Microperfusion Technique chargé d'enquêter sur le règlement des microvaisseaux perméabilité au Rat Mesentery

Abstract

Expériences pour mesurer les propriétés de perméabilité des microvaisseaux perfusés individuellement fournissent un pont entre l'enquête des mécanismes moléculaires et cellulaires régulant la perméabilité vasculaire dans des monocouches de cellules endothéliales en culture et les propriétés des lits microvasculaires entiers de change fonctionnels. Une méthode pour canuler et perfuser microvaisseaux des veinules de mésentère de rat et de mesurer la conductivité hydraulique de la paroi des microvaisseaux est décrite. L'équipement principal nécessaire comprend un microscope intravitale avec une grande scène modifiée qui prend en charge micromanipulateurs de positionner trois microtools différents: (1) une micro-pipette de verre biseauté à Cathétériser et perfuser l'microvaisseaux; (2) un verre de micro-obturateur pour bloquer temporairement la perfusion et permet la mesure de mouvement d'écoulement d'eau transvasculaire à une pression hydrostatique mesurée, et (3) une tige de verre émoussé pour stabiliser le tissu mésentérique au niveau du site de ponction. La Landis micro-occlusion techniq modifiéeue utilise les globules rouges en suspension dans le liquide de perfusion artificielle comme marqueurs de mouvement fluide transvasculaire, et permet également des mesures répétées de ces flux conditions expérimentales sont modifiées et de la différence de pression osmotique colloïde hydrostatique et à travers les microvaisseaux sont soigneusement contrôlées. Les mesures de conductivité hydraulique première aide d'un liquide de perfusion de commande, puis après une nouvelle ponction de même avec les microvaisseaux perfusats de test permettre des comparaisons de la réponse des microvaisseaux dans ces conditions bien contrôlées jumelés. Les tentatives visant à étendre la méthode de micro-vaisseaux dans le mésentère des souris avec des modifications génétiques prévus pour modifier la perméabilité vasculaire ont été sévèrement limitée à cause de l'absence de longs microvaisseaux droites et non ramifiées dans le mésentère des souris, mais la disponibilité récente des rats avec des modifications génétiques similaires en utilisant la technologie / cas9 CRISPR est prévu d'ouvrir de nouveaux domaines de recherche où les méthodes décrites ici peuvent être appliquées.

Introduction

Microperfusion dans le système vasculaire consiste à établir un écoulement d'un liquide de perfusion de composition connue artificielle commandé par l'intermédiaire d'une micropipette dans un vaisseau sanguin généralement inférieure à 40 um de diamètre. Le récipient perfusé reste dans son environnement normal et de tissu est perfusé avec du sang de l'animal jusqu'à l'heure de canulation le. Lorsqu'il est utilisé en conjonction avec une gamme de l'imagerie vidéo ou techniques fluorométriques, microperfusion in situ permet de mesurer des débits d'eau et de solutés à travers les murs de microvaisseaux dans des conditions où les forces motrices de ces flux sont connus et les propriétés de perméabilité de la paroi vasculaire peuvent être directement évaluée. De plus, en contrôlant la composition du fluide entourant la microvaisseaux dans le tissu (perfusat et superfusat), la régulation de la perméabilité microvasculaire et l'échange peut être étudiée en activant les cellules endothéliales qui forment la paroi de microvaisseaux à être exposée à une variété de econditions Xperimental (agonistes, conditions de perfusion modifiés, les indicateurs fluorescents pour mesurer la composition et la signalisation intracellulaire) pour des périodes mesurées précisément de temps (sec) à h. En outre, les évaluations ultrastructurales ou cytochimiques de structures moléculaires cellulaires clés régissant la barrière peuvent être étudiés dans les mêmes microvaisseaux dans lequel la perméabilité est mesurée directement. L'approche forme ainsi un pont entre l'enquête des mécanismes cellulaires et moléculaires de modifier la fonction de barrière endothéliale chez les monocouches de cellules endothéliales en culture et enquête microvaisseaux intactes. Voir les commentaires suivants pour une évaluation plus approfondie ^1-6.

Une limitation de microperfusion est qu'il peut être utilisé que dans des lits microvasculaires qui sont minces, transparentes et ayant une intégrité structurelle suffisante pour permettre une canule avec une micropipette de verre. Alors que les premières enquêtes utilisées microvaisseaux de grenouilles dans mésentère et mince cutanée angine muscle ^7,8, de loin la préparation la plus couramment utilisée dans les modèles de mammifères est le mésentère de rat ^9-15. La plupart des enquêtes ont porté sur les changements aigus de la perméabilité vasculaire étudié sur des périodes de 1-4 heures, mais des études plus récentes ont été étendus à des mesures sur les navires individuels 24-72 h après une première perfusion ^12,16. La technologie CRISPR récemment mis au point, qui promet de faire des modèles de rats plus génétiquement modifiés disponibles pour l'étude de la régulation de la perméabilité vasculaire ¹⁷ devrait permettre aux méthodes décrites dans la présente communication à appliquer dans les microvaisseaux des veinules du mésentère dans ces nouveaux modèles importants de rat.

