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Bioengineering

Mécano-profilage facile et précis sur Micropost Arrays

doi: 10.3791/53350 Published: November 17, 2015

Introduction

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Tests cellulaires mécano-sensibles permettent d'enquêter sur les cellules adhérentes, avec une large gamme d'applications qui reflètent le rôle central que peuvent jouer la mécanique en biologie cellulaire. Ces applications se concentrent souvent sur les mécanismes sous-jacents qui animent les processus intracellulaires ou le comportement de cellules entières. D'une part, les facteurs externes environnementaux tels que la composition de la matrice extra-cellulaire ou la rigidité de la matrice peuvent considérablement influer sur la réponse mécanique et biologique d'une cellule. 1 La même chose peut être observée après utilisation de plusieurs classes de composés pharmaceutiques actifs, dont les effets sont caractérisé souvent en utilisant des modèles de culture de cellules. 2 Dans les autres propriétés génotypiques à main, tels que ceux causés par des mutations génétiques spontanées ou induites expérimentalement, peut induire des changements marqués dans le phénotype des cellules qui sont associées à des altérations de la structure et la fonction du cytosquelette. 3 Ces exemples sont quelques-uns des nombreux possiblesujets pour lesquels phénotypage mécanique des cellules est pertinente, et tous ceux-ci ont été utilement étudiée avec des tableaux de Micropost.

Au moment d'écrire ces lignes, environ 200 articles ont été publiés décrivant l'interaction cellule-micropost. Ces œuvres de discuter des aspects théoriques de Micropost principes de déviation ainsi que des instructions pratiques sur leur fabrication. Le premier article décrivant l'interaction des cellules et des tableaux de Micropost flexibles a été publié par Tan et ses collègues en 2003. 4 Contrairement à la microscopie à force de traction classique (TFM) où substrats souples continues sont utilisées pour estimer la contractilité cellulaire nanonewton échelle, Tan et al. décrit une méthode utilisant des faisceaux multiples verticales rapprochées en élastomère silicone. Les principaux avantages de cette technique se dégagent de deux caractéristiques principales. D'abord afin de modifier la rigidité du substrat cellulaire apparente il suffit de modifier les dimensions de Micropost tout en gardantla composition du substrat par ailleurs constante et en évitant ainsi les différences de topologie de surface et la chimie. Deuxième microposts agissent comme des ressorts individuels qui peuvent être analysés discrètement avec force et résolution spatiale de l'ordre des adhésions focales individuels et peut réduire les défis analytiques qui sont inhérents à l'analyse analogue par la norme TFM.

Aujourd'hui, la gamme d'applications pour les réseaux de Micropost dépasse grandement simplement la cartographie des forces pendant quelques cellules individuelles. Par exemple, Akiyama rapporte l'utilisation d'un tissu de vaisseau dorsal isolé à partir d'une chenille de papillon comme un actionneur destiné à un réseau de micro-message, afin de développer un robot autonome micro-propulsion musculaire insecte. 5

Cependant, la plupart des applications publiées de microposts ont mis l'accent sur les études de conditions médicales telles que l'infection ou un cancer. Par exemple, les tableaux de Micropost ont été utilisés pour étudier la production d'groupé pili de type IV de Neisseria gonorrh de forceoea colonies qui est associé à l'amélioration de cascades de signaux infection. 6 D'autres ont utilisé microposts pour étudier les cellules de cancer du sein traitées avec des composés pharmaceutiques ciblant le cytosquelette. 7

Déviation d'un micro-message est souvent décrit en utilisant la théorie de faisceau classique pour une console avec une charge d'extrémité en supposant que la cellule attache seulement à la pointe de la micropost. Ici, la force F appliquée qui provoque une déviation δ dépend de "rigidité de flexion" S k et le micro-message est calculée par:

Equation 1 (1)

avec E, I et L étant le module de Young, le moment d'inertie de la zone et de la poutre longueur respectivement. Cependant, les résultats de cette équation ne donnent qu'une approximation générale des forces à l'œuvre depuis le cisaillement de la poutre et de flexion ainsi que la déformation du substrat ne sont pas prises en courant alternatifcompter. Considérant que microposts sont généralement fabriqués à partir de matériaux souples comme le polydiméthylsiloxane (PDMS) à base de caoutchouc de silicone de ces facteurs doivent être inclus. . Schoen et al a montré qu'il existe un tel facteur de correction en se basant sur ​​le rapport d'aspect du micro-message (L / D) et du polymère correspondant coefficient de Poisson v 8 Il est donné par.:

Equation 2 (2)

Avec T Tilt (v) étant un coefficient de basculement qui comprend un raccord paramètre = 1.3 que l'on peut trouver dans le même article:

Équation 3 (3)

Cela signifie que la rigidité d'un micropost corrigée k corr est le produit de la rigidité à la flexion pur k = k virage et le facteur de correction corrdonné par:

Equation 4 (4)

Par conséquent, les calculs de la force de cellules devraient être effectuées en utilisant la variation plus raffinée de l'équation (1) en train de lire:

Equation 5 (5)

L'impact de la correction devient plus évident dès que les valeurs typiques pour les dimensions de Micropost sont utilisés. Par exemple, une longue micro-message 15 microns avec une section transversale circulaire et un diamètre de 5 um en caoutchouc de silicone à base de PDMS conduit à un facteur de correction de 0,77 et donc un calcul non corrigé serait surestimer les forces de cellules exercée par 23%. Cela devient encore plus sévère pour les micro-messages avec des rapports d'aspect plus petits.

Traditionnellement, micropost analyse d'image a également été basée sur la théorie de flexion du faisceau idéalisée. En 2005, le groupe qui a lancé l'utilisation de MICRtableaux de opost publié un logiciel d'analyse d'image adaptée à l'analyse de micropost 9 Le logiciel requiert une licence de logiciel et l'utilisateur doit prendre trois images pour chaque position. une chacune de plans supérieur et inférieur de la micro-message en mode de transmission et une autre en mode de fluorescence avec la cellule colorée. Après avoir comparé les positions supérieure et inférieure pour chaque Micropost le logiciel détermine un champ force de vecteur et calcule les paramètres connexes comme force par poste. Les autres logiciels existent et leurs principes de l'analyse sont brièvement mentionnés dans les articles correspondants qui les décrivent, mais ces progiciels d'analyse sont généralement pas accessibles au public. 10,11

Les tableaux de Micropost conçus pour les forces de cellules de cartographie peuvent être classés comme étant dans une mise en micropost orthogonale ou un être hexagonale, dont le dernier qui ont l'avantage de lacunes équidistants entre tous microposts voisins. Microposts typiques have une section transversale circulaire et vont de 1,0 um à 10 um de diamètre et de 2 à 50 mm de longueur. 4 leurs dimensions Cependant, microposts avec section elliptique ou carrée ont également été signalés. 12,13

L'utilisation de mélanges de silicones à base de PDMS comme matière de micro-message pour l'ajout de nanoparticules permet dans le mélange. Par exemple en ajoutant cobalt nano-barres permet une activation magnétique de la micropost et donne ainsi un autre degré de liberté de modèles expérimentaux potentiels. 14 La plupart des groupes produisent leurs réseaux de Micropost sur ​​des substrats rigides plats comme le verre de couverture ou à l'intérieur d'une boîte de Petri. Cependant, Mann et ses collègues ont récemment rapporté une matrice de micro-message formé sur une membrane extensible. 15 Cela permet à l'application de l'étirement cellulaires forces de cellules adhérentes tout en étudiant cellules vivantes subcellulaire réponses dynamiques en termes de la contractilité cellulaire.

