Microperf Técnica para Investigar Regulamento de microvasos Permeabilidade de Rat Mesentery

Abstract

As experiências para medir as propriedades de permeabilidade dos microvasos perfundidos individualmente fornecer uma ponte entre a investigação dos mecanismos moleculares e celulares que regulam a permeabilidade vascular em monocamadas de células endoteliais em cultura e as propriedades de leitos microvasculares inteiros câmbio funcionais. Um método para canular e perfundir microvasos venulares de mesentério de ratos e medir a condutividade hidráulica da parede de microvasos é descrito. O principal equipamento necessário inclui um microscópio intravital com um palco modificado grande que suporta micromanipuladores para posicionar três microtools diferentes: (1) uma micropipeta de vidro chanfrado de canulação e perfundem o microvasos; (2) um micro-vidro oclusor para bloquear temporariamente a perfusão e permitir a medição de transvascular movimento fluxo de água a uma pressão hidrostática medida, e (3) uma vareta de vidro fechado para estabilizar o tecido mesentérico ao sítio de canulação. A Landis micro-oclusão techniq modificadoue utiliza células vermelhas suspensas no perfusato artificial como marcadores de circulação de fluido transvascular, e também permite medições repetidas destes fluxos condições experimentais são alteradas e diferença de pressão osmótica e hidrostática colóide através dos microvasos são cuidadosamente controlados. As medições de condutividade hidráulica primeiro usando um perfusado de controlo, em seguida, após a re-canulação da mesma microvasos com os perfusatos teste permitir comparações de resposta de microvasos sob estas condições bem controladas emparelhado. As tentativas para alargar o método de microvasos no mesentério de ratos com modificações genéticas que se espera modificar a permeabilidade vascular foram severamente limitada, devido à ausência de microvasos compridas rectas e não ramificados no mesentério do rato, mas a recente disponibilidade dos ratos com modificações genéticas semelhantes usando CRISPR tecnologia / Cas9 deverá abrir novas áreas de investigação onde os métodos aqui descritos podem ser aplicados.

Introduction

Microperfusão na vasculatura inclui estabelecer um fluxo de perfusato artificial de composição conhecida controlada através de uma micropipeta em um vaso sanguíneo geralmente menos de 40 um de diâmetro. O recipiente continua a ser perfundido no seu ambiente de tecido normal e é perfundido com sangue do animal até ao momento da punção. Quando usado em conjunto com uma série de imagens de vídeo ou técnicas fluorométricos, em microperfusão situ permite a medição de fluxos de água e de solutos através das paredes de microvasos em condições onde as forças de condução para estes fluxos são conhecidos e as propriedades de permeabilidade da parede vascular podem ser avaliada diretamente. Além disso, por controlo da composição do líquido que rodeia o de microvasos no tecido (perfusado e superfusate), a regulação da permeabilidade microvascular e podem ser investigadas de câmbio, permitindo que as células endoteliais que formam a parede de microvasos para ser exposta a uma variedade de econdições Xperimental (agonistas, condições de perfusão modificados, indicadores fluorescentes para medir a composição e sinalização intracelular) por períodos precisamente medidas de tempo (seg a hr). Além disso, as avaliações ultra-estruturais ou citoquímicos de estruturas moleculares celulares chave que regulam a barreira pode ser investigadas no mesmo microvasos em que a permeabilidade está diretamente medidos. A abordagem assim, forma uma ponte entre a investigação dos mecanismos celulares e moleculares para modificar a função de barreira endotelial em monocamadas de células endoteliais cultivadas e investigação em microvasos intactas. Consulte os seguintes comentários para uma avaliação mais aprofundada ^1-6.

Uma limitação de microperfusão é que ela só pode ser utilizada em leitos microvasculares que são finas, transparentes e possuem integridade estrutural suficiente para permitir a canulação com uma micropipeta de vidro. Enquanto as primeiras investigações usado microvasos rã no mesentério e fino cutânea pectoris muscle ^7,8, de longe, a preparação mais utilizada em modelos de mamíferos é o mesentério de rato ^9-15. A maioria das investigações concentraram-se em alterações agudas na permeabilidade vascular estudado ao longo de períodos de 1-4 horas, mas as investigações mais recentes foram estendidos para medições em navios individuais 24-72 horas após uma perfusão inicial ^12,16. A tecnologia CRISPR recentemente desenvolvido, que promete tornar mais modelos de ratos geneticamente modificados disponível para estudar regulação da permeabilidade vascular ¹⁷ deverá permitir que os métodos descritos na presente comunicação a ser aplicado em microvasos venulares do mesentério nestes novos modelos importantes de ratos.

O método requer um microscópio invertido equipado com um estágio de microscópio construído sob encomenda suficientemente grande para conter tanto a preparação dos animais e, pelo menos, três micromanipuladores usadas para microferramentas posição próxima do vaso e perfundidos para alinhar uma micropipeta de perfusão com o naviolúmen. Por exemplo, uma plataforma personalizada para um estágio de microscópio XY (cerca de 90 × 60 cm) pode ser fabricada a partir de uma chapa de aço de 1 cm de espessura com um revestimento à prova de ferrugem. O palco está ligado a uma tabela de índice de engenharia ou duas lâminas de cauda de andorinha montados em ângulos retos e apoiados em pilares de teflon ou transferências bola para o movimento no plano horizontal. Um equipamento típico (ver Figura 2) tem muito em comum com o microscópio e microposicionamento equipamento utilizado para uma série de experimentos microcirculação intravital tais como aqueles para medir o fluxo único dos vasos sanguíneos e hematócrito, entrega local de oxigênio pelo sangue perfusão microvasos, regulação da liso vascular tônus ​​muscular, eo acúmulo microvascular local dos marcadores fluorescentes injetadas em toda a circulação ^18-26.