La méthode nécessite un microscope inversé équipé d'une platine de microscope construite sur mesure assez grand pour contenir à la fois la préparation des animaux et au moins trois micromanipulateurs utilisé pour positionner microtools à proximité de la cuve perfusé et d'aligner une micropipette de perfusion avec le navirelumen. Par exemple, une plate-forme de commande pour un étage xy de microscope (environ 90 × 60 cm) peut être fabriqué à partir d'une plaque d'acier 1 cm d'épaisseur avec un revêtement anti-rouille. La scène est attaché à une table d'index d'ingénierie ou deux diapositives en queue d'aronde montés à angle droit et reposant sur des piliers en téflon ou les transferts de billes pour le déplacement dans le plan horizontal. Une installation typique (voir la figure 2) a beaucoup en commun avec l'équipement de microscope et micropositionnement utilisée pour toute une gamme d'expériences de la microcirculation intravitale tels que ceux de mesurer seul flux sanguin du navire et de l'hématocrite, la livraison d'oxygène locale par le sang perfusé microvaisseaux, réglementation des lisses vasculaires le tonus musculaire, et l'accumulation de micro-vasculaire local des traceurs fluorescents injectés dans l'ensemble de la circulation. ^18-26

L'aspect fondamental de la technique est la mesure de débit volumique (J _v) sur une zone de surface définie (S) de la paroi de microvaisseaux. Accomplirce par la technique de Landis modifié décrit ici un microscope inversé simple, est adéquat. Une petite caméra vidéo est montée sur l'orifice de l'image et le signal vidéo, avec une base de temps supplémentaire, est affichée sur un moniteur vidéo et enregistrés soit sous forme numérique sur un ordinateur ou sous forme de signal numérique ou analogique sur un enregistreur vidéo. Une fois que la canule microvaisseaux est la partie de la microvaisseaux visible par la caméra peut être modifiée par déplacement de la platine et les manipulateurs en tant qu'unité sans perturber la canulation.

Mesure des flux de transvasculaires peut également être combiné avec des études plus détaillées à l'aide d'un microscope à fluorescence avec filtres appropriés sophistiqués tels que les plates utilisées pour les mesures de perméabilité soluté, la surveillance de la fluorescence du calcium cytoplasmique rapport ou d'autres mécanismes cellulaires, et l'imagerie confocale ^{6,12,13, 27.} Un avantage clé de toutes les approches de microperfusion est la capacité de faire des mesures répétées, sur le même navire, Sous changement contrôlé de la force motrice telles que des pressions hydrostatiques et oncotiques, ou changement induit dans les réponses des navires à des conditions inflammatoires. La conception la plus commune est une comparaison par paires de la conductivité hydraulique mesurée (L _p) sur le même navire avec le premier récipient perfusées via une micropipette remplie d'un liquide de perfusion de contrôle et la suspension de globules rouges à établir un état ​​de référence de perméabilité, puis avec un second pipette avec l'agent de test ajouté au perfusat. Canulations multiples sont possibles avec le cycle répété après reperfusion avec la pipette de commande.

Le présent protocole démontre la canule et microperfusion d'un navire veinulaire dans mésentère de rat pour enregistrer les flux d'eau à travers la paroi des microvaisseaux et mesurer la L _{p de la} paroi de la cuve, un indice utile de la perméabilité de la voie commune pour l'eau et de solutés à travers le intacte barrière endothéliale. La procédure est appelée la techniq modifié Landisue parce que le principe Landis originale d'utiliser le mouvement relatif des globules rouges comme une mesure de l'échange fluide transvasculaire après perfusion est bloqué est préservée ^28, mais l'éventail des conditions expérimentales (par exemple, les différences de pression oncotiques hydrostatiques et de l'albumine à travers la paroi des microvaisseaux) disponible après microperfusion est beaucoup plus grande que dans le sang perfusé microvaisseaux uncannulated ^8,29.

Protocol

Déclaration éthique: Toutes les procédures ont été examinés et approuvés par le Comité de protection des animaux et l'utilisation institutionnelle.

1. Fabrication préliminaire de Micropipettes, retardateurs, et bloqueurs

1. Tirer plusieurs tubes capillaires en verre de borosilicate propres en utilisant un extracteur moitié électronique ajustée de sorte que, lorsqu'il est tiré, la partie étirée du tube est d'environ 1 cm de longueur et les deux moitiés sont quelque peu symétrique. Assurez-vous que le cône est compatible avec les dimensions à la figure 1. Utilisez les deux moitiés pour micropipettes, retardateurs et les bloqueurs.
   1. Bevel micropipettes utilisant un air entraîné meule ³⁰ avec 0,5 um papier abrasif baigné avec de l'eau. Régler l'angle du support de micropipette de sorte qu'il est d'environ 30 degrés par rapport à l'horizontale.
   2. Bien laver et sécher les micropipettes en utilisant aspiration pour tirer l'acétone propre à travers la pointe et jusqu'à l'arbre. Inspectez les micropipettes (Figure 1A) à l'aide d'un petit microscope droit avec 4 × 40 × et objectifs équipés d'un support de micropipette pince crocodile et d'un réticule de l'oculaire.
   3. Sélectionnez micropipettes avec embout ouverture d'environ 50 um de long avec un biseau dont le rapport longueur / largeur est entre 3,1 et 3,5 et un point fortement conique qui aide à pénétrer les fibres de collagène difficiles dans le mésentère.
   4. Stockez 15-20 micropipettes de légèrement différentes tailles dans une boîte sans poussière.
2. Assurez retardateurs utilisant des tubes capillaires tirés préparés à l'étape 1.1). Tenez un tube capillaire en verre tiré brièvement près d'un microflamme pour former une extrémité émoussée (figure 1B). Stocker plusieurs dans une boîte sans poussière.
3. Assurez microoccluders utilisant des tubes capillaires tirés préparés à l'étape 1.1). Tenez un tube capillaire tiré sous un microflamme et doucement plier (en utilisant un adaptateur de tube, par exemple., 23G) de la pointe fine (environ 4 mm de la pointe) pour faire un angle de près de 120 degrés à l'arbre (

2. Préparation des animaux et de chirurgie

1. Anesthetize mâle (350-450 g) ou des rats femelles Sprague-Dawley (200-300 g) avec du pentobarbital sodique (80 à 100 mg / kg, Sigma-Aldrich, P3761) par injection sous-cutanée; protéger le mésentère par ne pas utiliser l'injection intrapéritonéale.
2. Tout au long des procédures chirurgicales et des protocoles expérimentaux, de maintenir l'anesthésie par des injections supplémentaires (30 mg / kg) selon le besoin. Déterminer profondeur de l'anesthésie par pincement de l'orteil ou réflexe cornéen. Après achèvement de la procédure expérimentale, le rat euthanasie par surdose de pentobarbital ou injection intra-cardiaque de chlorure de potassium saturé sous anesthésie.

