen de mechanismen die barrière permeabiliteit te reguleren individueel geperfundeerde microvessel en die vaak beschreven in gekweekte endotheliale monolagen. Voorbeelden zijn reacties op afschuiving, blootstelling trombine, en de bijdrage van contractiele mechanismen inflammatoire spleetvorming ^2-6,9,16. Metingen van tracer accumulatie in intacte vaatbed behoudt meer normale fysiologische functie maar direct onderzoek van de werkelijke veranderingen in vasculaire permeabiliteit worden aangetast omdat tracer accumulatie kan toenemen als gevolg van toegenomen perfusie (grotere oppervlak voor uitwisseling) met of zonder een toename in de permeabiliteit van de wand. Dus de omvang van de doorlaatbaarheid verhoging kan worden overschat als vasodilatatie verhoogt het aantal geperfuseerde vaten en daardoor totale opgeloste accumulatie groter is dan die door toename in de vasculaire permeabiliteit alleen ^34.

Toekomstige toepassingen. Het bereik van mogelijkheden om cellulaire structuur en functie te wijzigen onder dezelfde voorwaarden als permeabiliteit van indiindividuele schepen wordt direct gemeten tijdens microperfusion zal naar verwachting toenemen. Voorts wordt verwacht dat de toepassing van de werkwijzen genetisch gemodificeerde rat mesenterium langdurig probleem dat bestaat genetisch gemodificeerde muizen kunnen oplossen. Specifiek, wanneer genetisch gemodificeerde muizen beschikbaar kwamen werd verwacht dat microperfusion kan worden uitgebreid tot microvaatjes in de mesenteriale vaten onderzoeken. Terwijl sommige microperfusion experimenten zijn in microvaatjes muis mesenterium ³⁵ afgerond, muizen hebben doorgaans minder microvaatjes in de mesenteriale weefsel dan ratten, en deze vaten zijn vaak kort en sterk vertakte, in tegenstelling tot geschiktere langere (> 500 pm) rechte vaartuigen die kan worden gevonden in ratten. Aldus experimenten om de modulatie van transvasculaire uitwisseling onderzoeken genetisch muizen aangevoerd testen zoals de Miles ³⁴ of technisch veeleisende, maar betrouwbaarder tracerproeven welke handelingveranderingen in zowel vasculaire en extravasculaire accumulatie van fluorescerende van radioactief gelabelde testsondes ^36.

Modificaties van de methode. In de bovenstaande protocollen, veranderingen in perfusaat samenstelling vereiste wijziging van micropipetten. Een alternatieve benadering is om de micropipet in situ vullen met een navullen inrichting. Deze procedure werd uitgevoerd zoals beschreven ^37. De beperking is dat de tijd om de samenstelling van het perfusaat in de pipet veranderen niet zo snel bereikt pipet vervanging, maar de procedure is vooral nuttig als het nodig is een microvaatje voor langere tijd te perfuseren.

Dezelfde microperfusion benaderd kan worden uitgebreid tot permeabiliteitscoëfficiënten meten fluorescent gelabelde opgeloste ^31,38-40. In dit geval is de enige loop micropipet wordt vervangen door een dubbele barrelled (theta) pipet ^{41 en} het vat is geperfuseerdeafwisselend test fluorescente opgeloste stof om weefselaccumulatie opzichte meten inhoud lumen en dezelfde perfusaat zonder fluorescente opgeloste stof om het weefsel wissen en herhaalde metingen van opgelost accumulatie. Bij metingen van transvasculaire waterstromen worden gecombineerd met metingen van opgelost doorlatendheidscoëfficiënt behulp van fluorescent gemerkte proef opgeloste stoffen, fluorescente indicatoren van intracellulaire preparaat of confocale beeldvorming van cellulaire componenten, meer geavanceerde computergestuurde fluorescentiemicroscoop vereist. Aangezien deze onderzoeken vereisen doorgaans lenzen met een hogere vergroting en veel kortere werkafstand wordt de kwarts pijler gebruikt om het mesenterium houden vervangen door een glazen afdekplaat slip vastgelijmd aan een plexiglas ondersteuning binnen het weefsel goed op de microscoop lade. De grotere beschikbaarheid van 3-D printers, zal zeer nauwkeurige vervaardiging van individuele lepels, waarbij de nauwe tolerantie volgens groter diamete positie voldoen toestaanr lenzen met kortere werkafstand ten opzichte geselecteerde microvaatjes.

