Abstract
Na ausência de células imunes celulares especializadas, as plantas utilizam sua localizada morte celular programada e sistêmica a resistência adquirida para se defender contra o ataque de patógenos. A contribuição de um gene Arabidopsis específico para a resposta imunitária geral da planta podem ser especificamente e quantitativamente avaliado por análise do crescimento do patógeno no tecido infectado. Por mais de três décadas, a bactéria Pseudomonas syringae pv hemibiotrophic. Maculicola ES4326 (ES4326 Psm) tem sido amplamente aplicada como modelo patógeno para investigar os mecanismos moleculares subjacentes a resposta imune Arabidopsis. Para entregar patógenos para o tecido foliar, foram estabelecidos vários métodos de inoculação, por exemplo, a infiltração seringa, inoculação mergulho, spray, infiltração a vácuo, e inoculação de inundação. O protocolo a seguir descreve um método de seringa infiltração otimizada para oferecer virulenta Psm ES4326 em folhas de adultosolo-grown plantas de Arabidopsis e rastrear com precisão para maior susceptibilidade à doença (EDS) em direção a este patógeno. Além disso, este protocolo pode ser complementado com vários pré-tratamentos para dissecar ainda mais defeitos imunes específicos dentro de diferentes camadas de defesa vegetal, incluindo ácido salicílico (SA) Imunidade Triggered (STI) e Imunidade MAMP-Provocado (MTI).
Introduction
Devido à sua natureza sessile, as plantas são constantemente ameaçados por uma infinidade de agentes patogénicos que apresentam vários estilos de vida e estratégias nutricionais 1. Para uma primeira aproximação, patógenos biotróficos manter seu hospedeiro vivo para recuperar nutrientes, enquanto patógenos necrotróficos toxinas e enzimas ativamente secretas para matar o tecido hospedeiro e se alimentam de células mortas 1. Outro grupo de patógenos, denominados hemibiotrophs, começa seu curso de infecção com o estágio biotrófica e mudanças para o palco necrotrophic ao atingir um determinado limiar de acumulação patógeno 2. A fim de defender-se eficazmente contra esses microorganismos, plantas desenvolveram um sistema imunológico inato complicado equipado com múltiplos mecanismos de vigilância para detectar o ataque de patógenos e desencadear localizada a morte celular programada 3, bem como a resistência adquirida sistémica (SAR) 4. A pesquisa atual está focada em caracterizando o sig essencialnaling componentes e transversais conversações dentro do sistema imunológico da planta 5.
Tal como proposto no modelo de "ziguezague" 5, a primeira camada da resposta imune inata planta requer a presença de plasma-membrana localizada Reconhecimento de Padrões Receptores (SRRS) para detectar a invasão de um micróbio. PRRs são capazes de reconhecer padrões Microbe-Associated Molecular (mAmps) e estabelecer Imunidade MAMP-Provocado (MTI) 6. Além de induzir uma regulação positiva da transcrição de genes que codificam proteínas PR antimicrobianos 7, MTI leva a uma variedade de eventos que parar o crescimento de agentes patogénicos, incluindo a produção de espécies de oxigénio reactivos (ROS) e reactiva de azoto Espécie (RNS), deposição de calose à parede celular , bem como a activação de múltiplas vias de sinalização da cinase 8.
Até agora, vários mAmps foram identificados para desencadear MTI em Arabidopsis, incluindo flg22 bacteriana 9 10 (18 elf18 aminoácidos do factor de tradução bacteriana alongamento Tu) e um componente da parede celular estrutural 11 peptidoglicanos. Para estabelecer uma infecção bem sucedida, alguns patógenos especializados têm evoluído a capacidade de proteínas efetoras secretos virulência para os espaços intracelulares ou intercelulares e, consequentemente, reprimir MTI e desencadear Suscetibilidade Effector-Provocado (ETS) 12,13. Por exemplo, efectores de virulência pode inactivar Mitogen-Activated Protein Kinase cascatas (MAPK) de fosforilação de MTI para induzir o desenvolvimento da doença no tecido infectado 14-16. Durante a co-evolução dinâmica entre hospedeiros e patógenos, as plantas também desenvolveu a estratégia de contra-ataque para reconhecer as proteínas efetoras e atenuar a virulência de patógenos moléculas 17. Este reconhecimento direto ou indireto efetora é mediada por proteínas de resistência a doenças (R) 18. Mais de them são membros do NB-LRR (Nucleotide Binding e leucina-ricos repetições) da família 19. A percepção de um efetor avirulent por uma proteína R provoca uma resposta imune mais forte e mais amplo caracterizada como Imunidade Effector-Provocado (ETI) 20. Além de induzir a expressão de genes de defesa 21 e a produção de metabolitos de defesa 22, ETI muitas vezes leva a uma rápida morte celular programada localizada conhecida como resposta hipersensível (HR) para restringir o agente patogénico a partir de espalhamento para o tecido adjacente 3.