3. Préparer des solutions et des érythrocytes pour une utilisation comme Flow Markers

1. Préparer la solution de Ringer mammifère pour superfusat et la solution de contrôle de perfusat (acide généralement le mammifère de solution de Ringer contenant 10 mg / ml grasalbumine libre de sérum bovin, BSA).
   1. Filtre de perfusion grâce à 0,2 um filtres seringue pour éliminer les particules minuscules qui pourraient bloquer la pointe de micropipette; filtrer dans un petit récipient propre.
2. Préparer érythrocytes par étirage d'environ 0,2 ml de sang de la veine de la queue du rat anesthésié dans une aiguille de 20G sur une petite seringue contenant 0,05 ml d'héparine (1000 U / ml) et transférer dans un tube de 15 ml de centrifugeuse contenant environ 14 ml de mammifère solution une solution de Ringer .
   1. Centrifugeuse pour emballer en douceur les cellules rouges (environ max 200 g pendant 7 min). Dessinez le surnageant et remettre en suspension les globules rouges dans la solution de Ringer.
   2. Après centrifugation et retrait du surnageant trois fois laisser les globules rouges concentrés dans le fond du tube pour une utilisation ultérieure. Notez que cette procédure permet de réduire les plaquettes dans perfusats finale à moins de 0,1% des niveaux normaux ^31.

4. Disposer les tissus de l'animalPlateau

1. Raser l'abdomen du rat anesthésié par le dessous du nombril au processus xiphoïde. Assurez-vous que la zone rasée étend autour du côté droit (pour rat placé sur le côté droit) de sorte que les cheveux ne fait pas une mèche d'attirer l'superfusat hors du tissu ainsi. Enlever les poils coupés avec un tampon de gaze ou un tissu mouillé.
   1. Maintenez la peau avec un instrument contondant pince dentelées et faire une incision ligne médiane (2-3 cm de long) à travers la peau en utilisant une paire de ciseaux robustes. Utilisation d'une amende (IRIS) ciseaux font une incision similaire, par la ligne blanche, soulever la paroi abdominale avec des pinces dentelées pour éviter d'endommager l'intestin.
   2. Avec l'animal sur le côté sur le plateau de l'animal, tirez doucement l'intestin de la cavité abdominale à l'aide d'applicateurs coton-tige (bâton de bois) trempés dans une solution de Ringer et une pince dentelées contondants. Disposer l'intestin dans le tissu même de sorte que le mésentère est drapée sur le pilier pour la visualisation au microscope en prenant soin d'éviter de toucher le mésentère (poteendommager ntially microvaisseaux) soit avec des forceps ou de coton.
      Remarque: Le plateau des animaux (figure 2A) peut être construite à partir de plexiglas et nécessite un tissu bien (environ 3 mm de profondeur), un pilier optiquement clair (par exemple, le quartz poli environ 2 cm de diamètre et 5 mm de haut.), Et un coussin chauffant ajustée pour maintenir la température de l'animal. L'épaisseur de la colonne ne doit pas dépasser la distance de travail de l'objectif.
2. Placez le bac animale sur la platine du microscope afin que le mésentère est visible à travers les oculaires.
3. Placez une ligne de goutte à goutte par gravité à superfuse permanence le mésentère avec la solution de Ringer mammifère maintenue à 35-37 ° C. Utilisez des tampons de gaze pour maintenir l'intestin en place, pour conserver l'humidité, et la mèche de la solution de Ringer excès de la surface. Régler le débit de l'effluent et aspirer à maintenir une épaisseur de superfusat cohérente.
4. Identifier les cibles microvaisseaux veinules, qui sontsegments linéaires en aval de l'écoulement convergente, une ou deux branches distales de vrais capillaires. Trouver un vaisseau non ramifié (idéalement, 600 à 1000 mm de longueur) ayant flux sanguin rapide et exempt de cellules blanches collées sur la paroi du vaisseau.
5. Placez le microvaisseaux de test dans le centre du champ de microscope et déplacer le dispositif de retenue en position à proximité du site de ponction choisi.