O aspecto fundamental da técnica é a medição do volume do caudal (J _v) através de uma área de superfície definido (S) da parede de microvasos. Cumpriresta via a técnica Landis modificado aqui descrito um microscópio invertido simples é adequada. Uma pequena câmara de vídeo está montado na porta e o sinal de imagem de vídeo, com uma base de tempo adicional, é apresentada num monitor de video e registadas na forma digital num computador ou como um sinal digital ou analógico de um gravador de vídeo. Uma vez que a microvasculatura é canulada a porção do microvasos visível para a câmara pode ser alterado movendo o palco e manipuladores como uma unidade, sem perturbar a canulação.

Medição dos fluxos transvascular pode também ser combinado com investigações mais detalhadas, utilizando um microscópio de fluorescência com filtros adequados sofisticados, tais como sondas utilizadas para as medições de permeabilidade soluto, fluorescente monitorização relação de cálcio citoplasmático ou outros mecanismos celulares, e imagiologia confocal ^{6,12,13, 27.} Uma das principais vantagens de todas as abordagens microperfusão é a capacidade de fazer medidas repetidas, no mesmo navio, Sob a mudança controlada de força motriz, tais como pressões hidrostática e oncótica, ou mudança induzida em respostas dos vasos para condições inflamatórias. O design mais comum é uma comparação pareada da condutividade hidráulica medida (L _p) no mesmo navio com o primeiro recipiente de perfusão através de uma micropipeta preenchido com um perfusato controle e suspensão de eritrócitos para estabelecer um estado permeabilidade da linha de base, em seguida, com uma segunda pipeta com o agente de teste adicionado ao perfusado. Várias cânulas são possíveis com o ciclo repetido após reperfusão, com a pipeta de controle.

O presente protocolo demonstra a canulação e microperfusão de um navio venular em mesentério de rato para gravar fluxos de água através da parede de microvasos e medir a G _P da parede do vaso, um índice útil da permeabilidade da via comum para a água e os solutos através da intacta barreira endotelial. O procedimento é chamado de techniq Landis modificadoue porque o princípio original Landis de utilizar o movimento relativo de células vermelhas como uma medida de troca de fluido transvascular após perfusão é bloqueado é preservada ^28, mas a gama de condições experimentais (por exemplo, as diferenças de pressão oncótica hidrostáticas e albumina através da parede de microvasos) disponível depois de microperfusão é muito maior do que no sangue perfusão microvasos canulados ^8,29.

Protocol

Declaração de Ética: Todos os procedimentos foram revistos e aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal Institucional.

1. Fabricação preliminar de Micropipetas, contenção e bloqueadores

1. Puxar vários tubos capilares de vidro de borosilicato limpas ao meio usando um extractor de electrónica ajustada de modo que, quando puxado, a parte alongada do tubo é de cerca de 1 cm de comprimento e as duas metades são um tanto simétrica. Certifique-se de que a vela é coerente com as dimensões em Figura 1. Use as duas metades para micropipetas, limitadores e bloqueadores.
   1. Bevel as micropipetas usando um rebolo ar impulsionado ^{30 com} 0,5 um papel abrasivo banhado com água. Definir o ângulo do suporte de micropipeta de modo que é cerca de 30 graus a partir da horizontal.
   2. Lave e seque as micropipetas usando sucção para puxar acetona limpa através da ponta e até o eixo. Inspecionar as micropipetas (Figura 1A), utilizando um pequeno microscópio vertical com 4 × 40 × objectivos e equipados com um titular micropipeta jacaré e um retículo ocular.
   3. Seleccione micropipetas com abertura da ponta cerca de 50 um longo com um chanfro cuja relação comprimento / largura é de entre 3,1 e 3,5 e com um ponto agudamente afilada o que ajuda a penetrar nas fibras de colágeno difíceis no mesentério.
   4. Armazenar 15-20 micropipetas de tamanhos ligeiramente diferentes em uma caixa livre de poeira.
2. Faça limitadores utilizando tubos capilares puxados preparados no passo 1.1). Segurar um tubo capilar de vidro removido brevemente perto de uma microflame para formar uma extremidade romba (Figura 1B). Armazenar vários em uma caixa livre de poeira.
3. Faça microoccluders utilizando tubos capilares puxados preparados no passo 1.1). Segure um tubo capilar puxado sob uma microflame e dobre (usando um adaptador de tubulação, por exemplo., 23G), a ponta fina (cerca de 4 mm a partir da ponta) para fazer um ângulo de cerca de 120 graus para o eixo (

2. Preparação animal e Cirurgia

1. Anestesiar ratos fêmea Sprague-Dawley macho (350-450 g) ou (200-300 g) com pentobarbital de sódio (80-100 mg / kg, Sigma-Aldrich, P3761), por injecção subcutânea; proteger o mesentério, não utilizando injecção intraperitoneal.
2. Ao longo de procedimentos cirúrgicos e protocolos experimentais, manter a anestesia por injecções suplementares (30 mg / kg), conforme necessário. Determinar a profundidade da anestesia por pitada dedo do pé ou reflexo da córnea. Após a conclusão do procedimento experimental, a eutanásia através de sobredosagem de pentobarbital de rato ou injecção intra-cardíaca de cloreto de potássio saturado, sob anestesia.

