微灌技术在调查微血管渗透性的大鼠肠系膜条例

Abstract

实验测量的单独灌注微血管渗透性属性提供的调节中培养的内皮细胞单层的整个微血管床功能交换性能血管通透性分子和细胞机制调查之间的桥梁。 A到导管插入并灌注大鼠肠系膜小静脉的微血管，测量微血管壁的渗透系数方法。所需要的主设备包括一个活体显微镜用支持显微操作以定位三个不同的微型工具的大改性阶段：（1）一个斜面玻璃微量吸管到导管插入并灌注微血管; （2）的玻璃微封堵以瞬时方框灌注和使经血管水流运动的测量在测量流体静压力，以及（3）一个钝玻璃棒以稳定肠系膜组织在插管的部位。修改后的兰迪斯微闭塞techniqUE使用红细胞悬浮在人工灌注液的液体经血管运动的标志，同时也使这些流动的实验条件变化以及水压和胶体渗透压差穿过微血管的重复测量得到精心控制。第一使用控制灌注液，然后经过重新插管相同微血管与测试灌流液的水力传导率的测量，使成对的这些精心控制的条件下的微血管应答的比较。尝试的方法延伸到微血管小鼠预期修改血管通透性遗传修饰的肠系膜是因为不存在的长的直链和无支链的微血管在小鼠肠系膜严重的限制，但在大鼠相似遗传修饰的最近情况使用所述CRISPR / Cas9技术开料调查的，其中本文描述的方法可以应用的新领域。

Introduction

微灌在脉管嗣继承建立经由微量吸管在通常小于40微米的直径的血管受控流动的已知组合物的人工灌注液。灌注容器保持在其正​​常组织环境内，并灌注动物的血液到插管的时间。当结合的范围内的视频成象或荧光技术，原位微灌用于支持跨微血管的壁水和溶质的流动的条件下，其中为这些流动的驱动力是已知的并且在血管壁的渗透性属性可以是测量直接评估。此外，通过控制周围组织中的微血管（灌注液和灌流）的流体的组合物，微血管通透性和交换的调节可以通过使内皮细胞形成的微血管壁被暴露于各种电子商务调查xperimental条件（激动剂，修改灌注的条件下，荧光指标来衡量细胞内的成分和信令）的时间精确测量周期（秒小时）。此外，关键的细胞的分子结构调节屏障的超微结构或细胞化学评价所用的相同的微血管，其中渗透性直接测量进行调查。该方法因此形成的细胞和分子机制的研究之间的桥梁来修改内皮屏障功能中培养的内皮细胞单层和调查在完整微血管。请参阅下面的评论作进一步评估^1-6。

微灌的一个限制是，它只能用于在微血管床是薄的，透明的，并具有足够的结构完整性，以使插管用玻璃微量吸管。虽然早期的研究中使用的青蛙微血管肠系膜和薄皮肤心绞痛米uscle ^7,8，迄今为止最常用的制备在哺乳动物模型是大鼠肠系膜^9-15。大多数研究都集中在研究过1-4小时的时期血管通透性的急性变化，但最近的调查已经扩展到测量个体船舶24-72小时的初始灌注^12,16后。最近开发的CRISPR技术，这将让更多的转基因大鼠模型可用于研究血管通透性^第 17条应启用该通信所描述的方法，在这些重要的新模型大鼠肠系膜小静脉的微血管被应用。

该方法要求一个倒置显微镜配备有定制的显微镜阶段足以容纳动物制备既和用于位置微型工具靠近灌注容器中并对准一个灌注微量与容器的至少三个微操作内腔。例如定制平台的xy显微镜阶段（约90×60厘米）能够从一个1厘米厚的钢板用防锈涂料来制造。该级被连接到一个工程索引表或两个燕尾滑动在水平面安装成直角并支撑在特氟隆支柱或球转移运动。一个典型的钻机（ 见图 2）有许多共同之处用于一系列的活体微循环实验，如测量单血管的血液血管平滑肌的流量和红细胞压积，局部氧输送血液灌注微血管，调节显微镜和微定位设备肌张力，并注入到整个循环荧光示踪剂的局部微血管积累^。18-26

该技术的基本方面是体积流量（j _v）的横跨微血管壁的规定表面面积（S）的测量。去完成这通过本文所述的改性兰迪斯技术简单的倒置显微镜是足够的。一个小的摄像机安装在图像端口和视频信号上，具有添加的时间的基础上，被显示在视频监视器上，要么在计算机上的数字形式或者作为在视频记录器的数字或模拟信号记录。一旦微血管插管微血管可见的摄像机的一部分可以通过移动台和操纵器作为一个单元而不中断插管被改变。

