Abstract
在没有专门的手机免疫细胞，植物利用其本地化的程序性细胞死亡和系统获得抗性反对病原体攻击自卫。具体拟南芥基因的整体植物免疫应答的贡献可以是具体地和定量通过测定内感染的组织的病原体生长评估。在过去的三十年里，hemibiotrophic细菌野火病菌 。 假单胞菌斑ES4326（PSM ES4326）已被广泛作为模型病原体研究拟南芥免疫反应的分子机制的应用。为了提供病原体进入叶组织，多个接种方法已经建立， 如注射器浸润，浸接种，喷涂，真空渗透，洪水接种。以下方案描述了优化注射器渗入法以提供强毒PSM ES4326到成年的叶土壤中生长的拟南芥植株，准确地筛选增强疾病易感性（EDS）对这种病菌。此外，该协议可以与多个预处理来补充不同层植物防御，包括水杨酸（SA），-Triggered抗扰度（STI）和MAMP触发抗扰度（MTI）内，以进一步解剖特异性免疫缺陷。
Introduction
由于其无柄性质，植物不断受到过多的病原体展示不同的生活方式和营养策略1的威胁。要第一个近似值，植物病毒保持自己的主机活着获取营养物质，而死体营养病原体积极秘密毒素和酶杀死宿主组织和食死细胞1。另一组的病原体，被称为hemibiotrophs，一旦到达病原体积累2的一定的阈值开始他们的感染过程的活体营养阶段和转移到死体营养阶段。为了对抗这些微生物有效地保护自己，植物进化配备了多个监测机制，以发现病原体的攻击，引发复杂的先天免疫系统的本地化程序性细胞死亡3以及系统获得抗性（SAR）4。目前的研究主要集中在定性的基本SIG南陵成分和植物免疫系统 5内跨会谈。
中提出的“之字形”的模式5中，植物天然免疫反应的第一层需要质膜本地化模式识别受体（的PRR）的存在来检测入侵微生物的。蓝耳病是能够识别微生物相关分子模式（毫安），并建立MAMP触发免疫（MTI）6。除了 诱导基因编码的抗菌PR蛋白7的一个转录上调，MTI导致各种事件的逮捕病原体的生长，包括活性氧的产生（ROS）和活性氮粒子（RNS），胼胝质沉积于细胞壁以及多个激酶通路的激活通路8。
到现在为止，几个毫安已经确定触发MTI拟南芥，包括细菌flg22 9 10和结构细胞壁成分（18个从细菌翻译延伸因子Tu氨基酸）肽聚糖11。要建立一个成功的感染，一些专业的病原体已经进化的能力，秘密毒性效应蛋白进入细胞内或细胞间隙，从而抑制MTI和触发效应触发易感性（ETS）12,13。例如，毒力效应可以灭活MTI的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的磷酸化级联以诱导内感染组织14-16所述疾病的发展。在主机和病原体之间的动态协同进化，植物也制定了反击策略，以识别效应蛋白，减轻病原毒力分子17。这直接或间接的执行识别由疾病抗性（R）的蛋白18介导的。大多数的t下摆是NB-LRR成员（核苷酸结合和富含亮氨酸重 复）系列19。一种无毒效应的由R蛋白的看法引发一个更强大和更广泛的免疫反应定性为效应触发免疫（ETI）20。除了 诱导防御基因21的表达和生产防御代谢物22的 ，ETI往往导致被称为过敏反应（HR）快速本地化程序性细胞死亡，以散布到邻近组织3限制病原体。
除了 局部程序性细胞死亡23，植物是能够引发长期和全系统的免疫应答称为系统获得性抗性（SAR）4。当与活体营养病原体的挑战，植物细胞触发内源性植物激素水杨酸（SA）和PR蛋白在局部和全身组织24的生物合成和积累。至T他的过程中，准备产生了高度的未感染叶子，允许通过的病原体24广谱在随后的感染上升较快的防御反应的实现。 SA和其合成的类似物，例如苯并（1,2,3） -噻二唑-7- 硫代羧酸S-甲酯（BTH）和2,6-二氯异烟酸（INA）能够化学诱导水杨酸（SA）的-Triggered抗扰度（STI）在外部应用程序24。的发病机制相关的基因1（NPR1）Nonexpressor建议成为该SA受体和功能期间在局部和全身组织21,25,26的SA介导的防卫反应的主要转录调节中的一个。已经决定性地证明了NPR1需要特区的建立和NPR1的缺失导致剧烈的敏感性对丁香假单胞菌 25。
到广泛表征植物的分子贡献在植物-病原体相互作用的组件，多个生物测定法已经被开发用于测量特异性防御事件，包括ROS的突发27，胼胝质沉积及其蛋白质产物21的28，防卫基因表达和积累。尽管这些个体测定可以提供深入了解植物的免疫反应的一种具体形式，其中没有，但是，都能够代表在整株水平完全防御反应。相反，在感染后量化病原体生长提供在有机体水平免疫应答的总体估计。因此，精确而高度标准化的病原体接种试验的开发和优化是非常重要的燃料上的拟南芥属的免疫反应的研究和发现。