3. Prepare Soluções e Erythrocytes para uso como marcadores de fluxo

1. Preparar a solução de Ringer de mamífero para a solução de controlo e superfusate perfusato (solução de Ringer contendo 10 mg / ml de ácido gordo de mamífero normalmentealbumina livre de soro bovino, BSA).
   1. Perfusato filtro através de 0.2 mm filtros de seringa para remover partículas minúsculas que podem bloquear a ponta micropipeta; filtrar para pequeno recipiente limpo.
2. Prepare eritrócitos por tiragem de cerca de 0,2 ml de sangue a partir da veia da cauda do rato anestesiado em uma agulha 20G num pequeno seringa contendo 0,05 ml de heparina (1000 U / ml) e transferir para um tubo de centrífuga de 15 ml contendo cerca de 14 ml de mamífero solução de solução de Ringer .
   1. Centrifugar para embalar suavemente as células vermelhas (cerca max 200 x g durante 7 min). Empate fora o sobrenadante e re-suspender as células vermelhas em solução de Ringer.
   2. Após centrifugação e remoção do sobrenadante, três vezes deixar os glóbulos vermelhos no fundo do tubo para uso posterior. Note-se que este processo reduz as plaquetas em perfusatos finais para menos do que 0,1% dos níveis normais de ^31.

4. Organizar o tecido no animalBandeja

1. Raspar o abdome do rato anestesiado abaixo do umbigo ao apêndice xifóide. Assegure-se que a área raspada se estende em torno do lado direito (para o rato colocado no lado direito), de modo que o cabelo não se forma um pavio para desenhar o superfusate fora do tecido bem. Remover cabelos cortados com uma gaze molhada ou tecido.
   1. Segurar a pele com uma pinça sem corte serrilhada e fazer uma incisão no centro da linha (2-3 cm de comprimento) através da pele utilizando uma tesoura resistentes. Usando uma multa (íris) tesoura fazer uma incisão semelhante através da linha alba, levantando a parede abdominal com uma pinça serrilhada para evitar danos ao intestino.
   2. Com o animal em seu lado na bandeja do animal, puxe cuidadosamente o intestino a partir da cavidade abdominal utilizando aplicadores com ponta de algodão (vara de madeira) embebidos em solução de Ringer e uma pinça sem corte serrilhadas. Organizar o intestino no tecido bem para que o mesentério é estendida sobre o pilar para visualização através do microscópio tendo o cuidado de evitar tocar o mesentério (potentially danificar microvasos), quer com fórceps ou algodão.
      Nota: O tabuleiro do animal (Figura 2A) pode ser construído a partir de Plexiglas e requer um tecido bem (aproximadamente 3 mm de profundidade), uma coluna opticamente transparente (por exemplo, quartzo polido cerca de 2 cm de diâmetro e 5 mm de altura.), E uma almofada de aquecimento ajustada para manter a temperatura do animal. A espessura do pilar não deve exceder a distância de trabalho do objectivo.
2. Posição da bandeja do animal sobre a platina do microscópio de modo que o mesentério é visível através das oculares.
3. Posicione uma linha de gotejamento alimentado por gravidade para superfuse continuamente o mesentério com solução de Ringer de mamífero mantida a 35-37 ° C. Use compressas de gaze para manter o intestino no lugar, ajudar a reter a umidade, e pavio excesso de solução de Ringer fora da superfície. Ajustar o fluxo e aspirar o efluente para manter uma espessura superfusate consistente.
4. Identificar alvo microvasos venulares, que sãonão ramificados segmentos a jusante do fluxo convergente, um ou dois ramos distais aos verdadeiros capilares. Encontrar um vaso não ramificada (de preferência, 600 a 1000 um de comprimento) com o fluxo de sangue livre e rápida de células brancas que furam na parede do vaso.
5. Posicionar o teste de microvasos no centro do campo do microscópio e mover o limitador para a posição perto do sítio de canulação escolhido.