经血管流动的测量，也可以使用与适当的过滤器一复杂的荧光显微镜更详细的调查，如用于溶质渗透率，细胞质钙或其它细胞机制，以及共焦成像^6,12,13的荧光比率监测测量钻机组合^{， 27。}所有微灌方法的主要优点是使重复测量的能力，同船根据驱动力，如静水和肿胀压力，或引起的变化血管反应，炎症性疾病的控制变化。最常见的设计是测量水力传导率（L _p）的对经由填充有控制灌注液和红细胞悬液微量第一灌注的容器相同的容器中的配对比较，以建立基线渗透性状态，然后用第二吸移管与测试试剂加入到灌注液。多插管是可能的再灌注控制吸管经过反复的恶性循环。

本协议演示了一个小静脉血管的插管和微灌大鼠肠系膜记录水通量穿过微血管壁并测量血管壁的_部分 L P，公用路径的渗透性为整个完好水和溶质的一个有用的指标内皮屏障。该过程被称为改性兰迪斯techniqUE因为原来兰迪斯原理用红细胞的相对运动作为灌注被阻止被保留²⁸后经血管的液体交换的量度的，但实验条件的范围 （例如，横跨微血管壁的静水和白蛋白肿胀压力差异）微灌后可用远比uncannulated血液灌注微血管^8,29更大。

Protocol

伦理声明：所有的程序进行审查和批准的机构动物护理和使用委员会。

微量移液器，限位装置和拦截1.初步加工

1. 使用电子牵拉调整，使得，当拉动时，在管的拉伸部分的长度约为1厘米和两半偏于对称拉在半几个清洁硼硅玻璃毛细管。确保该锥度是与图1的尺寸相一致。使用两个一半为微量，限位和阻滞剂。
   1. 使用斜角的气动砂轮³⁰具有0.5微米的沐浴用水砂纸的微量。设置微量保持器的角，使其从水平约30度。
   2. 彻底清洗，并通过使用抽吸穿过尖端和向上的轴去拉清洁丙酮干燥微量。检查微量（图1A）用一个小直立显微镜配有鳄鱼夹微量持有者和目镜标线4×和40×的目标。
   3. 选择微量与前端开口约50μm长，有一个斜面，其长度/宽度比为3.1至3.5，并用一个尖锐的锥形点，这有助于穿透在肠系膜坚韧胶原纤维。
   4. 存储15-20微量略微不同尺寸的在无尘框。
2. 用在步骤1.1准备拉毛细管）限制部分。持拉玻璃毛细管简要地靠近一个微火以形成钝端（图1B）。存储若干在无尘框。
3. 用在步骤1.1准备拉毛细管）microoccluders。持拉毛细管下一个微火轻轻弯曲（使用管状适配器，例如，23G）的细尖（约4从前端毫米），使接近120度的角度，以在轴（

2.动物准备和手术

1. 麻醉雄性（350-450克）或雌性Sprague-Dawley大鼠（200-300克）用戊巴比妥钠（80-100毫克/公斤，Sigma-Aldrich公司，P3761）通过皮下注射保护肠系膜不使用腹腔注射。
2. 在整个手术过程中和实验方案，维持麻醉根据需要补充注射（30毫克/千克）。确定由脚趾捏或角膜反射麻醉深度。的实验程序完成后，安乐死通过戊巴比妥过量或心内注射的饱和氯化钾麻醉下大鼠。

3.准备解决方案和红细胞用作流标记

1. 制备哺乳动物林格氏溶液灌流和控制灌注溶液（通常为哺乳动物含10mg林格氏液/毫升脂肪酸游离牛血清白蛋白，BSA）中。
   1. 通过0.2微米注射器过滤器过滤灌流以去除可能会阻止微量移液器尖端细小颗粒;过滤成小干净的容器中。
2. 通过绘制约0.2毫升的血液从尾静脉麻醉大鼠的成20G针上含有0.05 ml肝素（1000单位/毫升）的小注射器准备红细胞和转移到含约14毫升的哺乳动物林格氏溶液溶液15ml离心管。
   1. 离心机轻轻地收拾红细胞（约最大200×g的7分钟）。绘制上清，重悬浮红细胞在林格氏溶液中。
   2. 离心并除去上清液后三次留在管供以后使用的底部的封装红细胞。注意，此过程减少了在最终灌流液血小板正常水平^31的低于0.1％。

4.安排在动物组织盘子

1. 剃麻醉的老鼠的腹部从下到肚脐剑突。确保剃区域周围的右侧延伸（对于大鼠置于右侧），使得头发不会形成燃烧芯吸取灌流出组织的良好。用湿纱布或纸巾取出切下的毛发。
   1. 握住钝锯齿钳的皮肤，使用一个坚固的剪刀中线切口（2-3厘米长），通过皮肤。用细（IRIS）的剪刀做一个类似的切口，通过白线，解除了腹壁锯齿钳，以免损坏肠道。
   2. 在其一侧的动物托盘上的动物，用棉签涂抹（木棍）浸泡在林格氏液和钝锯齿钳轻轻拔出从腹腔内脏。安排在组织中的肠道也使肠系膜被披在支柱观看通过显微镜注意避免接触肠系膜（POTEntially损害微血管）与任一钳或棉花。
      注：动物托盘（图2A）可以从有机玻璃构成的，需要的组织以及（约3毫米深），光学透明的支柱（例如，抛光的石英约2厘米直径和5mm高），和一暖垫调整，以保持动物的体温。柱的厚度不能超过物镜的工作距离。
2. 定位显微镜舞台上的动物托盘使得肠系膜是通过目镜可见。
3. 放置一个重力给料滴线，不断superfuse保持在35-37℃，哺乳动物的林格氏液肠系膜。用纱布垫，以保持肠道中的位置，有利于保持水分和灯芯多余的林格氏液从表面。调节流量，吸出水保持一致的灌流厚度。
4. 确定目标小静脉的微血管，这是收敛流，一个或两个分支远端真毛细管的下游无支链段。发现无支链的容器中（理想600〜1000微米长）具有轻快血流和游离的白细胞粘附在血管壁上。
5. 定位测试微血管在显微镜场的中心，并移动阻挡进入靠近选择的插管站点位置。

