Microperfusion Техника по расследованию Правила микрососудов проницаемость у крыс брыжейки

Summary

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Abstract

Эксперименты по измерению свойств проницаемости микрососудов индивидуально перфузированных обеспечить мост между расследования молекулярных и клеточных механизмов, регулирующих проницаемость сосудов в культивируемых эндотелиальных монослоев клеток и функциональных свойств обменных целых микрососудистых кровати. Метод, чтобы иглу и заливать венулярного микрососудов брыжейки крыс на и измерения гидравлической проводимости в микрососудов стенки описано. Основное оборудование включает в себя необходимости прижизненной микроскоп с большим модифицированной стадии, которая поддерживает микроманипуляторами позиционировать три различных микроинструментов: (1) скошенной стекла микропипетки, чтобы иглу и заливать микрососудов; (2) стекло микро-обтуратор, чтобы временно блокировать перфузии и позволяют измерять transvascular движения потока воды в измеряемой гидростатического давления, и (3) тупым стеклянной палочкой, чтобы стабилизировать ткань брыжеечной на месте катетеризации. Модифицированный Лэндис микро-окклюзия TechniqUE использует эритроцитов, взвешенных в искусственном перфузат в качестве маркеров transvascular движения жидкости, а также позволяет повторные измерения этих потоков, экспериментальные условия изменились и разницы гидростатического и коллоидного осмотического давления в микрососудах тщательно контролируется. Измерения гидравлической проводимости в первую очередь с использованием управления перфузат, то после повторного катетеризации же микрососудов с тестов perfusates позволяют парных сравнений на ответ микрососудов в этих хорошо контролируемых условиях. Попытки продлить способ микрососудов в брыжейку мышей с генетической модификации ожидаемых изменить проницаемость сосудов были строго ограничены из-за отсутствия длинных прямых и неразветвленных микрососудов в брыжейку мыши, но в последнее время наличие у крыс с аналогичными генетических модификаций, используя CRISPR технологии / Cas9 планируется открыть новые области исследования, когда методы, описанные здесь, могут быть применены. </р>

Introduction

Microperfusion в сосудистой входит установка контролируемый поток искусственного перфузату известного состава с помощью микропипетки в кровеносном сосуде обычно меньше, чем 40 мкм в диаметре. Перфузией судно остается в пределах его нормальных условиях ткани и перфузии животного крови до времени катетеризации. При использовании в сочетании с различными видео изображений или флуорометрическими методов, в месте microperfusion позволяет измерять воды и растворенных веществ протекает через стенки микрососудов в условиях, когда движущие силы для этих потоков известны и свойства проницаемости сосудистой стенки может быть непосредственно оценены. Кроме того, путем регулирования состава жидкости, окружающей микрососудов в ткани (перфузату и superfusate), регулирование проницаемости микрососудов и обмена может быть исследована путем предоставления эндотелиальные клетки, формирующие стенки микрососудов подвергаться различным еXperimental условия (агонисты, модифицированные условия перфузии, люминесцентные индикаторы для измерения внутриклеточного состава и сигнализации) для измеренных именно периоды времени (с до часов). Кроме того, ультраструктурных или цитохимические оценки ключевых клеточных структур, регулирующих молекул барьер может быть исследована в тех же микрососудов, в котором проницаемость измеряется непосредственно. Подход, таким образом, образует мост между расследования клеточных и молекулярных механизмов, чтобы изменить функцию эндотелия барьер в культивируемых эндотелиальных монослоев клеток и расследования в интактных микрососудов. Смотрите следующие обзоры для дальнейшей оценки ^1-6.