丁香假单胞菌 ，一种革兰氏阴性细菌，被鉴定为能够引起疾病的范围内的植物宿主，包括Arabidops的植物病原菌29。作为模式植物-病原体系统，拟南芥- P.丁香互动已被广泛应用到了解的分子机制基础植物的防御反应29。到现在为止，超过50 P.基于它们感染不同的植物物种30能力丁香 pathovars已经确定 。P.斑点病菌 。 番茄DC3000（PST DC3000）31 和 P. 斑点病菌 。 假单胞菌斑ES4326（PSM ES4326）32是两种最广泛使用和广泛表征毒株。除了 由工厂被识别并触发MTI响应的Pst DC3000 和 PSM ES4326能分泌致命效应蛋白来抑制MTI，引发ETS有利于病原体生长31,33。
从功能解剖拟南芥和P之间的相互作用丁香，多0;根据病原体交付方法病原体感染的方法被开发出来。对于土壤中生长的植物，病原体可以通过注射器渗透，真空渗透，浸接种，接种喷雾29,34传递。近日，苗汛接种法的开发是为了在组织培养进行大规模的屏板生长的年轻拟南芥植物35。注射器渗入，作为最常用的方法之一，手动开出病原体进入质外体通过被称为气孔29的天然叶开口。通过这种做法，等于P.量丁香可以渗透到受感染的叶和植物免疫反应的强度负相关病原体的增长水平。因此，病原体生长的定量用作在整株水平来评价的免疫功能的最佳方法。此外，注射器浸润可以区分局部和全身组织，其可以bE采用的表征基本特区36的分子机制。
在下面的协议中，我们描述了PSM ES4326优化的注射器渗透法来筛选拟南芥突变体，增强疾病易感性（EDS）。该协议将使用两只拟南芥基因型：野生型生态型哥伦比亚-0（Col-0中）植物（对照）和功能丧失的突变体npr1-1 （hypersusceptible） 将被感染致命的细菌菌株PSM ES4326 37在npr1-1突变体携带NPR1基因分子，它改变了高度保守的组氨酸酪氨酸，并呈现蛋白无功能25的锚蛋白重复共有序列中的点突变。此外，一些注射器浸润测定的变型描述了允许在免疫反应，包括MTI和性病的特定层中的缺陷定量。
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Protocol
下面的文字描述了一个协议，逐步在拟南芥进行优化的PSM ES4326注射渗透法。该测定的主要程序中表示在一个简化流程图（ 图1）。
1.植物生长条件
- 播种
- 制备2盆（4-直径，竖直3.75）由从底部直径：浸泡松散装满泥土和水的盆/ N之前排出多余的水。
- 播下50-100拟南芥种子，野生型Col-0中或npr1-1突变体，到每个盆用折叠70毫米称重片或其它的纸张。
- 覆盖用与水喷透明圆顶的锅，以增加相对湿度80-90％（图2A）。
- 孵育罐，在4℃条件下72小时，以便完成分层和同步发芽。
- 转移锅的标准生长条件（12小时光照/ 12小时黑暗，21℃，光照强度100微摩尔/米2 /秒，相对湿度40％），以允许种子发芽。破解圆顶在转移到生长室，这将有助于避免凝结水后，立即打开生成一个2-3。
- 当第一片真叶达到2-3毫米长的大小，移植从器皿中的幼苗到72井平板充满了土壤。
- 使用手指或1毫升枪头在在平坦的土壤表面的中间建立一个1英寸深的抑郁症。
- 轻轻分开单独苗少根损害的可能。小心地拿起具有完整的根用钳子苗。
- 将一个单一的分隔苗连同附着土壤丛移植冲击减少到凹陷，轻轻拍打下来周围的土壤，填补了抑郁症。丢弃多余的苗土成生物危险废物的容器和处置依据与当地的生物危险废物处置的指导方针。
- 水转移从顶部幼苗和完全覆盖平板用与水喷洒透明圆顶以保持80-90％的湿度。保持圆顶上3天，然后裂纹圆顶在4天的早上和完全由该天结束时将其删除。
注意：播种种子可以通过分层种子含有1ml 0.1％琼脂48小时，在4℃1.5毫升离心管中，接着通过转移2-3种子用玻璃吸管上一个72井平板填满土可选地进行的。单位需覆盖有透明的圆顶可在发芽后一周被除去。额外的苗可以去掉，留下每孔只有一个苗子。
- 水草每两天通过浸泡单位以1在水中20分钟，然后沥干多余的水。
注：浇水的时间间隔取决于生长室内湿度和需要确定基地D对连续观察用户的植物生长设施。检查工厂每天以确保他们充分浇水。如果只有少数斑点干燥，水从用喷射瓶的顶部的那些植物。 - 关于植物是处于或接近发育阶段＃3.50（当莲座尺寸为50％的最终尺寸），其对应取决于生长条件下（光周期，温度），以3-5周龄执行病原体感染测定（步骤3-5）。不感染花序出现（阶段＃5）由于发病年龄相关的电阻38,39后的植物。