De beschikbaarheid van bruikbare bloedvaten in het mesenterium varieert met de leeftijd, geslacht en stam. Daarom is de keuze van stam van rat en het gebruik van mannelijke of vrouwelijke zal afhangen van de specifieke vragen aangepakt. Voor veel van onze recente studies hebben we mannelijke Sprague-Dawley-ratten die worden geacclimatiseerd in onze dierenverblijf ten minste één week vóór gebruik ongeveer 3-4 maanden oud waarna we ze algemeen beschikbaar lange, rechte mesenteriale microvaatjes gebruikt. Daarentegen zijn collega's met succes vrouwelijke Sprague-Dawley ratten van 2-3 maanden oud ^13.

De rol van de erytrocyten. De primaire rol van rode cellen zoals hierboven beschreven werd om sporen water transvasculaire beweging uitgaande van cellen optrad als inert, neutraal drijfvermogen indicatoren water stroomt na de microvaatjes werden afgesloten. Naast deze fundamentele rol isThans wordt erkend dat de erytrocyten bij aan de stabiliteit van de barrière door het leveren S1P de perfusievloeistof wanneer albumine in onderhavige ^31,42,43. Er zijn een aantal belangrijke implicaties van deze observaties. Aangezien rode cellen of het gebruik van alternatieve markers stroom inert de basislijn doorlaatbaarheid waarschijnlijk minder stabiel. Aanbevolen wordt metingen S1P worden gemaakt in alle perfusates gebruikt microperfusion experimenten.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health subsidies HL44485 en HL28607.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MICROSCOPE, TABLE AND STAGE
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Olympus	CK-40	try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Leica	DMIL	try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
narrow diameter, long working distance objective: example	Nikon	Nikon E Plan 10×/0.25 LWD
stage platform--1/2 inch or 1 cm sheet steel	welding shop		this should be heavy to reduce vibration
Unislide x-y table: dove tail slides	Velmex	AXY4006W1
VIDEO
CCD video camera: example	Pulnix	TM-7CN (no longer available)	no color needed
video capture system with audio--generic
video playback system (completely still frame, single frame motion)
small microphone
MICROMANIPULATORS, HOLDERS
micromanipulator, XYZ (3)	Prior/Stoelting (no longer available)		look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning
hydraulic probe drive, one way	FHC	50-12-1C	need to buy either manual drive or electronic drive
manual drum drive	FHC	50-12-9-02
or hydraulic drive, 3 way	Siskiyou Corporation	MX610 (1-way) or MX630 (3-way)	great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years
connectors/rods/holders	Siskiyou Corporation	MXC-2.5, MXB etc.
pin vise	Starrett	162C	to hold restrainer
pipette holder	World Prescision Instruments	MPH3
water manometer ~120 cm
MICROSCOPE TRAY
clear Plexiglas for microscope tray for animal
3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall	Quartz Scientific Inc.	custom	(or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective
Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)
medical adhesive for tissue well	NuSil	MED-1037
All-purpose silicone rubber heat mat, 5" L x 2" W	Cole Parmer	EW-03125-20	heater for microscope tray--needs cord and controller--240V version available
Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC	Cole Parmer	EW-03122-75
STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out	Cole Parmer	EW-01575-00
PIPET MANUFACTURE
vertical pipette puller	Sutter Instrument Company	P-30 with nichrome filament
1.5 mm OD thin wall capillary tubing	Sutter Instrument Company	B150-110-10
pipette grinder air stone and dissection microscope--see reference in text			or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments
RX Honing Machine, System II	RX Honing Machine Corporation	MAC-10700 Rx System II Machine	alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle
with ceramic sharpening disc	RX Honing Machine Corporation		use "as is" or attach lapping film
lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um	3M	part no. 051144 80827	268X Imperial lapping film sheets with adhesive back--can be purchased from Amazon

