Summary

Microperfusion Техника по расследованию Правила микрососудов проницаемость у крыс брыжейки

Published: September 12, 2015
doi:

Summary

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Abstract

Эксперименты по измерению свойств проницаемости микрососудов индивидуально перфузированных обеспечить мост между расследования молекулярных и клеточных механизмов, регулирующих проницаемость сосудов в культивируемых эндотелиальных монослоев клеток и функциональных свойств обменных целых микрососудистых кровати. Метод, чтобы иглу и заливать венулярного микрососудов брыжейки крыс на и измерения гидравлической проводимости в микрососудов стенки описано. Основное оборудование включает в себя необходимости прижизненной микроскоп с большим модифицированной стадии, которая поддерживает микроманипуляторами позиционировать три различных микроинструментов: (1) скошенной стекла микропипетки, чтобы иглу и заливать микрососудов; (2) стекло микро-обтуратор, чтобы временно блокировать перфузии и позволяют измерять transvascular движения потока воды в измеряемой гидростатического давления, и (3) тупым стеклянной палочкой, чтобы стабилизировать ткань брыжеечной на месте катетеризации. Модифицированный Лэндис микро-окклюзия TechniqUE использует эритроцитов, взвешенных в искусственном перфузат в качестве маркеров transvascular движения жидкости, а также позволяет повторные измерения этих потоков, экспериментальные условия изменились и разницы гидростатического и коллоидного осмотического давления в микрососудах тщательно контролируется. Измерения гидравлической проводимости в первую очередь с использованием управления перфузат, то после повторного катетеризации же микрососудов с тестов perfusates позволяют парных сравнений на ответ микрососудов в этих хорошо контролируемых условиях. Попытки продлить способ микрососудов в брыжейку мышей с генетической модификации ожидаемых изменить проницаемость сосудов были строго ограничены из-за отсутствия длинных прямых и неразветвленных микрососудов в брыжейку мыши, но в последнее время наличие у крыс с аналогичными генетических модификаций, используя CRISPR технологии / Cas9 планируется открыть новые области исследования, когда методы, описанные здесь, могут быть применены. </р>

Introduction

Microperfusion в сосудистой входит установка контролируемый поток искусственного перфузату известного состава с помощью микропипетки в кровеносном сосуде обычно меньше, чем 40 мкм в диаметре. Перфузией судно остается в пределах его нормальных условиях ткани и перфузии животного крови до времени катетеризации. При использовании в сочетании с различными видео изображений или флуорометрическими методов, в месте microperfusion позволяет измерять воды и растворенных веществ протекает через стенки микрососудов в условиях, когда движущие силы для этих потоков известны и свойства проницаемости сосудистой стенки может быть непосредственно оценены. Кроме того, путем регулирования состава жидкости, окружающей микрососудов в ткани (перфузату и superfusate), регулирование проницаемости микрососудов и обмена может быть исследована путем предоставления эндотелиальные клетки, формирующие стенки микрососудов подвергаться различным еXperimental условия (агонисты, модифицированные условия перфузии, люминесцентные индикаторы для измерения внутриклеточного состава и сигнализации) для измеренных именно периоды времени (с до часов). Кроме того, ультраструктурных или цитохимические оценки ключевых клеточных структур, регулирующих молекул барьер может быть исследована в тех же микрососудов, в котором проницаемость измеряется непосредственно. Подход, таким образом, образует мост между расследования клеточных и молекулярных механизмов, чтобы изменить функцию эндотелия барьер в культивируемых эндотелиальных монослоев клеток и расследования в интактных микрососудов. Смотрите следующие обзоры для дальнейшей оценки 1-6.