2.准备文化传媒和盘子
- 让1升国王B（KB）液体介质。轻轻搅动20个克蛋白胨和2g磷酸氢二钾三水合物使用1000毫升去离子H 2 O的，直到没有可见的沉淀磁力搅拌棒。分装百毫升到容量为150ml的玻璃瓶和高压锅在20分钟的液体循环。
- 备培养板KB固体培养基。
- 轻轻搅动20个克蛋白胨，2克磷酸氢二钾三水和15g琼脂用1,000ml去离子H 2 O高压灭菌器。
- 冷静下来的磁力搅拌板中，直到它很酷的触摸，以减少未来的凝结，并避免抗生素降解。加入18毫升无菌80％甘油和5毫升无菌的1M 硫酸镁向培养基。鉴于PSM ES4326运载反对链霉素抗性，添加链霉素入冷却的介质的50微克ml的终浓度- 1。
- 倒入平板上。准备两个不同尺寸的KB介质板：100毫米×15毫米和150毫米×15毫米的培养皿中。较小的Petri培养皿含有介质作为主要的细菌培养板，和较大的陪替氏培养皿用作细菌计数板。
注意：对于细菌计数板，矩形板可被用于降低耗材成本，因为两倍的治疗可以每盘相比传统的圆板绘制。- 倒板前的感染实验。商店的KB培养基平板在4℃下，因为硫酸链霉素长达2-3个月逐渐失去抗生素活性40。
3.增强疾病易感性（EDS）
- 第1天 - 在平板Streak的细菌
- EDS的检测前两天，连胜PSM ES4326从-80℃甘油在KB-链球菌细菌培养板和孵化在28℃，24〜48小时。
- 第2天 - 发起液体培养和水草
- 启动液体培养在无菌试管中含50微克毫升4毫升液体KB培养基- 1链霉素和摇晃在250转，28°CO / N。
注意：对于EDS感染测定，使用6植物每基因型推荐编辑。对于STI和MTI测定，每基因型6厂每处理建议。为细菌接种物，它建议用新鲜液体培养用的光密度在600nm的 λ在0.3和0.6之间。 - 标记的叶数5和6的钝端防水标记以易于识别感染组织中的采样的叶柄（ 图1）。为了提高气孔开放和促进病原体的解决方案进入叶，浸泡从底部平20分钟植物浇水好，然后沥干多余的水分。
注：另外，盖平，透明的穹顶和浸泡在水中2-4小时，以增加气孔开放。 - 第3天 - 病原稀释和注射渗透
注：病原感染期间早晨是最适合的易感基因型，最明显的疾病症状病原体增殖和发育。尽一切努力保持侵染离子定时一致，以消除昼夜节律和昼夜基因调控41,42的作用，这有助于减少实验重复中的变化。- 沉淀细菌培养在微量1.5毫升管在9600×g离心在RT 2分钟，并弃去上清液。重悬细菌沉淀用1毫升无菌的10mM的MgCl 2。
注意：镁阳离子可以提高P 的运动和粘附丁香43。或者，使用MgSO 4干燥以相同的浓度。无菌水是一种可接受的替代物中的Mg盐溶液。 - 稀释的细菌悬浮液用9ml的10mM的MgCl 2在50毫升离心管中，并测量细菌的光密度（OD）用分光光度计在λ= 600纳米。稀释细菌用10mM的MgCl 2的最终的OD 600nm的 = 0.0002 EDS感染测定。
- 渗透叶用1毫升钝端针注射器（俗称胰岛素注射器），包含稀释细菌溶液。
- 不填注射器至其满负荷生产。与0.5-0.6毫升加满，以便在渗透过程中更好地控制。
- 暴露于食指顶部的叶的下表面，然后轻轻地调整与拇指的帮助的叶位置。垂直地定位在注射器靠在叶面上，以保证压力均匀分布。尽量避免脉地区的渗透，以减少危害叶片。
- 慢慢推柱塞渗透到细菌的解决方案;由较暗叶色所示液体进入叶肉将被可视化。试图渗透到叶的整个表面。如果这不是在一个单一的企图实现的，选择另一浸润点，并重复上述步骤，直到整个叶表面被覆盖所述的操作。
- 完成后，轻轻地涂抹用吸水组织叶删除多余的病原体的解决方案。目视检查感染叶组织的损伤。
注：圆形注射器的印象就不会再看见后，渗透完成。 - 离开渗入植物它们返回到原来的生长条件之前，干燥1-2小时。接下来，喷透明球罩与水并覆盖感染的植物2小时，然后破解圆顶产生开2-3，让它在整个感染剩余的实验。
注：由于P.丁香不是空中病原体，存在传播感染因子在同一设施生长其它植物的危险。然而，作为一个附加的预防措施，避免在附近感染的植物和其他实验工厂之间的身体接触。覆盖平面呈透明圆顶会增加病原体毒力，加速病情恶化。该需要在此步骤中的覆盖物期间的和最佳持续时间需要根据用户的植物生长设施的湿度条件被确定。
