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Immunology and Infection

का उपयोग संयंत्र रक्षा प्रतिक्रियाएँ ललित विशेषता के लिए बैक्टीरियल लीफ घुसपैठ परख Published: October 1, 2015 doi: 10.3791/53364
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Biology, University of Alabama at Birmingham

Abstract

विशेष मोबाइल प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अभाव में, पौधों उनके स्थानीयकृत क्रमादेशित कोशिका मृत्यु और प्रणालीगत अधिग्रहण प्रतिरोध रोगज़नक़ हमले के खिलाफ खुद का बचाव करने के लिए उपयोग। समग्र संयंत्र प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए एक विशिष्ट एराबिडोप्सिस जीन का योगदान विशेष रूप से और मात्रात्मक संक्रमित ऊतक के भीतर रोगज़नक़ विकास परख करने की क्रिया द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। तीन दशक से अधिक के लिए, hemibiotrophic जीवाणु स्यूडोमोनास syringae पीवी। Maculicola ES4326 (पी एस एम ES4326) व्यापक रूप से एराबिडोप्सिस प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया अंतर्निहित आणविक तंत्र की जांच करने के लिए मॉडल रोगज़नक़ के रूप में लागू किया गया है। पत्ती के ऊतकों में रोगजनकों देने के लिए, कई टीका तरीकों स्थापित किया गया है, जैसे, सिरिंज घुसपैठ, डुबकी टीका, स्प्रे, निर्वात घुसपैठ, और बाढ़ टीका। निम्नलिखित प्रोटोकॉल वयस्क की पत्तियों में ज़हरीले Psm ES4326 वितरित करने के लिए एक अनुकूलित सिरिंज घुसपैठ विधि का वर्णनArabidopsis पौधों मिट्टी देसी और सही ढंग से इस रोगज़नक़ की ओर बढ़ाया रोग संवेदनशीलता (ईडीएस) के लिए स्क्रीन। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल आगे चिरायता एसिड (एसए) -Triggered प्रतिरक्षण (एसटीआई) और MAMP-उत्प्रेरित प्रतिरक्षण (एमटीआई) सहित संयंत्र रक्षा की विभिन्न परतों के भीतर विशिष्ट प्रतिरक्षा दोष काटना करने के लिए कई पूर्व उपचार के साथ पूरक हो सकता है।

Introduction

कारण उनके बिना डंठल प्रकृति के कारण, पौधों लगातार विभिन्न जीवन शैली और पोषण संबंधी रणनीतियों 1 का प्रदर्शन करते रोगाणुओं की अधिकता के द्वारा धमकी दी हैं। Necrotrophic रोगजनकों सक्रिय रूप से गुप्त विषाक्त पदार्थों और एंजाइमों मेजबान ऊतक को मारने और मृत कोशिकाओं को 1 पर खिलाने के लिए, जबकि एक पहली सन्निकटन करने के लिए, biotrophic रोगजनकों, पोषक तत्वों को पुनः प्राप्त करने के लिए जीवित अपने मेजबान बनाए रखें। रोगजनकों, करार दिया hemibiotrophs का एक अन्य समूह, रोगज़नक़ संचय 2 की एक निश्चित सीमा पर पहुंचने पर necrotrophic चरण के लिए biotrophic मंच और बदलाव के साथ अपने संक्रमण पाठ्यक्रम शुरू होता है। प्रभावी ढंग से इन सूक्ष्मजीवों के खिलाफ खुद का बचाव करने के लिए, पौधों रोगज़नक़ हमले का पता लगाने और गति प्रदान करने के लिए कई निगरानी तंत्र से लैस एक जटिल सहज प्रतिरक्षा प्रणाली विकसित किया है कोशिका मृत्यु 3 के रूप में अच्छी तरह के रूप में प्रणालीगत अधिग्रहण प्रतिरोध (एसएआर) 4 क्रमादेशित स्थानीय। वर्तमान शोध आवश्यक हस्ताक्षर निस्र्पक पर ध्यान केंद्रित कर रहा हैnaling घटकों और संयंत्र प्रतिरक्षा प्रणाली 5 भीतर पार वार्ता।

"Zig-Zag" मॉडल 5 में प्रस्तावित रूप में, संयंत्र सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की पहली परत एक सूक्ष्म जीव के आक्रमण का पता लगाने के लिए प्लाज्मा झिल्ली स्थानीय पैटर्न पहचान रिसेप्टर्स (PRRS) की उपस्थिति की आवश्यकता है। PRRS सूक्ष्म जीव-एसोसिएटेड आणविक पैटर्न (MAMPs) को समझते हैं और MAMP-उत्प्रेरित प्रतिरक्षण (एमटीआई) 6 स्थापित करने में सक्षम हैं। रोगाणुरोधी पीआर प्रोटीन 7 एन्कोडिंग जीन की एक ट्रांसक्रिप्शनल अपरेगुलेशन उत्प्रेरण इसके अलावा, एमटीआई सेल दीवार के लिए प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन (आरओएस) और प्रतिक्रियाशील नाइट्रोजन प्रजाति (RNS), callose के बयान सहित रोगज़नक़ विकास को गिरफ्तार कि घटनाओं की एक किस्म के लिए सुराग साथ ही कई काइनेज सिगनल की सक्रियता के 8 रास्ते के रूप में।

अब तक, कई MAMPs बैक्टीरियल flg22 9 सहित एराबिडोप्सिस में एमटीआई को गति प्रदान करने के लिए पहचान की गई है 10 (बैक्टीरियल अनुवाद बढ़ाव कारक मं से 18 एमिनो एसिड) 11 peptidoglycans। एक सफल संक्रमण की स्थापना करने के लिए, कुछ विशेष रोगजनकों इंट्रासेल्युलर या कहनेवाला रिक्त स्थान में गुप्त डाह प्रेरक प्रोटीन करने की क्षमता विकसित किया है, और फलस्वरूप एमटीआई को दबाने और प्रेरक-उत्प्रेरित संवेदनशीलता (टिकट) 12,13 को गति प्रदान की है। उदाहरण के लिए, डाह प्रभावोत्पादक संक्रमित ऊतक 14-16 भीतर रोग के विकास के लिए प्रेरित करने एमटीआई के माइटोजन सक्रिय प्रोटीन kinase (MAPK) फास्फोरिलीकरण झरने को निष्क्रिय कर सकते हैं। मेजबान और रोगजनकों के बीच गतिशील सह-विकास के दौरान, पौधों को भी प्रेरक प्रोटीन को समझते हैं और रोगज़नक़ डाह 17 अणुओं attenuate को पलटवार की रणनीति विकसित की है। यह प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से प्रेरक मान्यता रोग प्रतिरोध (आर) प्रोटीन 18 द्वारा मध्यस्थता है। टी के सबसेहेम नायब LRR के सदस्यों (Nucleotide बंधन और Leucine-रिच दोहराता) परिवार 19 हैं। एक अनुसंधान प्रोटीन से एक असंक्रामक प्रेरक की धारणा प्रेरक-उत्प्रेरित प्रतिरक्षण (ETI) 20 के रूप में होती है एक मजबूत और व्यापक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया elicits। रक्षा जीन 21 की अभिव्यक्ति और रक्षा चयापचयों 22 के उत्पादन उत्प्रेरण इसके अलावा, ETI अक्सर आसन्न ऊतक 3 में फैलने से रोगज़नक़ प्रतिबंधित करने के लिए अतिसंवेदनशील रिस्पांस (मानव संसाधन) के रूप में जाना जाता है एक तेजी से स्थानीकृत क्रमादेशित कोशिका मृत्यु हो जाती है।

प्रोग्राम किया स्थानीयकृत कोशिका मृत्यु 23 के अलावा, पौधों (एसएआर) 4 प्रणालीगत अधिग्रहण प्रतिरोध करार दिया एक दीर्घकालिक और प्रणाली में व्यापक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की शुरुआत करने में सक्षम हैं। एक biotrophic रोगज़नक़ के साथ चुनौती पर, संयंत्र कोशिकाओं स्थानीय और प्रणालीगत ऊतकों 24 दोनों में एक अंतर्जात phytohormone चिरायता एसिड (एसए) और पीआर प्रोटीन का जैवसंश्लेषण और संचय ट्रिगर। टी के माध्यम सेउसकी प्रक्रिया, तैयारियों का बढ़ राज्य रोगजनकों 24 की एक व्यापक स्पेक्ट्रम से बाद में एक संक्रमण के दौरान तेजी से रक्षा की प्रतिक्रियाएं बढ़ते के लिए अनुमति देता है कि असंक्रमित पत्तियों में हासिल की है। एसए और उसकी ऐसी benzo- के रूप में सिंथेटिक एनालॉगों (1,2,3) -thiadiazole-7-carbothioic एसिड एस -methyl एस्टर (BTH) और 2,6-dichloroisonicotinic एसिड (आईएनए) रासायनिक चिरायता एसिड उत्प्रेरण के लिए सक्षम हैं (एसए) बाहरी आवेदन 24 पर -Triggered प्रतिरक्षण (एसटीआई)। रोगजनन से संबंधित जीन 1 (NPR1) की Nonexpressor स्थानीय और प्रणालीगत ऊतकों 21,25,26 दोनों में एसए की मध्यस्थता रक्षा प्रतिक्रिया के दौरान एक प्रमुख ट्रांसक्रिप्शनल नियामक के रूप में एसए रिसेप्टर्स और कार्यों में से एक हो जाने का प्रस्ताव है। यह निर्णायक NPR1 एसएआर स्थापना के लिए आवश्यक है और NPR1 के नुकसान स्यूडोमोनास syringae 25 की दिशा में नाटकीय संवेदनशीलता की ओर जाता है कि प्रदर्शन किया गया है।