Ограничение microperfusion, что он может быть использован только в микрососудистых кровати, которые являются тонкими, прозрачными и имеют достаточную структурную целостность, чтобы позволить катетеризации со стеклянной микропипетки. В то время как ранние исследования использовали лягушачьи микрососудов брыжейки в тонкой кожной и жабы мuscle 7,8, на сегодняшний день наиболее часто используется в моделях подготовка млекопитающих является крыса брыжейки 9-15. Большинство исследований были сосредоточены на острых изменений в сосудистой проницаемости исследуемой за периоды 1-4 часов, но более поздние исследования были распространены на измерения на отдельных судов 24-72 ч после первоначального перфузии 12,16. Недавно разработанная технология CRISPR, который обещает сделать более генетически модифицированные модели крыс для изучения регулирования проницаемости сосудов 17 следует включить методы, описанные в этой связи должны применяться в венулярного микрососудов брыжейки в этих важных новых моделей крыс.

Метод требует инвертированного микроскопа, оснащенного встроенным микроскопом обычай этапе достаточно большой, чтобы держать и подготовку животных и по крайней мере три микроманипуляторами используется для позиционирования микроинструментов близких к перфузии судна и согласовать перфузии микропипетку с суднаПросвет. Например, пользовательские платформы для стадии ху микроскопа (около 90 × 60 см) могут быть изготовлены из листа толщиной 1 см стального листа с антикоррозийной покрытием. Этап прикреплен к столу инженерно индексом или двух голубей хвост слайды, установленных под прямым углом и поддерживаемых на тефлоновых столбов или шаровые переводов для движения в горизонтальной плоскости. Типичный установка (рисунок 2) имеет много общего с микроскопом и микропозиционированное оборудования, используемого для диапазона прижизненных экспериментов микроциркуляции, таких как те, для измерения одного потока кровеносного сосуда и гематокрита, локальную доставку кислорода кровью перфузии микрососудов, регуляция сосудистого гладкой тонус мышц, и локальное скопление микрососудов флуоресцентных индикаторов, введенных в обращение всей. 18-26

Принципиальной особенностью метода является измерение объемного расхода (J) через об области, определенной поверхности (ы) микрососудов стенки. Для достиженияэто через модифицированной методики Landis описанного здесь простой перевернутый микроскоп является адекватной. Небольшое видео камера установлена ​​на порт изображений и видеосигнала, с добавлением временной базы, отображается на видеомониторе и записаны как в цифровом виде на компьютере или в виде цифрового или аналогового сигнала на видеомагнитофоне. После того, как микрососудов канюлировали часть из микрососудов видимой камере, может быть изменена путем перемещения этап и манипуляторы в качестве единицы, не нарушая катетеризации.

Измерение transvascular потоков может быть также в сочетании с более детальных исследований с использованием флуоресцентного микроскопа сложный с соответствующими фильтрами, таких как установок, используемых для измерения растворенного проницаемости, люминесцентного контроля соотношения цитоплазматического кальция или других клеточных механизмов, и конфокальной микроскопии 6,12,13, 27. Ключевым преимуществом всех подходов microperfusion является способность делать повторные меры, на том же судне, При контролируемом изменении движущей силы, такой как гидростатического и онкотического давлений или индуцированного изменения ответов судна в воспалительных состояний. Наиболее распространенной конструкцией является попарное сравнение измеренного гидравлической проводимости (L P) на том же сосуде с судна первой перфузии с помощью микропипетки, заполненной контрольной перфузату и красной суспензии клеток, чтобы установить состояние базовой линии проницаемости, то со второй пипетки с тестируемым агентом добавлены перфузату. Несколько cannulations возможны цикла повторного после реперфузии с контрольной пипетки.

Настоящий протокол показывает катетеризации и microperfusion из венулярного судна крысы брыжейки записывать потоки воды по всей микрососудов стенки и измерения L P стенки сосуда, полезную индекс проницаемости общего пути для воды и растворенных веществ через неповрежденный эндотелия барьер. Процедура называется модифицированной Landis TechniqUE потому, что первоначальный принцип Landis использования относительное движение эритроцитов в качестве меры transvascular обмен жидкости после перфузии блокируется сохраняется 28, но диапазон условий эксперимента (например, гидростатические и альбумина различия онкотического давления на микрососудов стенки) доступны после microperfusion намного больше, чем в крови uncannulated перфузии микрососудов 8,29.