L'éta et le plus largement utiliséblies processus pour la fabrication de tableaux de Micropost est basé sur la lithographie douce comme décrit dans les protocoles perspicaces de Sniadecki et collègues. 16-18 Dans courtes processus de salle blanche standard sont utilisés pour générer les microstructures sur le dessus d'une plaquette de silicium en utilisant résine photosensible SU8. Ceci est suivi par un processus de copie, dans lequel le caoutchouc silicone est moulée sur les structures les transférer dans les moules. Dans une deuxième étape ces moules sont utilisés pour reproduire la microstructure initiale en utilisant un caoutchouc de silicone sur le dessus d'un substrat choisi. Cependant, malgré le nombre important et croissant de publications liées à leur application, en établissant un processus de fabrication pour microposts prend beaucoup de temps, même pour des experts micro-ingénierie; il existe de nombreuses étapes de traitement qui nécessitent une optimisation et l'adaptation à l'environnement de laboratoire micro-message spécifique et la mise en page pour obtenir un niveau de qualité acceptable.

Tableaux de Micropost commerciales sont maintenant disponibles dans un prête-to-utilisation ("off-the-shelf») format avec un qualité constante. Comme tels, ils sont une alternative à la longue et complexe processus de fabrication nécessaires à la production sur place. Dans cet article, un tableau de micropost disponible dans le commerce a été utilisé pour cartographier les forces cellulaires en utilisant une seule image à champ lumineux microscopie. Plus important encore cet article décrit et documente un logiciel open-source entièrement fonctionnelle nommé MechProfiler, qui est disponible en téléchargement en tant que matière supplémentaire à ce manuscrit. Une version maintenue activement du logiciel peut également être trouvé à http://www.orthobiomech.ethz.ch.

La combinaison d'un essai "off-the-shelf» et un logiciel d'analyse compatible open-source abaisse nettement l'entrée obstacle pour atteindre expériences précises TFM. Chercheurs sans accès ni salles blanches ou des logiciels expertise en développement peuvent analyser les forces cellulaires succès. Il permet à un utilisateur de se concentrer sur les mechanossortie de dosage de ensitivity plutôt que la technologie elle-même, et qui rend la mesure de la force de traction disponible à une communauté plus large. En outre, cela est une étape importante pour ouvrir la voie vers le dépistage entièrement automatique de tableaux de Micropost.

Le logiciel d'analyse MechProfiler traite les images en format de fichier tiff, png, bmp et jpg. Les images peuvent être prises en utilisant la fluorescence, contraste de phase ou de la microscopie optique à champ lumineux. Le programme autonome fonctionne conjointement avec la libre MATLAB Compiler Runtime (disponible à l'adresse: Figure 12) et algorithmes sous-jacents de permettre le traitement d'image simplifiée, qui permet à l'utilisateur de traiter des images avec des cellules uniques ou multiples dans environ 1 min. En outre, ces cellules peuvent être soit vivant ou «fixes».

Le logiciel MechProfiler est capable d'augmenter grandement l'analyse de données débit en se fondant sur la reproductibilité de réseaux de Micropost commerciale de qualité, plus spécifiquement, la valeur par défaut & #8220; non dévié "position de chaque poste dans le tableau peut être présumé contre une grille idéale (les écarts de fabrication de la grille dans les tableaux utilisés pour cette étude étaient inférieures à 100 nm).

En bref on ouvre une sélection de fichiers d'image pour l'analyse, les cultures de la région d'intérêt, définit les postes couverts par des cellules ou qui doivent être mis au rebut, détermine les positions de départ, calcule les déviations / forces contre la grille idéale, et enfin enregistre toutes les données spécifiques des cellules avec une possibilité pour l'exportation, y compris à une feuille de calcul de bureau standard.

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Protocol

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1. la culture de cellules sur Micropost Arrays

Remarque: Toutes les étapes doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique pour assurer la stérilité. Les volumes sont indiquées ici pour des flacons de culture T25 cellulaire. La densité de la recette et ensemencement cellulaire milieu de culture cellulaire sont optimisés pour les lignées cellulaires de cancer de l'os HuO9 et M132.

  1. Préparer une culture de cellules pour l'ensemencement sur un réseau de micro-message.
    1. Inspecter la qualité d'une culture de cellules en plaçant le flacon de culture sur un microscope optique standard. Veiller à ce que les cellules montrent une croissance et une morphologie en estimant la quantité de fond de flacon de culture est couvert. Une couverture de 70% -80% reflète un taux de croissance saine. Faites attention à la quantité de cellules flottantes, car ils représentent les cellules mortes et / ou une culture envahie.
    2. Trypsiniser les cellules en éliminant milieu et on lave avec 4 ml 1x solution saline tamponnée phosphate (PBS) tampon. Ajouter 0,8 ml de trypsine 1x / acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et incubation à température ambiante jusqu'à ce que la cellules déloger, ce qui prend environ 2-4 min. Vérifier le processus avec le microscope et parfois appuyez sur le flacon doucement pour soutenir le délogement.
    3. Ajouter 5 ml de milieu de culture cellulaire (le milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) / F12 avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS), 1% de pénicilline / streptavidine (Pen / Strep)) pour arrêter la réaction et pour laver les cellules résiduelles qui siègent encore sur le fond du flacon. Par la suite pipette cette suspension monter et descendre plusieurs fois pour obtenir un mélange homogène. Assurez-vous de la pipette toutes les solutions à travers la zone de croissance d'origine du flacon pour obtenir un délogement efficace.
    4. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 ml et centrifuger à l'aide d'une centrifugeuse de table à 0,5 g pendant 3 min.
    5. Eliminer le surnageant et remettre en suspension le culot de cellules dans 5 ml de milieu par aspiration et refoulement 5 fois. Veillez à éviter la formation de bulles en le faisant.
    6. Déterminer la densité cellulaire en utilisant une chambre de comptage de cellules et une lumière microscope. Vérifier la suspension de cellules dans la chambre de comptage de cellules pour des agrégats de cellules et s'assurer d'avoir seulement des cellules individuelles pour l'expérience suivante. Pipette à nouveau de haut en bas plusieurs fois si les cellules ont tendance à former des agrégats de les séparer.
    7. Diluer la suspension cellulaire avec du milieu suffisante pour obtenir une solution de cellules de 25.000 cellules / ml. Bien mélanger en inversant le tube fermé à plusieurs reprises.
  2. Préparer un réseau de micro-message pour l'ensemencement des cellules.
    Remarque critique: Ne pas pipeter sur le réseau de micro-message directement car cela pourrait potentiellement nuire les microposts, en particulier lorsque des bulles indésirables sont introduits. En outre, assurez-vous que le réseau de micro-message ne sèche jamais comme se produisant forces capillaires conduisent à l'effondrement des micro-messages.
    1. Placer le substrat de verre avec la matrice de micro-message face dans un puits d'une plaque à 12 puits en utilisant une paire de pinces et de le mouiller par addition de 1 ml d'éthanol (99%). Incuber à température ambiante pendant 20-30 secondes.
    2. Diluer l'éthanolpar étapes en ajoutant environ 1 ml de l'eau déminéralisée stérile (eau DI) sur le côté du puits et aspirer environ 1 ml à l'aide d'une pipette de transfert ou d'un dispositif d'aspiration. Répétez cette étape au moins 3 fois.
    3. Remplacer l'eau déminéralisée avec du PBS-tampon de la même façon par addition d'aspiration et environ 1 ml. Répétez cette étape 3 fois.
    4. Remplacer le tampon PBS avec du milieu par addition d'aspiration et environ 1 ml de milieu. Répétez cette étape 3 fois.
  3. Solution de la pipette de 1 ml de cellules (25.000 cellules) sur le dessus de chaque réseau de micro-message préparé. Fermer plaque multi-puits et le transférer dans un incubateur (5% de CO 2, 37 ° C). Laissez les cellules adhèrent et se développent au-dessus de microposts pour 6 -7 h.
  4. Inspectez le processus d'adhésion à l'occasion en utilisant une lumière d'un microscope. Vérifiez que la plupart des cellules apparaissent propagés sur plusieurs microposts.