5. Remplissez Micropipette et Mount Holder

1. Juste avant cannulating, suspendre les globules rouges dans le perfusat. Ajouter 7 pi de globules rouges à 0,5 ml de perfusion dans un tube à essai de borosilicate propre. Remarque: les hématocrites de 1-3% peuvent être utilisés, mais hématocrite cohérente seront conduire à des concentrations de perfusat cohérentes de toutes les substances libérées par les globules rouges.
2. Monter une seringue de 1 ml avec un adaptateur de tube de 23G et PE 50 tubes (5-15 cm de longueur). Dessinez le mélange de cellules de perfusion / rouge dans la seringue. Inversez la seringue de mélanger et d'expulser toutes les bulles à partir de tubes etadaptateur. Pour une efficacité accrue, des tubes en forme à plusieurs seringues avant l'expérience commence et les conserver dans une boîte sans poussière ou un sac plastique.
3. Remplir la micropipette en faisant avancer le tube dans la grande extrémité de la micropipette jusqu'à venir en butée de la région conique. Appliquer une poussée rapide douce sur le piston de la seringue pour remplir la pointe de la micropipette. Remarque: Un petit ruisseau ou gouttelettes doivent être visibles à la pointe de mettre en évidence le remplissage complet.
4. Retirer le tube tout en poussant doucement sur le piston pour remplir la partie la plus large de l'arbre de micropipette. Retirer petites bulles dans l'arbre de large en feuilletant attentivement l'arbre de micropipette. Remarque: Une procédure similaire a été illustrée ^32.
5. Placer la micropipette dans un support de pipette avec un orifice latéral qui permet une connexion de fluide continu à un manomètre à eau. Veiller à ce que le titulaire, qui est attaché à un entraînement hydraulique utilisé pour contrôler très fine avancement de la micropipette, est à un léger angle (15-25 °)à l'horizontale de sorte que le bord du cône de micropipette ne touche pas l'intestin ou d'un plateau.
6. Monter l'entraînement hydraulique sur un micromanipulateur mobile, qui a x, y et z lecteurs pour permettre un alignement étroit de la cuve d'essai (figure 2).
7. Régler la pression hydrostatique appliquée sur le fluide dans la seringue en utilisant une micropipette ou poire en caoutchouc rempli d'eau pour modifier la hauteur de liquide dans la colonne d'eau du manomètre à environ 40 cmH ₂ O au-dessus du mésentère.
8. Cathétériser l'microvaisseaux dès que possible après le remplissage de la pipette; globules rouges se déposent au fond de la pipette, de sorte que, après environ 40 min très peu de globules rouges seront versés dans le récipient.

6. Microcannulation et microvasculaire mesure de pression

1. Avant de positionner la micropipette remplie sous le microscope, appuyez doucement sur le dispositif de retenue sur le tissu près de la microvaisseaux appliquer une force suffisante pour saisir le tissu. Dessinez lerestrainer à dos, légèrement en étirant le tissu conforme à l'microvaisseaux de sorte que les contraintes dans les fibres de collagène mésentériques sont alignés avec le récipient.
   1. Aligner la micropipette avec le navire et l'abaisser dans vue à travers les oculaires. Placez la pointe juste en amont du site de ponction choisi et l'abaisser sur le tissu afin qu'il obstrue partiellement l'écoulement dans le vaisseau, mais ne pas obstruer.
2. Cathétériser la cuve par la conduite de la pointe de la pipette lentement dans la lumière du vaisseau à l'aide de la commande hydraulique. Veillez à ne pas pousser à travers la partie inférieure de la cuve.
   Remarque: Comme la micropipette entre dans le lumen, le perfusat lave rapidement le sang dans le récipient hors de la lumière et perfusat librement flux en circulation de l'distale de l'animal à la microvaisseaux d'essai, en déplaçant une partie de la perfusion sanguine normale dans les vaisseaux en aval.
3. Abaisser la pression de perfusion en ajustant le manomètre jusqu'à ce que le sang (comme indiquépar les globules rouges de l'animal) est tiré en arrière dans le segment perfusé; ce qui détermine la pression d'équilibre où les globules rouges oscillent doucement dans la lumière du vaisseau et mesure la pression hydrostatique des microvaisseaux (P _c) à l'extrémité distale du segment de microvaisseaux. Maintenir navire perfusion à toutes les pressions au-dessus de cette pression de l'équilibre.

7. Microocclusion et collecte de données

1. Etape facultative: Avant d'utiliser le micro-dispositif d'occlusion pour bloquer le navire, l'enfoncer dans le tissu dans une zone non utilisée du mésentère loin de tout navire de telle sorte que la pointe accumule une amende pad de tissu qui protège le navire expérimental au cours micro répétée occlusions.
2. Placer le dispositif de blocage au-dessus du récipient perfusé à proximité du bord inférieur du champ de microscope.
3. Consigner les renseignements suivants avec la vidéo et l'audio.
   1. Enregistrer verbalement l'emplacement du site de bloc et le bord inférieur de l'écran comme on le voit sur le réticule d'oculaire.
   2. Avec la pointedu bloqueur placé juste au-dessus de la microvaisseaux, utilisez le z contrôle fin de l'micromanipulateur pour abaisser doucement le bloqueur jusqu'à ce que le flux dans la cuve est obstruée. Notez la pression du manomètre _{(P c)} sur audio. Appliquer occlusion typiquement pour 3-10 secondes, puis relâchez, la restauration de la perfusion libre. Déplacez le site de bloc le navire vers la pointe de la pipette en 5-10 pm étapes en fonction du temps (> 5 min après le bloc initial à un site), le nombre d'occlusions (3-5), pour empêcher navire dommages murale sur le site de bloc .

8. Analyse des données et la mesure de L _p (perméabilité à l'eau)

1. Pendant la lecture vidéo, déterminer la distance initiale (ℓ ₀₎ à partir d'un marqueur cellulaire rouge pour le site de l'occlusion par l'utilisation d'une image d'un micromètre et les positions connues sur les images. Déterminer la vitesse initiale (dl / dt) de la cellule de marqueur à partir de sa position en plusieurs trames au cours de la seconde 10.3 des images enregistrées. Dissuadermienne rayon de la cuve (r) à partir des images prises pendant l'occlusion (Figure 3).
2. Calculer J _{v /} S pour chaque occlusion (dl / dt) x (1 / ℓ ₀₎ x (r / 2). Calculer L _p à une pression constante (J _V / S) divisée par la pression de conduite (pression des microvaisseaux - pression osmotique colloïde efficace; voir Discussion).