5.填写微管和安装在支架

1. 就在cannulating之前，暂停红细胞的灌流液。加7微升封装红细胞的0.5 ml的灌注液在一个干净的硼硅酸盐试管。注：1-3％血球计数都可以使用，但一致的血细胞比容将​​导致从红细胞释放的任何物质一致灌洗液浓度。
2. 适合1毫升注射器，用23G油管接头和PE 50管（5-15厘米长）。绘制灌流/红细胞混合物倒入注射器。倒置注射器混合和驱逐所有气泡管和适配器。为了提高效率，适合管道的几个注射器在实验开始前，让他们在无尘盒或塑料袋。
3. 通过推进管导入微量的较大端，直到它抵靠锥形区填充微量。注射器柱塞申请一个温柔的快速推进，填补了枪头。注：涓涓溪流或滴应该是可见的尖端证据完全填充。
4. 拔出油管，同时轻轻推柱塞，填补了微量轴的较宽的部分。通过仔细轻弹微量轴卸下在宽轴小气泡。注意：类似的程序已经示出^32。
5. 将微量成与侧端口，其允许连续流体连接至一个水压力计的吸移管支架。确保该保持器，其附连到用于控制微量的非常细的前进液压驱动，是在一个微小的角度（15-25度）对于水平，使得微量锥形的边缘不会撞到肠道或托盘。
6. 安装在一个可移动的微操作，它具有的x，y和z的驱动器，以使附近的对准到测试容器（图2）的液压驱动。
7. 调整使用注射器或充满水的橡胶管来改变的流体的高度，在压力计的水柱至约40 _水柱肠系膜上述静水压力施加到流体中的微。
8. 填充吸管后尽快导管插入微血管;红细胞沉降到移液管的底部，以使大约40分钟后很少红细胞会流入容器中。

6. Microcannulation和微血管压力测量

1. 在显微镜下定位填补微量，轻轻按下阻挡到附近施加足够的力夹住组织的微血管组织。绘制阻挡器背部，略微拉伸与微血管线的组织，以便在肠系膜胶原纤维的应力与容器对准。
   1. 对齐容器中的微管，降低其进入视野通过目镜观察。将吸头所选择的插管部位的上游和降低它到组织上，使得它部分地阻挡所述容器内的流动，但不会堵塞它。
2. 通过驱动移液管尖端慢慢进入使用液压驱动的血管腔导管插入血管。注意不要推动通过该容器的下侧。
   注意：作为微量进入内腔，灌注液迅速洗血液在血管出管腔和灌注液自由地流入到动物的循环远端测试微血管，取代某些正常血液灌注在下游容器。
3. 降低通过调节压力计直到血液灌注压力（所指示通过动物的红细胞）被抽回到所述灌流段;这决定了平衡的压力，其中所述红细胞轻轻摆动在血管腔和测量静水微血管压力（P _c）应微血管段的远端。保持容器灌注在这个平衡压力高于一切的压力。

7. Microocclusion和信息的收集

1. 任选的步骤：在使用微封堵以阻止容器中，将其压入在肠系膜的未使用区域中的组织远离任何容器，使尖端聚集组织的微细垫，在反复微保护实验容器之前闭塞。
2. 放置阻滞剂显微镜视野的下边缘附近的灌注容器的上方。
3. 记录有视频和音频以下。
   1. 口头记录块站点的位置和观察在目镜标线片的下屏幕边缘。
   2. 与顶端阻塞置于正好微血管以上的，可使用显微的微细Ž控制轻轻降低阻滞剂直到在容器的流动闭塞。注意音频压力表压力（P _C）。典型的应用闭塞3-10秒，然后松开，恢复自由的灌注。移动块站点向上朝向枪头容器中基于时间：5-10微米的步骤（>初始块后5分钟，在一个位点），闭塞的数目（3-5），为防止血管壁损伤，在块站点。