बड़े पैमाने पर पौधे की आणविक योगदान को चिह्नित करने के लिएसंयंत्र रोगज़नक़ बातचीत में घटकों, कई bioassays, आरओएस 27 फट सहित विशिष्ट रक्षा घटनाओं को मापने के लिए उनके प्रोटीन उत्पादों की 21 callose बयान 28, रक्षा जीनों की अभिव्यक्ति और संचय विकसित किया गया है। इन व्यक्तिगत assays संयंत्र प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का एक विशिष्ट रूप में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं, उनमें से कोई भी, हालांकि, पूरे संयंत्र के स्तर पर पूरी रक्षा की प्रतिक्रिया का प्रतिनिधित्व करने में सक्षम हैं। इसके विपरीत, संक्रमण के बाद रोगज़नक़ वृद्धि की मात्रा का ठहराव जीवधारी स्तर पर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए एक समग्र आकलन प्रदान करता है। इसलिए, एक सटीक और अत्यधिक मानकीकृत रोगज़नक़ टीका परख के विकास और अनुकूलन एराबिडोप्सिस प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर अनुसंधान और खोजों के लिए ईंधन के लिए महत्वपूर्ण है।

स्यूडोमोनास syringae, एक ग्राम नकारात्मक जीवाणु, Arabidops सहित संयंत्र सेनाओं के एक रेंज में रोग पैदा करने में सक्षम एक phytopathogen के रूप में पहचान की गई थी29 है। पी - मॉडल संयंत्र रोगज़नक़ प्रणाली, एराबिडोप्सिस के रूप में syringae बातचीत व्यापक रूप से आणविक तंत्र अंतर्निहित संयंत्र रक्षा प्रतिक्रियाएं 29 को समझने के लिए लागू किया गया है। अब तक, 50 से अधिक पी syringae pathovars विभिन्न प्रजातियों के पौधे 30 को संक्रमित करने के लिए अपनी क्षमता के आधार पर पहचान की गई है पी। syringae पीवी। टमाटर DC3000 (पीएसटी DC3000) 31 और पी syringae पीवी। maculicola ES4326 (पी एस एम ES4326) 32 दो सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया है और बड़े पैमाने पर की विशेषता विषमय उपभेदों हैं। एक तरफ संयंत्र द्वारा मान्यता प्राप्त है और एमटीआई प्रतिक्रिया ट्रिगर किया जा रहा से, पीएसटी DC3000 और Psm ES4326 एमटीआई को दबाने और रोगज़नक़ विकास 31,33 के पक्ष में करने के लिए टिकट को गति प्रदान करने के लिए उग्र प्रेरक प्रोटीन स्रावित करने में सक्षम हैं।

कार्यात्मक एराबिडोप्सिस और पी के बीच बातचीत के टुकड़े करना syringae, कई0; रोगज़नक़ संक्रमण तरीकों रोगज़नक़ वितरण दृष्टिकोण के आधार पर विकसित किया गया है। मिट्टी-बड़े पौधों के लिए, रोगज़नक़ सिरिंज घुसपैठ, वैक्यूम घुसपैठ, डुबकी टीका और स्प्रे टीका 29,34 से दिया जा सकता है। हाल ही में, अंकुर बाढ़ टीका परख टिशू कल्चर पर बड़े पैमाने पर स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए विकसित किया गया था युवा Arabidopsis पौधों 35 प्लेटें देसी। सिरिंज घुसपैठ, सबसे अधिक इस्तेमाल किया दृष्टिकोण में से एक के रूप में, मैन्युअल रंध्र 29 करार दिया प्राकृतिक पत्ती के उद्घाटन के माध्यम apoplast में रोगज़नक़ बचाता है। पी के इस दृष्टिकोण के माध्यम से, बराबर मात्रा में syringae संक्रमित पत्ती में घुसपैठ की जा सकती है और संयंत्र के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की ताकत व्युत्क्रमानुपाती रोगज़नक़ विकास के स्तर को जोड़ा जाता है। इसलिए, रोगज़नक़ वृद्धि की मात्रा का ठहराव पूरे संयंत्र स्तर पर प्रतिरक्षा समारोह का मूल्यांकन करने के लिए एक इष्टतम दृष्टिकोण के रूप में कार्य करता है। इसके अलावा, सिरिंज घुसपैठ स्थानीय और प्रणालीगत ऊतक भेद कर सकते हैं, जो कर सकते हैं खएसएआर 36 अंतर्निहित आणविक तंत्र निस्र्पक में लागू ई।

निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, हम बढ़ाया रोग संवेदनशीलता (ईडीएस) के लिए एराबिडोप्सिस म्यूटेंट स्क्रीन करने के लिए Psm ES4326 के साथ एक अनुकूलित सिरिंज घुसपैठ परख का वर्णन है। इस प्रोटोकॉल दो एराबिडोप्सिस जीनोटाइप को रोजगार देगा: एक जंगली प्रकार ecotype कोलंबिया -0 (कर्नल-0) पौधों (नियंत्रण) और npr1-1 नुकसान के समारोह म्यूटेंट (Hypersusceptible) कि विषमय बैक्टीरियल तनाव Psm ES4326 37 से संक्रमित हो जाएगा। npr1-1 उत्परिवर्ती टाइरोसीन करने के लिए अत्यधिक संरक्षित हिस्टिडीन बदल और 25 गैर कार्यात्मक प्रोटीन जो renders NPR1 अणु, की ankyrin दोहराने आम सहमति अनुक्रम के भीतर एक बिंदु उत्परिवर्तन किया जाता है। इसके अलावा, सिरिंज घुसपैठ परख के संशोधनों के एक नंबर एमटीआई और एसटीआई सहित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के विशिष्ट परतों में दोष की मात्रा का ठहराव की अनुमति है कि वर्णित हैं।

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Protocol

निम्न पाठ एराबिडोप्सिस में Psm ES4326 सिरिंज घुसपैठ परख अनुकूलित करने के लिए एक चरणबद्ध प्रोटोकॉल का वर्णन है। इस परख के प्रमुख प्रक्रियाओं एक सरल प्रवाह संचित्र (चित्रा 1) में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं।

1. संयंत्र विकास की स्थिति

  1. बीज बोएं
    1. शिथिल नीचे हे से उन्हें भिगोने से मिट्टी और पानी के बर्तन के साथ भरा 2 बर्तन (व्यास में 4, लंबा में 3.75) तैयार / एन अतिरिक्त पानी draining से पहले।
    2. चादर या अन्य कागज वजन एक जोड़ 70 मिमी के साथ प्रत्येक बर्तन पर, 50-100 Arabidopsis बीज, जंगली प्रकार कर्नल -0 या npr1-1 उत्परिवर्ती बोना।
    3. 80-90% (2A चित्रा) के सापेक्ष नमी को बढ़ाने के लिए एक पानी का छिड़काव पारदर्शी गुंबद के साथ कवर बर्तन।
  2. पूरा स्तरीकरण और तुल्यकालिक अंकुरण के लिए अनुमति देने के लिए 72 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बर्तन सेते हैं।
  3. मानक विकास की स्थिति के लिए बर्तन हस्तांतरण (12 घंटा प्रकाश/ 12 घंटा अंधेरे, 21 डिग्री सेल्सियस, प्रकाश की तीव्रता 100 μmol / 2 मीटर / सेकंड, सापेक्षिक आर्द्रता 40%) बीज अंकुरित करने के लिए अनुमति देने के लिए। पानी संक्षेपण से बचने में मदद मिलेगी, जो विकास के कमरे में, स्थानांतरण के बाद तुरंत खोलने में 2-3 से उत्पन्न करने के लिए गुंबद क्रैक।
  4. पहली सच पत्ती लंबाई में 2-3 मिमी के आकार तक पहुँच जाता है, फ्लैट मिट्टी से भरा एक 72 कुओं के लिए बर्तन से पौध।
    1. फ्लैट पर मिट्टी की सतह के बीच में एक 1-में गहरे अवसाद पैदा करने के लिए एक उंगली या एक 1 मिलीलीटर विंदुक टिप का उपयोग करें।
    2. धीरे जितना संभव हो कम जड़ क्षति के साथ अलग-अलग पौध अलग। ध्यान से संदंश के साथ बरकरार जड़ों की है कि पौध उठाओ।
    3. अवसाद में प्रत्यारोपण के सदमे को कम करने और धीरे अवसाद को भरने के लिए आसपास की जमीन के नीचे थपथपाना पालन मिट्टी पेड़ों का झुरमुट के साथ मिलकर एक एकल अलग अंकुर रखें। Biohazard अपशिष्ट कंटेनर में अतिरिक्त पौध और मिट्टी त्यागें और अनुसार निपटानेस्थानीय Biohazard अपशिष्ट निपटान के दिशा निर्देशों के साथ।
    4. पानी ऊपर से पौध का तबादला और पूरी तरह से 80-90% नमी बनाए रखने के लिए एक पानी का छिड़काव पारदर्शी गुंबद के साथ फ्लैट को कवर किया। उसके बाद 4 दिन की सुबह में गुंबद दरार और पूरी तरह से उस दिन के अंत तक इसे हटाने, 3 दिनों के लिए गुंबद पर रखें।
      नोट: बुवाई बीज वैकल्पिक फ्लैट मिट्टी से भरा एक 72 कुओं पर एक गिलास विंदुक के साथ 2-3 बीज के हस्तांतरण के द्वारा पीछा 4 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटे के लिए 1 मिलीलीटर 0.1% अगर युक्त 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में stratifying बीज के द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है। फ्लैट्स बेचने के अंकुरण के बाद एक सप्ताह से हटाया जा सकता है कि एक पारदर्शी गुंबद के साथ शामिल किया जाना चाहिए। अतिरिक्त पौध अच्छी तरह प्रति केवल एक अंकुर छोड़ने के लिए हटाया जा सकता है।
  5. 20 मिनट के लिए 1-पानी में फ्लैटों भिगोने से पानी के पौधों हर दो दिन में, तो अतिरिक्त पानी के निकास।
    नोट: पौधों को पानी के लिए समय अंतराल विकास कमरे में नमी पर निर्भर करता है और निर्धारित आधार होने की जरूरत हैउपयोगकर्ता के पौधों की वृद्धि की सुविधा के सतत अवलोकन पर घ। वे अच्छी तरह से पानी पिलाया जाता है सुनिश्चित करने के लिए दैनिक पौधों की जाँच करें। केवल कुछ धब्बे, पानी की एक धार की बोतल के साथ ऊपर से उन पौधों सूख रहे हैं।
  6. पर या विकास की स्थिति (फोटो पीरियड, तापमान) के आधार पर 3-5 सप्ताह पुराने मेल खाती है जो विकास के चरण # 3.50 (थाली के आकार है जब 50% अंतिम आकार), के पास हैं कि पौधों पर रोगज़नक़ संक्रमण assays (चरण 3-5) निष्पादित करें। फूलना उद्भव (चरण # 5) के कारण उम्र से संबंधित प्रतिरोध 38,39 की शुरुआत करने के बाद पौधों को संक्रमित नहीं है।