- 沉淀细菌培养在微量1.5毫升管在9600×g离心在RT 2分钟，并弃去上清液。重悬细菌沉淀用1毫升无菌的10mM的MgCl 2。
- 第5天 - 预干燥介质板
- 就拿150毫米×15毫米的KB片了冷藏单元和干任何预先存在的冷凝水盘上。干板通过保持其在室温约24小时。为了加快这一进程，将它们放置在层流罩与盖破获30-60分钟。
注意：此步骤是为圆形液滴的板的表面上形成在接下来的步骤是至关重要的。
- 就拿150毫米×15毫米的KB片了冷藏单元和干任何预先存在的冷凝水盘上。干板通过保持其在室温约24小时。为了加快这一进程，将它们放置在层流罩与盖破获30-60分钟。
- 第6天 - 量化的病原体生长
注意：以下病原体量化过程可在更早的时间点进行感染后，确认细菌被递送到叶，特别是当植物具有改变的叶形态等量。- 过程中，出苗后感染的组织萎黄的指示通过在易感基因型的感染组织的变黄，但坏死性病变的发展（图2B）之前。
注：建议的采样时间为病原体接种后三天。然而，由于病原体生长取决于多种环境因素，孵化的长度可以为2½-3天半内变化，且需要获得在用户的植物生长设施仔细的观察感染进展来确定。- 制备6磨削管每种基因型（图1）。将其中不锈钢磨球，加入500微升无菌的10毫氯化镁到每个管。
- 分离从植物中的感染叶和冲头叶盘用1孔纸冲头（ 图1）。
注意：为了尽量减少抽样误差，尽量在同一位置每次打孔取样的叶子。从顶部叶盘的采样叶的建议。 - 随机放置2叶盘（从两个不同的植物）到使用镊子每个研磨管。
- 密封该管并均化组织在最大速度高吞吐量均化器（每分钟1600冲程）10分钟。如果需要的话，直到组织是良好均质化并且溶液变成绿色，由于从感染叶叶绿素释放重复此过程。
- 同时等待均质化，使用多道移液器，并移液贮存器填充第6行到96孔培养板的180微升的10mM的MgCl 2。
- 粉碎后，转移20微升基本组织悬浮进96孔板的第一行和反复吹打液体上下混合。如果组织的小碎片堵塞的前端，将它夹2-3毫米，以帮助获得溶液的正确体积。
- 为了提供在顶O足够的空间液滴f显示板，空间从不同基因型中替换行的组织（ 图1）。要准备十倍连续稀释，转移20微升液体到第二行并重复上述步骤，直到第六次稀释。
- 转移20微升从96孔板的溶液到使用划分枪头（图1）150毫米×15毫米的KB板。从最稀的悬浮最集中的工作。
注：从最稀释至最集中出发，就没有必要改变稀释液的吸头。如果该板是公预干燥后，所传输的液滴应该保持不变在介质的顶部，直到被吸收（通常15-30分钟）。干燥时间随RT和湿度。 - 干燥板在室温盖破裂。一次没有更多的液体可以在板表面上可以观察到，盖上盖子，倒置，并培育该板在RT或28℃培养箱中。
- 板块孵育40-60小时，直到殖民地变得可见。确认在板上生长反映形成单位（cfu）的菌落的预测的10倍下降（图2C）。算上细菌，他们长满和殖民地保险丝之前。确定细菌在最低稀释不具有重叠的菌落数。通常情况下，首选的稀释要算将包含10-50殖民地之间。
注：变异之间可能会技术重复出现;因此，最低的稀释每个重复应分别确定。 - 要计算的细菌的增殖水平，记录行（R），以及每个技术复制（T），以书面内的细菌的数量的数量。确定集落形成单位的数量-通过公式CFU /叶盘：CFU /叶盘=（T×10 R / 20）×500/2
- 在下面的电子表格模板输入数据到机生产线CE的曲线图（图1）（对于电子表格的数据分析的模板文件，见表2）。每个数据点被表示为对数刻度6技术重复的平均值。误差棒代表平均值的95％置信区间（N = 6）。
注：95％置信区间的计算需要基于技术复制的数目进行调整。
- 过程中，出苗后感染的组织萎黄的指示通过在易感基因型的感染组织的变黄，但坏死性病变的发展（图2B）之前。
- 启动液体培养在无菌试管中含50微克毫升4毫升液体KB培养基- 1链霉素和摇晃在250转，28°CO / N。
4. SA-触发免疫（STI）
- 第1天：如步骤3.1中所述按照相同的步骤。
- 第2天：除了植物浇水并起始液体细菌培养（步骤3.2），水杨酸衍生物水杨酸钠21的外部应用诱导阻力。
注：纯SA具有水溶性较差，需要事先pH值调节，因此不建议这个实验。- 诱导针对P. SA介导的防御丁香和总理对未来21感染的植物，24，喷1毫米水杨酸钠细雾或H 2 O（如模拟）植物病原体感染前16-24小时。
- 第3天：准备病原体稀释OD 600nm的为0.001和推入细菌通过注射器浸润（步骤3.3）整个叶面。