数据和L _的p测量8.分析（渗水）

1. 在视频播放期间，通过使用一个阶段微米和在图像上的已知位置的图像的确定，从一个标记红细胞的闭塞部位的初始距离_{（ℓ0）。}在3-10秒记录图像的过程中确定它的位置在若干帧标记单元的初始速度（分升/ DT）。阻止矿容器半径（r）从阻塞（ 图3）期间拍摄的图像。
2. 计算_{ĴV / S}为每个闭塞作为（分升/ DT）×（1 _{/ℓ0）×（R} / 2）。计算_部分 L P以恒定压力（j _{V / S）}由驱动压力除以（微血管压力-有效胶体渗透压;见讨论）。

Representative Results

图4示出了结果从测量变化期L _p的时间过程在大鼠小静脉微血管具有四个灌流液依次插管³³以恒定的压力计算_部分 L P的大小被用作变化微血管壁渗透性的量度，第一在用含有1％牛血清白蛋白那么当容器暴露使用含有10nM的浅滩的第二微量的抗炎剂缓激肽（BK）灌注液中的控制状态。缓激肽引起的对控制值返回在随后的10-15分钟一过性升高的_部分 L P。然后将容器重新灌注控制灌洗液30分钟，重新建立一个稳定的基线。当微血管使用第四微量与浅滩的相同浓度以及1μM的鞘氨醇-1-磷酸酯（S1P）在灌注液灌注时，响应于浅滩被显著衰减。的程度当BK和S1P灌流同时衰减被认为是类似于在其中S1P加入到灌注液达20分钟，暴露在浅滩之前其它实验测定。这些结果证明了能够使在单个容器_部分 L P的多次测量的功率，并表明，诸如S1P稳定血管壁中的抗炎剂的存在的试剂的动作可被解析为时间周期上几秒钟的次序。在单独的容器控制进行了研究以在不存在S1P的一种类似的协议，表明在BK响应的衰减不是由于过敏反应。

对于一些实验设计它来估计两个溶质反射系数为大分子（σ）与L _p是很重要的。这是通过测量Ĵ _当v在每个独立的微血管多重压力最好实现的。 图5示出了实验我N的两个_部分 L P和5％白蛋白的灌注液中的有效胶体渗透压（π _白蛋白 = 27 _水柱 ，在37℃）的条件下，估计当有在围绕大鼠微血管的组织无白蛋白。在这些实验中_{ĴV / S，}测定在三个不同的压力。的_部分 L P为J _{的v /} S和压力之间的关系的斜率，并在压力轴的截距是穿过血管壁（σΔπ）有效肿胀压力差。

图1.微型工具为个人微血管的灌注。（A）微量大鼠微血管与斜尖的插管。（B）的抑止举行肠系膜组织稳定插管的工地附近。（C） 请点击此处查看该图的放大版本。

图2.活体钻机微灌。 （一）动物盘与显微操作和微型工具导向在玻璃支柱概述（二）大型金属阶段安装工程表，并配套轴承。（C）麻醉大鼠中的微血管微灌位置微型工具。（D）关闭视图在实验中肠系膜。 请点击此处查看本figu的放大版本。回覆。

图3.测量每使用改良兰迪斯技术单位面积的过滤速度。这示意图显示了单一的微血管插管用微量和封堵杆定位在容器中。立即阻断微血管，标记红细胞之间的距离_（ℓ0）行驶的闭塞微血管的中心线和闭塞部位之后被记录，以使细胞轨迹可以遵循的闭塞后5-10秒。初始位置_{（ℓ0）和}电池的初始速度（分升/ dt的）被用来计算每标记细胞和闭塞部位之间微血管壁单位面积的平均过滤速率。所述microoccluder然后升高，和自由灌注建立附加测量之前。COM /文件/ ftp_upload / 53210 / 53210fig3large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。

图4。代表性数据显示，鞘氨醇-1-磷酸（S1P）抑制的作用非常快缓激肽（BK; 10纳米）。引起微血管_部分 L P暂时升高。 S1P应用并发与第二缓激肽（BK）测试抑制浅滩响应相对于第一浅滩急。这些数据表明，暴露于测试试剂的时间可以被修改以评估活化的抑制反应的动力学。具体来说，S1P应用并发只有浅滩强烈抑制的浅滩响应。 S1P为1μm和BK为10nm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5.测量的J _{V / S}在多重压力使两者大号_p和有效肿胀压力要测量的过滤通量，J _{V / S，}被灌注与BSA（50期间测量在该容器中，在不同的微血管静水压力毫克毫升^{- 1;π=} 27 _水柱 ），而肠系膜沐浴与蛋白质的林格氏液。 _{ĴV / S}和压力之间的关系的斜率的就是L _p和在压力轴的截距表示跨越血管壁的有效肿胀压力差。在该实验中的Lp为1.2×10 ^-7（厘米^秒 -1 _水柱 ^{-1），σΔπ}为24 CMH _{2 O.} <A HREF =“htt​​ps://www.jove.com/files/ftp_upload/53210/53210fig5large.jpg”目标=“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。