5. Preencha Micropipeta e Monte em Detentor

1. Pouco antes da canulação, suspender as células vermelhas no perfusato. Adicionar 7 ul de eritrócitos a 0,5 ml de perfusato em um tubo de ensaio limpo borosilicato. Nota: hematócritos de 1-3% pode ser usado, mas hematócrito consistente levará a concentrações de perfusão consistente de qualquer substâncias libertadas a partir das células vermelhas.
2. Caber numa seringa de 1 ml com um adaptador de tubulação de 23G e PE 50 tubos (5-15 cm de comprimento). Desenha-se a mistura de células do perfusato / vermelho para dentro da seringa. Inverta a seringa para misturar e expulsar todas as bolhas de tubulação eadaptador. Para maior eficiência, ajuste tubulação para várias seringas antes do experimento começa e mantê-los em uma caixa livre de poeira ou saco plástico.
3. Encher a micropipeta com o avanço do tubo na extremidade mais larga da micropipeta até a mesma se encostar a região cónica. Aplicar um empurrão rápido suave sobre o êmbolo da seringa para encher a ponta da micropipeta. Nota: Um pequeno córrego ou uma gota deve ser visível na ponta para comprovar o preenchimento completo.
4. Retirar o tubo enquanto empurrando suavemente o êmbolo para preencher a parte mais larga do eixo micropipeta. Remover pequenas bolhas no grande eixo sacudindo cuidadosamente o eixo micropipeta. Nota: Um procedimento semelhante foi ilustrado ^32.
5. Coloque a micropipeta em um suporte da pipeta com uma porta lateral que permite uma ligação de fluido contínuo a um manómetro de água. Assegure-se que o suporte, o qual está ligado a um accionamento hidráulico usado para controlar o avanço muito fina da micropipeta, é com um ligeiro ângulo (15-25 °)com a horizontal, de modo que a aresta do cone micropipeta não atingiu o intestino ou o tabuleiro.
6. Montar a unidade hidráulica de um micromanipulador móvel, que tem x, y, z e unidades para permitir alinhamento próximo ao recipiente de ensaio (Figura 2).
7. Ajustar a pressão hidrostática aplicada ao fluido na micropipeta com uma seringa ou ampola de borracha cheio de água, para alterar a altura do fluido na coluna de água do manómetro de cerca de 40 cm H _{2 O acima} do mesentério.
8. Canular o de microvasos, logo que possível depois de encher a pipeta; células vermelhas assentar no fundo da pipeta, de modo que após cerca de 40 min muito poucas células vermelhas irá fluir para o vaso.

6. Microcannulation e microvasculares Medição Pressão

1. Antes de posicionar a micropipeta preenchido sob o microscópio, pressione suavemente a restrição sobre o tecido perto do microvasos aplicar força suficiente para segurar o tecido. Desenhe olimitador de volta, que se estende ligeiramente o tecido de acordo com o de microvasos, de modo que as tensões nas fibras de colagénio mesentéricos são alinhados com o navio.
   1. Alinhe a micropipeta com a embarcação e abaixe-o na vista através das oculares. Colocar a ponta imediatamente a montante do sítio de canulação escolhido e colocá-la sobre o tecido, de modo que possa obstruir parcialmente o fluxo no interior do recipiente, mas isso não ocluir.
2. Canular o navio dirigindo a ponta da pipeta lentamente para o lúmen do vaso usando a unidade hidráulica. Ter cuidado para não apertar através do lado inferior do recipiente.
   Observação: Como a micropipeta entra no lúmen, o perfusato lava-se rapidamente o sangue no vaso para fora do lúmen e flui livremente perfusato em circulação distal do animal ao teste de microvasos, deslocando algumas das perfusão normal do sangue nos vasos jusante.
3. Diminuir a pressão de perfusão, ajustando o manómetro até que o sangue (conforme indicadopelas células vermelhas do animal) é atraído de volta para o segmento de perfusão; esta determina a pressão de equilíbrio onde os glóbulos vermelhos oscilar suavemente no lúmen do vaso e mede a pressão hidrostática de microvasos (P _C) na extremidade distai do segmento de microvasos. Manter a perfusão navio em todas as pressões acima essa pressão equilíbrio.

7. Microocclusion e Coleta de Dados

1. Passo opcional: Antes de usar o micro-oclusor para bloquear o recipiente, que pressiona para o tecido numa zona não utilizada de mesentério longe de qualquer recipiente de modo que a ponta se acumula uma fina camada de tecido que protege o recipiente experimental durante micro repetido oclusões.
2. Colocar o bloqueador de cima do vaso perfundido perto da borda inferior do campo do microscópio.
3. Grave o seguinte com vídeo e áudio.
   1. Verbalmente registar a localização do sítio de bloqueio e o bordo inferior da tela, como visto no retículo ocular.
   2. Com a pontado bloqueador colocado imediatamente acima do de microvasos, utilizar o controlo Z fina do micromanipulador para diminuir suavemente o bloqueador até que o fluxo no vaso está ocluso. Observe a pressão do manômetro (P _c) em áudio. Aplicar oclusão normalmente para 3-10 segundos e solte, restaurando a perfusão livre. Mover o site quadra até o navio em direção à ponta da pipeta em 5-10 mm etapas com base no tempo (> 5 min após o bloco inicial em um site), número de oclusões (3-5), para evitar danos da parede do vaso no local bloco .

8. Análise de Dados e Medição da L _{p (de} água)

1. Durante a reprodução de vídeo, determinar a distância inicial (ℓ ₀₎ a partir de um marcador de células vermelhas para o local de oclusão através da utilização de uma imagem de um micrómetro de plataforma e as posições conhecidas sobre as imagens. Determinar a velocidade inicial (dl / dt) da célula de marcador a partir da sua posição em vários quadros durante a 3-10 segundos de imagens gravadas. Dissuadirmina o raio do vaso (r) a partir das imagens captadas durante a oclusão (Figura 3).
2. Calcular J _v / S para cada oclusão como (dl / dt) x (1 / ℓ ₀₎ x (r / 2). Calcular G _P a uma pressão constante como (J _v / S) dividida pela pressão de condução (microvasos pressão - a pressão osmótica colóide eficaz; ver discussão).