संस्कृति, मीडिया और प्लेट्स के 2. तैयारी

  1. राजा के बी (केबी) तरल माध्यम से 1 एल बनाओ। धीरे 1000 मिलीलीटर नहीं दिखाई गोली नहीं है 2 हे जब तक विआयनीकृत एच के साथ एक चुंबकीय हलचल पट्टी का उपयोग कर 20 ग्राम proteose peptone और 2 जी पोटेशियम फॉस्फेट द्विक्षारकीय trihydrate हलचल। एक 20 मिनट तरल चक्र पर 150 मिलीलीटर कांच की बोतलों में विभाज्य 100 मिलीलीटर और आटोक्लेव।
  2. तैयार करनाकेबी ठोस माध्यम से संस्कृति प्लेटों।
    1. धीरे 20 ग्राम Proteose Peptone, 2 ग्राम पोटेशियम फॉस्फेट Dibasic Trihydrate और 1000 मिलीलीटर के साथ 15 ग्राम अगर विआयनीकृत एच 2 ओ हलचल आटोक्लेव।
    2. यह भविष्य संक्षेपण को कम करने और एंटीबायोटिक दवाओं की गिरावट से बचने के छूने के लिए अच्छा है, जब तक एक चुंबकीय हलचल प्लेट पर मध्यम शांत हो जाओ। मध्यम करने के लिए 1 एम MgSO 4 बाँझ 18 मिलीलीटर बाँझ 80% ग्लिसरॉल और 5 मिलीलीटर जोड़ें। Psm ES4326 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता के लिए ठंडा मीडिया में स्ट्रेप्टोमाइसिन जोड़ने, स्ट्रेप्टोमाइसिन के खिलाफ प्रतिरोध किया जाता है यह देखते हुए कि - 1।
    3. प्लेटों डालो। 100 मिमी x 15 मिमी और 150 मिमी x 15 मिमी पेट्री डिश: केबी मीडिया प्लेटों के दो अलग अलग आकार तैयार करें। छोटे पेट्री डिश युक्त मध्यम प्राथमिक बैक्टीरिया संस्कृति की थाली के रूप में कार्य करता है, और बैक्टीरिया प्लेट गिनती के रूप में बड़ा पेट्री डिश में कार्य करता है।
      नोट: प्लेटें गिनती बैक्टीरिया के लिए, आयताकार के आकार प्लेटों को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकतादो बार के रूप में कई उपचार पारंपरिक दौर प्लेटों की तुलना में प्रति प्लेट साजिश रची जा सकता है, क्योंकि उपभोग्य लागत।
      1. संक्रमण प्रयोग करने से पहले प्लेटों डालो। स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट के बाद से 2-3 महीनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर केबी मध्यम प्लेटों धीरे-धीरे एंटीबायोटिक गतिविधि 40 खो देता है।

3. बढ़ी रोग संवेदनशीलता (ईडीएस)