2. Fixation et coloration des cellules

Remarque: Toutes les étapes etvolumes donnés ici sont pour un seul puits d'une plaque de 12 puits. Il est recommandé de traiter pas plus de quatre des douze puits à la fois pour éviter un assèchement des puits après l'aspiration de tout liquide, qui se traduira par un effondrement des micro-messages.

  1. Aspirer le milieu du puits et laver les cellules 2 fois avec 1 ml de PBS-tampon. Assurez-vous d'appliquer une force douce tout en lavant avec du PBS pour éliminer les débris cellulaires qui se sont accumulés sur le réseau de micro-message pendant l'incubation et de détacher les cellules mortes.
  2. Fixer les cellules avec une solution de formaldehyde tamponnée 0,5 ml de 3,7% pendant 5 min.
  3. Remplacer la solution de formaldéhyde en lavant les micro-message matrice 2x avec 1 ml d'eau désionisée stérile.
  4. Colorer les cellules avec 0,05% (colorant bleu brillant de Coomassie à 50% d'eau, 40% d'éthanol et d'acide acétique à 10%) pendant environ 90 sec. Laver la solution de coloration excès hors 2x avec 1 ml d'eau DI stérile. Ajouter 1 ml d'eau DI à Micropost tableau.
  5. Vérifier le résultat de la coloration à l'aide d'un microscope optique. Répétez til l'étape de coloration, si le corps cellulaire est trop faible pour être visualisées.
  6. Tableaux de Micropost de magasin avec les cellules colorées sur le dessus dans un réfrigérateur à 4 ° C. Assurez-vous de les garder sous l'eau en tout temps.

3. imagerie cellulaire

Nota: L'étape 4 applique uniquement aux microscopes sans corrigé à l'infini optique.

  1. Ajouter 2 ml de l'eau déminéralisée à une boîte de Pétri avec un fond de verre mince pour l'imagerie haute résolution.
  2. Transfert tableau micropost utilisant une paire de pince à épiler dans le plat d'imagerie avec les micro-messages vers le haut.
  3. Placez l'imagerie boîte de Petri sur une scène mobile d'un microscope optique.
  4. Tournez la bague de compensation de la lentille utilisée pour l'imagerie jusqu'à ce que le chiffre de l'échelle représente l'épaisseur totale de tous les matériaux le long du trajet optique afin de compenser la non-concordance des indices de réfraction du substrat de verre, l'élastomère de silicone et le liquide sur le dessus. Cela devrait conduire à un aspect brillant des micropostsnoyaux.
  5. Fermer le diaphragme sur le côté d'éclairage jusqu'à 50% et retirez les anneaux de contraste de phase du trajet optique permettant un mode champ lumineux ordinaire.
  6. Aligner le réseau de micro-message que les microposts forment une ligne horizontale à travers le champ d'observation. Définir un point de départ (par exemple, en haut à gauche) et déplacer le plat Petri par étapes à travers la scène balayage de la matrice de micro-message tout en prenant de nombreuses images.
  7. Prenez toutes les images avec le réglage de la résolution la plus élevée pour l'appareil photo en utilisant un objectif 20X ou 40X. But d'avoir une seule cellule dans le centre de l'image.
  8. Balayer le long de l'axe z à travers le substrat jusqu'à ce que les conseils de Micropost sont en discussion. Utilisez la molette de réglage de mise au point fine du microscope et tournez vers concentrant sur le fond de micropost pendant environ 2-3 um.
  9. Établir une procédure d'imagerie standard en prenant série d'images d'essai d'une section de tableau balayant les imagerie paramètres un à la fois (par exemple, le temps d'exposition,réglage de l'iris, les paramètres de la lampe, etc.). Analyser les images avec MechProfiler et de déterminer un ensemble de paramètres appropriés pour une analyse rapide et fiable.

4. Analyse d'image avec l'Open Source Software "MechProfiler"

Remarque: Toutes les fonctions du logiciel peuvent être activés avec un dispositif de pointage en utilisant le bouton gauche de la souris. Toutefois, un opérateur formé va utiliser les touches de raccourci documentés conçus pour être sur la moitié gauche du clavier pour permettre un traitement d'image à deux mains efficace.

  1. Commencez analyse d'image MechProfiler logiciel et ouvrir une série d'images qui doivent être analysés en cliquant sur «Ouvrir».
  2. Insérez tous les paramètres dans la section "Paramètres" donnée par le développeur du logiciel. Déterminer les paramètres qui doivent être configurés sur mesure (par exemple, le seuil de contour et la distance minimale) selon les modes opératoires décrits en détail dans le manuel du logiciel.
  3. Analyser l'images un par un en les recadrage pour la zone d'intérêt en utilisant "cultures" (cliquez et glissez avec le bouton de la souris enfoncé). Double-cliquez à l'intérieur du rectangle dessiné pour terminer cette action.
  4. Marquage chaque contour de la cellule visible un par un en cliquant sur "Dessiner les contours de cellules" et utilisez le curseur en forme de croix pour le dessin y compris tous les microposts la cellule est attaché.
  5. Jeter toutes microposts indésirables en cliquant sur "Supprimer les messages" et utilisez le curseur en forme de croix pour le dessin. Joindre les micro-messages qui appartiennent à une cellule à l'extérieur de la section d'image qui sont déviées ou pour toute autre raison, mais pas par la cellule d'intérêt.
  6. Démarrez le sous-programme de logiciel "Trouver Centroïdes" par clic de souris. Ajustez le réglage juste à côté du bouton "Trouver Centroïdes" jusqu'à ce que tous les micro-messages sont enregistrés, ce qui est visible par une croix rouge dans leur centre filtre. Si le réglage du filtre est trop faible microposts seront ignorés, si elle est trop élevée multiple positions seront marqués pour un seul micropost. Gardez réglage constant au cours d'une séance d'analyse du filtre.
  7. Utilisez la fonction manuelle d'édition "Edit Manuel» pour centroïdes avec multiples ou manqués positions de Micropost. Utilisez les cheveux de croix de la souris pour sélectionner le micropost en question en cliquant et en faisant glisser partout. Double-cliquez dans le rectangle et placez le marqueur rouge manquant dans la section image agrandie, qui se ferme automatiquement. Jeter un tel micropost si elle est à l'extérieur du contour des cellules dessinée (voir l'étape 4.5) avant de continuer.
  8. Trouver la grille de micropost idéal en activant la fonction "Générer Grille" avec un clic de souris. Vérifiez que la position correspond à la vraie tête de micropost, indiqué par un anneau bleu, l'intérieur du contour de la cellule dessinée.
  9. Corrigez tout fabricant de grille déplacée à l'intérieur de la zone de la cellule si nécessaire en utilisant la fonction correspondante "Manuel Edition" avec un clic de souris. Utilisez la croix pour sélectionner le micropost dans question en cliquant et en faisant glisser partout. Double-cliquez dans le rectangle apparaissant et placez le marqueur bleu manquant dans la section image agrandie, qui se ferme automatiquement.
  10. Utilisez le bouton "calculer" Déviations par clic de souris pour obtenir un histogramme des valeurs de déviation calculé sur la différence entre la position d'un micro-message à l'intérieur de la section de l'image et la grille idéal engendré.
  11. Enregistrer l'analyse complète, y compris les tableaux de valeurs par un clic de souris sur "Enregistrer".
  12. Poursuivre l'analyse d'image soit en cliquant sur "Reset View" et d'analyser une autre section de l'image ou de la souris, cliquez sur "Image suivante", qui peut facilement être fait en utilisant la touche de curseur droite du clavier.