Representative Results

La figure 4 montre les résultats de la mesure de l'évolution dans le temps des changements de _L p dans un rat veinulaire microvaisseaux canule successivement avec quatre perfusats. ³³ L'amplitude de _L p calculée à une pression constante a été utilisée comme mesure de l'évolution des microvaisseaux paroi perméabilité, d'une part dans l'état de commande avec un liquide de perfusion contenant 1% d'albumine de sérum bovin, puis lorsque le navire a été exposé à l'agent inflammatoire bradykinine (BK) en utilisant une deuxième micropipette contenant 10 nM Bk. Bradykinine a provoqué une augmentation transitoire de la L _p qui a renvoyé vers la valeur de contrôle sur la suite 10-15 min. Le navire a ensuite été re-perfusée avec le contrôle de perfusion pendant 30 min à ré-établir une base stable. Lorsque le microvaisseaux a été perfusé à l'aide d'un quatrième micropipette avec la même concentration de Bk ainsi que 1 uM de sphingosine-1-phosphate (S1P) dans le liquide de perfusion, la réponse à Bk a été significativement atténuée. Le degré deatténuation lorsque Bk S1P ont été perfuses et en même temps a été jugée similaire à celle mesurée dans d'autres expériences où S1P a été ajouté à la solution de perfusion jusqu'à 20 min avant l'exposition à Bk. Ces résultats démontrent la puissance d'être en mesure d'effectuer plusieurs mesures de _L p sur un même récipient, et montrent que l'action d'un agent tel que la S1P pour stabiliser la paroi de la cuve en présence d'un agent inflammatoire peut être réglé à des périodes de temps sur l'ordre de quelques secondes. Dans des récipients séparés études de contrôle ont été effectuées avec un protocole similaire en l'absence de S1P de montrer que l'atténuation de la réponse Bk est pas due à l'anaphylaxie.

Pour certains modèles expérimentaux, il est important d'évaluer à la fois le coefficient de réflexion de soluté pour une macromolécule (σ) et de la _L p. Ceci est accompli en mesurant mieux J _V à de multiples pressions sur chaque microvaisseaux individuelle. La figure 5 montre une expérience in _L p qui à la fois et la pression oncotique efficace de 5% d'albumine dans le perfusat (π = _albumine 27 cmH ₂ O à 37 ° C) ont été estimées dans des conditions où il n'y avait pas d'albumine dans le tissu entourant l'microvaisseaux de rat. Dans ces expériences, J _v / S a été mesurée à trois pressions différentes. La _L p est la pente de la relation entre J _{V / s} et la pression, et le point d'intersection sur l'axe de pression est la différence de pression oncotique efficace à travers la paroi du vaisseau (σΔπ).

Figure 1. Microtools pour perfusion des microvaisseaux individuels. (A) une micropipette pour canulation des microvaisseaux de rat avec une pointe biseautée. (B) un dispositif de retenue pour maintenir le tissu mésentérique stable près du site de ponction (C). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2. rig Intravitale pour microperfusion. (A) Vue d'ensemble du plateau de l'animal avec micromanipulateurs et microtools orientés sur pilier de verre. (B) Grand stade du métal monté sur la table de l'ingénierie et de paliers de support. (C) anesthésiés rat microtools en position de microperfusion d'un microvaisseaux. (D) Vue rapprochée du mésentère cours d'une expérience. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figu re.

Figure 3. Mesure de la vitesse de filtration par unité de surface en utilisant une technique Landis modifié. Ce schéma montre un seul microvaisseaux canulée avec une micropipette et une tige d'obturation positionné sur la cuve. Immédiatement après l'occlusion microvasculaire, la distance (ℓ ₀₎ entre le marqueur RBC circulant sur ​​la ligne centrale de la microvaisseaux occlus et le site d'occlusion est enregistrée de sorte que la trajectoire de la cellule peut être suivie pour 5-10 secondes après l'occlusion. La position initiale (ℓ ₀₎ et de la vitesse initiale (dl / dt) de la cellule sont utilisées pour calculer la vitesse moyenne de filtration par unité de surface de paroi de microvaisseaux entre la cellule de marqueur et le site d'occlusion. Le microoccluder est ensuite soulevé et perfusion sans établie avant mesures supplémentaires soient faites.com / files / ftp_upload / 53210 / 53210fig3large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4. Les données représentatives montrent que sphingosine-1-phosphate (S1P) inhibition agit très vite bradykinine (Bk; 10 nM). Provoqué une augmentation transitoire de microvaisseaux L _p. S1P appliqué comme concomitante d'un deuxième bradykinine (BK) essai inhibé la réponse aiguë Bk par rapport au premier Bk. Ces données démontrent que le temps d'exposition à un agent de test peut être modifié pour évaluer la cinétique de l'activation d'une réponse inhibitrice. Plus précisément, S1P concomitante appliquée uniquement avec Bk fortement inhibé la réponse Bk. S1P était de 1 pm et Bk était de 10 nM. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5. Mesure de J _{v /} S à pressions multiples permet à la fois _L p et la pression oncotique efficace à mesurer. Le flux de filtration, J _{v /} S, a été mesurée dans cette cuve à différentes pressions hydrostatiques de microvaisseaux au cours de la perfusion avec de la BSA (50 mg ml ^{- 1;} π = 27 cmH _{2 O),} tandis que le mésentère a été baigné avec une solution de Ringer sans protéines. La pente de la relation entre J _{V / s} et la pression est la _L p et le point d'intersection sur l'axe de la pression indique la différence de pression oncotique efficace à travers la paroi du vaisseau. Dans cette expérience, la Lp était de 1,2 × ¹⁰ -7 (cm ^sec -1 cmH _{2 O} ^-1) et le σΔπ était de 24 _cmH 2 O. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53210/53210fig5large.jpg" target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Détails de L calculs _p. Bien que le mouvement du fluide transvasculaire se produit alors que le navire est librement perfusé, tel échange est trop petite pour être mesurée pendant la perfusion libre car elle est généralement moins de 0,01% du taux de perfusion de navire. Toutefois, lorsque la perfusion est temporairement arrêté par occlusion de la microvaisseaux, écoulement transvasculaire (par exemple, filtration) est mesurée à partir de la circulation des globules rouges de marquage dans la lumière comme la colonne de fluide entre un marqueur de globules rouges et le site de l'occlusion raccourcit comme représenté sur la Figure 3. En fonction de la complexité et de la durée du protocole expérimental un récipient non ramifié de 600 à 1000 um de longueur est nécessaire.