  1. दिन 1 - थाली पर स्ट्रीक बैक्टीरिया
    1. दो दिन ईडीएस परख से पहले, लकीर Psm ES4326 से -80 सी ग्लिसरॉल स्टॉक ° एक KB-Strep जीवाणु कल्चर प्लेट पर और 24-48 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  2. दिन 2 - तरल संस्कृति और पानी पौधों आरंभ
    1. 28 ° सीओ / एन 1 स्ट्रेप्टोमाइसिन और 250 rpm पर हिला - 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम से युक्त 4 मिलीलीटर तरल केबी माध्यम के साथ एक बाँझ टेस्ट ट्यूब में तरल संस्कृति आरंभ।
      नोट: ईडीएस संक्रमण परख के लिए, जीनोटाइप की सिफारिश है प्रति 6 पौधों का उपयोगएड। एसटीआई और एमटीआई assays के लिए, इलाज के प्रति जीनोटाइप प्रति 6 पौधों की सिफारिश कर रहे हैं। बैक्टीरिया inoculum के लिए, यह 0.3 और 0.6 के बीच λ 600nm पर ऑप्टिकल घनत्व के साथ एक ताजा तरल संस्कृति का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है।
    2. मार्क नमूने में संक्रमित ऊतक की आसान पहचान के लिए एक कुंद अंत निविड़ अंधकार मार्कर के साथ पत्तियों नंबर 5 और 6 के डंठल (चित्रा 1)। रंध्र के उद्घाटन के अवसर बढ़ाने के लिए और पत्ती में रोगज़नक़ समाधान के प्रवेश द्वार की सुविधा, 20 मिनट के लिए नीचे से फ्लैट भिगोने से अच्छी तरह से पौधों को पानी, तो अतिरिक्त पानी के निकास।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, एक पारदर्शी गुंबद के साथ फ्लैट को कवर किया और रंध्र संबंधी उद्घाटन बढ़ाने के लिए 2-4 घंटे के लिए पानी में भिगो दें।
    3. दिन 3 - पैथोजन कमजोर पड़ने और सिरिंज घुसपैठ
      नोट: सुबह घंटों के दौरान पैथोजन संक्रमण अतिसंवेदनशील जीनोटाइप पर सबसे स्पष्ट बीमारी के लक्षण के रोगज़नक़ प्रसार और विकास के लिए इष्टतम है। संक्रमित रखने के लिए हर संभव प्रयास करेंलगातार आयन समय प्रयोगात्मक अनुकरण के बीच भिन्नता को कम करने में मदद करता है, जो circadian लय और प्रतिदिन जीन विनियमन 41,42 के प्रभाव को खत्म करने के लिए।
      1. आरटी पर 2 मिनट के लिए 9,600 XG पर एक microcentrifuge 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में जीवाणु संस्कृति गोली और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। बाँझ 10 के 1 मिलीलीटर मिमी 2 MgCl साथ बैक्टीरिया गोली Resuspend।
        नोट: मैगनीशियम फैटायनों पी की गतिशीलता और आसंजन वृद्धि कर सकते हैं syringae 43। वैकल्पिक रूप से, एक ही एकाग्रता में MgSO 4 का उपयोग करें। बाँझ पानी मिलीग्राम नमक समाधान के लिए एक स्वीकार्य विकल्प नहीं है।
      2. एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में 10 मिमी 2 MgCl के 9 मिलीलीटर के साथ बैक्टीरिया निलंबन पतला और λ = 600 एनएम पर एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ बैक्टीरिया के ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) को मापने। अंतिम ओवर ड्राफ्ट 600nm के लिए 10 मिमी 2 MgCl = ईडीएस संक्रमण परख के लिए 0.0002 साथ बैक्टीरिया पतला।
      3. पत्ती घुसपैठपतला बैक्टीरियल समाधान होता है कि (आमतौर पर इंसुलिन सिरिंज के रूप में जाना जाता है) एक 1 मिलीलीटर कुंद अंत needleless सिरिंज के साथ।
      4. अपनी पूरी क्षमता के लिए सिरिंज भर नहीं है। घुसपैठ की प्रक्रिया के दौरान एक बेहतर नियंत्रण के लिए अनुमति देने के लिए 0.5-0.6 मिलीलीटर के साथ इसे भरने के।
      5. तर्जनी के शीर्ष पर पत्ती की निचली सतह बेनकाब, और फिर धीरे अंगूठे की मदद से पत्ता स्थिति को समायोजित। दबाव है कि समान रूप से वितरित किया जाता है सुनिश्चित करने के लिए पत्ती की सतह के खिलाफ खड़ी सिरिंज स्थिति। पत्ती नुकसान को कम करने के लिए घुसपैठ के दौरान midrib क्षेत्र से बचने की कोशिश करें।
      6. धीरे धीरे बैक्टीरियल समाधान घुसपैठ करने के लिए सवार धक्का; गहरे रंग का पत्ता रंग से संकेत के रूप पत्ती पर्णमध्यक में तरल प्रविष्टि देखे जा जाएगा। पत्ती की पूरी सतह घुसपैठ करने का प्रयास। यह एक एकल प्रयास में पूरा नहीं होता है, तो एक और घुसपैठ स्थान का चयन करें और पूरी पत्ती की सतह कवर किया जाता है जब तक ऊपर वर्णित कार्यों को दोहराने।
      7. पूरा एक बार, धीरे अतिरिक्त रोगज़नक़ समाधान निकालने के लिए शोषक ऊतक के साथ पत्ती दाग। दिखने में क्षति के लिए संक्रमित पत्ता ऊतक का निरीक्षण किया।
        नोट: घुसपैठ पूर्ण होने के बाद परिपत्र सिरिंज छाप दिखाई नहीं होना चाहिए।
      8. उनके मूल विकास की स्थिति में उन्हें लौटने से पहले 1-2 घंटे के लिए शुष्क करने के लिए घुसपैठ पौधों छोड़ दें। इसके बाद, पानी के साथ एक स्पष्ट गुंबद स्प्रे और कवर संक्रमित पौधों 2 घंटे के लिए, तो खोलने में एक 2-3 पैदा करते हैं और संक्रमण प्रयोग के शेष के दौरान उस पर छोड़ने के लिए गुंबद दरार।
        नोट: पी के बाद से syringae ही सुविधा में उगाया अन्य पौधों को संक्रामक एजेंट फैलाने का कोई खतरा नहीं है, एक हवाई रोगज़नक़ नहीं है। हालांकि, एक जोड़ा एहतियात के रूप में, पास में स्थित संक्रमित पौधों और अन्य प्रयोगात्मक पौधों के बीच शारीरिक संपर्क से बचें। एक पारदर्शी गुंबद के साथ फ्लैट कवर रोगज़नक़ डाह बढ़ाने के लिए और रोग प्रगति को गति देगा।कवरिंग की अवधि के इस कदम और इष्टतम अवधि उपयोगकर्ता के पौधों की वृद्धि की सुविधा के आर्द्रता की स्थिति के आधार पर निर्धारित किया जाना चाहिए के लिए की जरूरत है।
    4. दिन 5 - मीडिया प्लेटों प्री-सूखी
      1. कोल्ड स्टोरेज यूनिट से 150 मिमी x 15 मिमी केबी प्लेटें ले लो और थाली पर किसी भी पूर्व मौजूदा पानी संक्षेपण सूखी। मोटे तौर पर 24 घंटे के लिए आरटी पर उन्हें रखने से सूखी प्लेटें। इस प्रक्रिया को तेज करने के लिए, 30-60 मिनट के लिए फटा उनकी पलकों के साथ एक लामिना का प्रवाह हुड में उन्हें जगह है।
        नोट: यह कदम अगले चरण में थाली की सतह पर परिपत्र छोटी बूंद के गठन के लिए महत्वपूर्ण है।
    5. दिन 6 - रोगज़नक़ विकास बढ़ाता
      नोट: निम्न रोगज़नक़ मात्रा का ठहराव प्रक्रिया बैक्टीरिया के बराबर मात्रा में पौधों के पत्ते आकृति विज्ञान बदल दिया है, खासकर जब पत्ती में वितरित कर रहे हैं पुष्टि करने के लिए संक्रमण के बाद पहले के समय बिंदुओं पर प्रदर्शन किया जा सकता है।
      1. उद्भव के बाद संक्रमित ऊतक प्रक्रियाहरिद्रोग के अतिसंवेदनशील जीनोटाइप में संक्रमित ऊतक की पीली ने संकेत दिया है, लेकिन परिगलित घावों के विकास (चित्रा 2 बी) के पहले।
        नोट: सुझाए गए नमूने समय तीन दिन रोगज़नक़ टीका के बाद है। रोगज़नक़ विकास पर्यावरणीय कारकों की एक संख्या पर निर्भर करता है लेकिन, जब से ऊष्मायन की लंबाई 2 साढ़े 3 आधा दिनों की एक सीमा के भीतर भिन्न है और उपयोगकर्ता के पौधों की वृद्धि की सुविधा में संक्रमण प्रगति से सावधान टिप्पणियों द्वारा निर्धारित किए जाने की जरूरत हो सकती है।
        1. प्रत्येक जीनोटाइप (चित्रा 1) के लिए 6 पीस ट्यूबों तैयार। एक स्टेनलेस स्टील पीस गेंद प्लेस और प्रत्येक ट्यूब में 10 मिमी 2 MgCl बाँझ 500 μl जोड़ें।
        2. संयंत्र से संक्रमित पत्ती को अलग करें और एक 1-छेद कागज पंच (चित्रा 1) के साथ एक पत्ता डिस्क पंच।
          नोट: नमूना त्रुटि को कम से कम एक ही स्थिति में प्रत्येक नमूना पत्ती पंच के लिए प्रयास करें। ऊपर से पत्ता डिस्क की सैम्पलिंगपत्ती की सिफारिश की है।
        3. बेतरतीब ढंग से संदंश का उपयोग कर प्रत्येक पीस ट्यूब में (दो अलग पौधों से) 2 पत्ता डिस्क जगह है।
        4. ट्यूब को सील करने और 10 मिनट के लिए अधिकतम गति से एक उच्च throughput homogenizer (प्रति मिनट 1,600 स्ट्रोक) के साथ ऊतक homogenize। ऊतक अच्छी तरह से homogenized है और समाधान की वजह से संक्रमित पत्तियों से क्लोरोफिल रिहाई के लिए हरे रंग की बारी है, जब तक की जरूरत है तो इस प्रक्रिया को दोहराएं।
      2. Homogenization के लिए इंतजार करते हुए, एक मल्टी चैनल पिपेट और एक pipetting जलाशय का उपयोग कर 180 μl 10 मिमी 2 MgCl के साथ एक 96 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली के पहले 6 पंक्तियों को भरने।
      3. पीसने के बाद, 96 अच्छी तरह से थाली की पहली पंक्ति में जमीन ऊतक निलंबन के 20 μl हस्तांतरण और तरल ऊपर और नीचे pipetting दोहराया द्वारा मिश्रण। ऊतक के छोटे टुकड़े टिप को रोकना है, तो समाधान का सही मात्रा प्राप्त करने में मदद करने के लिए 2-3 मिमी से यह क्लिप।
        1. शीर्ष ओ पर छोटी बूंद के लिए पर्याप्त जगह उपलब्ध कराने के लिएप्लेट, अंतरिक्ष वैकल्पिक पंक्तियों में अलग जीनोटाइप से ऊतक (चित्रा 1) च। एक दस गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने को तैयार करने के लिए, दूसरी पंक्ति में 20 μl तरल हस्तांतरण और छठे कमजोर पड़ने जब तक इस प्रक्रिया को दोहराने।
      4. स्थानांतरण विभाजित पिपेट टिप्स (चित्रा 1) का उपयोग कर 150 मिमी x 15 मिमी केबी थाली पर 96 अच्छी तरह से थाली से समाधान के 20 μl। सबसे केंद्रित करने के लिए सबसे पतला निलंबन से काम करते हैं।
        नोट: सबसे केंद्रित करने के लिए पतला सबसे से कार्यवाही यह अनावश्यक dilutions के बीच पिपेट युक्तियों को बदलने के लिए बनाता है। प्लेट अच्छी तरह से पूर्व सूख जाता है तो (आमतौर पर 15-30 मिनट) अवशोषित जब तक तबादला छोटी बूंद माध्यम के शीर्ष पर बरकरार रहना चाहिए। सुखाने समय आर टी और नमी के साथ बदलता रहता है।
      5. ढक्कन फटा साथ आरटी पर थाली सूखी। कोई और अधिक तरल प्लेट की सतह पर मनाया जा सकता है एक बार, ढक्कन, पलटना को बंद करने और आरटी पर प्लेट या एक 28 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर सेते हैं।
      6. कालोनियों दिखाई देने लगते हैं, जब तक 40-60 घंटे के लिए प्लेटें सेते हैं। प्लेटों पर विकास इकाइयों (CFU) के गठन कॉलोनी में उम्मीद के मुताबिक 10 गुना ड्रॉप (चित्रा -2) को दर्शाता है कि पुष्टि करें। वे अधिक बढ़ना और कालोनियों फ्यूज से पहले बैक्टीरिया की गणना करें। ओवरलैपिंग कालोनियों के पास नहीं है कि सबसे कम कमजोर पड़ने में जीवाणुओं की संख्या निर्धारित है। आमतौर पर, वरीय कमजोर पड़ने 10-50 कालोनियों के बीच में शामिल होंगे गिना जा।
        नोट: रूपांतर तकनीकी प्रतिकृति के बीच में मौजूद हो सकता है; इसलिए, प्रत्येक को दोहराने के लिए न्यूनतम कमजोर पड़ने अलग से निर्धारित किया जाना चाहिए।
      7. जीवाणु प्रसार के स्तर की गणना करने के लिए, पंक्ति (आर) के साथ ही लेखन में एक तकनीकी दोहराने (टी) के भीतर जीवाणुओं की संख्या की संख्या दस्तावेज़। कॉलोनी बनाने यूनिट की संख्या का निर्धारण - सूत्र के माध्यम से CFU / पत्ती डिस्क: CFU / पत्ती डिस्क = (टी × 10 आर / 20) 500/2 ×
      8. Produ के लिए निम्न स्प्रेडशीट टेम्पलेट में डेटा प्रकारएक ग्राफ (चित्रा 1) सीई (स्प्रेडशीट डेटा विश्लेषण टेम्पलेट फ़ाइल के लिए, 2 टेबल देखें)। प्रत्येक डेटा बिंदु एक लघुगणकीय पैमाने पर छह तकनीकी प्रतिकृति की मतलब के रूप में प्रतिनिधित्व किया है। त्रुटि सलाखों मतलब की 95% विश्वास अंतराल प्रतिनिधित्व (एन = 6)।
        नोट: 95% विश्वास अंतराल की गणना तकनीकी प्रतिकृति की संख्या के आधार पर समायोजित करने की जरूरत है।