References

1. Curry, F. R. Permeability measurements in an individually perfused capillary: the 'squid axon' of the microcirculation. Experimental physiology. 93, 444-446 (2008).
2. Curry, F. R., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
3. Curry, F. R., Adamson, R. H. Tonic regulation of vascular permeability. Acta physiologica. 207, 628-649 (2013).
4. Michel, C. C. Fluid exchange in the microcirculation. The Journal of physiology. 557, 701-702 (2004).
5. Tarbell, J. M., Simon, S. I., Curry, F. R. Mechanosensing at the vascular interface. Annual review of biomedical engineering. 16, 505-532 (2014).
6. Sarelius, I. H., Kuebel, J. M., Wang, J., Huxley, V. H. Macromolecule permeability of in situ and excised rodent skeletal muscle arterioles and venules. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 290, H474-H480 (2006).
7. Curry, F. E., Frokjaer-Jensen, J. Water flow across the walls of single muscle capillaries in the frog, Rana pipiens. The Journal of physiology. 350, 293-307 (1984).
8. Michel, C. C., Mason, J. C., Curry, F. E., Tooke, J. E., Hunter, P. J. A development of the Landis technique for measuring the filtration coefficient of individual capillaries in the frog mesentery. Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 59, 283-309 (1974).
9. Adamson, R. H., Zeng, M., Adamson, G. N., Lenz, J. F., Curry, F. E. PAF- and bradykinin-induced hyperpermeability of rat venules is independent of actin-myosin contraction. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 285, H406-H417 (2003).
10. Huxley, V. H., Rumbaut, R. E. The microvasculature as a dynamic regulator of volume and solute exchange. Clinical and experimental pharmacology, & physiology. 27, 847-854 (2000).
11. Rumbaut, R. E., Wang, J., Huxley, V. H. Differential effects of L-NAME on rat venular hydraulic conductivity. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. , 279-H2023 (2000).
12. Yuan, D., He, P. Vascular remodeling alters adhesion protein and cytoskeleton reactions to inflammatory stimuli resulting in enhanced permeability increases in rat venules. Journal of applied physiology. 113, 1110-1120 (2012).
13. Zhou, X., He, P. Temporal and spatial correlation of platelet-activating factor-induced increases in endothelial [Ca(2)(+)]i, nitric oxide, and gap formation in intact venules. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 301, H1788-H1797 (2011).
14. Adamson, R. H., et al. Oncotic pressures opposing filtration across non-fenestrated rat microvessels. The Journal of physiology. 557, 889-907 (2004).
15. Adamson, R. H., et al. Epac/Rap1 pathway regulates microvascular hyperpermeability induced by PAF in rat mesentery. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 294, H1188-H1196 (2008).
16. Curry, F. E., Zeng, M., Adamson, R. H. Thrombin increases permeability only in venules exposed to inflammatory conditions. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 294, H1188-H1196 (2003).
17. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature. 32, 347-355 (2014).
18. Bagher, P., Davis, M. J., Segal, S. S. Intravital macrozoom imaging and automated analysis of endothelial cell calcium signals coincident with arteriolar dilation in Cx40(BAC) -GCaMP2 transgenic mice. Microcirculation. 18, 331-338 (2011).
19. Duza, T., Sarelius, I. H. Increase in endothelial cell Ca(2+) in response to mouse cremaster muscle contraction. The Journal of physiology. 555, 459-469 (2004).
20. Oshiro, H., et al. L-type calcium channel blockers modulate the microvascular hyperpermeability induced by platelet-activating factor in vivo. Journal of vascular surgery. 22, 732-739 (1995).
21. Chen, W., et al. Atrial natriuretic peptide-mediated inhibition of microcirculatory endothelial Ca2+ and permeability response to histamine involves cGMP-dependent protein kinase I and TRPC6 channels. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 33, 2121-2129 (2013).
22. Harris, N. R., Whitt, S. P., Zilberberg, J., Alexander, J. S., Rumbaut, R. E. Extravascular transport of fluorescently labeled albumins in the rat mesentery. Microcirculation. 9, 177-187 (2002).
23. Yuan, W., Li, G., Zeng, M., Fu, B. M. Modulation of the blood-brain barrier permeability by plasma glycoprotein orosomucoid. Microvascular research. 80, 148-157 (2010).