- 第6天：病原体量化和计票过程，如针对EDS分析（步骤3.4和3.5），按照该过程。板块和算上H 2 O和水杨酸钠-预处理样品分别。对于野生型拟南芥，在病原体生长1-2数减少，预计在水杨酸钠 - 预处理工厂。
5. MAMP触发免疫（MTI）
注意：在该试验中，我们使用的拟南芥野生型Col-0中和突变FLS2和EFR植物。 FLS2和EFR是细胞膜本地化模式识别受体（蓝耳病），可以识别flg22和elf18，respe沉着应对9,10。损失的各PRR导致不敏感的特定类型MAMP的，这是由下列外部MAMP预处理和注射器浸润PSM ES4326未改变的病原体生长的突变体表示。
- 天1和2：如步骤3.1和3.2中所述按照相同的步骤。
- 第3天：甲基苯丙胺前处理和病原体感染
- 要建立MAMP触发免疫，准备鞭毛抗原flg22或EF-Tu的表位elf18和1微米的解决方案注射器渗透入病原体感染（步骤3.3.3-3.3.6）之前，整个叶面上4小时。这将允许诱导对铜绿甲基苯丙胺介导的防御丁香和总理对未来感染6,37植物。
注：公开提供芯片数据揭示了甲基苯丙胺反应基因的转录最大重编程后flg22或elf18治疗37,44发生4小时。因此，4小时是推荐持续时间MAMP预处理导致在实现之间的甲基苯丙胺治疗COL-0和FLS2和EFR突变的病原体生长有着明显的区别的。 - 取出用吸水组织额外的甲基苯丙胺的解决方案，并留下破获加快叶片内的液体吸收过程中的植物。以考虑从注射器压力渗透伤人效果，渗透H 2 O的进对照植物的叶子上。
- 准备病原体稀释至OD 600nm的 = 0.001和推入细菌MAMP / H 2 O的预处理叶由注射器浸润（步骤3.3）的整个叶表面。
- 要建立MAMP触发免疫，准备鞭毛抗原flg22或EF-Tu的表位elf18和1微米的解决方案注射器渗透入病原体感染（步骤3.3.3-3.3.6）之前，整个叶面上4小时。这将允许诱导对铜绿甲基苯丙胺介导的防御丁香和总理对未来感染6,37植物。
- 第6天：为了病原体量化及数量的过程中，如在步骤3.4和3.5中所述遵循的过程。板块和单独算H 2 O和甲基苯丙胺预处理的样本。在野生型拟南芥中病原体生长1-2数减少，预计在MAMP预处理厂，有点强ER通过降低介flg22相比elf18。
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Representative Results
我们在这里描述的协议代表了一个优化的P.丁香注射器浸润试验，以定量地评价在拟南芥植物的免疫应答。 如图1，PSM ES4326的注射器浸润之后是通过连续稀释和菌落计数病原体提取和定量。
在协议文本中步骤3所述，增强疾病易感性（EDS）对PSM ES4326可以通过感染有OD = 0.0002的接种物进行评估。 如图3所示，高度易感npr1-1突变体具有大约2.5的日志（300次）以上病原体生长与野生型Col-0中的植物。根据不同的实验条件下，npr1-1植株可以支持多达3.0日志更多细菌生长比Col-0中，用1.5-2.5日志的范围内最常见的结果。因此，EDS屁股唉提供差的宽窗口，在其中，研究人员可能能够把他们的拟南芥突变体和转基因，以确定候选基因可能参与在植物免疫应答。
除了 确定EDS，PSM ES4326浸润注射器测定可修改成解剖免疫反应的不同的层。为了评估水杨酸触发免疫，化学水杨酸钠外敷用于触发免疫应答，这是由病原体生长（图4A）定量。 NPR1基因的损失，其功能是作为SA与依赖性靶基因的SA受体和主要转录共调节器，导致不敏感水杨酸衍生物的外源应用程序。这不敏感的SA证明由未改变的病原体生长的npr1-1水杨酸钠预处理过的植物在对比明显减少Col-0中的植物（20倍pathog少连接后，水杨酸钠申请）（ 图4B）。
表征MAMP触发免疫，治疗前与flg22或elf18进行这表现在图5A。为了表征鞭毛触发免疫力，Col-0中和FLS2突变植物被使用。 FLS2，一个膜定位受体样激酶，识别flg22并触发MTI 9。这表现在图5B中，所述flg22处理的Col-0中的植物支持的〜1日志（10倍）减少细菌群体，而FLS2突变植物没有触发细菌生长限制效果。同样，EF-Tu的受体EFR在EFR突变植物的消失造成不敏感elf18预处理就证明了未改变的病原体生长继elf18预处理（图5B）。