4. SA-उत्प्रेरित प्रतिरक्षण (एसटीआई)

  1. दिन 1: 3.1 कदम के रूप में वर्णित एक ही प्रक्रिया का पालन करें।
  2. दिन 2: तरल जीवाणु संस्कृति (3.2 कदम) पौधों को पानी और शुरुआत करने के अलावा, एसए व्युत्पन्न सोडियम सैलिसिलेट 21 की बाहरी आवेदन के द्वारा प्रतिरोध प्रेरित।
    नोट: शुद्ध एसए गरीब पानी घुलनशीलता है और पूर्व पीएच समायोजन की आवश्यकता है, इस प्रकार यह इस परख के लिए अनुशंसित नहीं है।
    1. पी के खिलाफ एसए की मध्यस्थता गढ़ प्रेरित करने के लिए syringae और भविष्य के संक्रमण से 21 के लिए प्रधानमंत्री पौधों,(नकली) के रूप में एक ठीक 1 मिमी सोडियम सैलिसिलेट की धुंध या एच 2 ओ के साथ 24, स्प्रे पौधों रोगज़नक़ संक्रमण से पहले 16-24 ज।
  3. दिन 3: = आयुध डिपो 600nm करने के लिए 0,001 रोगज़नक़ कमजोर पड़ने को तैयार है और सिरिंज घुसपैठ (3.3 कदम) द्वारा पूरे पत्ती की सतह में बैक्टीरिया धक्का।
  4. दिन 6: ईडीएस परख (कदम 3.4 और 3.5) के लिए के रूप में वर्णित रोगज़नक़ मात्रा का ठहराव और गिनती की प्रक्रिया के लिए, प्रक्रिया का पालन करें। प्लेट और गिनती एच 2 हे और सोडियम सैलिसिलेट - अलग pretreated नमूने हैं। Pretreated पौधों - जंगली प्रकार एराबिडोप्सिस के लिए, रोगज़नक़ विकास में 1-2 लॉग कमी सोडियम सैलिसिलेट में होने की उम्मीद है।

5. MAMP-उत्प्रेरित प्रतिरक्षण (एमटीआई)

नोट: इस परख में, हम एराबिडोप्सिस जंगली प्रकार कर्नल -0 और उत्परिवर्ती fls2 और ईएफआर पौधों का उपयोग करें। FLS2 और ईएफआर प्लाज्मा झिल्ली स्थानीय पैटर्न पहचान रिसेप्टर्स (PRRS) flg22 और elf18 को पहचान सकते हैं कि, respe हैंctively 9,10। Psm ES4326 के साथ बाहरी MAMP पूर्व उपचार और सिरिंज घुसपैठ निम्नलिखित उत्परिवर्ती में अनछुए रोगज़नक़ विकास ने संकेत दिया है जो MAMP के विशिष्ट प्रकार, असंवेदनशीलता में प्रत्येक PRR परिणामों की हानि।

  1. दिन 1 और 2: चरण 3.1 और 3.2 में वर्णित के रूप में एक ही प्रक्रिया का पालन करें।
  2. दिन 3: MAMP पूर्व उपचार और पैथोजन संक्रमण
    1. , MAMP-उत्प्रेरित प्रतिरक्षण स्थापित flagellin मिलान flg22 या एफई-टू मिलान elf18 और 1 माइक्रोन समाधान तैयार करने के लिए रोगज़नक़ संक्रमण (कदम 3.3.3-3.3.6) से पहले पूरे पत्ती की सतह 4 घंटे में यह सिरिंज-घुसपैठ। यह पी के खिलाफ MAMP की मध्यस्थता गढ़ की प्रेरण के लिए अनुमति देगा syringae और प्रधानमंत्री भविष्य संक्रमण 6,37 के लिए पौधों।
      नोट: सार्वजनिक रूप से उपलब्ध माइक्रोएरे डेटा flg22 या elf18 उपचार 37,44 के बाद 4 घंटे होता MAMP जिम्मेदार जीन की अधिकतम ट्रांसक्रिप्शनल reprogramming का पता चला। इस प्रकार, 4 घंटा की सिफारिश की हैकर्नल -0 MAMP का इलाज और fls2 और ईएफआर म्यूटेंट के बीच रोगज़नक़ विकास में एक स्पष्ट अंतर को प्राप्त करने में यह परिणाम है कि MAMP पूर्व उपचार की अवधि।
    2. शोषक ऊतक के साथ अतिरिक्त MAMP समाधान निकालें और पत्ती के भीतर तरल अवशोषण की प्रक्रिया को तेज करने के लिए खुला पौधों छोड़ दें। सिरिंज दबाव घुसपैठ से घायल हो गए प्रभाव के लिए खाते में करने के लिए, नियंत्रण पौधों की पत्तियों में एच 2 ओ घुसपैठ।
    3. आयुध डिपो 600nm को रोगज़नक़ कमजोर पड़ने को तैयार = 0.001 और MAMP / एच 2 ओ पूर्व इलाज सिरिंज घुसपैठ से पत्ती (3.3 कदम) की पूरी पत्ती की सतह में बैक्टीरिया धक्का।
  3. दिन 6: 3.4 कदम और 3.5 में वर्णित के रूप में रोगज़नक़ मात्रा का ठहराव और गिनती की प्रक्रिया के लिए, प्रक्रिया का पालन करें। प्लेट और अलग से एच 2 हे और MAMP-pretreated नमूने गिनती। जंगली-प्रकार में एराबिडोप्सिस, रोगज़नक़ विकास में 1-2 लॉग कमी कुछ हद तक मजबूत के साथ, MAMP-pretreated पौधों में होने की उम्मीद हैflg22 द्वारा मध्यस्थता एर कमी elf18 की तुलना में।

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Representative Results

हम यहाँ वर्णन प्रोटोकॉल एक अनुकूलित पी का प्रतिनिधित्व करता है syringae सिरिंज घुसपैठ परख मात्रात्मक Arabidopsis पौधों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए। चित्रा 1 में सचित्र, पी एस एम ES4326 की सिरिंज घुसपैठ धारावाहिक dilutions और कालोनियों गणन के माध्यम से रोगज़नक़ निकासी और मात्रा का ठहराव के बाद है।

प्रोटोकॉल पाठ के भीतर चरण 3 में वर्णित है, पी एस एम ES4326 के खिलाफ बढ़ी रोग संवेदनशीलता (ईडीएस) आयुध डिपो = 0.0002 के साथ एक inoculum के साथ संक्रमण द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। 3 चित्र में दिखाया गया है, अत्यधिक अतिसंवेदनशील npr1-1 म्यूटेंट जंगली प्रकार कर्नल -0 संयंत्रों की तुलना में लगभग 2.5 लॉग (300 बार) अधिक रोगज़नक़ विकास किया है। प्रयोगात्मक शर्तों पर निर्भर करता है, npr1-1 पौधों 1.5-2.5 लॉग की सीमा के भीतर सबसे आम परिणामों के साथ, कर्नल-0 से 3.0 लॉग करने के लिए और अधिक बैक्टीरिया विकास के लिए समर्थन कर सकते हैं। इसलिए, इस ईडीएस गधाप्र शोधकर्ताओं संभावित संयंत्र प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में शामिल उम्मीदवार जीन की पहचान करने के लिए उनके एराबिडोप्सिस म्यूटेंट और ट्रांसजेनिक्स जगह करने में सक्षम हो सकता है, जो में अंतर का एक व्यापक खिड़की प्रदान करता है।

ईडीएस का निर्धारण करने के लिए इसके अलावा, पी एस एम ES4326 सिरिंज घुसपैठ परख प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के विभिन्न परतों काटना करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। चिरायता एसिड-उत्प्रेरित प्रतिरक्षण का मूल्यांकन करने के लिए, रासायनिक सोडियम सैलिसिलेट के बाहरी आवेदन रोगज़नक़ विकास (चित्रा 4 ए) द्वारा मात्रा निर्धारित है जो प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, गति प्रदान करने के लिए प्रयोग किया जाता है। SA-निर्भर लक्ष्य जीन के एसए रिसेप्टर और प्रमुख ट्रांसक्रिप्शनल सह नियामक के रूप में कार्य करता है जो NPR1 की हानि, चिरायता एसिड व्युत्पन्न की बहिर्जात आवेदन करने के लिए असंवेदनशीलता की ओर जाता है। एसए करने के लिए इस असंवेदनशीलता कर्नल -0 पौधों में एक उल्लेखनीय कमी के विपरीत npr1-1 सोडियम सैलिसिलेट पूर्व इलाज के पौधों में अनछुए रोगज़नक़ विकास (20 गुना कम pathog द्वारा प्रदर्शन किया है सोडियम सैलिसिलेट आवेदन पर एन) (चित्रा 4 बी)।

चित्रा 5 ए में प्रदर्शन के रूप flg22 या elf18 साथ MAMP-उत्प्रेरित प्रतिरक्षण, पूर्व उपचार को चिह्नित करने के लिए किया गया था। Flagellin ट्रिगर उन्मुक्ति को चिह्नित करने के लिए, कर्नल -0 और fls2 उत्परिवर्ती पौधों का इस्तेमाल कर रहे हैं। FLS2, एक झिल्ली स्थानीय रिसेप्टर की तरह काइनेज, flg22 पहचानता है और एमटीआई 9 से चलाता है। चित्रा 5 ब में प्रदर्शन के रूप fls2 उत्परिवर्ती पौधों बैक्टीरिया विकास प्रतिबंध प्रभाव को गति प्रदान करने में विफल रहा है, जबकि flg22 इलाज कर्नल -0 पौधों, एक ~ 1 लॉग (10 बार) बैक्टीरियल आबादी में कमी का समर्थन किया। इसी तरह, ईएफआर उत्परिवर्ती पौधों में एफई-तू रिसेप्टर ईएफआर के नुकसान elf18 पूर्व उपचार (चित्रा 5 ब) निम्नलिखित अनछुए रोगज़नक़ विकास द्वारा प्रदर्शन के रूप में पूर्व उपचार elf18 को असंवेदनशीलता की ओर जाता है।