5. Analyse des données - Mechanoprofiling

  1. Ouvrez le fichier "results.xls" avec un tableur de bureau à partir du dossier avec les images analysées. Il contient les données avec all valeurs calculées, y compris toutes les déviations de Micropost et mesures dérivés standards tels que le travail (par exemple, l'énergie de déformation du substrat) par la cellule analysé.

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Representative Results

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Le principal avantage de la technique décrite réside dans sa simplicité et le potentiel pour une intégration rapide et efficace dans le travail de laboratoire de routine. La combinaison des réseaux de capteurs commerciaux de haute qualité jumelés avec des logiciels open-source fournit des informations sur la mécano-sensibilité qui autrement nécessite l'accès à des installations de salles blanches et d'une connaissance approfondie de l'analyse de l'image et le développement de logiciels. La figure 1 illustre le flux de travail de la méthode présentée. Il commence avec la préparation et l'ensemencement des cellules sur le réseau de micro-message. Après fixation et coloration des cellules des tableaux de Micropost sont prêts pour l'imagerie. La partie centrale de la technique est l'analyse d'image en utilisant le logiciel MechProfiler. Un utilisateur peut commencer analyszng images immédiatement après la saisie de tous les paramètres pertinents dans les "Paramètres" de l'interface graphique. La taille de pixel correspondante est la longueur qui est représentée par un pixel unique et dépend de la configuration de l'utilisateur. Il fautêtre établie séparément pour chaque grossissement utilisé en prenant des images d'objets avec la taille connue. Un exemple est donné dans la Figure 9 supplémentaire.

La qualité d'image est un facteur clé car il influe fortement sur le processus d'analyse. Afin d'atteindre la plus haute qualité il faut faire en sorte d'avoir une plate-forme d'imagerie stable et régulièrement entretenu conformément à la figure 2. En particulier, l'alignement de la source de lumière est important car un mauvais alignement des ombres indésirables qui peut être problématique lors de l'analyse de la des images. En outre, en plaçant le microscope optique placé sur une table anti-vibration ou plaque est bénéfique dans la plupart des laboratoires, car il donne une stabilité supplémentaire pendant l'imagerie.

Les avantages de l'utilisation d'un fond plat de Petri en verre mince pour l'imagerie comprennent les valeurs d'ouverture numérique élevée efficaces qui se traduit par des images plus lumineuses avec une résolution accrue.

Lorsque taking les images en mode champ lumineux de 50% pour l'iris fermé est recommandé, en se concentrant sur les conseils Microposts est facilitée en raison des circonférences apparaissant comme un anneau sombre croustillant. En outre, dans le cas où l'objectif utilisé a un anneau de compensation, il est essentiel de fixer correctement pour atteindre des lectures précises de force. L'impact de cette fonctionnalité peut être vu en comparant la figure 3A et la figure 3B. Les images qui peuvent être analysés rapidement, sont atteints en combinant le réglage correct de la bague de compensation avec un éclairage optimal comme le montre la figure 3C. Fort contraste entre un micro-message et ses alentours, réduit le temps d'analyse, car elle accélère l'algorithme de recherche. Les utilisateurs trouveront que seule l'expérience minimale est requise pour obtenir des images qui peuvent être analysés avec facilité.

Surtout, les protocoles ci-dessus surmonter un obstacle critique et commun à l'intégration rapide et efficace des réseaux de Micropost dans la routinetravail en laboratoire. Cet obstacle découle de la nécessité de contrôler la qualité de l'array - une demande qui est réalisable seulement par caractérisation expérimentale approfondie et détaillée de la sonde reproductibilité, la sensibilité et la précision. Cependant, en se tournant vers disponibles dans le commerce des tableaux de Micropost cet obstacle de taille est complètement évitée. Figures 4A et 4B illustrent la précision d'un tel réseau de micro-message. La déviation de la position microposts est bien en dessous de 200 nm et en tant que telle comparable à une "erreur de pixel" qui accompagne la caméra / combinaison objectif qui a abouti à une taille de pixel de 82 nm pour la configuration utilisée. L'analyse des images avec des cellules de déviation des micro-messages démontre que les valeurs de déviation imposé une cellule sont sensiblement supérieures à 200 nm (comme représenté sur la figure 4C et la figure 4D) conduisant à un signal confortable à bruit.

Figure 5 illustrates les différents types d'apparences pour microposts au sein d'une image en fonction si elle est déviée ou pas. Comme mentionné ci-dessus microposts non déviés avoir un aspect brillant circulaire avec un anneau sombre autour d'eux. Leur position peut être déterminée en utilisant une transformation de Hough, qui est une technique d'extraction de caractéristique pour l'analyse d'image numérique.

En outre, il montre que microposts déviés sur un microscope inversé montrent deux face à des formes de demi-lune sombre (voir figure 5A). Dans un microscope droit le bord de la pointe de micro-message et l'un forme sombre en demi-lune sont bien visibles tandis que le second devient difficile à détecter. Ces caractéristiques sont la base pour calculer les positions des images lumineuses champ de microscope des conseils de microposts déviés, qui a été développé pour ce protocole et a été nommé "approche Contour".

La figure 5B est un exemple d'un cancer des os HuO9cellulaire sur microposts imagées sur un microscope inversé (en haut). La version analysé de cette image montre les résultats de l'approche de contour appliquée (en bas). Figure 5C a été prise en utilisant le même réseau de micro-message avec un microscope droit (en haut). Encore une fois la version analysée montre les résultats de l'aide de l'approche de contour.