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的PSM ES4326注射器渗透法对拟南芥的植物图1.示意图。叶5号和6成人土壤种植拟南芥植物的标记，并通过注射器渗透感染PSM ES4326。疾病症状出现后，分离叶和收获叶盘用于组织均匀化。良好的组织匀浆连续稀释在96孔平板转印到细菌计数板之前。后在平板上菌落出现，算上细菌的数量和处理数据生成的图表。 请点击此处查看该图的放大版本。
图中的EDS分析2.代表的程序。（一）盆上COL-0和npr1-1叶子受到EDS分析（OD 600nm的 = 0.0002）覆盖着播种后的水喷透明圆顶。（B）代表的症状后3天接种。注意关于npr1-1严重萎黄和Col-0的几乎正常的外观。（℃）PSM ES4326的系列稀释液对KB生长（50微克/ ml链霉素）培养基板后〜45小时培养的。五稀释可见。 请点击此处查看该图的放大版本。
EDS的分析图3。代表结果 PSM ES4326增长（菌落形成单位- CFU /叶盘，EXPressed对数标度）中的量化4周龄Col-0中和npr1-1植株后3天接种（OD 600nm处 = 0.0002）。误差棒代表平均值的95％置信区间（N = 6）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4。代表的程序和STI检测的结果。（一）水杨酸触发免疫的示意图（STI）检测。（B）水杨酸触发免疫是根据病原体的生长量化厂预处理1mm厚水杨酸钠或H 2 O 16小时之前，PSM ES4326注射器浸润（OD 600nm的 = 0.001）。病原体生长定量3天后接种。误差棒代表平均值的95％置信区间（N = 6）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5.代表性的程序和MTI检测的结果。 （一）MAMP触发免疫的示意图（MTI）检测。（B）MTI是在工厂预先治疗flg22，elf18或H 2 O（对照），4小时到 PSM之前1μM溶液定量病原体生长ES4326浸润注射器（OD 600nm处 = 0.001）。病原体生长量化后3天接种。误差棒代表均值的95％置信区间（N = 6）。 请他再查看该图的放大版本。
| 问题 | 可能的原因 | 建议操作 |
| O / N培养后无细菌生长在液体介质 | 减少了细菌的活动 | 从新划线平板中启动液体培养 |
| 注射器渗透后循环注射器的印象呈现在叶 | 渗透过程压力太大 | 减少浸润期间pressue |
| 注射器渗透后局部注射的印象呈现在叶 | 注射器的不适当的定位 | 调整注射器被定位垂直靠在叶表面 |
| 叶枯萎wthtin渗透经过几个小时 | 太多病原体溶液渗透到叶 | 停止INF整个叶面后，立即iltrating变成了颜色变深绿色 |
| 无疾病症状3天感染后 | 湿度太低病原体增殖 | 其中，增加感染的植物都保持湿度 |
| 病菌进入死体阶段或之前3 DPI | 病原体的解决方案不正确的浓度 | 使用600nm的 OD = 0.0002 EDS分析;采用上独立分光光度计确认稀释 |
| 液滴上的细菌计数板的顶部合并 | 细菌计数板没有恰当地干 | 预干板O / N使用前 |
| 病原体稀释不代表降低10倍 | 不正确地进行稀释 | 使用以及校准多道移液器转移液体;确认所有液体被分配 |
| 病原体生长在野生型超过8日志CFU /叶盘 | 在被感染的组织病原茂密生长 - 取样进行为时已晚 | 萎黄后出现样品感染组织 |
| 之间的技术复制大变化 | 植物不是在相同发育阶段或浸润叶数不一致 | 只使用植物在同一发展阶段的感染。确认同步发芽。感染不同的植物都是一致的叶片数 |
表1.故障排除注射器渗透测定。
表2的电子表格的病原体生长数据进行统计分析。
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Discussion
通过减少现有耕地和人口的不断增加，世界各地的研究人员正在与作物改良迫切的需求的挑战。产率可以通过各种生物和非生物胁迫可以极大影响。其中，病原体感染是其中作物产量减少的主要原因，负责在美国约12％的损失就45。要解决此问题，大量的研究已经在模型拟南芥进行- P.丁香病害系统全面表征组件和植物免疫反应的调节机制。在这里，我们提出了一个优化的P.丁香 ES4326注射器渗透检测，以定量评估在全厂级植物免疫反应的微妙差异。