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Arabidopsis पौधों पर Psm ES4326 सिरिंज घुसपैठ परख की चित्रा 1. योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। नंबर 5 और वयस्क मिट्टी देसी Arabidopsis पौधों के 6 चिह्नित और सिरिंज घुसपैठ के माध्यम से Psm ES4326 से संक्रमित हैं बचता है। रोग के लक्षण सामने आने के बाद, ऊतक homogenization के लिए पत्ते और फसल पत्ता डिस्क अलग। खैर-homogenized ऊतक क्रमानुसार प्लेट गिनती एक बैक्टीरिया पर स्थानांतरित करने से पहले 96 अच्छी तरह से प्लेट में पतला है। प्लेट पर कालोनियों उद्भव के बाद, बैक्टीरिया की संख्या गिनती और एक ग्राफ उत्पन्न करने के लिए डेटा की प्रक्रिया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
ईडीएस परख की 2. प्रतिनिधि प्रक्रियाओं चित्रा।(ए) बर्तन बीज बोने के बाद एक पानी का छिड़काव पारदर्शी गुंबद के साथ कवर कर रहे हैं। (बी) के प्रतिनिधि लक्षण कर्नल -0 और ईडीएस परख के अधीन npr1-1 पत्तियों (आयुध डिपो 600nm = 0.0002) पर 3 दिन टीका पोस्ट। Npr1-1 पर गंभीर हरिद्रोग और कर्नल-0 के लगभग सामान्य उपस्थिति पर ध्यान दें। (सी) केबी पर बढ़ती Psm ES4326 के सीरियल dilutions मीडिया प्लेट (/ एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन 50 ग्राम) के बाद ~ ऊष्मायन के 45 घंटा। पांच dilutions दिखाई दे रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
ईडीएस परख की चित्रा 3. प्रतिनिधि परिणाम Psm ES4326 विकास (कॉलोनी बनाने इकाइयों -। CFU / पत्ती डिस्क, ऍक्स्पएक लॉग पैमाने पर ressed) 4 सप्ताह पुराने कर्नल -0 और npr1-1 पौधों में मात्रा निर्धारित किया गया था, 3 दिन) आयुध डिपो 600nm = 0.0002 (टीका पोस्ट। त्रुटि सलाखों मतलब की 95% विश्वास अंतराल प्रतिनिधित्व (एन = 6)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. प्रतिनिधि प्रक्रिया और एसटीआई परख का परिणाम है। (ए) चिरायता एसिड-उत्प्रेरित प्रतिरक्षण की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व (एसटीआई) परख। (बी) चिरायता एसिड-उत्प्रेरित प्रतिरक्षण पौधों में रोगज़नक़ विकास पर आधारित मात्रा निर्धारित किया गया था, 1mm के साथ पूर्व इलाज सोडियम सैलिसिलेट या एच 2 ओ 16 घंटा से पहले Psm को ES4326 सिरिंज घुसपैठ (आयुध डिपो 600nm = 0.001)। पैथोजन विकास 3 मात्रा निर्धारित किया गया था,दिनों टीका पोस्ट। त्रुटि सलाखों मतलब की 95% विश्वास अंतराल प्रतिनिधित्व (एन = 6)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. प्रतिनिधि प्रक्रिया और एमटीआई परख का परिणाम है। (ए) MAMP-उत्प्रेरित प्रतिरक्षण की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व (एमटीआई) परख। (बी) एमटीआई पौधों 2 हे 4 एच (नियंत्रण) से पहले Psm को flg22, elf18 या एच के 1μM समाधान के साथ पूर्व इलाज में रोगज़नक़ विकास द्वारा मात्रा था ES4326 सिरिंज घुसपैठ (आयुध डिपो 600 एनएम = 0.001)। पैथोजन विकास 3 दिन टीका पोस्ट मात्रा निर्धारित किया गया था। त्रुटि सलाखों (एन = 6)। मतलब की 95% विश्वास अंतराल प्रतिनिधित्व करते हैं वह क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कर रहे हैं।

मुद्दा संभावित कारण अनुशंसित क्रियाएँ
हे / एन संस्कृति के बाद तरल माध्यम में कोई बैक्टीरिया विकास से कम बैक्टीरिया गतिविधि एक नव रेखादार थाली से तरल संस्कृति आरंभ
परिपत्र सिरिंज छाप सिरिंज घुसपैठ के बाद पत्ते पर प्रस्तुत करता है घुसपैठ के दौरान बहुत अधिक दबाव घुसपैठ के दौरान pressue में कमी
आंशिक सिरिंज छाप सिरिंज घुसपैठ के बाद पत्ते पर प्रस्तुत करता है सिरिंज के अनुचित स्थिति सिरिंज समायोजित पत्ती की सतह के खिलाफ खड़ी तैनात करने के लिए
पत्ता मुरझा जाती घुसपैठ के बाद कुछ ही घंटों के wthtin बहुत ज्यादा रोगज़नक़ समाधान पत्ती में घुसपैठ की है बंद करो infपूरे पत्ती की सतह के तुरंत बाद iltrating गहरे रंग में हरे रंग बदल जाता है
कोई रोग के लक्षणों को तीन दिन के संक्रमण के बाद रोगज़नक़ पैदा करना के लिए नमी बहुत कम है संक्रमित पौधों रखा जाता है, जहां नमी को बढ़ाने
पैथोजन पर या 3 डीपीआई से पहले necrotrophic चरण में प्रवेश करती है रोगज़नक़ समाधान का गलत एकाग्रता उपयोग आयुध डिपो 600nm = ईडीएस परख के लिए 0.0002; indepedent स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कमजोर पड़ने की पुष्टि
बूंदों प्लेट गिनती बैक्टीरिया के शीर्ष पर विलय प्लेट गिनती बैक्टीरिया उचित रूप से सूख नहीं है प्री-सूखी थाली हे / एन उपयोग करने से पहले
पैथोजन कमजोर पड़ने 10 गुना कमी का प्रतिनिधित्व नहीं करता कमजोर पड़ने सही ढंग से नहीं किया जाता है तरल स्थानांतरित करने के लिए एक अच्छी तरह से calibrated मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग करें; सभी तरल तिरस्कृत है कि इस बात की पुष्टि
जंगली प्रकार में पैथोजन विकास 8 लॉग CFU / पत्ती डिस्क से अधिक संक्रमित ऊतक के भीतर पैथोजन overgrew - बहुत देर हो चुकी प्रदर्शन नमूना नमूना हरिद्रोग के उद्भव के बाद ऊतक संक्रमित
तकनीकी प्रतिकृति के बीच में बड़ा बदलाव पौधे ही विकास के चरण में नहीं हैं या घुसपैठ की पत्ती नंबर असंगत है केवल संक्रमण के लिए एक ही विकास मंच के भीतर पौधों का उपयोग करें। तुल्यकालिक अंकुरण की पुष्टि करें। विभिन्न पौधों के बीच लगातार पत्ती संख्या को संक्रमित

सिरिंज घुसपैठ परख की तालिका 1. समस्या निवारण।

तालिका 2 को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

रोगज़नक़ विकास डेटा का सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए तालिका 2 स्प्रेडशीट।

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Discussion

जनसंख्या उपलब्ध खेत में कमी के साथ बढ़ रही है, दुनिया भर के शोधकर्ताओं फसल सुधार के लिए अहम जरूरतों के साथ चुनौती दी है। उपज बहुत विभिन्न जैविक और अजैविक दबावों से प्रभावित किया जा सकता है। उनमें से, रोगज़नक़ संक्रमण अकेले 45 अमेरिका में लगभग 12% नुकसान के लिए जिम्मेदार फसल की उपज में कमी के प्रमुख कारणों में से एक है। इस समस्या को हल करने के लिए, बड़े पैमाने पर अनुसंधान मॉडल एराबिडोप्सिस में आयोजित किया गया है - पी syringae pathosystem व्यापक घटकों और संयंत्र प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए नियामक तंत्र को चिह्नित करने के लिए। यहाँ, हम एक अनुकूलित पी पेश syringae ES4326 सिरिंज घुसपैठ परख मात्रात्मक पूरे संयंत्र स्तर पर संयंत्र प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में सूक्ष्म अंतर का आकलन करने के लिए।