Lorsque le récipient ne soit pas obstruée et la pression manométrique est de conduire l'écoulement à travers la micro-vaisseaux, la chute de pression à travers l'embout de pipette est grande de sorte que la pression au cours de la perfusion des microvaisseaux libre est typiquement seulement un_cmH 2 0 peu supérieure à la pression en aval. En revanche, lors d'une occlusion de la chute de pression à travers la pipette est très faible en raison de fluide pénétrant lentement la lumière du vaisseau pour remplacer le filtrage de fluide à travers la paroi du vaisseau. Ainsi, pendant l'occlusion de la pression hydrostatique dans la lumière du vaisseau (P _c) est égal à celui fixé par le manomètre. La pression oncotique dans le tissu mésentérique est négligeable, donc immédiatement après l'occlusion, les mouvements fluides transvasculaires à partir de cellules de marqueurs rouges sont mesurés où la pression hydrostatique est connue et la pression oncotique dans la lumière du vaisseau est égal à celui fixé dans le perfusat. Avec des mesures successives de L _p, la longueur du navire est perdu à chaque fois que le site de bloc est avancé. En outre, recannulation successive réduit disponibles longueur du navire.

L'écoulement de fluide transvasculaire par unité de surface de paroi _(v J / S) est estimé à partir récipient le taux qu 'une longueur mesurée de la colonne d'eau dans le microVEssel lumière entre un marqueur cellulaire rouge et le site de l'occlusion soit raccourcit (filtration net) ou allonge (réabsorption nette). L'hypothèse est que les cellules rouges flottabilité neutre se déplaçant le long de l'axe de la lumière du vaisseau peuvent être utilisés pour suivre la vitesse moyenne de la colonne d'eau entourant la cellule (le rapport de la vitesse de globules rouges à la vitesse moyenne de l'eau est proche de 1,8 pour un pm 6 globules rouges dans un récipient 30 um de diamètre). ^8,14 Ainsi, si la vitesse d'une cellule de marqueur (en um / s) vers le dispositif de blocage est V um / sec au-dessus de la première 2-5 secondes après l'occlusion, et le rayon de la cuve est r, le volume de fluide filtré à travers la paroi des microvaisseaux entre la cellule rouge et le site de l'occlusion (J _v) est πr ² V ³ um / s en supposant que la microvaisseaux est cylindrique. En outre la surface d'un microvaisseaux cylindrique (S) entre cette cellule et le marqueur de site de l'occlusion est 2πrℓ, où ℓ est la distance initiale entre la cellule de marqueuret le site d'occlusion. Ainsi, le flux de transvasculaire initiale moyenne par unité de surface (J _V / S) à la pression fixé par le manomètre à eau Vr / (de 2ℓ).

L'estimation simple de récipient _L p est faite si la pression oncotique du perfusat a été mis en bas par rapport à la pression des microvaisseaux (typiquement 3,6 cmH ₂ O, la pression oncotique de sérum-albumine bovine à une concentration de 10 mg / ml et un capillaire pression supérieure à 30 cmH ₂ O). _L p est calculé en tant que (J _{V /} S) / (P _c -3) cm / sec / cm H ₂ O parce que le coefficient (σ _{de l'albumine)} d'albumine de réflexion dans l'état de commande est proche de 0,9. Avec cette approche changements rapides dans L _p avec une résolution temporelle de l'ordre de 1 min peut être mesurée en établissant la libre circulation entre les mesures successives de J _v / S à pression constante comme le montrent les résultats représentatifs à la figure 4. L'approche IG ci-dessusNores de petits changements dans la pression oncotique de l'albumine qui tombent à moins de 1 cmH ₂ O lorsque le coefficient de réflexion tombe en dessous de 0,5, mais l'erreur dans l'estimation de _L p reste inférieure à 5% lorsque P _c est supérieure à 30 cmH ₂ O .

Quand une mesure précise à la fois de réflexion et _L p coefficient est nécessaire, J _{v /} S est mesurée à une série de pressions de microvaisseaux-dessous de la pression oncotique efficace prévue de la macromolécule d'essai. La pente de la relation entre J _V / S et des mesures de pression L _{p et} le point d'intersection sur l'axe de pression lorsque le débit net est de zéro mesures (la Figure 5). La démonstration que Jv est linéairement liée à la pression est également une validation importante de l'utilisation de simples mesures de pression en utilisant le protocole simple décrit ci-dessus (figure 4) lorsque la différence de pression oncotique est faible par rapport à la presse hydrostatiqueure.