Discussion

_部分 L P的计算的详细情况。虽然经血管的流体运动发生同时容器自由地灌注，例如交换是太小期间自由灌注被测定，因为它通常是在容器的灌注率小于0.01％。然而，当灌注瞬时通过堵塞微血管，经血管流动停止（即，过滤）从标记红细胞在管腔作为流体的标记物红细胞和闭塞的位点之间的列中的运动测量缩短所示图3。根据实验方案的非支链容器600〜1000微米的长度是必要的复杂性和长度。

当容器未遮挡和压力计压力通过微血管驱动流动，穿过枪头的压降大，因此在自由灌注该微血管压力通常只有一个一些CMH ₂ 0以上下游压力。与此相反，在遮挡期间通过该吸管的压降是很小的，由于流体慢慢进入血管腔，以取代在整个容器壁流体过滤。因此，在闭塞的血管腔（P _C）静水压力等于所设置的压力表。在肠系膜组织的肿胀压力可忽略不计，因此闭塞后立即从标记红细胞经血管流体运动的测量，其中流体静压是已知的并且在血管腔的肿胀压力等于设定在灌注液。随着_部分 L P的连续测量，船舶长度块场地被提前每次丢失。此外，连续recannulation可减少血管长度。

每血管壁（j _{V / S）}单位面积的经血管流体流从速率估计，水从柱中microv一个测量长度标记红细胞和闭塞部位要么缩短（净过滤）或延长（净重吸收）之间爱索尔流明。的假设是，中性浮力红细胞沿血管腔的中心线移动，可用于跟踪水柱的细胞（红细胞速度为是指水速度比周围的平均速度是接近1.8为6微米红细胞在一个直径为30微米的容器^）。8,14因此，如果一个标记细胞（以微米/秒）朝阻断剂的速度为V微米/秒以上闭塞后的第2-5秒，并且将容器半径是R，流体过滤横跨微血管壁红细胞和闭塞（j _v）的站点之间的体积为^{πR2 V}微米^{3 /秒}假设微血管是圆柱形的。进一步该标记细胞和闭塞部位之间的圆柱形微血管（S）的面积是2πrℓ，其中ℓ是标记单元之间的初始距离和闭塞部位。因此每单位面积（j _{V / S）}处的压力在由水压力计Vr的/（2ℓ）中设定的平均初始经血管流。

如果灌注液的渗透压已设置相对低的微血管压力（通常3.6 _水柱 ，牛血清白蛋白在10毫克/毫升和毛细管的浓度的肿胀压力容器大号_p的最简单的估计是由压力大于30 _水柱 ）。 _部分 L P的计算公式为（j _{V / S）/（PÇ-3）}厘米/秒/厘米_的 H 2 O，因为使白蛋白反射系数（σ _白蛋白）中的控制状态是接近0.9。使用这种方法的快速变化在_部分 L P为1分钟量级的时间分辨率可通过建立Ĵ _诉连续测量之间自由流动/ S上，如图4中所示的代表性结果恒定的压力。上述方法灌胃被测量NORES在白蛋白的肿胀压力微小变化落入到小于1 _水柱时的反射系数低于0.5，但期L _p的估计的误差保持小于5％当P _c大于 30 _水柱 。

当需要两个大号_p和反射系数的精确测量，J _{V / S}处测量的一系列测试大分子的预期有效肿胀压力低于微血管压力。在压力轴Ĵ _体积/ S和压力的措施大号_p和截距之间的关系的斜率时净流量为零措施σπ（图5）。该JV是线性相关的压力的示范也是采用使用上述的简单的协议单个压力测量值的一个重要的验证（图4）时的肿胀压力差是相对于静水压机低URE。

错误的可能来源。有几个问题，损害精确测量。如果未能正确地堵塞血管或损坏血管壁在闭塞部位导致流体泄漏过去闭塞部位，和标记的细胞的运动朝着闭塞部位比更快由于经血管交换。而标记的细胞通常缓慢移向闭塞部位，但没有达到它，一个泄漏指示如果标记的细胞追踪一路阻塞器。另一方面，未能封住吸管进入微血管内腔在插管站点结果为J _{V / S}的低估。从吸管的灌流或血管腔的插管位点的上游的流体泄漏导致横跨枪头一个显著压降。检测到这样的泄漏时，细胞中以比那些在下游容器陆更高速度的微量移液器尖端流男人闭塞血管的。微量的仔细重新定位通常封这样的泄露。不同的问题产生，如果血管壁的大号_p不是均匀的，通常是用局部损伤或炎症中的一个或多个位点具有。标记的细胞追踪到现场如果大部分流量经血管都集中在那里。红细胞运动还是测量流经血管，但这项措施_{ĴV / S}是不是代表的大部分测试段内的墙体面积。