कई रोगज़नक़ संक्रमण assays संयंत्र प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 29,35 को चिह्नित करने के लिए विकसित किया गया है, सिरिंज घुसपैठ प्रदान करता हैरोगज़नक़ के बराबर मात्रा में संक्रमित ऊतक में प्रशासित रहे हैं, जहां एक अच्छी तरह से नियंत्रित प्रणाली। डुबकी टीका और स्प्रे टीका सहित अन्य संक्रमण assays में, रोगज़नक़ बीजपत्र सहित पूरे हवाई ऊतकों को लागू किया जाता है के रूप में अच्छी तरह से सच के रूप में 34 छोड़ देता है। यह ecotype लैंड्सबर्ग erecta (एल ईआर) से बीजपत्र बहुत अधिक अतिसंवेदनशील डेटा तिरछा और समग्र रोग प्रतिरोध 34 पर गलत निष्कर्ष करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं जो डुबकी टीका परख के दौरान रोगज़नक़, करने के लिए कर रहे हैं कि सूचना दी गई है। इसके अलावा, दो ऊपर उल्लिखित assays नमी और प्रकाश सहित विभिन्न पर्यावरणीय कारकों, द्वारा नियंत्रित किया जाता है, जो रंध्र, के माध्यम से पत्ती दर्ज करने के लिए रोगज़नक़ की आवश्यकता होती है। इन कारकों की अस्थिरता सिरिंज घुसपैठ परख 35 की तुलना में इस रोग के लक्षणों में बदलाव की एक उच्च स्तर के लिए योगदान देता है। वैक्यूम घुसपैठ के लिए, मुख्य कमियां रोगज़नक़ समाधान, कठिनाई के बड़ी मात्रा के लिए आवश्यकता शामिलप्रभावी रूप से क्षति से बचने, जबकि सभी पत्ते घुसपैठ, और काफी श्रम तीव्रता से 29। इसके अलावा, स्प्रे, डुबकी या वैक्यूम टीका से संक्रमित पौधों पूरे अंकुर रोगज़नक़ से संक्रमित है के बाद से उबरने के लिए कम संभावना है। अन्य विधियों के कई सीमाओं को देखते हुए, सिरिंज घुसपैठ परख मज़बूती से सच पत्ती के भीतर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को चिह्नित करने के लिए एक समान है और बहुत ही उम्मीद के मुताबिक रोग प्रगति और रोगज़नक़ की सही मात्रा का ठहराव प्राप्त करने के लिए पसंद की विधि बनी हुई है। इसके अलावा, इस परख आसानी MAMP-उत्प्रेरित प्रतिरक्षण और प्रणालीगत अधिग्रहण प्रतिरोध को चिह्नित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। कि इसके अलावा, तकनीक के भविष्य के आवेदनों का वादा संयंत्र प्रतिरक्षा संकेतन नेटवर्क की विभिन्न परतों काटना या प्रतिरक्षा संयंत्र में एक विशिष्ट मार्ग की भूमिका की पहचान करने के लिए रोगज़नक़ सिरिंज घुसपैठ के द्वारा पीछा कई phytohormones, रसायन या अवरोधकों पूर्व उपचार के परीक्षण के प्रभाव के लिए लागू किया जा सकता है प्रतिक्रिया। संक्रमण वाईबढ़ी रोग प्रतिरोध (EDR) परीक्षण के रूप में जाना जाता है पूर्व उपचार, भड़काना किसी भी रक्षा के अभाव में रोगज़नक़ (आयुध डिपो 600nm = 0.001) की एक वृद्धि की खुराक वें, म्यूटेंट की पहचान या करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि इस पद्धति का एक और उपयोगी संशोधन है बढ़ाया रोग प्रतिरोध के साथ ट्रांसजेनिक्स।

यह रोगज़नक़ रंध्र के माध्यम से पत्ती के ऊतकों में सीधे दिया है के बाद से सिरिंज घुसपैठ परख रक्षा प्रतिक्रिया के प्री-इनवेसिव चरण के लक्षण वर्णन करने के लिए लागू नहीं होता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए। रोगज़नक़ प्रवेश द्वार के लिए शारीरिक बाधा के रूप में कार्य करता है जो रंध्र बंद, अक्सर MAMP-उत्प्रेरित प्रतिरक्षण 46 की स्थापना पर रोगज़नक़ प्रवेश को प्रतिबंधित करने के लिए शुरू हो रहा है। इसके अलावा, phytohormone abscisic एसिड पूर्व आक्रामक चरण 47 के दौरान रंध्र बंद करने के लिए योगदान देता है। इसलिए, छिड़काव या सूई तरीकों जुड़े निरंतर बावजूद, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के रंध्र संबंधी परत को चिह्नित करने के लिए फायदेमंद साबित हो सकता हैinoculations के उन प्रकार के साथ, 29 से ऊपर चर्चा की।

संयंत्र रोगज़नक़ बातचीत विभिन्न जैविक और अजैविक कारकों द्वारा बदला जा सकता है, यह सफल संक्रमण को प्राप्त करने और विश्वसनीय outputs के प्राप्त करने के लिए प्रोटोकॉल में नीचे सूचीबद्ध महत्वपूर्ण कदम पर ध्यान केंद्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है:

संयंत्र की स्थिति और बैक्टीरिया गतिविधि

Arabidopsis पौधों को आसानी से उप इष्टतम तापमान, सूखे और आसमाटिक तनाव सहित विभिन्न अजैविक कारकों से जोर दिया, और प्रतिरक्षा उत्पादन 48 के साथ हस्तक्षेप कि सेलुलर प्रतिक्रियाओं को गति प्रदान की जा सकती है। इसलिए, यह इष्टतम विकास शर्तों के तहत पौधों को विकसित करने और पर्यावरण के तनाव से बचाने के लिए महत्वपूर्ण है। संक्रमित पत्ती के विकास के चरण भी प्रयोगात्मक परिणाम बदल सकता है क्योंकि इसके अलावा, यह लगातार कलाकृतियों से बचने के पत्ते नंबर 5 और 6 को संक्रमित करने के लिए आवश्यक है। विकास के चरणों के साथ चल रहा, ऊंचा फिर सेकुछ उग्र और असंक्रामक रोगजनकों के खिलाफ sistance Arabidopsis पौधों की प्रजनन चरण के लिए वनस्पति चरण से संक्रमण के साथ संबद्ध है। विकास मंच के ऊपर इस गतिशील प्रतिरोध (एआरआर) 38 आयु से संबंधित प्रतिरोध करार दिया है। सच प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के साथ एआरआर हस्तक्षेप से बचने के लिए, यह प्रोटोकॉल में संकेत के रूप में सही विकास के चरण में संक्रमण प्रदर्शन और प्रजनन चरण की शुरुआत के बाद संक्रमण प्रयोगों प्रयास से परहेज करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, बैक्टीरियल फिटनेस और गतिविधि काफी संक्रमित ऊतक के भीतर रोगज़नक़ प्रसार प्रभावित करते हैं। इस प्रकार, यह अधिक नहीं 2 दिन पुरानी है कि एक हौसले से परेशान संस्कृति की थाली से बैक्टीरियल तरल संस्कृति आरंभ करने के लिए महत्वपूर्ण है।

सिरिंज घुसपैठ कौशल

सिरिंज घुसपैठ के दौरान अच्छी तरह से हस्तक्षेप करने के लिए जाना जाता है प्रभाव लोग घायल हो गए, क्योंकि पत्ती के लिए किसी भी शारीरिक क्षति से बचने की कोशिशएसए ट्रिगर रक्षा को दबा सकते हैं कि मुख्य रूप से jasmonic एसिड की मध्यस्थता संकेतन के माध्यम से संयंत्र प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, 49 रास्ते। संक्रमण के बाद, घुसपैठ की थी कि एक पत्ता पूरी तरह से किसी भी दृश्य क्षति के बिना सामान्य शारीरिक रूप से ठीक करना चाहिए। शुरुआती के लिए यह पहला Psm ES4326 सिरिंज घुसपैठ परख प्रदर्शन से पहले गैर प्रायोगिक पौधों का उपयोग कर इस तकनीक का अभ्यास करने की सलाह दी है।

पैथोजन निकासी और कमजोर पड़ने

सही रूप में रोगज़नक़ विकास को मापने के लिए, यह कुशलता से संक्रमित संयंत्र के ऊतकों के बाहर रोगज़नक़ निकालने के लिए महत्वपूर्ण है। अन्य निष्कर्षण तरीकों के साथ तुलना में, उच्च throughput homogenizers के माध्यम से यांत्रिक ऊतक homogenization प्रभावी ढंग से ऊतक का नमूना और पार संदूषण की हानि के बिना रोगज़नक़ निकालता है। बाद में, नमूना dilutions ठीक pipetting त्रुटि को कम करने के लिए एक मज़बूती से calibrated मल्टी चैनल विंदुक के साथ बाहर किया जाना चाहिए।कमजोर पड़ने की प्रक्रिया में ± 1 μl रोगज़नक़ विकास मात्रा का ठहराव में एक ~ 5% अंतर में अनुवाद होगा के रूप में छोटे विचलन। सिरिंज घुसपैठ परख की अधिक समस्या निवारण उदाहरण के लिए, 1 टेबल देखें।

अंत में, हम मात्रात्मक और मज़बूती से संयंत्र प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का आकलन करने के एराबिडोप्सिस पर अनुकूलित Psm ES4326 सिरिंज घुसपैठ परख का वर्णन है। इस pathosystem की मदद के साथ, संयंत्र रोगज़नक़ बातचीत की समझ प्रयोगशाला में त्वरित किया जाएगा और अंत में क्षेत्र में फसल सुरक्षा के लिए लागू किया जा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MetroMix 360  Grosouth SNGMM360
Large pots Grosouth TEKUVCC10TC
12 x 6 Inserts Grosouth LM1206
11x 21 Flats with no holes Grosouth LM1020
11x 21 Flats with holes Grosouth LM1020H
Vinyl propagation domes Grosouth CW-221
Proteose Peptone Fisher Scientific DF0122-17-4
Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate  MP Biomedicals 151946
Agar  Fisher Scientific A360-500
Streptomycin sulfate Bio Basic Inc SB0494
100 x 15 mm Petri dishes Fisher Scientific FB0875713
150 x 15 mm Petri dishes Fisher Scientific R80150
Rectangular plate Fisher Scientific 12-565-450 
MgCl2 Hexahydrate Bio Basic Inc MB0328
Glycerol Bio Basic Inc GB0232
MgSO4  Bio Basic Inc MN1988
1 ml syringe Fisher Scientific NC9992493 
Kimwipe Fisher Scientific 06-666-A
Grinding tubes  Denville Scientific B1257
Caps for grinding tubes Denville Scientific B1254
Stainless steel grinding ball Fisher Scientific 2150
96-well plate  Fisher Scientific 12-556-008
Sodium Salicylate Sigma Aldrich s3007-1kg
flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA) Genescript Made to order
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) Genescript Made to order
Hole puncher Staples 146308
Biophotometer plus Eppendorf 952000006
PowerGen High-Throughput Homogenizer Fisher Scientific 02-215-503
Accu spin micro centrifuge Fisher Scientific 13-100-675
Multichannel pipette (10-100 µl) Eppendorf 3122 000.043
Multichannel pipette (30-300 µl) Eppendorf 3122 000.060
Pipette (20µl) Eppendorf 3120 000.038
Pipette tips Fisher Scientific 3552-HR
Sharpie permanent marker Staples 507130
1.5 ml tube Eppendorf 22363204
Forceps Fisher Scientific 08-890