Protocol

О себе этика: Все процедуры были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу и использованию животного Институциональная. 1. Предварительное изготовление Микропипетки, Restrainers, и блокаторы Извлеките несколько чистые боросиликатного стекла капилляров в половине исп?…

Representative Results

На рисунке 4 показаны результаты от измерения временной ход изменений в L р у крысы венул микрососудов канюлированную последовательно четыре perfusates. 33 Величина L P, рассчитанной при постоянном давлении, использовали в качестве показателя изменений микрососудо…

Discussion

Подробная информация о L расчетов стр. Несмотря на то, transvascular движение жидкости происходит в то время как судно свободно перфузии, такой обмен слишком мал, чтобы быть измерена в свободное перфузии, потому что это, как правило, меньше, чем 0,01% от стоимости перфузии сосудов. Одна?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была выполнена при поддержке Национального института здравоохранения грантов HL44485 и HL28607.

Materials

MICROSCOPE, TABLE AND STAGE
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example Olympus CK-40 try to place eyepieces higher relative to stage–you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example Leica DMIL try to place eyepieces higher relative to stage–you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
narrow diameter, long working distance objective: example Nikon Nikon E Plan 10×/0.25 LWD
stage platform–1/2 inch or 1 cm sheet steel welding shop this should be heavy to reduce vibration
Unislide x-y table: dove tail slides Velmex AXY4006W1
VIDEO
CCD video camera: example Pulnix TM-7CN (no longer available) no color needed
video capture system with audio–generic
video playback system (completely still frame, single frame motion)
small microphone
MICROMANIPULATORS, HOLDERS
micromanipulator, XYZ (3) Prior/Stoelting (no longer available) look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning
hydraulic probe drive, one way FHC 50-12-1C need to buy either manual drive or electronic drive
manual drum drive  FHC 50-12-9-02
or hydraulic drive, 3 way Siskiyou Corporation MX610 (1-way) or MX630 (3-way) great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years
connectors/rods/holders Siskiyou Corporation MXC-2.5, MXB etc.
pin vise Starrett 162C to hold restrainer
pipette holder World Prescision Instruments MPH3
water manometer ~120 cm
MICROSCOPE TRAY
clear Plexiglas for microscope tray for animal
3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall Quartz Scientific Inc. custom  (or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective
Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)
medical adhesive for tissue well NuSil MED-1037
All-purpose silicone rubber heat mat, 5" L x 2" W Cole Parmer EW-03125-20 heater for microscope tray–needs cord and controller–240V version available
Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC Cole Parmer EW-03122-75
STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out Cole Parmer EW-01575-00
PIPET MANUFACTURE
vertical pipette puller Sutter Instrument Company P-30 with nichrome filament
1.5 mm OD thin wall capillary tubing Sutter Instrument Company B150-110-10
pipette grinder air stone and dissection microscope–see reference in text or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments
RX Honing Machine, System II RX Honing Machine Corporation MAC-10700 Rx System II Machine alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle
   with ceramic sharpening disc RX Honing Machine Corporation use "as is" or attach lapping film
lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um 3M part no. 051144 80827 268X Imperial lapping film sheets with adhesive back–can be purchased from Amazon