该方法相对于现有方法的意义。两种最常用的方法来研究的内皮屏障通透性和经血管交换的调节是（1） 在体外穿过培养的内皮细胞单层和（2）中测量示踪剂蓄积交换的测量示踪剂后一个组织样品静脉注射到整个动物。在培养的内皮细胞单层实验为favored因为细胞功能，可以更直接地修改，并没有可用于在内皮细胞分子事件的详细评估足够细胞物质。然而，大多数的培养条件下的内皮细胞通常不形成阻挡代表的体内血管通透性。上述改性兰迪斯技术已被证明是一个强健而可靠的技术来研究内皮屏障功能的完整小静脉微血管的调节。在一个有经验研究者手中成对渗透性的控制和测试条件的测量，其中的一些在细胞培养中使用的方法（例如，细胞组分的成像，修改信号通路的）都可以应用。实验在完整微血管的重要性已被证明通过表明调节屏障通透性的单独灌注microve的机制之间的差异显著ssels和那些在培养的内皮单层经常被描述。实例包括响应于剪切，凝血酶曝光和收缩机制炎性缝隙形成^2-6,9,16的贡献。示踪剂蓄积在一个完整的血管床测量保留了更多的正常生理功能，但在血管通透性的实际变化直接调查受到损害，因为示踪剂蓄积可随着增加的灌注（增加的表面积为交换）的结果有或没有增加的渗透性的墙。由此一通透性增加的程度时血管舒张增加灌注血管的数量，从而总溶质积累大于由于增加在单独³⁴血管通透性可能被高估。

未来的应用程序。的选项的范围，以在相同的条件下修改蜂窝结构和功能因迪的渗透性维杜阿尔容器直接测量期间微灌预期增加。此外，预期的在转基因鼠肠系膜的方法的应用可以解决存在已遗传修饰的小鼠长期的问题。具体地，当转基因小鼠变得可用它预计，微灌可以扩大到调查在其肠系膜血管微血管。虽然一些微灌实验已经在小鼠肠系膜³⁵的微血管完毕后，小鼠通常具有其比鼠肠系膜组织较少微血管，而这些血管是经常短和高度支化的，而不是更合适的较长（> ​​500微米）的直管即可以在大鼠中找到。因此，实验研究交流经血管的调制基因小鼠依靠试验，如万里^34或技术要求高，但更可靠的示踪实验以衡量变化在这两个血管及放射性同位素示踪试验探针³⁶的荧光血管外聚集。

该方法的修饰。另外，在上述协议，改变灌洗液组合物所需的微量的变动。另一种方法是使用一个补充装置，以补充原位微量。如详细描述的³⁷本程序已经完成。的限制是，该时间来改变在所述吸移管的灌流液中的组合物是不一样快吸管置换为实现，但该过程是特别有用的，如果有必要灌注一个微血管延长的时间周期。

同一微灌走近可以扩展到测量渗透性系数以荧光标记的溶质^31,38-40。在这种情况下，单个桶装微量替换为双管（THETA）吸移管^41和容器是灌流交替地与测试荧光溶质测量积累相对组织到管腔内容，和不使用荧光溶质相同灌流以清除组织和允许溶质积累重复测量。当经血管水流量的测量是使用荧光标记的测试溶质溶质渗透系数的测量结合，细胞内的组合物，或细胞成分的共焦成像的荧光指示剂，更复杂的计算机控制的荧光显微镜是必需的。因为这些研究通常需要透镜具有更高的放大倍率和短得多的工作距离，用来装肠系膜石英支柱被替换的玻璃盖玻片粘到组织以及在显微镜托盘内的有机玻璃支持。三维打印机的供应量增加，将使定制托盘，符合定位较大地径所需的窄公差精度高，制造- [R镜头的工作距离相对于选定的微血管短。

可用微血管肠系膜的可用性变化与年龄​​，性别和应变。因此，大鼠的菌株和使用男性或女性的将取决于具体问题的选择被寻址。对于我们的许多最近的研究中，我们使用雄性SD大鼠，其中至少一个星期驯化在我们的动物设施在使用之前大约年龄3-4个月，在此期间，我们发现，他们一般都用长而直肠系膜微血管。相比之下，我们的同事已经成功地使用的雌性Sprague-Dawley大鼠的2-3个月^13岁 。

红细胞的作用。如上所述红细胞的主要作用是追踪经血管水运动假定细胞充当惰性的，水中性浮力指标中流动的微血管闭塞后。除了这个基本的作用，它现在认识到的红细胞通过在本^31,42,43白蛋白时供给S1P到灌注液有助于屏障的稳定性。有这些观察的几个重要的意义。在没有红细胞或与使用替代惰性流标志物的基线渗透率很可能是较不稳定的。所以建议S1P的测量应在微灌实验中使用的所有的灌流液制成。