Chaque séance d'analyse d'image commence par une vérification de l'utilisateur des paramètres dans la section "Paramètres" de la MechProfiler. Certains sont fournies par le fabricant de micro-message comme Micropost dimensions du tableau et constante de ressort. D'autres sont définis par l'utilisateur tels que les valeurs pour le seuil de contour et un seuil minimal de déviation selon les procédures décrites dans le manuel du logiciel. Cependant, il est important de noter que ces valeurs doivent être choisis avec soin et doivent être constante pour toutes les images dans un ensemble interdépendant de images de garantir la comparabilité. Alors que les étapes de pré-traitement de l'image analysis, comme le recadrage, sont auto-expliquant les stratégies sous-jacentes pour les fonctions du logiciel comme "Finding Centroïdes", "Générer Grille" et "l'approche Contour" besoin des explications plus détaillées.

Algorithmique détection de la position de micropost par défaut (tel que livré par le fabricant) commence en utilisant la fonction de logiciel "centroïdes constatation". L'algorithme commence dans le coin supérieur gauche d'une image de chercher pour la première micropost. Par la suite tous les autres microposts se trouvent sur la base des coordonnées de ce premier micropost plus les valeurs de la grille et micropost taille donnée par le fabricant sur la géométrie hexagonale. Le centre de gravité pour chaque micropost trouvé est calculée en utilisant une transformation de Hough. Le curseur de filtre à côté du bouton de commande de l'interface graphique permet de régler la sensibilité de cette transformation. Tous microposts trouvés sont marqués d'une croix rouge et leurs positions notées pour subsequent processus.

Ensuite, la fonction "Générer Grille" conduit à les coordonnées de tous Microposts conseils. Ce sont les résultats d'un processus à plusieurs étapes. Première d'une fonction d'optimisation est résolu y compris les positions initiales de l'algorithme exécuté avant "Trouver centroïdes" pour établir la grille idéale. Deuxièmement les positions des micro-messages à l'intérieur de la zone de cellule sont calculés. Microposts avec moins de déformation que celles définies dans le paramètre de réglage «seuil minimum de déviation" par rapport à la grille idéale sont traitées avec une transformation Hugh. Toutes les autres positions de pointe de micropost sont calculées en utilisant l'approche de contour décrite ci-dessus pour microposts déviés. Ici, le logiciel commence la recherche à partir du centre de gravité initial loin du centre de la cellule pour un bord circulaire (clair à foncé) dans un angle de 15 ° (voir la figure 5A). Une fois que le bord se trouve un cercle avec le diamètre du micro-message donné est ajusté à tbord du chapeau en utilisant la valeur de seuil de contour à partir des paramètres dans l'interface graphique. Ce paramètre détermine quel pixel valeur de gris est utilisé pour le processus d'ajustement. Plus cette valeur est plus le raccord se penche vers le centre de micropost plus brillant de la plus faible qui valorisent plus elle correspond à ce cercle au micropost contour plus foncé. Une fois choisi cette valeur doit rester constante pour tous analyse d'images au sein d'une étude donnée pour éviter d'ajouter déviation artificielle ou en appelant déviations trop conservatrice.

Par exemple, la figure 6 illustre l'importance de choisir pour une valeur de seuil de contour approprié. Le logiciel permet à l'utilisateur de choisir pour une large gamme (0,1 à 0,9) pour englober toutes les situations d'éclairage physiquement possible. La traduction de l'information optique dans les distances de déformations indiquées pour les deux extrêmes et une valeur plus pratique dans le milieu sont donnés à la figure 6B. Toutefois, les utilisateurs de logiciels formés converg souventE à valeurs de seuil de contour très similaires, ce qui conduit à des résultats comparables comme on peut le voir sur la figure 6C. En outre, en utilisant des procédures standardisées pour la coloration de l'imagerie cellulaire et minimise le risque de valeurs de seuil de contour invalide, ce qui devrait généralement rester constante dans des ensembles interdépendants d'images.

Afin de démontrer la robustesse de la méthode de sélection d'un résultat mécano-profilage sont résumés dans la figure 7. Sur la figure 7A deux résultats de cellules de cancer de l'os à partir de deux HuO9 et M132 sont comparées. Les quatre tableaux sont du même lot de production et ont donc des propriétés mécaniques identiques. L'analyse a été effectuée avec un ensemble fixe de paramètres de déviation minimal (0,25 um) et pour le seuil de contour (0,125). En outre, deux ensembles d'images identiques de 2 SaOS cancer des os ont été donnés à deux analystes, sans plus d'informations sur les réglages de paramètres (voir Figure 7B). L'influence de la coloration de l'analyse a été testé en prenant des images de cellules de cancer de l'os colorées avec du bleu de Coomassie R. Ensuite, le colorant a été enlevé. Après re-coloration avec du bleu de Coomassie G un deuxième ensemble d'images a été prise. La figure 7C illustre les résultats de deux séries, qui ont été analysés par le même utilisateur avec des valeurs identiques pour la déviation minimale (0,25 um) et le seuil de contour (0,25) .

Un exemple typique d'application mécano-profilage est présenté sur la figure 8A, dans lequel les données compilées est présenté pour les lignées cellulaires de cancer de l'os HuO9 M132 et après avoir analysé 151 cellules mises en commun à partir de chacun des quatre ensembles. Dans cet aperçu toutes les valeurs des indicateurs sont plus élevés pour HuO9 que pour M132 déjà indiquant que les cellules HuO9 appliquent plus de force que M132. Toutefois, les données de l'analyse d'image contient une grande quantité d'informations à cellule unique supplémentaire qui peut être exploité afin de mieux comprendre phencomportement de lignée cellulaire otypic et la variabilité de cellule à cellule dans une ligne donnée. En présentant les résultats de la force par micropost dans une boîte à moustaches on constate que malgré les minima et maxima similaires, les valeurs de données sont différemment réparties et même de la lignée cellulaire métastatique bas cellules HuO9 ont tendance à appliquer plus de force que la ligne de M132 hautement métastatique (voir Figure 8B). En outre, en catégorisant les valeurs de force par rapport à la surface de la cellule, on trouve que la force moyenne par cellule est non seulement élevée pour les cellules HuO9 rapport à M132, mais aussi que la force moyenne par Micropost augmente à mesure que les cellules réparties jusqu'à ce qu'une force moyenne par poste atteint une valeur plus stable (comme on peut le voir sur la figure 8C). En outre pour les cellules couvrant sept microposts les valeurs sont presque identiques, ce qui est probablement dû au fait qu'ils apparaissent généralement de forme hexagonale avec un centre non dévié micropost indépendante de leur lignée cellulaire. En dehors de la diffrences de la contractilité, différences morphologiques peuvent être quantifiés avec un résultat intéressant. Par exemple, contrairement aux cellules M132 fortement métastatiques, il y avait très peu de cellules HuO9 couvrant seulement trois micro-messages. Autres comparaisons morphologiques entre les lignées cellulaires peuvent être prises, y compris la distribution de la superficie de la cellule représentée par le nombre de micro-messages couverts. Figure 8D montre que les deux lignées de cellules diffèrent également dans le comportement propagation dynamique lors de la croissance au-dessus de microposts. En bref, le mechanoprofile pour la lignée cellulaire parentale HuO9 révèle qu'ils couvrent généralement plus d'espace et d'appliquer un peu plus de force pour microposts alors que la lignée cellulaire métastatique M132, une cellule agressive qui dérive de HuO9, couvre beaucoup moins appel microposts et applique une force par micropost moins . Ces résultats démontrent le potentiel d'une approche fondée TFM pour les applications discriminatoires.