References

  1. Curry, F. R. Permeability measurements in an individually perfused capillary: the ‘squid axon’ of the microcirculation. Experimental physiology. 93, 444-446 (2008).
  2. Curry, F. R., Adamson, R. H. Vascular permeability modulation at the cell, microvessel, or whole organ level: towards closing gaps in our knowledge. Cardiovasc Res. 87, 218-229 (2010).
  3. Curry, F. R., Adamson, R. H. Tonic regulation of vascular permeability. Acta physiologica. 207, 628-649 (2013).
  4. Michel, C. C. Fluid exchange in the microcirculation. The Journal of physiology. 557, 701-702 (2004).
  5. Tarbell, J. M., Simon, S. I., Curry, F. R. Mechanosensing at the vascular interface. Annual review of biomedical engineering. 16, 505-532 (2014).
  6. Sarelius, I. H., Kuebel, J. M., Wang, J., Huxley, V. H. Macromolecule permeability of in situ and excised rodent skeletal muscle arterioles and venules. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 290, H474-H480 (2006).
  7. Curry, F. E., Frokjaer-Jensen, J. Water flow across the walls of single muscle capillaries in the frog, Rana pipiens. The Journal of physiology. 350, 293-307 (1984).
  8. Michel, C. C., Mason, J. C., Curry, F. E., Tooke, J. E., Hunter, P. J. A development of the Landis technique for measuring the filtration coefficient of individual capillaries in the frog mesentery. Q J Exp Physiol Cogn Med Sci. 59, 283-309 (1974).
  9. Adamson, R. H., Zeng, M., Adamson, G. N., Lenz, J. F., Curry, F. E. PAF- and bradykinin-induced hyperpermeability of rat venules is independent of actin-myosin contraction. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 285, H406-H417 (2003).
  10. Huxley, V. H., Rumbaut, R. E. The microvasculature as a dynamic regulator of volume and solute exchange. Clinical and experimental pharmacology, & physiology. 27, 847-854 (2000).
  11. Rumbaut, R. E., Wang, J., Huxley, V. H. Differential effects of L-NAME on rat venular hydraulic conductivity. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. , 279-H2023 (2000).
  12. Yuan, D., He, P. Vascular remodeling alters adhesion protein and cytoskeleton reactions to inflammatory stimuli resulting in enhanced permeability increases in rat venules. Journal of applied physiology. 113, 1110-1120 (2012).
  13. Zhou, X., He, P. Temporal and spatial correlation of platelet-activating factor-induced increases in endothelial [Ca(2)(+)]i, nitric oxide, and gap formation in intact venules. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 301, H1788-H1797 (2011).
  14. Adamson, R. H., et al. Oncotic pressures opposing filtration across non-fenestrated rat microvessels. The Journal of physiology. 557, 889-907 (2004).
  15. Adamson, R. H., et al. Epac/Rap1 pathway regulates microvascular hyperpermeability induced by PAF in rat mesentery. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 294, H1188-H1196 (2008).
  16. Curry, F. E., Zeng, M., Adamson, R. H. Thrombin increases permeability only in venules exposed to inflammatory conditions. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 294, H1188-H1196 (2003).
  17. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nature. 32, 347-355 (2014).
  18. Bagher, P., Davis, M. J., Segal, S. S. Intravital macrozoom imaging and automated analysis of endothelial cell calcium signals coincident with arteriolar dilation in Cx40(BAC) -GCaMP2 transgenic mice. Microcirculation. 18, 331-338 (2011).
  19. Duza, T., Sarelius, I. H. Increase in endothelial cell Ca(2+) in response to mouse cremaster muscle contraction. The Journal of physiology. 555, 459-469 (2004).
  20. Oshiro, H., et al. L-type calcium channel blockers modulate the microvascular hyperpermeability induced by platelet-activating factor in vivo. Journal of vascular surgery. 22, 732-739 (1995).
  21. Chen, W., et al. Atrial natriuretic peptide-mediated inhibition of microcirculatory endothelial Ca2+ and permeability response to histamine involves cGMP-dependent protein kinase I and TRPC6 channels. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 33, 2121-2129 (2013).
  22. Harris, N. R., Whitt, S. P., Zilberberg, J., Alexander, J. S., Rumbaut, R. E. Extravascular transport of fluorescently labeled albumins in the rat mesentery. Microcirculation. 9, 177-187 (2002).
  23. Yuan, W., Li, G., Zeng, M., Fu, B. M. Modulation of the blood-brain barrier permeability by plasma glycoprotein orosomucoid. Microvascular research. 80, 148-157 (2010).