虽然多种病原体感染测定法已经被开发以表征植物免疫应答29,35，注射器浸润提供良好控制的系统，其中的病原体的等量施用到受感染的组织中。在其他感染测定法，包括浸涂接种并喷雾接种，病原体被施加到整个天线组织，包括子叶以及片真叶34。据报道，从生态型兰茨贝格万寿菊 （L ER）的子叶期间浸接种试验中的病原体，其可倾斜的数据，并导致错误的结论，对整体的抗病34更容易受到影响。此外，上述的两个检验都要求病原体通过气孔，这是由多种环境因素，包括湿度和光照控制进入叶子。这些因素波动有助于变异在疾病症状更高水平相比注射器渗透试验35。真空浸润，主要的缺点包括需要大体积的病原体溶液，困难有效地渗透到所有的叶子，而避免损坏和大量的劳动强度29。此外，感染了喷涂，浸涂或真空接种的植物是不太可能恢复，因为整个幼苗感染病原体。定的其它方法的许多限制，注射器浸润试验仍选择的方法来实现均匀且高度可预测疾病进展和病原体的准确定量可靠地表征真叶内的免疫应答。此外，该法可以很容易地修改，以表征MAMP触发免疫和系统获得抗性。除此之外，看好该技术的未来应用可应用于多种植物激素，化学物质或抑制剂预处理之后病原体注射器渗透测试效果来剖析植物免疫信号网络的不同层或确定在植物免疫特定途径的作用反应。感染的WiTH病原体（OD 600nm处 = 0.001）在不存在任何防御吸预处理，被称为增强抗病性（EDR）测试的剂量增加，是这个方法可以用于鉴定突变体或另一种有用的修饰转基因具有增强抗病能力。
应当指出的是，注射器浸润法不适用于防御反应的侵袭前阶段的特征，因为病原体经由气孔直接递送到叶组织。气孔关闭，作为病原体入口处的物理屏障，往往是触发限制在建立MAMP触发免疫46的病原体进入。此外，植物激素脱落酸有助于气孔关闭过程中浸润前阶段47。因此，喷涂或浸渍方法可以证明是有利的免疫应答的气孔层表征，尽管相关的注意事项与这些类型的接种，上述29所讨论。
由于植物病原体相互作用可以通过各种生物和非生物因素的改变，它把重点放在了协议中的下列关键步骤来实现成功的感染，并获得可靠的输出是关键：
植物状态和细菌活动
拟南芥植物可通过各种非生物因素，包括亚最佳温度，干旱和渗透胁迫容易地强调，并且触发与免疫输出48干扰细胞应答。因此，关键是要种植植物在最佳生长条件，并保护他们免受环境压力。另外，由于受感染的叶子的发育阶段也可以改变试验结果，有必要持续感染叶数5和6，以避免伪像。随着发育阶段与时俱进，提升重sistance对一些有毒和无毒的病原体与相关从营养阶段拟南芥植物的生殖期的过渡。这种动态性过度发育阶段被称为年龄相关性（ARR）38。为了避免与真正的免疫应答的ARR干扰，关键是要在正确的发育阶段进行感染在协议中表示，并从尝试进行繁殖阶段的发作后感染实验避免。此外，细菌和健身活动基本上影响内的感染组织的病原体增殖。因此，为了从一个新鲜的划线培养板的长度不超过2天的老引发细菌液体培养是很重要的。
注射器渗透技能
在注射器浸润，尽量避免给叶任何物理损坏，因为伤人效果是公知的干扰植物免疫反应，主要是通过茉莉酸介导的信号，可以抑制SA触发防御途径49。感染之后，被渗透叶要完全恢复到正常的物理外观没有任何视觉损伤。对于初学者，建议先对PSM ES4326注射器渗透实验之前，练习使用非实验厂这种技术。
病原提取和稀释
为了精确测量的致病菌生长，至关重要的是要有效地提取出病原体感染植物组织。与其它的提取方法相比，通过高通量均质机械组织均质化有效地提取病原体未经组织样品和交叉污染的损失。随后，样品稀释应当精确进行了一个可靠的校准多通道移液器以减少移液误差。差低至±1微升在稀释过程中会转化为病原体的生长量化了〜5％的差异。对于注射渗透法的更多的故障排除实例，请参见表1。
最后，我们描述对拟南芥的优化PSM ES4326浸润注射器测定以定量和可靠地评估植物免疫应答。与此病害系统的帮助下，植物 - 病原体相互作用的理解将在实验室被加速，并最终被应用于在大田作物保护。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MetroMix 360 | Grosouth | SNGMM360 | |
| Large pots | Grosouth | TEKUVCC10TC | |
| 12 x 6 Inserts | Grosouth | LM1206 | |
| 11x 21 Flats with no holes | Grosouth | LM1020 | |
| 11x 21 Flats with holes | Grosouth | LM1020H | |