Acknowledgments

这项工作是由卫生部资助HL44485和HL28607国家机构的支持。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MICROSCOPE, TABLE AND STAGE
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Olympus	CK-40	try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Leica	DMIL	try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
narrow diameter, long working distance objective: example	Nikon	Nikon E Plan 10×/0.25 LWD
stage platform--1/2 inch or 1 cm sheet steel	welding shop		this should be heavy to reduce vibration
Unislide x-y table: dove tail slides	Velmex	AXY4006W1
VIDEO
CCD video camera: example	Pulnix	TM-7CN (no longer available)	no color needed
video capture system with audio--generic
video playback system (completely still frame, single frame motion)
small microphone
MICROMANIPULATORS, HOLDERS
micromanipulator, XYZ (3)	Prior/Stoelting (no longer available)		look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning
hydraulic probe drive, one way	FHC	50-12-1C	need to buy either manual drive or electronic drive
manual drum drive	FHC	50-12-9-02
or hydraulic drive, 3 way	Siskiyou Corporation	MX610 (1-way) or MX630 (3-way)	great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years
connectors/rods/holders	Siskiyou Corporation	MXC-2.5, MXB etc.
pin vise	Starrett	162C	to hold restrainer
pipette holder	World Prescision Instruments	MPH3
water manometer ~120 cm
MICROSCOPE TRAY
clear Plexiglas for microscope tray for animal
3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall	Quartz Scientific Inc.	custom	(or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective
Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)
medical adhesive for tissue well	NuSil	MED-1037
All-purpose silicone rubber heat mat, 5" L x 2" W	Cole Parmer	EW-03125-20	heater for microscope tray--needs cord and controller--240V version available
Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC	Cole Parmer	EW-03122-75
STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out	Cole Parmer	EW-01575-00
PIPET MANUFACTURE
vertical pipette puller	Sutter Instrument Company	P-30 with nichrome filament
1.5 mm OD thin wall capillary tubing	Sutter Instrument Company	B150-110-10
pipette grinder air stone and dissection microscope--see reference in text			or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments
RX Honing Machine, System II	RX Honing Machine Corporation	MAC-10700 Rx System II Machine	alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle
with ceramic sharpening disc	RX Honing Machine Corporation		use "as is" or attach lapping film
lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um	3M	part no. 051144 80827	268X Imperial lapping film sheets with adhesive back--can be purchased from Amazon