  24. Sugiura, Y., Morikawa, T., Takenouchi, T., Suematsu, M., Kajimura, M. Cilostazol strengthens the endothelial barrier of postcapillary venules from the rat mesentery in situ. Phlebology / Venous Forum of the Royal Society of Medicine. 29, 594-599 (2014).
  25. Guo, M., et al. Fibrinogen-gamma C-terminal fragments induce endothelial barrier dysfunction and microvascular leak via integrin-mediated and RhoA-dependent mechanism. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 29, 394-400 (2009).
  26. Dewar, A. M., Clark, R. A., Singer, A. J., Frame, M. D. Curcumin mediates both dilation and constriction of peripheral arterioles via adrenergic receptors. The Journal of investigative dermatology. 131, 1754-1760 (2011).
  27. Lee, J. F., et al. Balance of S1P1 and S1P2 signaling regulates peripheral microvascular permeability in rat cremaster muscle vasculature. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 296, H33-H42 (2009).
  28. Landis, E. M. Microinjection studies of capillary permeability. II. The relation between capillary pressure and the rate at which fluid passes through the walls of single capillaries. Am J Physiol. 82, 217-238 (1927).
  29. Curry, F. E., Huxley, V. H., Sarelius, I. H., Linden, R. J. . Techniques in cardiovascular physiology Part 1. P3/1, 1-34 (1983).
  30. Vurek, G. G., Bennett, C. M., Jamison, R. L., Troy, J. L. An air-driven micropipette sharpener). J Appl Physiol. 22, 191-192 (1967).
  31. Curry, F. E., Clark, J. F., Adamson, R. H. Erythrocyte-derived sphingosine-1-phosphate stabilizes basal hydraulic conductivity and solute permeability in rat microvessels. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 303, H825-H834 (2012).
  32. Bagher, P., Polo-Parada, L., Segal, S. S. Microiontophoresis and micromanipulation for intravital fluorescence imaging of the microcirculation. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
  33. Adamson, R. H., et al. Attenuation by sphingosine-1-phosphate of rat microvessel acute permeability response to bradykinin is rapidly reversible. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 302, H1929-H1935 (2012).
  34. Bates, D. O. Vascular endothelial growth factors and vascular permeability. Cardiovasc Res. 87, 262-271 (2010).
  35. Adamson, R. H., et al. Rho and rho kinase modulation of barrier properties: cultured endothelial cells and intact microvessels of rats and mice. The Journal of physiology. 539, 295-308 (2002).
  36. Curry, F. R., et al. Atrial natriuretic peptide modulation of albumin clearance and contrast agent permeability in mouse skeletal muscle and skin: role in regulation of plasma volume. The Journal of physiology. 588, 325-339 (2010).
  37. Neal, C. R., Bates, D. O. Measurement of hydraulic conductivity of single perfused Rana mesenteric microvessels between periods of controlled shear stress. The Journal of physiology. 543, 947-957 (2002).
  38. Adamson, R. H., et al. Albumin modulates S1P delivery from red blood cells in perfused microvessels: mechanism of the protein effect. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 306, H1011-H1017 (2014).
  39. Huxley, V. H., Wang, J. J., Sarelius, I. H. Adaptation of coronary microvascular exchange in arterioles and venules to exercise training and a role for sex in determining permeability responses. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. 293, H1196-H1205 (2007).
  40. Huxley, V. H., Williams, D. A. Basal and adenosine-mediated protein flux from isolated coronary arterioles. Am J Physiol. 271, H1099-H1108 (1996).
  41. Davis, M. J., Gore, R. W. Double-barrel pipette system for microinjection. Am J Physiol. 253, H965-H967 (1987).
  42. Adamson, R. H., et al. Sphingosine-1-phosphate modulation of basal permeability and acute inflammatory responses in rat venular microvessels. Cardiovasc Res. 88, 344-351 (2010).
  43. Zeng, Y., Adamson, R. H., Curry, F. R., Tarbell, J. M. Sphingosine-1-phosphate protects endothelial glycocalyx by inhibiting syndecan-1 shedding. American journal of physiology, Heart and circulatory physiology. , H306-H363 (2014).

Play Video

Cite This Article
Curry, F. E., Clark, J. F., Adamson, R. H. Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery. J. Vis. Exp. (103), e53210, doi:10.3791/53210 (2015).

View Video