Representative Results

A Figura 4 mostra os resultados da medição do curso de tempo das alterações no G _P num rato venular microvasos canulada sucessivamente com quatro perfusatos. ³³ A magnitude de L _p calculado a uma pressão constante foi usada como uma medida de mudanças na microvasos permeabilidade da parede, primeiro no estado de controlo com um perfusato contendo 1% de albumina de soro bovino, em seguida, quando o recipiente foi exposta ao agente inflamatório bradicinina (BK) através de um segundo micropipeta contendo 10 nM de BK. Bradicinina ocasionou um aumento temporário em L _p que voltou em direção valor controle sobre o subseqüente 10-15 min. O recipiente foi, em seguida, re-perfundido com controlo perfusato durante 30 minutos para re-estabelecer uma linha de base estável. Quando o de microvasos foi perfundido com uma quarta micropipeta com a mesma concentração de Bk, bem como de 1 uM de esfingosina-1-fosfato (S1P) no perfusato, a resposta à bradicinina foi significativamente atenuada. O grau deatenuação quando Bk e S1P foram perfundidos ao mesmo tempo verificou-se ser semelhante ao que foi medido em outras experiências em que S1P foi adicionado ao perfusado 20 min até antes da exposição ao Bk. Estes resultados demonstram o poder de ser capaz de fazer várias medições de G _P num único vaso, e mostram que a acção de um agente tal como S1P para estabilizar a parede do vaso, na presença de um agente inflamatório pode ser resolvido para períodos de tempo da ordem de alguns segundos. Em estudos separados vasos de controlo foram realizadas com um protocolo semelhante na ausência de S1P para mostrar que a atenuação da resposta BK não foi devido a anafilaxia.

Para alguns modelos experimentais, é importante tanto para estimar o coeficiente de reflexão de soluto para uma macromolécula (σ) e a L _p. Isto é realizado através da medição melhor J _{V com} vários pressões de microvasos em cada indivíduo. A Figura 5 mostra uma experiência in que ambos G e _P a pressão oncótica eficaz de 5% de albumina no perfusato (π _albumina = 27 _cmH 2 O a 37 ° C) foram estimados em condições em que não havia albumina no tecido circundante do rato de microvasos. Nestas experiências J _v / S foi medida a três pressões diferentes. O G _{o símbolo p representa} o declive da relação entre _v J / S e da pressão, e a ordenada na origem no eixo de pressão é a diferença de pressão oncótica eficaz em toda a parede do vaso (σΔπ).

Figura 1. microferramentas para perfusão de microvasos individuais. (A) Uma micropipeta para canulação de microvasos ratos com uma ponta chanfrada. (B) A retentoras para a realização de tecido mesentério estável perto do local da punção. (C) Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. rig Intravital para microperf. (A) Visão de bandeja animal com micromanipuladores e microtools orientados sobre pilar de vidro. (B) Grande estágio metal montado na tabela de engenharia e rolamentos de apoio. (C) anestesiados rato com microtools em posição de microperfusão de um microvasos. (D) Vista próxima de mesentério durante um experimento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figu re.

Figura 3. A medição da taxa de filtração por unidade de área usando a técnica modificada Landis. Este esquema mostra um único microvasos canulada com uma micropipeta e uma haste posicionada sobre a oclusão do vaso. Imediatamente após a oclusão microvascular, a distância (ℓ ₀₎ entre o marcador de RBC que viaja na linha de centro do microvasos ocluída e com o local de oclusão é gravada de modo a que a trajectória de célula pode ser seguido durante 5-10 segundos após a oclusão. A posição inicial ₍₀ ℓ) e a velocidade inicial (dl / dt) da célula são utilizados para calcular a taxa média de filtração por unidade de área de parede microvascular entre a célula marcador e o local de oclusão. O microoccluder é então aumentada, e perfusão livre estabelecida antes de medições adicionais são feitas.com / arquivos / ftp_upload / 53210 / 53210fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4. Os dados representativos mostram que a esfingosina-1-fosfato (S1P) inibição actua muito rapidamente A bradicinina (BK; 10 nM). Causou um aumento transiente em microvasos L _p. S1P aplicado como concorrente com o segundo teste bradicinina (BK) inibiu a aguda Bk resposta em relação ao primeiro Bk. Estes dados demonstram que o tempo de exposição a um agente de teste pode ser modificado para avaliar a cinética de activação de uma resposta inibitória. Especificamente, S1P concorrente aplicado apenas com Bk inibiu fortemente a resposta Bk. S1P foi de 1 mM e Bk foi de 10 nM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5. Medição da J _v / S em múltiplas pressões permite que ambos G e _P a pressão oncótica efectiva a ser medido. O fluxo de filtração, J _v / s, foi medida neste recipiente a diferentes pressões hidrostáticas microvasos durante a perfusão com BSA (50 mg ml ^{- 1;} π = 27 _cmH 2 O), enquanto que o mesentério foi banhada com solução de Ringer isenta de proteína. A inclinação da relação entre _v J / s e a pressão é a G _P ea ordenada na origem no eixo de pressão indica que a diferença de pressão oncótica eficaz em toda a parede do vaso. Nesta experiência o Lp foi de 1,2 × 10 ^-7 (cm ^s-1 _cmH 2 ^O -1) eo σΔπ foi de 24 cmH _{2 O.} <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/53210/53210fig5large.jpg" target = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Detalhes dos cálculos de _{L p.} Embora o movimento fluido transvascular ocorre enquanto o navio é perfundido livremente, essa troca é pequena demais para ser medido durante a perfusão livre porque é tipicamente menor do que 0,01% da taxa de perfusão navio. No entanto, quando a perfusão é transitoriamente interrompido por oclusão da micro-vasos, o fluxo transvascular (isto é, por filtração) é medido a partir do movimento das células marcador vermelho no lúmen que a coluna de líquido entre uma célula vermelha do marcador e o local da oclusão encurta como mostrado na Figura 3. Dependendo da complexidade e a duração do protocolo experimental, um vaso não ramificado 600 a 1.000 uM de comprimento é necessário.