References

1. Curry, F. R. Permeability measurements in an individually perfused capillary: the 'squid axon' of the microcirculation. Experimental physiology. 93, 444-446 (2008).
2. Curry, F. R., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
3. Curry, F. R., Adamson, R. H. Tonic regulation of vascular permeability. Acta physiologica. 207, 628-649 (2013).
4. Michel, C. C. Fluid exchange in the microcirculation. The Journal of physiology. 557, 701-702 (2004).
5. Tarbell, J. M., Simon, S. I., Curry, F. R. Mechanosensing at the vascular interface. Annual review of biomedical engineering. 16, 505-532 (2014).
6. Sarelius, I. H., Kuebel, J. M., Wang, J., Huxley, V. H. Macromolecule permeability of in situ and excised rodent skeletal muscle arterioles and venules. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 290, H474-H480 (2006).
7. Curry, F. E., Frokjaer-Jensen, J. Water flow across the walls of single muscle capillaries in the frog, Rana pipiens. The Journal of physiology. 350, 293-307 (1984).
8. Michel, C. C., Mason, J. C., Curry, F. E., Tooke, J. E., Hunter, P. J. A development of the Landis technique for measuring the filtration coefficient of individual capillaries in the frog mesentery. Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 59, 283-309 (1974).
9. Adamson, R. H., Zeng, M., Adamson, G. N., Lenz, J. F., Curry, F. E. PAF- and bradykinin-induced hyperpermeability of rat venules is independent of actin-myosin contraction. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 285, H406-H417 (2003).
10. Huxley, V. H., Rumbaut, R. E. The microvasculature as a dynamic regulator of volume and solute exchange. Clinical and experimental pharmacology, & physiology. 27, 847-854 (2000).
11. Rumbaut, R. E., Wang, J., Huxley, V. H. Differential effects of L-NAME on rat venular hydraulic conductivity. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. , 279-H2023 (2000).
12. Yuan, D., He, P. Vascular remodeling alters adhesion protein and cytoskeleton reactions to inflammatory stimuli resulting in enhanced permeability increases in rat venules. Journal of applied physiology. 113, 1110-1120 (2012).
13. Zhou, X., He, P. Temporal and spatial correlation of platelet-activating factor-induced increases in endothelial [Ca(2)(+)]i, nitric oxide, and gap formation in intact venules. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 301, H1788-H1797 (2011).
14. Adamson, R. H., et al. Oncotic pressures opposing filtration across non-fenestrated rat microvessels. The Journal of physiology. 557, 889-907 (2004).
15. Adamson, R. H., et al. Epac/Rap1 pathway regulates microvascular hyperpermeability induced by PAF in rat mesentery. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 294, H1188-H1196 (2008).
16. Curry, F. E., Zeng, M., Adamson, R. H. Thrombin increases permeability only in venules exposed to inflammatory conditions. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 294, H1188-H1196 (2003).
17. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature. 32, 347-355 (2014).
18. Bagher, P., Davis, M. J., Segal, S. S. Intravital macrozoom imaging and automated analysis of endothelial cell calcium signals coincident with arteriolar dilation in Cx40(BAC) -GCaMP2 transgenic mice. Microcirculation. 18, 331-338 (2011).
19. Duza, T., Sarelius, I. H. Increase in endothelial cell Ca(2+) in response to mouse cremaster muscle contraction. The Journal of physiology. 555, 459-469 (2004).
20. Oshiro, H., et al. L-type calcium channel blockers modulate the microvascular hyperpermeability induced by platelet-activating factor in vivo. Journal of vascular surgery. 22, 732-739 (1995).
21. Chen, W., et al. Atrial natriuretic peptide-mediated inhibition of microcirculatory endothelial Ca2+ and permeability response to histamine involves cGMP-dependent protein kinase I and TRPC6 channels. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 33, 2121-2129 (2013).
22. Harris, N. R., Whitt, S. P., Zilberberg, J., Alexander, J. S., Rumbaut, R. E. Extravascular transport of fluorescently labeled albumins in the rat mesentery. Microcirculation. 9, 177-187 (2002).
23. Yuan, W., Li, G., Zeng, M., Fu, B. M. Modulation of the blood-brain barrier permeability by plasma glycoprotein orosomucoid. Microvascular research. 80, 148-157 (2010).
24. Sugiura, Y., Morikawa, T., Takenouchi, T., Suematsu, M., Kajimura, M. Cilostazol strengthens the endothelial barrier of postcapillary venules from the rat mesentery in situ. Phlebology / Venous Forum of the Royal Society of Medicine. 29, 594-599 (2014).
25. Guo, M., et al. Fibrinogen-gamma C-terminal fragments induce endothelial barrier dysfunction and microvascular leak via integrin-mediated and RhoA-dependent mechanism. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29, 394-400 (2009).
26. Dewar, A. M., Clark, R. A., Singer, A. J., Frame, M. D. Curcumin mediates both dilation and constriction of peripheral arterioles via adrenergic receptors. The Journal of investigative dermatology. 131, 1754-1760 (2011).
27. Lee, J. F., et al. Balance of S1P1 and S1P2 signaling regulates peripheral microvascular permeability in rat cremaster muscle vasculature. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 296, H33-H42 (2009).
28. Landis, E. M. Microinjection studies of capillary permeability. II. The relation between capillary pressure and the rate at which fluid passes through the walls of single capillaries. Am J Physiol. 82, 217-238 (1927).
29. Curry, F. E., Huxley, V. H., Sarelius, I. H. Techniques in cardiovascular physiology Part 1. Linden, R. J. P3/1, Elsevier Scientific Publishers Ireland Ltd. 1-34 (1983).
30. Vurek, G. G., Bennett, C. M., Jamison, R. L., Troy, J. L. An air-driven micropipette sharpener). J Appl Physiol. 22, 191-192 (1967).
31. Curry, F. E., Clark, J. F., Adamson, R. H. Erythrocyte-derived sphingosine-1-phosphate stabilizes basal hydraulic conductivity and solute permeability in rat microvessels. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 303, H825-H834 (2012).
32. Bagher, P., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Microiontophoresis and micromanipulation for intravital fluorescence imaging of the microcirculation. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
33. Adamson, R. H., et al. Attenuation by sphingosine-1-phosphate of rat microvessel acute permeability response to bradykinin is rapidly reversible. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 302, H1929-H1935 (2012).
34. Bates, D. O. Vascular endothelial growth factors and vascular permeability. Cardiovasc Res. 87, 262-271 (2010).
35. Adamson, R. H., et al. Rho and rho kinase modulation of barrier properties: cultured endothelial cells and intact microvessels of rats and mice. The Journal of physiology. 539, 295-308 (2002).
36. Curry, F. R., et al. Atrial natriuretic peptide modulation of albumin clearance and contrast agent permeability in mouse skeletal muscle and skin: role in regulation of plasma volume. The Journal of physiology. 588, 325-339 (2010).
37. Neal, C. R., Bates, D. O. Measurement of hydraulic conductivity of single perfused Rana mesenteric microvessels between periods of controlled shear stress. The Journal of physiology. 543, 947-957 (2002).
38. Adamson, R. H., et al. Albumin modulates S1P delivery from red blood cells in perfused microvessels: mechanism of the protein effect. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 306, H1011-H1017 (2014).
39. Huxley, V. H., Wang, J. J., Sarelius, I. H. Adaptation of coronary microvascular exchange in arterioles and venules to exercise training and a role for sex in determining permeability responses. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 293, H1196-H1205 (2007).
40. Huxley, V. H., Williams, D. A. Basal and adenosine-mediated protein flux from isolated coronary arterioles. Am J Physiol. 271, H1099-H1108 (1996).
41. Davis, M. J., Gore, R. W. Double-barrel pipette system for microinjection. Am J Physiol. 253, H965-H967 (1987).
42. Adamson, R. H., et al. Sphingosine-1-phosphate modulation of basal permeability and acute inflammatory responses in rat venular microvessels. Cardiovasc Res. 88, 344-351 (2010).
43. Zeng, Y., Adamson, R. H., Curry, F. R., Tarbell, J. M. Sphingosine-1-phosphate protects endothelial glycocalyx by inhibiting syndecan-1 shedding. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. , H306-H363 (2014).

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