Summary

Quantifizierung von Kolon Stem Cell Mutationen

Published: September 25, 2015
doi:

Summary

We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.

Abstract

Die Fähigkeit zur Stammzellmutationen zu messen, ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um in einer kritischen Zellpopulation zu quantifizieren, ob und in welchem ​​Umfang kann eine chemische Mutationen, die möglicherweise zu Krebs führen zu induzieren. Die Verwendung eines enzymatischen Assays zur Stammzellmutationen in der X-verknüpften Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase-Gens zu quantifizieren wurde bereits berichtet. 1 Dieses Verfahren erfordert die Herstellung von Gefrierschnitten und Inkubation des geschnittenen Gewebes mit einem Reaktionsgemisch, das ein ergibt blaue Farbe, wenn die Zellen produzieren funktionelle Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PD) Enzym. Wenn nicht, werden die Zellen erscheinen weißlich. Haben wir die Reaktionsmischung unter Verwendung optimaler Schneidtemperatur Verbindung (OCT) Medium anstelle von Polyvinylalkohol modifiziert. Dies erleichtert die pH-Messung erhöht Solubilisierung der G6PD Färbungskomponenten und schränkt die Diffusion der G6PD-Enzym. Um zu demonstrieren, dass eine Mutation aufgetreten ist in einer Stammzelle muss der gesamte Krypta G6PD enzymatische fehltAktivität. Nur wenn eine Stammzelle birgt eine phänotypische G6PD Mutation wird die gesamte Nachkommenschaft in der Krypta fehlt G6PD enzymatische Aktivität. Um Krypten mit einer Stammzelle Mutation zu identifizieren, wurden vier aufeinander folgenden benachbarten Gefrierschnitten (Stufe A) bei 7 & mgr; m Dicke geschnitten. Dieser Ansatz zur Herstellung von benachbarten Schnitten bietet Konformation, die eine Krypta wurde vollständig mutiert, da dieselbe mutierte Krypta in benachbarten Abschnitten beachten. Objektträger mit Gewebeproben, die mehr als 50 & mgr; m getrennt waren bereit waren, insgesamt> 10 4 Krypten pro Maus zu bewerten. Die Mutationsfrequenz ist die Anzahl der beobachteten mutiert (weiß) Krypten durch die Anzahl der Wildtyp (blau) Krypten in einer Behandlungsgruppe ÷.

Introduction

Darmkrebs ist gedacht, um die Exposition gegenüber Umweltfaktoren und Nahrungskomponenten, die DNA schädigen kann es sich um und produzieren Aktivieren somatische Mutationen in Onkogenen (zB ß-Catenin) oder inaktivierende Mutationen im Tumorsuppressor-Gene (zB APC). Es wird angenommen, dass diese kritische Mutationen in colonic Stammzellen vorkommen. Aufgrund der einzigartigen Architektur der Krypta Kolonepithel, ist es möglich, Stammzellmutationen im Dickdarm nach dem Belichten Tiere Chemikalien Coloncarzinogenese zu bemessen. Mehrere X-chromosomal-Enzyme können als Indikatoren für die Mutationen, die in Stammzellen auftreten dienen, wie die Mutationen wird in allen Zellen in einer Krypta vorhanden sein.

Bisher wurde ein Verfahren veröffentlicht demonstriert, dass Chemikalien, die Dickdarmtumoren in Mäusen zu induzieren ebenfalls erzeugt somatischer Stammzellen Mutationen in den Dickdarm über die Analyse von Mutationen in der X-verknüpften Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PD) Gens. 1-3Das Verfahren quantifiziert die Häufigkeit von Zufalls somatische Mutationen in Kolon-Stammzellen ohne Selektionsdruck. Das Verfahren beinhaltet die Herstellung von nicht fixierten gefrorenen Doppelpunkt Schnitte von behandelten und Kontrollmäusen und die Identifikation der Krypten frei von Zellen, die funktionelle G6PD-Aktivität zu erzeugen. Diese mutierten Krypten, die weiß erscheinen, zeigen an, dass die Mutation trat bei einer Stammzelle, die zu Nachkommen gab auch beherbergt eine mutierte G6PD-Gen. Im Enzymassay kann G6PD defiziente Mutante Krypten nicht oxidiert Glucose-6-phosphat, die zur Reduktion von Nitro-Blau-Tetrazolium (NBT) erforderlich ist. Wenn G6PD Enzym ist funktionell, wird die NBT in der Färbemischung zu unlöslichem Formazan reduziert und ausfällt, Speichern am Ort des Enzyms und "Schleierbildung" Zellen blau. Zellen, die G6PD Mutanten bleiben weißlichen, im Gegensatz zu blau gefärbte Wildtyp Krypten. Bei dieser Methode wird Mutationen, die eine "null" Phänotyp haben. Weil enEnzyme wie G6PD kann aus den Zellen an einer unfixierten Gewebeschnitt, wenn die Abschnitte in einer wässrigen Lösung platziert diffundieren, ist es erforderlich, das Enzym in den Gewebeabschnitten zu analysierende stabilisieren. 4 die Stabilisierung des Enzyms in der Gewebe darf nicht mit Diffusion kleiner Moleküle Reagenz für G6PD enzymatische Reaktion notwendig stören.