| Vinyl propagation domes | Grosouth | CW-221 | |
| Proteose Peptone | Fisher Scientific | DF0122-17-4 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate | MP Biomedicals | 151946 | |
| Agar | Fisher Scientific | A360-500 | |
| Streptomycin sulfate | Bio Basic Inc | SB0494 | |
| 100 x 15 mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 150 x 15 mm Petri dishes | Fisher Scientific | R80150 | |
| Rectangular plate | Fisher Scientific | 12-565-450 | |
| MgCl2 Hexahydrate | Bio Basic Inc | MB0328 | |
| Glycerol | Bio Basic Inc | GB0232 | |
| MgSO4 | Bio Basic Inc | MN1988 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | NC9992493 | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| Grinding tubes | Denville Scientific | B1257 | |
| Caps for grinding tubes | Denville Scientific | B1254 | |
| Stainless steel grinding ball | Fisher Scientific | 2150 | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 12-556-008 | |
| Sodium Salicylate | Sigma Aldrich | s3007-1kg | |
| flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA) | Genescript | Made to order | |
| elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | Genescript | Made to order | |
| Hole puncher | Staples | 146308 | |
| Biophotometer plus | Eppendorf | 952000006 | |
| PowerGen High-Throughput Homogenizer | Fisher Scientific | 02-215-503 | |
| Accu spin micro centrifuge | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Multichannel pipette (10-100 µl) | Eppendorf | 3122 000.043 | |
| Multichannel pipette (30-300 µl) | Eppendorf | 3122 000.060 | |
| Pipette (20µl) | Eppendorf | 3120 000.038 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 3552-HR | |
| Sharpie permanent marker | Staples | 507130 | |
| 1.5 ml tube | Eppendorf | 22363204 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 08-890 |
References
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