Ограничение microperfusion, что он может быть использован только в микрососудистых кровати, которые являются тонкими, прозрачными и имеют достаточную структурную целостность, чтобы позволить катетеризации со стеклянной микропипетки. В то время как ранние исследования использовали лягушачьи микрососудов брыжейки в тонкой кожной и жабы мuscle ^7,8, на сегодняшний день наиболее часто используется в моделях подготовка млекопитающих является крыса брыжейки ^9-15. Большинство исследований были сосредоточены на острых изменений в сосудистой проницаемости исследуемой за периоды 1-4 часов, но более поздние исследования были распространены на измерения на отдельных судов 24-72 ч после первоначального перфузии ^12,16. Недавно разработанная технология CRISPR, который обещает сделать более генетически модифицированные модели крыс для изучения регулирования проницаемости сосудов ¹⁷ следует включить методы, описанные в этой связи должны применяться в венулярного микрососудов брыжейки в этих важных новых моделей крыс.

Метод требует инвертированного микроскопа, оснащенного встроенным микроскопом обычай этапе достаточно большой, чтобы держать и подготовку животных и по крайней мере три микроманипуляторами используется для позиционирования микроинструментов близких к перфузии судна и согласовать перфузии микропипетку с суднаПросвет. Например, пользовательские платформы для стадии ху микроскопа (около 90 × 60 см) могут быть изготовлены из листа толщиной 1 см стального листа с антикоррозийной покрытием. Этап прикреплен к столу инженерно индексом или двух голубей хвост слайды, установленных под прямым углом и поддерживаемых на тефлоновых столбов или шаровые переводов для движения в горизонтальной плоскости. Типичный установка (рисунок 2) имеет много общего с микроскопом и микропозиционированное оборудования, используемого для диапазона прижизненных экспериментов микроциркуляции, таких как те, для измерения одного потока кровеносного сосуда и гематокрита, локальную доставку кислорода кровью перфузии микрососудов, регуляция сосудистого гладкой тонус мышц, и локальное скопление микрососудов флуоресцентных индикаторов, введенных в обращение всей. ^18-26

Принципиальной особенностью метода является измерение объемного расхода (J) через _об области, определенной поверхности (ы) микрососудов стенки. Для достиженияэто через модифицированной методики Landis описанного здесь простой перевернутый микроскоп является адекватной. Небольшое видео камера установлена ​​на порт изображений и видеосигнала, с добавлением временной базы, отображается на видеомониторе и записаны как в цифровом виде на компьютере или в виде цифрового или аналогового сигнала на видеомагнитофоне. После того, как микрососудов канюлировали часть из микрососудов видимой камере, может быть изменена путем перемещения этап и манипуляторы в качестве единицы, не нарушая катетеризации.

Измерение transvascular потоков может быть также в сочетании с более детальных исследований с использованием флуоресцентного микроскопа сложный с соответствующими фильтрами, таких как установок, используемых для измерения растворенного проницаемости, люминесцентного контроля соотношения цитоплазматического кальция или других клеточных механизмов, и конфокальной микроскопии ^{6,12,13, 27.} Ключевым преимуществом всех подходов microperfusion является способность делать повторные меры, на том же судне, При контролируемом изменении движущей силы, такой как гидростатического и онкотического давлений или индуцированного изменения ответов судна в воспалительных состояний. Наиболее распространенной конструкцией является попарное сравнение измеренного гидравлической проводимости _(L P) на том же сосуде с судна первой перфузии с помощью микропипетки, заполненной контрольной перфузату и красной суспензии клеток, чтобы установить состояние базовой линии проницаемости, то со второй пипетки с тестируемым агентом добавлены перфузату. Несколько cannulations возможны цикла повторного после реперфузии с контрольной пипетки.

Настоящий протокол показывает катетеризации и microperfusion из венулярного судна крысы брыжейки записывать потоки воды по всей микрососудов стенки и измерения _L P стенки сосуда, полезную индекс проницаемости общего пути для воды и растворенных веществ через неповрежденный эндотелия барьер. Процедура называется модифицированной Landis TechniqUE потому, что первоначальный принцип Landis использования относительное движение эритроцитов в качестве меры transvascular обмен жидкости после перфузии блокируется сохраняется ^28, но диапазон условий эксперимента (например, гидростатические и альбумина различия онкотического давления на микрососудов стенки) доступны после microperfusion намного больше, чем в крови uncannulated перфузии микрососудов ^8,29.