Sources d'erreurs possibles. Il ya plusieurs problèmes qui compromettent la mesure précise. Échec pour obturer correctement le navire ou des dommages à la paroi du vaisseau sur les résultats du site d'occlusion en fuite de liquide au-delà du site de l'occlusion, et le mouvement des cellules de marqueurs vers le site de l'occlusion plus rapide que celle due à l'échange transvasculaire. Alors que les cellules de marqueurs se déplacent normalement lentement vers le site de l'occlusion, mais ne parviennent pas, une fuite est indiqué si les cellules de marqueurs de suivre tout le chemin à l'obturateur. D'autre part, l'échec pour sceller la pipette dans la lumière de microvaisseaux sur le site de cathétérisme résultats dans la sous-estimation de J _v / s. Fuite de liquide de la pipette à la superfusat ou à la lumière du vaisseau en amont du site de ponction provoque une chute de pression significative à travers la pointe de la pipette. Une telle fuite est détectée lorsque les cellules dans le flux de pointe de la micropipette à une vitesse plus élevée que celles de la lu avalanthommes du vaisseau obstrué. Attention repositionnement de la micropipette scelle habituellement une telle fuite. Un problème se pose si le différent L _{p de la} paroi de la cuve est pas uniforme, ayant généralement avec un ou plusieurs sites de dommages ou une inflammation localisée. Cellules piste Marqueur sur le site si la plupart des flux de transvasculaire s'y concentre. Le mouvement des globules rouges mesure encore écoulement transvasculaire, mais la mesure J _v / S est pas représentatif de la majeure partie de la surface du mur dans le segment de test.

Importance de la méthode par rapport aux méthodes existantes. Les deux méthodes les plus couramment utilisées pour étudier la régulation de la perméabilité de la barrière endothéliale et l'échange transvasculaire sont (1) in vitro de mesure de l'échange à travers des monocouches de cellules endothéliales en culture et (2) la mesure de l'accumulation de traceur dans un échantillon de tissu après que le traceur est injecté par voie intraveineuse à l'animal entier. Des expériences dans des monocouches de cellules endothéliales cultivées sont Favored parce que les fonctions cellulaires peuvent être plus directement modifiées et il ya suffisamment de matériau cellulaire disponible pour l'évaluation détaillée des événements moléculaires dans les cellules endothéliales. Cependant, dans la plupart des conditions de culture des cellules endothéliales ne font généralement pas le représentant de la barrière de la perméabilité vasculaire in vivo. La technique Landis modifiée décrite ci-dessus a été démontré être une technique robuste et fiable pour enquêter sur la régulation de la fonction de barrière endothéliale chez les microvaisseaux veinulaires intactes. Dans les mains d'un enquêteur expérimenté jumelé mesures de perméabilité dans des conditions de contrôle et de test où certaines des approches utilisées en culture cellulaire (par exemple, l'imagerie des composants cellulaires, la modification des voies de signalisation) peut être appliqué. L'importance des expériences dans les microvaisseaux intactes a été démontré en montrant des différences significatives entre les mécanismes qui régulent la perméabilité de la barrière dans microve perfusé individuellementxelles et ceux décrits souvent dans des monocouches endothéliales cultivées. Les exemples incluent les réponses à un cisaillement, l'exposition de la thrombine, et la contribution des mécanismes contractiles à la formation de l'écart inflammatoire ^2-6,9,16. Les mesures de l'accumulation de traceur dans un lit vasculaire intacte conserve plus une fonction physiologique normale, mais l'enquête directe de réels changements dans la perméabilité vasculaire sont compromise parce que l'accumulation de traceur peut augmenter à la suite de la perfusion accrue (augmentation de la surface d'échange) avec ou sans une augmentation de la la perméabilité de la paroi. Ainsi, la mesure d'une augmentation de la perméabilité peut être surestimée lorsque vasodilatation augmente le nombre de navires perfusés et l'accumulation de soluté ainsi totale est supérieure à celle due à l'augmentation de la perméabilité vasculaire seuls ^34.

Les applications futures. La gamme d'options pour modifier la structure et la fonction cellulaire dans les mêmes conditions que la perméabilité des indiles navires individuels sont directement mesurés pendant microperfusion est prévu d'augmenter. En outre, il est prévu que l'application des méthodes de mésentère de rat génétiquement modifié peut résoudre un problème à long terme qui a existé pendant des souris génétiquement modifiées. Plus précisément, lorsque les souris génétiquement modifiées ont été disponibles, il a été prévu que microperfusion pourrait être étendu à enquêter sur les microvaisseaux dans leurs vaisseaux mésentériques. Alors que certaines expériences de microperfusion ont été réalisées dans les microvaisseaux de mésentère de la souris ^35, les souris ont généralement moins de microvaisseaux dans leur tissu mésentérique de rats, et ces navires sont souvent courts et très ramifié, par opposition aux plus longues (> 500 um) vaisseaux droits plus appropriés qui peut être trouvé chez les rats. Ainsi des expériences pour étudier la modulation de change transvasculaire dans génétiquement des souris se sont appuyés sur des tests comme le Miles ^{34 ou} les expériences de traçage techniquement exigeants, mais plus fiables qui mesurechangements à la fois vasculaire et l'accumulation extravasculaire de fluorescence de sondes de test ³⁶ radiomarqués.