24. Sugiura, Y., Morikawa, T., Takenouchi, T., Suematsu, M., Kajimura, M. Cilostazol strengthens the endothelial barrier of postcapillary venules from the rat mesentery in situ. Phlebology / Venous Forum of the Royal Society of Medicine. 29, 594-599 (2014).
25. Guo, M., et al. Fibrinogen-gamma C-terminal fragments induce endothelial barrier dysfunction and microvascular leak via integrin-mediated and RhoA-dependent mechanism. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29, 394-400 (2009).
26. Dewar, A. M., Clark, R. A., Singer, A. J., Frame, M. D. Curcumin mediates both dilation and constriction of peripheral arterioles via adrenergic receptors. The Journal of investigative dermatology. 131, 1754-1760 (2011).
27. Lee, J. F., et al. Balance of S1P1 and S1P2 signaling regulates peripheral microvascular permeability in rat cremaster muscle vasculature. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 296, H33-H42 (2009).
28. Landis, E. M. Microinjection studies of capillary permeability. II. The relation between capillary pressure and the rate at which fluid passes through the walls of single capillaries. Am J Physiol. 82, 217-238 (1927).
29. Curry, F. E., Huxley, V. H., Sarelius, I. H. Techniques in cardiovascular physiology Part 1. Linden, R. J. P3/1, Elsevier Scientific Publishers Ireland Ltd. 1-34 (1983).
30. Vurek, G. G., Bennett, C. M., Jamison, R. L., Troy, J. L. An air-driven micropipette sharpener). J Appl Physiol. 22, 191-192 (1967).
31. Curry, F. E., Clark, J. F., Adamson, R. H. Erythrocyte-derived sphingosine-1-phosphate stabilizes basal hydraulic conductivity and solute permeability in rat microvessels. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 303, H825-H834 (2012).
32. Bagher, P., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Microiontophoresis and micromanipulation for intravital fluorescence imaging of the microcirculation. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
33. Adamson, R. H., et al. Attenuation by sphingosine-1-phosphate of rat microvessel acute permeability response to bradykinin is rapidly reversible. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 302, H1929-H1935 (2012).
34. Bates, D. O. Vascular endothelial growth factors and vascular permeability. Cardiovasc Res. 87, 262-271 (2010).
35. Adamson, R. H., et al. Rho and rho kinase modulation of barrier properties: cultured endothelial cells and intact microvessels of rats and mice. The Journal of physiology. 539, 295-308 (2002).
36. Curry, F. R., et al. Atrial natriuretic peptide modulation of albumin clearance and contrast agent permeability in mouse skeletal muscle and skin: role in regulation of plasma volume. The Journal of physiology. 588, 325-339 (2010).
37. Neal, C. R., Bates, D. O. Measurement of hydraulic conductivity of single perfused Rana mesenteric microvessels between periods of controlled shear stress. The Journal of physiology. 543, 947-957 (2002).
38. Adamson, R. H., et al. Albumin modulates S1P delivery from red blood cells in perfused microvessels: mechanism of the protein effect. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 306, H1011-H1017 (2014).
39. Huxley, V. H., Wang, J. J., Sarelius, I. H. Adaptation of coronary microvascular exchange in arterioles and venules to exercise training and a role for sex in determining permeability responses. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 293, H1196-H1205 (2007).
40. Huxley, V. H., Williams, D. A. Basal and adenosine-mediated protein flux from isolated coronary arterioles. Am J Physiol. 271, H1099-H1108 (1996).
41. Davis, M. J., Gore, R. W. Double-barrel pipette system for microinjection. Am J Physiol. 253, H965-H967 (1987).
42. Adamson, R. H., et al. Sphingosine-1-phosphate modulation of basal permeability and acute inflammatory responses in rat venular microvessels. Cardiovasc Res. 88, 344-351 (2010).
43. Zeng, Y., Adamson, R. H., Curry, F. R., Tarbell, J. M. Sphingosine-1-phosphate protects endothelial glycocalyx by inhibiting syndecan-1 shedding. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. , H306-H363 (2014).

Tags

Molecular Biology Microperfusion rat mesenterium hydraulische geleidbaarheid permeabiliteit Landis techniek