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References

  1. Glazebrook, J. Contrasting mechanisms of defense against biotrophic and necrotrophic pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 43, 205-227 (2005).
  2. Hammond-Kosack, K. E., Jones, J. D. Plant disease resistance genes. Annual review of plant biolog. 48, 575-607 (1997).
  3. Pontier, D., Balague, C., Roby, D. The hypersensitive response. A programmed cell death associated with plant resistance. C R Acad Sci II. 321, 721-734 (1998).
  4. Ryals, J. A., et al. Systemic Acquired Resistance. Plant Cel. 8, 1809-1819 (1996).
  5. Jones, J. D., Dangl, J. L. The plant immune system. Natur. 444, 323-329 (2006).
  6. Newman, M. A., Sundelin, T., Nielsen, J. T., Erbs, G. MAMP (microbe-associated molecular pattern) triggered immunity in plants. Front Plant Sc. 4, 139 (2013).
  7. Fritig, B., Heitz, T., Legrand, M. Antimicrobial proteins in induced plant defense. Curr Opin Immuno. 10, 16-22 (1998).
  8. Nicaise, V., Roux, M., Zipfel, C. Recent advances in PAMP-triggered immunity against bacteria: pattern recognition receptors watch over and raise the alarm. Plant Physio. 150, 1638-1647 (2009).
  9. Zipfel, C., et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Natur. 428, 764-767 (2004).
  10. Kunze, G., et al. The N terminus of bacterial elongation factor Tu elicits innate immunity in Arabidopsis plants. Plant Cel. 16, 3496-3507 (2004).
  11. Gust, A. A., et al. Bacteria-derived peptidoglycans constitute pathogen-associated molecular patterns triggering innate immunity in Arabidopsis. J Biol Che. 282, 32338-32348 (2007).
  12. Alfano, J. R., Collmer, A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annu Rev Phytopatho. 42, 385-414 (2004).
  13. Tyler, B. M. Entering and breaking: virulence effector proteins of oomycete plant pathogens. Cell Microbio. 11, 13-20 (2009).
  14. He, P., et al. Specific bacterial suppressors of MAMP signaling upstream of MAPKKK in Arabidopsis innate immunity. Cel. 125, 563-575 (2006).
  15. Gimenez-Ibanez, S., et al. AvrPtoB targets the LysM receptor kinase CERK1 to promote bacterial virulence on plants. Curr Bio. 19, 423-429 (2009).
  16. Zhang, Z., et al. Disruption of PAMP-induced MAP kinase cascade by a Pseudomonas syringae effector activates plant immunity mediated by the NB-LRR protein SUMM2. Cell Host Microb. 11, 253-263 (2012).
  17. Chisholm, S. T., Coaker, G., Day, B., Staskawicz, B. J. Host-microbe interactions: shaping the evolution of the plant immune response. Cel. 124, 803-814 (2006).
  18. Jones, D. A., Takemoto, D. Plant innate immunity - direct and indirect recognition of general and specific pathogen-associated molecules. Curr Opin Immuno. 16, 48-62 (2004).
  19. Elmore, J. M., Lin, Z. J., Coaker, G. Plant NB-LRR signaling: upstreams and downstreams. Curr Opin Plant Bio. 14, 365-371 (2011).
  20. Gassmann, W., Bhattacharjee, S. Effector-triggered immunity signaling: from gene-for-gene pathways to protein-protein interaction networks. Mol Plant Microbe Interac. 25, 862-868 (2012).
  21. Wang, D., Weaver, N. D., Kesarwani, M., Dong, X. Induction of protein secretory pathway is required for systemic acquired resistance. Scienc. 308, 1036-1040 (2005).
  22. Bednarek, P. Chemical warfare or modulators of defence responses - the function of secondary metabolites in plant immunity. Curr Opin Plant Bio. 15, 407-414 (2012).
  23. Heath, M. C. Hypersensitive response-related death. Plant Mol Bio. 44, 321-334 (2000).
  24. Fu, Z. Q., Dong, X. Systemic acquired resistance: turning local infection into global defense. Annu Rev Plant Bio. 64, 839-863 (2013).
  25. Cao, H., Glazebrook, J., Clarke, J. D., Volko, S., Dong, X. The Arabidopsis NPR1 gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing ankyrin repeats. Cel. 88, 57-63 (1997).
  26. Wu, Y., et al. The Arabidopsis NPR1 protein is a receptor for the plant defense hormone salicylic acid. Cell Re. 1, 639-647 (2012).
  27. Smith, J. M., Heese, A. Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae. Plant Method. 10, 6 (2014).
  28. Nomura, K., et al. A bacterial virulence protein suppresses host innate immunity to cause plant disease. Scienc. 313, 220-223 (2006).
  29. Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. The Arabidopsis book/American Society of Plant Biologist. 1, (2002).
  30. Sawada, H., Suzuki, F., Matsuda, I., Saitou, N. Phylogenetic analysis of Pseudomonas syringae pathovars suggests the horizontal gene transfer of argK and the evolutionary stability of hrp gene cluster. J Mol Evo. 49, 627-644 (1999).
  31. Xin, X. F., He, S. Y. Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000: a model pathogen for probing disease susceptibility and hormone signaling in plants. Annu Rev Phytopatho. 51, 473-498 (2013).
  32. Dong, X., Mindrinos, M., Davis, K. R., Ausubel, F. M. Induction of Arabidopsis defense genes by virulent and avirulent Pseudomonas syringae strains and by a cloned avirulence gene. Plant Cel. 3, 61-72 (1991).
  33. Mackey, D., Holt 3rd, B. F., Wiig, A., Dangl, J. L. RIN4 interacts with Pseudomonas syringae type III effector molecules and is required for RPM1-mediated resistance in Arabidopsis. Cel. 108, 743-754 (2002).
  34. Tornero, P., Dangl, J. L. A high‐throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana. The Plant Journa. 28, 475-481 (2001).
  35. Ishiga, Y., Ishiga, T., Uppalapati, S. R., Mysore, K. S. Arabidopsis seedling flood-inoculation technique: a rapid and reliable assay for studying plant-bacterial interactions. Plant Method. 7, 32 (2011).
  36. Zheng, X. Y., et al. Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation. Cell Host Microb. 11, 587-596 (2012).
  37. Pajerowska-Mukhtar, K. M., et al. The HSF-like transcription factor TBF1 is a major molecular switch for plant growth-to-defense transition. Curr Bio. 22, 103-112 (2012).
  38. Rusterucci, C., et al. Age-related resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato is associated with the transition to flowering in Arabidopsis and is effective against Peronospora parasitica. Physiological and molecular plant patholog. 66, 222-231 (2005).
  39. Boyes, D. C., et al. Growth stage–based phenotypic analysis of Arabidopsis a model for high throughput functional genomics in plants. The Plant Cell Onlin. 13, 1499-1510 (2001).
  40. Regna, P. P., Wasselle, L. A., Solomons, I. A. The stability of streptomycin. Journal of Biological Chemistr. 165, 631-638 (1946).
  41. Wang, W., et al. Timing of plant immune responses by a central circadian regulator. Natur. 470, 110-114 (2011).
  42. Hua, J. Modulation of plant immunity by light, circadian rhythm, and temperature. Current opinion in plant biolog. 16, 406-413 (2013).
  43. Cuppels, D. A. Chemotaxis by Pseudomonas syringae pv. tomato. Appl Environ Microbio. 54, 629-632 (1988).
  44. Qutob, D., et al. Phytotoxicity and innate immune responses induced by Nep1-like proteins. The Plant Cell Onlin. 18, 3721-3744 (2006).
  45. Pimentel, D., Lach, L., Zuniga, R., Morrison, D. Environmental and economic costs of nonindigenous species in the United States. BioScienc. 50, 53-65 (2000).
  46. Zeng, W., Melotto, M., He, S. Y. Plant stomata: a checkpoint of host immunity and pathogen virulence. Current opinion in biotechnolog. 21, 599-603 (2010).
  47. Ton, J., Flors, V., Mauch-Mani, B. The multifaceted role of ABA in disease resistance. Trends in plant scienc. 14, 310-317 (2009).
  48. Mahajan, S., Tuteja, N. Cold salinity and drought stresses: an overview. Archives of biochemistry and biophysic. 444, 139-158 (2005).
  49. León, J., Rojo, E., Sánchez‐Serrano, J. J. Wound signalling in plants. Journal of Experimental Botan. 52, 1-9 (2001).

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संक्रमण अंक 104, प्रणालीगत अधिग्रहण प्रतिरोध सूक्ष्म जीव-एसोसिएटेड आणविक पैटर्न (MAMPs) बढ़ी> ES4326 संक्रमण सिरिंज घुसपैठ संयंत्र प्रतिरक्षा चिरायता एसिड (एसए) MAMP-उत्प्रेरित प्रतिरक्षण एसए-उत्प्रेरित प्रतिरक्षण
का उपयोग संयंत्र रक्षा प्रतिक्रियाएँ ललित विशेषता के लिए बैक्टीरियल लीफ घुसपैठ परख<em&gt; Arabidopsis thaliana-स्यूडोमोनास syringae</em&gt; Pathosystem
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Liu, X., Sun, Y., Kørner, C.… More

Liu, X., Sun, Y., Kørner, C. J., Du, X., Vollmer, M. E., Pajerowska-Mukhtar, K. M. Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem. J. Vis. Exp. (104), e53364, doi:10.3791/53364 (2015).

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