Figure 1. Expérience Workflow. (A) La procédure globale contient cinq grandes étapes consécutives de l'ensemencement des cellules sur une matrice de micro-message au profilage de leurs propriétés mécaniques. (B) L'analyse d'image est réalisée avec le logiciel MechProfiler décrit. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Installation de l'imagerie. Un microscope inversé standard est utilisé pour l'imagerie des cellules sur les tableaux de Micropost. L'installation comporte également une caméra de microscope et son contrôleur, qui peut également fournir des fonctions de stockage de données. Le grand écran ne correspond pas essentiel, mais néanmoins est pratique pour l'imagerie prolongéeséances. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Lignes directrices pour l'imagerie micro-message. (A) Image de cellules colorées sur un réseau de micropost prise avec un objectif 40X en mode champ lumineux. Microposts non dévié apparaissent anneaux sombres lorsque imagé. Messages dévié supposent une forme elliptique avec les deux sous-régions plus sombres et lumineuses. Cellules colorées qui couvrent microposts fait apparaître encore plus sombre au point qu'il n'y a pas opposition entre micropost et cellulaire. (B) images identiques prises après le réglage de la bague de compensation de la lentille et le recentrage. Voici les noyaux des microposts deviennent sensiblement plus lumineux et donnent plus de contraste. (C) La même position imagé nouveau après adjusTing tous Les paramètres d'éclairage avec le contrôleur de la caméra. Les microposts librement debout apparaissent comme des cercles lumineux avec un anneau sombre. Microposts dévié montrent une demi-lune "l'ombre" distincte autour du noyau d'anse long de l'axe de traction. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.>

Figure 4
Figure 4. screenshots MechProfiler de microposts analysés. (A) Un exemple typique d'un vide micropost tableau peut être vu dans cette capture d'écran. Les micro-messages sont disposées selon un motif hexagonal constante. (B) L'histogramme des valeurs de déviation pour ces micro-messages indique que toutes les valeurs sont inférieures à 200 nm. (C) un exemple typique pour os revêtement de cellule cancéreuse HuO9et en tirant sur plusieurs microposts. On peut voir que la quantité de traction est hétérogène. (D) L'histogramme avec les valeurs de déviation pour la cellule HuO9 montre le large spectre des déviations qui découle de l'interaction des cellules avec le substrat de micropost. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. apparences Micropost en éclairage sur fond clair et les stratégies pour le calcul de leur position dans une image. (A) microposts non dévié apparaît comme une zone lumineuse circulaire avec un anneau externe sombre. Le centre de gravité est calculée par une transformation de Hough. Microposts dévié montrent sombres formes de demi-lune. Selon la configuration de microscope si les microposts face à la ligh t source (par exemple, microscope inversé), il existe deux formes de demi-lune bien visibles. Si les microposts face à la lentille (par exemple, microscope droit), une seule demi-lune est bien visible, mais aussi au bord de la pointe. Dans les deux cas, l'approche de contour doit être utilisé pour calculer la pointe de micro-message. (B) Une image d'origine (en haut) à l'aide d'un microscope inversé à partir d'une cellule de cancer des os HuO9 et sa version analysée (en bas) en utilisant l'approche de contour. (C) de l'image d'origine à partir de la même matrice de micro-message (en haut) en utilisant un microscope droit et la version analysé, appliquer à nouveau l'approche du contour (en bas), mais avec une valeur seuil de contour beaucoup plus faible plus appropriée pour appeler le bord en forme d'anneau sombre. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 6. L'approche de contour et en choisissant la valeur de seuil approprié. (A) Les trois captures d'écran illustrent les mêmes microposts analysés à l'aide de trois valeurs de seuil de contour différentes. Si la valeur est définie soit trop faible (à gauche) ou trop haute (à droite) que le logiciel adapte l'anneau bleu qui représente la tête de micropost incorrecte. Il sous-estime ou dépasse la position réelle de la tête de micro-message. Une valeur seuil correctement choisi permet au logiciel de s'adapter cette bague bleue à la forme de l'intérieur de la zone sombre micropost qui forme grâce à la déviation de demi-lune. (B) Le graphique montre le montant moyen de la déviation dépend du seuil de contour choisi pour les micro-messages présentés dans ci-dessus. Il illustre également que les valeurs pour les micro-messages à l'extérieur du contour de la cellule ne sont pas touchées depuis le raccord de contour est pas appliquée là. (C) Le graphique montre que le choixune valeur de seuil dans un intervalle modérée minimalizes le risque de sur- ou sous-estimer les déviations de Micropost. La différence entre les valeurs choisies par les différents utilisateurs formés est normalement inférieure à 0,05, ce qui entraîne des différences acceptables des valeurs moyennes de déviation. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7
Figure 7. Test de robustesse pour mécano-profil résultats de différentes lignées cellulaires de cancer des os; les barres d'erreur représentent un écart-type (A) Mécano-profilage résultats de quatre tableaux de Micropost identiques après l'ensemencement des cellules HuO9 sur tableau 1 et M132 sur tableau 3 -. ensemencement quatre jours plus tard HuO9 sur tableau 2 et M132 sur tableau 4. (B) Comparaison des résultats de mEchano-profilage fondé sur des ensembles d'images identiques après analyse par deux analystes indépendants. (C) Comparaison des résultats d'analyse d'image à partir de deux séries différentes de l'image première prise après coloration au bleu de Coomassie R et le second après le retrait complet de colorant et re-coloration au bleu de Coomassie G. S'il vous plaît cliquez ici pour afficher une version plus grande de cette figure .>