Protocol

О себе этика: Все процедуры были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу и использованию животного Институциональная. 1. Предварительное изготовление Микропипетки, Restrainers, и блокаторы Извлеките несколько чистые боросиликатного стекла капилляров в половине исп?…

Representative Results

На рисунке 4 показаны результаты от измерения временной ход изменений в L р у крысы венул микрососудов канюлированную последовательно четыре perfusates. 33 Величина L P, рассчитанной при постоянном давлении, использовали в качестве показателя изменений микрососудо…

Discussion

Подробная информация о L расчетов _стр. Несмотря на то, transvascular движение жидкости происходит в то время как судно свободно перфузии, такой обмен слишком мал, чтобы быть измерена в свободное перфузии, потому что это, как правило, меньше, чем 0,01% от стоимости перфузии сосудов. Одна?…

Materials

MICROSCOPE, TABLE AND STAGE
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Olympus	CK-40	try to place eyepieces higher relative to stage–you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
inverted microscope (metallurgical type) with trinocular head for video: example	Leica	DMIL	try to place eyepieces higher relative to stage–you have to look through eyepieces while reaching around to top of stage over intervening micromanipulators
narrow diameter, long working distance objective: example	Nikon	Nikon E Plan 10×/0.25 LWD
stage platform–1/2 inch or 1 cm sheet steel	welding shop		this should be heavy to reduce vibration
Unislide x-y table: dove tail slides	Velmex	AXY4006W1
VIDEO
CCD video camera: example	Pulnix	TM-7CN (no longer available)	no color needed
video capture system with audio–generic
video playback system (completely still frame, single frame motion)
small microphone
MICROMANIPULATORS, HOLDERS
micromanipulator, XYZ (3)	Prior/Stoelting (no longer available)		look for fine Z, and larger range of travel in coarse drives for ease of positioning
hydraulic probe drive, one way	FHC	50-12-1C	need to buy either manual drive or electronic drive
manual drum drive	FHC	50-12-9-02
or hydraulic drive, 3 way	Siskiyou Corporation	MX610 (1-way) or MX630 (3-way)	great for short arms, water filled and must be sent back for refill ~every 2 years
connectors/rods/holders	Siskiyou Corporation	MXC-2.5, MXB etc.
pin vise	Starrett	162C	to hold restrainer
pipette holder	World Prescision Instruments	MPH3
water manometer ~120 cm
MICROSCOPE TRAY
clear Plexiglas for microscope tray for animal
3/4 inch polished quartz disc ~1/4 inch tall	Quartz Scientific Inc.	custom	(or polished plexiglass, glass); make sure the height is less than working distance of objective
Plexiglas glue (Weld-on 4: CAUTION CARCINOGEN)
medical adhesive for tissue well	NuSil	MED-1037
All-purpose silicone rubber heat mat, 5" L x 2" W	Cole Parmer	EW-03125-20	heater for microscope tray–needs cord and controller–240V version available
Power Cord Adapter for Kapton Heaters and Kits, 6 ft, 120 VAC	Cole Parmer	EW-03122-75
STACO 3PN1010B Variable-Voltage Controller, 10 A; 120 V In, 0-140 V Out	Cole Parmer	EW-01575-00
PIPET MANUFACTURE
vertical pipette puller	Sutter Instrument Company	P-30 with nichrome filament
1.5 mm OD thin wall capillary tubing	Sutter Instrument Company	B150-110-10
pipette grinder air stone and dissection microscope–see reference in text			or purchase a package from Sutter Instruments or World Precision Instruments
RX Honing Machine, System II	RX Honing Machine Corporation	MAC-10700 Rx System II Machine	alternative for air stone, use with a dissecting microscope mounted at an angle
with ceramic sharpening disc	RX Honing Machine Corporation		use "as is" or attach lapping film
lapping film sheets, 0.3 or 0.5 um	3M	part no. 051144 80827	268X Imperial lapping film sheets with adhesive back–can be purchased from Amazon