Modifications de la méthode. Dans les protocoles ci-dessus, changements dans la composition de perfusion nécessaire changement de micropipettes. Une autre approche consiste à remplir la micropipette in situ en utilisant un appareil de remplissage. Cette procédure a été accomplie comme décrit en détail ^37. La limitation est que le temps de changer la composition du liquide de perfusion dans la pipette est pas aussi vite que réalisée par remplacement de la pipette, mais la procédure est particulièrement utile si elle est nécessaire pour perfuser un microvaisseaux pour des périodes de temps prolongées.

La même microperfusion approché peut être étendu pour mesurer les coefficients de perméabilité marqué par fluorescence soluté ^31,38-40. Dans ce cas, la micropipette à canon unique est remplacé par un double canon (thêta) pipette ⁴¹ et le navire est perfuséen alternance avec le soluté fluorescente d'essai pour mesurer l'accumulation de tissu par rapport à lumen contenu, et même sans le soluté de perfusion fluorescente pour effacer le tissu et permettre la mesure répétée de l'accumulation de solutés. Lorsque les mesures de débits d'eau transvasculaires doivent être combinées avec des mesures de coefficient de perméabilité à l'aide de soluté solutés d'essai marqués par fluorescence, des indicateurs fluorescents de composition intracellulaire, ou l'imagerie confocale de composants cellulaires, un ordinateur contrôlé plus sophistiquée microscope à fluorescence est nécessaire. Étant donné que ces enquêtes exigent habituellement des lentilles avec un plus fort grossissement et beaucoup plus courte distance de travail, le pilier de quartz utilisé pour maintenir le mésentère est remplacé par une lamelle de verre collé sur un support en plexiglas dans le tissu bien sur le plateau de microscope. La disponibilité accrue des imprimantes 3-D, permettra la fabrication de haute précision de plateaux personnalisées, qui répondent à la tolérance étroite nécessaire pour positionner plus grande diametelentilles de r avec plus courte distance de travail par rapport aux microvaisseaux sélectionnés.

La disponibilité des microvaisseaux utilisables dans le mésentère varie avec l'âge, le sexe, et la souche. Par conséquent, les choix de souche de rat et de l'utilisation de sexe masculin ou féminin dépendra des questions spécifiques traitées. Pour beaucoup de nos études récentes, nous avons utilisé des rats Sprague-Dawley qui sont acclimatés dans notre animalerie au moins une semaine avant de l'utiliser vers l'âge de 3-4 mois au cours de laquelle nous trouvons qu'ils ont généralement disponibles longues, microvaisseaux mésentériques droites. En revanche, nos collègues ont utilisé avec succès des rats femelles Sprague-Dawley de 2-3 mois ^{de 13 ans.}

Le rôle des globules rouges. Le rôle principal des globules rouges comme décrit ci-dessus était de suivre transvasculaire mouvement de l'eau en supposant que la cellule a agi comme inerte, neutre indicateurs flottabilité de l'eau après que les flux ont été microvaisseaux occlus. En plus de ce rôle fondamental, ilest maintenant reconnu que les cellules rouges contribuent à la stabilité de la barrière en fournissant S1P au perfusat lorsque l'albumine dans ^31,42,43 présente. Il ya plusieurs implications importantes de ces observations. En l'absence de globules rouges ou avec l'utilisation de marqueurs d'écoulement alternés inerte la perméabilité de base est susceptible d'être moins stable. Il est recommandé que les mesures de S1P devraient être utilisés dans tous les perfusats dans des expériences de microperfusion.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la Santé et des subventions HL44485 HL28607.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MICROSCOPE, TABLE AND STAGE
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Olympus	CK-40	try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Leica	DMIL	try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
narrow diameter, long working distance objective: example	Nikon	Nikon E Plan 10×/0.25 LWD
stage platform--1/2 inch or 1 cm sheet steel	welding shop		this should be heavy to reduce vibration
Unislide x-y table: dove tail slides	Velmex	AXY4006W1
VIDEO
CCD video camera: example	Pulnix	TM-7CN (no longer available)	no color needed
video capture system with audio--generic
video playback system (completely still frame, single frame motion)
small microphone
MICROMANIPULATORS, HOLDERS
micromanipulator, XYZ (3)	Prior/Stoelting (no longer available)		look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning
hydraulic probe drive, one way	FHC	50-12-1C	need to buy either manual drive or electronic drive
manual drum drive	FHC	50-12-9-02
or hydraulic drive, 3 way	Siskiyou Corporation	MX610 (1-way) or MX630 (3-way)	great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years
connectors/rods/holders	Siskiyou Corporation	MXC-2.5, MXB etc.
pin vise	Starrett	162C	to hold restrainer
pipette holder	World Prescision Instruments	MPH3
water manometer ~120 cm
MICROSCOPE TRAY
clear Plexiglas for microscope tray for animal
3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall	Quartz Scientific Inc.	custom	(or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective
Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)
medical adhesive for tissue well	NuSil	MED-1037
All-purpose silicone rubber heat mat, 5" L x 2" W	Cole Parmer	EW-03125-20	heater for microscope tray--needs cord and controller--240V version available
Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC	Cole Parmer	EW-03122-75
STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out	Cole Parmer	EW-01575-00
PIPET MANUFACTURE
vertical pipette puller	Sutter Instrument Company	P-30 with nichrome filament
1.5 mm OD thin wall capillary tubing	Sutter Instrument Company	B150-110-10
pipette grinder air stone and dissection microscope--see reference in text			or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments
RX Honing Machine, System II	RX Honing Machine Corporation	MAC-10700 Rx System II Machine	alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle
with ceramic sharpening disc	RX Honing Machine Corporation		use "as is" or attach lapping film
lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um	3M	part no. 051144 80827	268X Imperial lapping film sheets with adhesive back--can be purchased from Amazon

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