Figure 8
Figure 8. Mécano-profilage de lignées cellulaires de cancer de l'os. (A) La comparaison entre les lignées cellulaires de cancer deux osseuses HuO9 (faible potentiel métastatique) et M132 (hautement métastatique) graphique montre que toutes les valeurs indicatrices sont plus élevés pour la lignée cellulaire HuO9 ( Total n = 302; deux ensembles indépendants d'expériences, erreur bar = écart-type). (B trong>) La boîte à moustaches montre que les forces appliquées par micropost sont dans la gamme inférieure nano-Newton. Cependant, les cellules HuO9 tirent plus de cellules M132 (moustaches représentent le minimum et le maximum de données). (C) Un résultat similaire peut être vu en comparant les cellules qui couvrent le même nombre de micro-messages. Cellulaire HuO9 appliquer plus de force que les cellules M132. Le nombre de cellules HuO9 couvrant trois microposts est pas représentatif et seulement inclus pour l'exhaustivité (barre d'erreur = écart-type). (D) Les distributions différentes à travers le nombre de couverts microposts démontrer que chaque lignée cellulaire de cancer des os a sa propre caractéristique étalement lors de l'interaction avec les tableaux de Micropost. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure complémentaire 9. La taille du pixel pour une configuration de microscope est généralement déterminée en utilisant une lame de microscope spécial avec une barre d'échelle sur elle; alternativement la disposition du réseau de micro-message, donnée par le fabricant peut être utilisé. Par exemple, 15 unités avec 13 microns (195 um de longueur totale) divisé par 2375 pixels (établis avec un outil de traitement d'image) conduit à 0,082 um / pxl. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure complémentaire 10
Figure 10. Comparaison complémentaire d'images d'une cellule HuO9 au cancer des os prélevé sur la même position en utilisant deux techniques d'éclairage sur un microscope inversé; Dio teinté microposts sont fluorescente verte. (A Mode champ lumineux. (B) a analysé i mage pris après le passage à la chaîne de fluorescence verte sans recentrage.   (C) de deuxième image de fluorescence après la correction de la mise au point sur ​​les conseils très Micropost. (D) Superposition de deux canaux d'éclairage à titre illustratif seulement.   Indicateurs (E) Mécano-profilage que les résultats des trois images. Malgré la correction de la mise au point de la déviation complète ne peut pas être estimée à partir des images de fluorescence. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure supplémentaires 11
Fi supplémentairefigure 11. séquence d'image de la même position de microposts colorées par fluorescence à l'aide de Dil sur un microscope droit (A) de l'image à champ lumineux. il ya trois microposts touchant l'autre à la pointe. (B) Même position après le passage à la chaîne fluorescent légèrement au-dessus de la tête des Microposts. (C) Abaisser le plan focal à la pointe des micro-messages. (DE) images consécutifs après abaissant encore le plan par étapes focale vers le fond de la micro-messages. (F) l'image des microposts après l'abaissement du plan focal à l'intérieur du substrat en élastomère de silicone. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure complémentaire 12 Figure complémentaire 12. Capture d'écran de l'interface graphique MechProfiler. De résultat d'analyse typique de profilage d'une cellule de cancer des os HuO9. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

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Ce travail vise à faire progresser le domaine de la force de traction microscopie en abaissant considérablement les obstacles techniques et pratiques à l'entrée. Ces obstacles proviennent de deux côtés. Tout d'abord sont les nombreux défis techniques non négligeables qui doivent être surmontés pour la fabrication reproductible et mettre en service un réseau de micropost expérimentalement. Deuxièmement, la nécessité est de même non négligeable pour une analyse semi-automatique fiable des forces de cellules uniques - en gardant à l'esprit que une expérience typique peut exiger l'analyse de centaines voire des milliers de cellules. Les techniques décrites ci-dessus ont été élaborés pour faire en fonction microscopie à force de traction de micropost accessibles dans les laboratoires de biologie cellulaire qui ne disposent pas de l'expertise en ingénierie résident. Les capteurs et les techniques d'analyse présentés dans cet article doivent permettre aux non-experts pour analyser facilement et avec exactitude les forces exercées par des cellules individuelles.

Outre l'accès à une biologie cellulaire Lab avec au moins un champ lumineux microscope de qualité moyenne, les méthodes décrites nécessite quelques éléments techniques supplémentaires. Ici, la plupart les utilisateurs peuvent effectuer des expériences force de traction de microscopie valides, même avec une expérience limitée, malgré la puissance et la polyvalence de la technique. Néanmoins, il existe trois aspects critiques dans le protocole présenté qui doit être considéré. D'abord, il est nécessaire de veiller à ce que les matrices de micro-message sont toujours recouverts de liquide pour éviter que leur effondrement en raison des forces capillaires. Deuxièmement on a besoin pour optimiser les paramètres d'imagerie pour les images Micropost acquises, ce qui est le mieux fait en prenant série d'images de la même position de tableau en faisant varier la durée d'exposition, de l'iris ouverture, et la position de l'anneau de compensation. Il est important de trouver le plan focal correct pour la pointe de micropost, et cet aspect prend une certaine expérience compte tenu de la faible profondeur dimensions des réseaux de capteurs. Troisièmement, il faut télécharger l'analyse d'image MechProfiler logiciel discusse librement accessiblesD ici, pour lesquels un manuel d'utilisation et de formation des exemples détaillés sont disponibles sur le site de téléchargement. Après quelques expériences en utilisant le logiciel pour analyser les exemples fournis avec le manuel, l'utilisateur doit prendre des images de test sur l'installation d'imagerie pour être utilisés de manière à configurer les paramètres appropriés de microscope. Sur la base des images obtenues, la valeur de seuil de contour doit être optimisée de façon similaire. Une seule image de micro-message peut être analysé par un utilisateur formé à l'intérieur d'une minute en utilisant le logiciel MechProfiler code source ouvert indépendamment du fait qu'il contient une ou plusieurs cellules, ce qui permet la génération des résultats statistiquement pertinents (analyse de plusieurs centaines de cellules) en quelques heures .

Un autre aspect qui nécessite quelques réglages est l'optimisation de toute procédure de coloration cellulaire appliquée. Lorsque les cellules sont trop colorées-le logiciel peut ne pas enregistrer les positions de Micropost correctes. D'autre part, si la coloration est trop faible, il exige plus d'effort par l'utilisateur pour détecter une"True" contour des cellules minces saillies cellulaires peut pas être manquée.

Cependant, en appliquant un protocole fixe de coloration de l'imagerie cellulaire et de la matrice procédure la gamme pour cette erreur devient suffisamment faible. Au cours de ce travail différentes procédures de coloration cellulaire ont été testés, sur la base de diverses concentrations de cristal violet, la présence d'agents tensio-actifs tels que Tween 20 ou le Triton-X, ou une combinaison de colorants en ajoutant l'éosine. Néanmoins, l'intensité de la coloration ainsi que sa stabilité varie sensiblement d'une expérience à. Seule l'utilisation de Brilliant Blue G comme décrit ci-dessus a montré une robustesse de coloration cellulaire acceptable combiné avec assez d'intensité pour voir encore la mince contour des cellules, mais sans interférer avec l'approche de contour développé.

En général, il ya des options pour modifier la technique présentée. Par exemple en combinant les techniques champ clair présentés ici avec microscopie par fluorescence organites de colorationcomme le noyau ou le réseau des filaments d'actine, qui peut fournir des informations supplémentaires sur les processus cellulaires sous-jacentes dans le contexte de la mécanique des cellules. En outre, en utilisant carboxycyanines de dialkyle à longue chaîne (DII ou DIO) les microposts deviennent fluorescentes. 14 Néanmoins, il est important de contrôler chaque écart par rapport à la technique présentée. Les figures complémentaires 10 et Figure 11 illustrent les pièges potentiels. Les images prises d'une cellule de fibroblastes NIH 3T3 bleu de Coomassie G taché dans le canal de fluorescence verte (Figure 10B et 10C) en utilisant le microscope inversé présentent les principaux organes de Micropost mais pas leurs conseils conduisant à un défaut d'analyse de position (Figure 10E). Malgré les meilleurs efforts pour recentrer après la commutation du mode champ lumineux (Figure 10A) les conseils de Micropost ne peuvent être imagées, qui pourrait être due à l'absorption de signal de fluorescence par la tache de la cellule. Ceci est en contraste avec images prises avec le canal de fluorescence jaune d'un microscope droit (Figure 11B-11F) dans lequel de multiples images nettes peuvent être obtenir le long de l'axe z. Ici, l'utilisateur doit veiller à ce que l'image est prise avec le plan focal à la très pointe (Figure 11C) et non quelque part près du fond de micropost pour éviter d'appeler les valeurs de déviation défectueux.