Quando o recipiente não é obstruída e o manómetro de pressão está a conduzir através do fluxo de microvasos, a queda de pressão ao longo da ponta da pipeta é grande, de modo que a pressão de perfusão microvascular durante livre é tipicamente apenas umapoucos _cmH 2 0 acima da pressão a jusante. Em contraste, durante uma oclusão da queda de pressão através da pipeta é muito pequena devido ao fluido que entra lentamente do lúmen do vaso de filtragem para substituir o fluido através da parede do vaso. Assim, durante a oclusão da pressão hidrostática no lúmen do vaso (P _c) é igual a esse conjunto pelo manómetro. A pressão oncótica no tecido mesentérica é insignificante, por isso, imediatamente após a oclusão, movimentos fluidos transvascular de células marcador vermelho são medidas em que a pressão hidrostática é conhecido ea pressão oncótica no lúmen do vaso é igual ao fixado no perfusato. Com medições sucessivas de L _p, comprimento do vaso é perdida cada vez que o sítio de bloqueio é avançado. Além disso, reduz o comprimento sucessivo recanalização vaso disponível.

O fluxo fluido transvascular por unidade de área da parede do vaso (J _v / S) é calculado a partir da taxa de que um comprimento medido da coluna de água no microVlúmen Essel entre uma célula vermelha do marcador e do site oclusão quer encurta (filtração líquida) ou aumenta (reabsorção líquida). A suposição é de que as células vermelhas de flutuação neutra que se deslocam ao longo da linha central do lúmen do vaso pode ser utilizado para controlar a velocidade média da coluna de água circundante da célula (a razão entre a velocidade dos glóbulos vermelhos para significar a velocidade da água é próximo de 1,8 para um uM 6 de glóbulos vermelhos num recipiente de 30 um de diâmetro). ^8,14 Assim, se a velocidade de um marcador de células (em uM / seg) na direcção do bloqueador é V ^ M / seg sobre o primeiro 2-5 seg após a oclusão, e o raio do vaso é R, o volume de fluido filtrado através da parede da célula de microvasos que entre vermelho e o local da oclusão (J _v) é πr ² V ^ M ³ / seg assumindo o de microvasos é cilíndrica. Além disso, a área de microvasos cilíndrico (S) entre a célula e o marcador de oclusão é 2πrℓ, onde ℓ é a distância inicial entre o marcador de célulase o local de oclusão. Assim, o fluxo inicial transvascular médio por unidade de área (J _v / S) a uma pressão estabelecida pelo manómetro de água Vr / (2ℓ).

A estimativa simples do recipiente G _P é feito se a pressão oncótica do perfusato foi ajustada baixa em relação à pressão de microvasos (tipicamente 3,6 _cmH 2 O, a pressão oncótica de albumina de soro de bovino a uma concentração de 10 mg / ml e um capilar pressão maior do que 30 _cmH 2 O). G _P é calculado como (J _v / S) / (P _C -3) cm / seg / cm _H2O porque o coeficiente de reflexão de albumina _(albumina σ) no estado de controlo é cerca de 0,9. Com esta abordagem mudanças rápidas em L _{P com} uma resolução de tempo da ordem de 1 minuto pode ser medido através do estabelecimento de fluxo livre entre as medidas sucessivas de J _v / S a uma pressão constante, como mostrado nos resultados representativos na Figura 4. A abordagem IG acimaNores pequenas mudanças na pressão oncótica de albumina que caem para menos de 1 _cmH 2 O quando o coeficiente de reflexão cai abaixo de 0,5, mas o erro na estimativa de L _P continua a ser inferior a 5% quando P _C é superior a 30 _cmH2O .

Quando é necessária uma medição precisa de ambos G e _p coeficiente de reflexão, J _v / S é medido a uma série de microvasos pressões abaixo da pressão oncótica de eficácia esperado da macromolécula teste. A inclinação da relação entre _v J / S e as medidas de pressão _P e L a ordenada na origem no eixo de pressão quando o fluxo de líquido é de zero medidas σπ (Figura 5). A demonstração de que Jv está linearmente relacionada com a pressão é também um importante validação da utilização de medições de pressão único usando o protocolo acima descrito simples (Figura 4), ​​quando a diferença de pressão oncótica é baixa em relação à prensa hidrostáticaure.