Wir haben eine Reihe von signifikanten Änderungen des ursprünglichen Verfahrens hergestellt. Das Medium für die kritische enzymatische Färbung wurde von Polyvinylalkohol zu optimaler Schneidtemperatur Verbindung (OCT), die pH-Steuerung und Solubilisierung der im Assay verwendeten Komponenten ermöglicht geändert. Die Färbung wird durchgeführt unter Verwendung von 0,4 – 0,5 ml Vertiefungen der Stahlscheiben hergestellt, so dass jede Gewebeabschnitt empfangen das gleiche Volumen an G6PD Reaktionsgemisches. Es wurde ein Verfahren entwickelt, um die Anzahl der Krypten in einem abgebildeten Abschnitt, der einen großen Abtastung des Colongewebe bietet, ohne schätzenmanuell zählen,> 10 5 Krypten pro Doppelpunkt. Die Analyse von angrenzenden 7 um Gewebeschnitte ergibt Visualisierung einer Mutante Krypta auf mehr als eine Folie, die so Flecken Artefakte reduziert. Diese Veränderungen stellen das Verfahren effizienter und reproduzierbar.

Nach dem geänderten Protokoll haben wir die Mutationsfrequenz in colonic Stammzellen nach der Belichtung von C57BL / 6-Mäusen zu Azoxymethan, einem bekannten Karzinogen colon in Nagetieren quantifiziert. 5-7

Protocol

Die experimentellen Verfahren und ethische Behandlung von Tieren wurde von der University of Pittsburgh IACUC (Protokoll # 1104674) zugelassen. 1. Herstellung von G6PD Färbemischung HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Endkonzentration der einzelnen Reagenzien ist wie folgt; 5 mM Glucose-6-Phosphat (G6P); 2 mM NADP, 5 mM MgCl 2, 0,35 mM 1-methoxy-5-Methylphenazinium-Methylsulfat (MMPMS) und 0,8 mM NBT. 1,8,9 für jedes Reagenz die anfängliche Konzentration wurd…

Representative Results

Die Fähigkeit, Kolon-Stammzellmutationen in Tieren zu messen, bietet eine einzigartige Möglichkeit, um Mutationen zu Krebs Induktion korreliert. Normalerweise wird angenommen, dass der kritische Schritt bei der Karzinogenese beinhaltet aktivierende Mutationen in Onkogenen und / oder inaktivierende Mutationen in Tumorsuppressorgenen. Injizierten wir C57BL / 6-Mäuse mit 200 ul PBS oder 10 mg / kg AOM in 200 ul PBS. AOM ist ein bekanntes Karzinogen Doppelpunkt. 5-7 nach 90 Tagen wurden die Doppelpunkte für d…

Discussion

Oft die genotoxische Wirkung einer Verbindung wird durch ihre Fähigkeit, zu modifizieren DNA bestimmt. Dies wird normalerweise durch Isolieren der Gewebe und Messen der globalen Ebene der DNA-Addukte erfolgt. AOM wäre dies die Quantifizierung O 6 -Methylguanin-Addukte in den Dickdarm. Unter Verwendung dieses Ansatzes Informationen zu Schäden innerhalb bestimmter Zelltypen, wie in der Stammzellnische wird verloren. Darüber hinaus ist ein DNA-Addukt nicht das gleiche wie eine Mutation, da nur ein kleiner Te…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren haben keine Bestätigungen.

Materials

reagents
nitroblue tetrazolium
NADP
glucose-6-phosphate
1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate
dimethyl formamide
phosphate buffer (pH 7.4
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT) 
Equipment
light microscope equipped with 5 megapixel camera
cryostat
warm room 

References

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Cite This Article
Whetstone, R. D., Gold, B. Quantification of Colonic Stem Cell Mutations. J. Vis. Exp. (103), e53240, doi:10.3791/53240 (2015).

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