Il convient de noter qu'il existe aussi des limitations techniques pour les dosages de Micropost. Par exemple, la précision d'une déviation détectée dépend de la qualité de la configuration optique. Microscopes sont souvent optimisés pour l'imagerie de fluorescence dans lequel la sensibilité à la lumière de la caméra connectée a une priorité plus élevée que d'un grand nombre de pixels. Naturellement, cela conduit à des images avec une taille de pixel plus grand. En outre, il convient de noter que les images de champ lumineux ne peut pas déterminer si les saillies de cellules atteignent le fond du substrat. Cependant, les réseaux de Micropost commerciaux ont été testés à l'aide confocalemicroscopie. Il a été constaté que les cellules semblent accepter le revêtement binaire qui ne favorise que l'adhérence sur les conseils de Micropost et non pour le reste de la matrice de micro-message. Un autre facteur qui dérive de l'erreur de position de la matrice de micro-message, qui a été montré que 0,2 um. Avec la constante de rappel donnée de 2,8 nN / um ce qui conduit à une erreur dans la force de lecture de 0,6 nn. Une autre contrainte pour des essais de micro-message provient du fait que les forces appliquées à partir de micro-messages communs à plusieurs cellules ne peuvent être déterminées. Par conséquent, les cellules simples-isolées ne peuvent être analysés. Une limitation spécifique pour le protocole présenté découle de l'application correcte de l'approche de contour sensible, qui nécessite une certaine quantité de la formation pour l'utilisateur afin d'obtenir des résultats fiables. En outre, pour une analyse plus rapide, l'utilisateur doit prendre des images, dans lequel la matrice de micro-message est alignée pour former une horizontale ou une verticale le long du bord du champ d'observation. Despite le fait que l'algorithme de logiciel pour trouver des micro-messages à l'intérieur d'une géométrie de grille hexagonale est pas limitée par un angle de rotation de l'imagerie de micro-messages de plus de 5 ° par rapport à l'axe, il est difficile pour recadrer à une section d'image sans contenant microposts incomplètes, ce qui conduit alors à un défaut de la fonction "Générer Grille". Dans un tel cas, l'utilisateur peut utiliser la fonction de rotation intégrée avant de commencer à analyser les positions de Micropost.

Le procédé décrit a été principalement appliquée à caractériser deux lignées cellulaires de cancer des os, une lignée de cellules parentale nommé HuO9, et une ligne hautement métastatique dérivé dénommé M132. Dans ce contexte, plus de six cents images unicellulaires ont été prises en mode champ lumineux et analysées en utilisant le logiciel MechProfiler. L'exploration de données ultérieures ont révélé que la lignée cellulaire parentale HuO9 exerce peu plus de force et couvre en général plus microposts par cellule que les cellules de la lignée cellulaire métastatique M132. Cependant, les cellulesne sont pas synchronisées et donc à des stades différents du cycle cellulaire au moment de la fixation, ce qui a probablement contribué à la large gamme de résultats. En prenant des images de cellules vivantes sur des périodes allant jusqu'à 24 heures, il a été constaté que, après la diffusion de nombreuses cellules restent à leur position initiale tandis que d'autres migrent, diffusion, déconnexion et migrent à nouveau avec des vitesses différentes (voir vidéos supplémentaires). Ceci indique que le profil mécanique d'une cellule est souvent pas constant et peut varier considérablement d'une population de cellules ou même à l'intérieur d'une seule cellule en fonction de son activité en cours. Un autre facteur qui pourrait être sur un réseau de micro-message une cellule est forcée à effectuer les étapes de migration discrètes pour atteindre un autre micro-message, ce qui est en contraste avec TFM classique, où les cellules adhèrent à des surfaces planes et peuvent migrer à pas d'une minute. Toutefois, afin d'analyser ces petites étapes, il est nécessaire de prendre des images fluorescentes de points d'adhésion focale, ce qui nécessite l'accès à m très avancéicroscopes et des logiciels d'analyse d'image très élaborée. Néanmoins, la répartition des profils mécaniques dans les grandes populations est encore souvent une caractéristique déterminante d'une lignée cellulaire. Ainsi, une méthode à haut débit qui permet la caractérisation d'un grand nombre de cellules est essentiel. Le processus d'imagerie manuel et le logiciel libre d'accès présentée ici héberge un grand potentiel pour l'extension des systèmes de microscope entièrement automatiques.

En résumé une approche force de traction de la microscopie robuste est présenté qui est facilement adoptable dans un laboratoire de biologie cellulaire standard. L'ensemble du workflow de l'ensemencement des cellules d'analyse d'image est simple et efficace. Alors que les protocoles décrits ici sont entièrement fonctionnels, des améliorations sont en cours pour adapter les algorithmes d'analyse pour être en mesure de traiter également Micropost tableaux avec des mises en page orthogonales et procédures en développement qui simplifient l'analyse de séquences d'images à partir de l'imagerie de cellules vivantes. Dans le contexte avec les résultats obtenus pour les cellules li au cancer des osnda, les approches décrites ici peuvent être utilisées pour les cellules d'écran provenant de biopsies cliniques afin d'établir si ces tests peuvent avoir de la valeur pronostique, permettant aux cliniciens de prédire le potentiel métastatique des cellules de biopsies de patients atteints de cancer des os. Un tel essai pourrait influencer les stratégies thérapeutiques. D'autres applications potentielles concernent des composés actifs sur le plan pharmaceutique des essais sur des cellules mécaniquement actifs comme les cellules musculaires lisses ou des cardiomyocytes, potentiellement pour aider à établir l'efficacité ou de la toxicité d'un médicament.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
T25 cell culture flasks Nunc 156367
1x PBS-buffer Sigma D8537
0.5% Trypsin-EDTA Life Technologies 15400054
Medium DMEM/F12 Sigma D8437
FBS South America Life Technologies 10270106
Penicillin-Streptomycin 100x Sigma P4333
15 ml centrifuge vials Sarstedt 62.554.502 
Micropost array pre-coated with Collagen I/Fibronectin MicroDuits MPA-col1/FN Micropost dimensions: Ø=6.4 µm, l=18.2 µm; grid=13 µm, kcorr=2.87 nN/µm
Ethanol abs p.A. Merck 100.983
12-well plate Nunc 150628
Formalin solution, neutral buffered 10% Sigma HT5011
Brilliant Blue G-250 Sigma 27815 Coomassie blue
Methanol ACS p.A. Merck 1.06009
Acetic acid Sigma 695092
Glass bottom dish WillCo Wells BV GWSb-3522 35 mm diameter, aperture 22 mm
T-100 Eclipse Nikon n/a Inverted microscope
D3-L3 Nikon n/a Camera controler
DS Fi2 Nikon Camera

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References

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Mécano-profilage facile et précis sur Micropost Arrays
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Goedecke, N., Bollhalder, M., Bernet, R., Silvan, U., Snedeker, J. Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays. J. Vis. Exp. (105), e53350, doi:10.3791/53350 (2015).More

Goedecke, N., Bollhalder, M., Bernet, R., Silvan, U., Snedeker, J. Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays. J. Vis. Exp. (105), e53350, doi:10.3791/53350 (2015).

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