As possíveis fontes de erro. Existem vários problemas que comprometem a medição precisa. A falta de ocluir corretamente o reservatório ou danos à parede do vaso com os resultados do site oclusão em vazamento de fluido além do local de oclusão, e movimento de células marcador para o local de oclusão mais rápido do que devido a troca transvascular. Enquanto as células de marcador normalmente mover-se lentamente em direção ao local da oclusão, mas não atingir, um vazamento é indicado se as células marcadoras acompanhar todo o caminho para o oclusor. Por outro lado, a incapacidade de selar a pipeta para dentro do lúmen microvasos no sítio de canulação resulta em subestimação do J _{v /} S. Perda de fluido a partir da pipeta para o superfusate ou para o lúmen do vaso a montante do sítio de canulação provoca uma queda de pressão significativa entre a ponta da pipeta. Tal fuga for detectada quando as células da ponta da micropipeta de fluxo a uma velocidade mais elevada do que aqueles no lu vaso a jusantehomens do vaso ocluído. Reposicionamento cuidadosa da micropipeta geralmente sela uma tal fuga. Uma outra questão surge se a L _p da parede do vaso não é uniforme, tendo geralmente com um ou mais locais de danos localizados ou inflamação. Células marcador acompanhar ao site se mais fluxo transvascular está concentrada lá. A movimentação das células vermelhas ainda mede o fluxo transvascular, mas a medida J _v / S não é representativa da maioria da área de parede dentro do segmento de teste.

Importância do método com respeito aos métodos existentes. Os dois métodos mais utilizados para investigar a regulação da permeabilidade da barreira endotelial e troca transvascular são (1) in vitro, a medição de troca entre as monocamadas de células endoteliais em cultura e (2) a medição da acumulação de marcador nos uma amostra de tecido depois de o marcador for injectado intravenosamente em todo o animal. Experiências em monocamadas de células endoteliais cultivadas são favored porque as funções celulares podem ser mais modificados directamente e não existe material celular suficiente disponível para avaliação detalhada de eventos moleculares em células endoteliais. No entanto sob a maioria das condições de cultura das células endoteliais não costumam formar o representante barreira de permeabilidade vascular in vivo. A técnica Landis modificado descrito acima demonstrou-se ser uma técnica robusta e fiável para investigar a regulação da função da barreira endotelial no microvasos venulares intactas. Nas mãos de um investigador experiente emparelhado medições de permeabilidade sob condições de controlo e de teste, onde algumas das abordagens utilizadas na cultura de células (por exemplo, imagiologia de componentes celulares, a modificação de vias de sinalização) podem ser aplicados. A importância de experiências em microvasos intacto foi demonstrada por mostrar diferenças significativas entre os mecanismos que regulam a permeabilidade da barreira em microve perfundido individualmentessels e aqueles que são frequentemente descritos em monocamadas endoteliais cultivadas. Exemplos incluem respostas a tesoura, a exposição de trombina, e a contribuição de mecanismos contráteis a formação de espaços inflamatória ^2-6,9,16. Medidas de acumulação marcador em um leito vascular intacta preserva a função mais normal fisiológico, mas investigação direta de mudanças reais na permeabilidade vascular está comprometida por causa acúmulo traçador pode aumentar como resultado do aumento da perfusão (maior área de superfície para a troca) com ou sem um aumento no permeabilidade da parede. Assim, a medida de um aumento de permeabilidade pode ser sobrestimada vasodilatação quando aumenta o número de vasos perfundidos e, assim, a acumulação total de soluto é maior do que o devido ao aumento da permeabilidade vascular ³⁴ sozinho.

As aplicações futuras. A gama de opções para modificar a estrutura e a função celular nas mesmas condições como a permeabilidade de INDIvasos indivi- é directamente medido durante microperfusão é esperado aumentar. Além disso, espera-se que a aplicação dos métodos de mesentério de rato geneticamente modificada pode resolver um problema a longo prazo, que já existe há ratinhos geneticamente modificados. Especificamente, quando os ratos geneticamente modificados se tornaram disponíveis esperava-se que microperf poderia ser estendido para investigar microvasos em seus vasos mesentéricos. Enquanto algumas experiências microperfusão foram concluídos em microvasos de rato mesentério ^35, os ratos geralmente têm menos microvasos em seu tecido mesentérica de ratos, e estes navios são muitas vezes curto e muito ramificado, em oposição a (> 500 mm) vasos retas mais longas mais adequados que pode ser encontrada em ratos. Assim experimentos para investigar a modulação de câmbio transvascular em camundongos geneticamente têm contado com ensaios, tais como o Miles ^{34 ou} os experimentos tracer tecnicamente exigentes, mas mais confiável que medidamudanças em ambos vascular e acumulação de extravascular fluorescente de sondas de teste radiomarcados ^36.

Modificações do método. Nos protocolos acima, as mudanças na composição do perfusato necessária mudança de micropipetas. Uma abordagem alternativa é a de tornar a encher o micropipeta in situ, utilizando um aparelho de reenchimento. Este procedimento foi realizado tal como descrito em pormenor ^37. A limitação é que o tempo necessário para alterar a composição do perfusato na pipeta não é tão rápida como conseguido por substituição da pipeta, mas o procedimento é especialmente útil se for necessário para perfundir um microvasos por longos períodos de tempo.

O mesmo se aproximou de microperfusão pode ser estendido para medir os coeficientes de permeabilidade para marcado fluorescentemente soluto ^31,38-40. Neste caso, o único micropipeta cano é substituído por um duplo cano (teta) pipeta ⁴¹ e o recipiente é perfundidoalternadamente com o soluto teste fluorescente para medir o tecido acumulação em relação ao lúmen conteúdo, e ao mesmo perfusato sem o soluto fluorescente para limpar o tecido e permitir a medição repetida de acumulação de solutos. Quando as medições do fluxo de água transvascular devem ser combinados com medições de coeficiente de permeabilidade utilizando solutos soluto de teste marcadas fluorescentemente, indicadores fluorescentes de composição intracelular, ou de imagem confocal de componentes celulares, um computador controlado mais sofisticado microscópio de fluorescência é necessária. Uma vez que estes geralmente exigem investigações lentes com maior ampliação e distância de trabalho muito mais curto, o pilar de quartzo utilizada para segurar o mesentério é substituído por uma lamela de vidro colado a um suporte de plexiglas dentro do tecido bem no tabuleiro de microscópio. O aumento da disponibilidade de impressoras 3-D, vai permitir o fabrico de alta precisão de bandejas personalizadas, que atendam a tolerância estreita necessário para posicionar maior diameter lentes com distância mais curta de trabalho em relação ao microvasos selecionadas.

A disponibilidade de microvasos utilizáveis ​​no mesentério varia com a idade, sexo e tensão. Portanto, as escolhas de estirpe de rato e a utilização do sexo masculino ou feminino vai depender das questões específicas a ser tratadas. Para muitos dos nossos estudos recentes que usamos ratos Sprague-Dawley que são ambientadas no nosso biotério pelo menos uma semana antes do uso em cerca de 3-4 meses de idade, altura em que nos encontramos eles têm, geralmente, disponíveis por muito tempo, microvasos mesentérica retas. Por outro lado, os nossos colegas usaram com sucesso ratos fêmea Sprague-Dawley de 2-3 meses de idade ^13.

O papel das células vermelhas. O papel principal das células vermelhas, como descrito acima foi para rastrear transvascular movimento da água assumindo a célula agiu como inerte, neutra indicadores flutuantes de água flui após os microvasos foram fechados. Em adição a este papel fundamental,é agora reconhecido que os glóbulos vermelhos contribuir para a estabilidade da barreira através do fornecimento de S1P para o perfusato quando albumina na presente ^31,42,43. Há várias implicações importantes destas observações. Na ausência de células vermelhas ou com o uso de marcadores de fluxo alternativos inerte a permeabilidade da linha de base é provável que seja menos estável. Recomenda-se que as medições de S1P deve ser feito em todos os perfusatos utilizados em experiências de microperfusão.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health subvenções HL44485 e HL28607.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MICROSCOPE, TABLE AND STAGE
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Olympus	CK-40	try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Leica	DMIL	try to place eyepieces higher relative to stage--you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
narrow diameter, long working distance objective: example	Nikon	Nikon E Plan 10×/0.25 LWD
stage platform--1/2 inch or 1 cm sheet steel	welding shop		this should be heavy to reduce vibration
Unislide x-y table: dove tail slides	Velmex	AXY4006W1
VIDEO
CCD video camera: example	Pulnix	TM-7CN (no longer available)	no color needed
video capture system with audio--generic
video playback system (completely still frame, single frame motion)
small microphone
MICROMANIPULATORS, HOLDERS
micromanipulator, XYZ (3)	Prior/Stoelting (no longer available)		look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning
hydraulic probe drive, one way	FHC	50-12-1C	need to buy either manual drive or electronic drive
manual drum drive	FHC	50-12-9-02
or hydraulic drive, 3 way	Siskiyou Corporation	MX610 (1-way) or MX630 (3-way)	great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years
connectors/rods/holders	Siskiyou Corporation	MXC-2.5, MXB etc.
pin vise	Starrett	162C	to hold restrainer
pipette holder	World Prescision Instruments	MPH3
water manometer ~120 cm
MICROSCOPE TRAY
clear Plexiglas for microscope tray for animal
3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall	Quartz Scientific Inc.	custom	(or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective
Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)
medical adhesive for tissue well	NuSil	MED-1037
All-purpose silicone rubber heat mat, 5" L x 2" W	Cole Parmer	EW-03125-20	heater for microscope tray--needs cord and controller--240V version available
Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC	Cole Parmer	EW-03122-75
STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out	Cole Parmer	EW-01575-00
PIPET MANUFACTURE
vertical pipette puller	Sutter Instrument Company	P-30 with nichrome filament
1.5 mm OD thin wall capillary tubing	Sutter Instrument Company	B150-110-10
pipette grinder air stone and dissection microscope--see reference in text			or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments
RX Honing Machine, System II	RX Honing Machine Corporation	MAC-10700 Rx System II Machine	alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle
with ceramic sharpening disc	RX Honing Machine Corporation		use "as is" or attach lapping film
lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um	3M	part no. 051144 80827	268X Imperial lapping film sheets with adhesive back--can be purchased from Amazon

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