Além da morte celular programada localizada 23, as plantas são capazes de iniciar um a longo prazo e a resposta imunitária global do sistema denominado a resistência adquirida sistémica (SAR) 4. Após o desafio com um agente patogénico biotrofica, células vegetais desencadear a biossíntese e acumulação de um ácido salicílico fitohormônio endógena (SA) e proteínas PR em ambos os tecidos locais e sistémicos 24. Através de tseu processo, um elevado estado de prontidão é alcançado nas folhas não infectados que permite a montagem respostas de defesa mais rápidos durante uma infecção subsequente por um amplo espectro de agentes patogénicos 24. SA e os seus análogos sintéticos, tais como o benzo (1,2,3) -tiadiazol-7-carbotióico éster do ácido S-metil (BTH) e ácido 2,6-dicloroisonicotínico (INA) são capazes de induzir quimicamente ácido salicílico (AS) Imunidade Triggered (STI) mediante aplicação externa 24. Nonexpressor de genes relacionados-Patogênese 1 (NPR1) se propõe a ser um dos receptores e funções SA como principal regulador da transcrição durante a resposta de defesa SA-mediada em ambos os tecidos locais e sistêmicos 21,25,26. Tem sido demonstrado de forma conclusiva que NPR1 é necessária para a criação de SAR e a perda de NPR1 conduz a susceptibilidade dramática no sentido 25 de Pseudomonas syringae.
Para caracterizar a contribuição extensivamente molecular de plantacomponentes nas interacções planta-patógeno, vários bioensaios foram desenvolvidos para medir a eventos específicos de defesa, incluindo a explosão de ROS 27, 28 deposição de calose, expressão dos genes de defesa e acumulação de produtos de proteína de 21 suas. Embora estes ensaios individuais pode fornecer informações para uma forma específica da resposta imune da planta, nenhum deles, no entanto, são capazes de representar a resposta de defesa completa em toda a nível da planta. Por outro lado, a quantificação do crescimento do patógeno após a infecção fornece uma estimativa global da resposta imunitária ao nível do organismo. Portanto, o desenvolvimento e otimização de um ensaio de inoculação do patógeno preciso e altamente padronizada é fundamental para abastecer-se a pesquisa e descobertas sobre as respostas imunes de Arabidopsis.
Pseudomonas syringae, uma bactéria Gram-negativa, foi identificado como um fitopatógeno capaz de causar doença em uma gama de espécies de plantas, incluindo Arabidopsé 29. Como o modelo do sistema planta-patógeno, a Arabidopsis - P. interação syringae tem sido amplamente aplicada para compreender os mecanismos moleculares subjacentes respostas de defesa da planta 29. Até agora, mais de 50 P. patovares syringae foram identificadas com base em sua capacidade de infectar diferentes espécies de plantas 30 . P. syringae pv. DC3000 tomate (Pst DC3000) 31 e P. syringae pv. maculicola ES4326 (ES4326 Psm) 32 são as duas estirpes virulentas mais utilizados e extensivamente caracterizados. Além de ser reconhecido pela planta e desencadeamento da resposta MTI, Pst DC3000 e Psm ES4326 são capazes de segregar proteínas efetoras virulentos para suprimir MTI e desencadear ETS para favorecer o crescimento de patógenos 31,33.
Para dissecar funcionalmente a interação entre Arabidopsis e P. syringae, múltiplos0; infecção patogénica métodos foram desenvolvidos com base na abordagem de entrega de agente patogénico. Para as plantas cultivadas no solo, patógeno pode ser entregue por infiltração seringa, infiltração de vácuo, a inoculação mergulho e inoculação de pulverização 29,34. Recentemente, ensaio inundação-inoculação de mudas foi desenvolvido para executar telas em grande escala em placas de cultura de tecidos cultivados jovens plantas de Arabidopsis 35. Seringa de infiltração, como um dos abordagem mais utilizada, proporciona manualmente o agente patogénico para o apoplasto através das aberturas de folhas naturais chamados estomas 29. Através desta abordagem, quantidades iguais de P. syringae pode ser infiltrada na folha infectada e a força da resposta imune da planta está inversamente correlacionada com os níveis de crescimento do patógeno. Portanto, a quantificação do crescimento do patógeno serve como uma melhor abordagem para avaliar a função imune a todo o nível da planta. Além disso, a seringa pode distinguir a infiltração do tecido local e sistémica, a qual pode be aplicável em caracterizar os mecanismos moleculares subjacentes SAR 36.
No seguinte protocolo, descrevemos um ensaio infiltração seringa otimizado com Psm ES4326 para rastrear mutantes de Arabidopsis para maior susceptibilidade à doença (EDS). Este protocolo irá empregar dois genótipos de Arabidopsis: a de tipo selvagem ecótipo Columbia-0 (Col-0) plantas (controle) e npr1-1 mutantes de perda de função (hypersusceptible) que será infectada com a cepa bacteriana virulenta Psm ES4326 37. O mutante npr1-1 transporta uma mutação pontual no interior da sequência de consenso de anquirina-repetição da molécula NPR1, o que altera a histidina altamente conservado e a tirosina torna a proteína não funcional 25. Além disso, um certo número de modificações do ensaio de seringa infiltração estão descritos que permitem a quantificação de defeitos nas camadas específicas da resposta imunitária, incluindo MTI e STI.
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Protocol
O texto a seguir descreve um protocolo passo a passo para executar otimizado Psm ES4326 ensaio seringa infiltração em Arabidopsis. Os principais procedimentos deste ensaio estão representados em um fluxograma simplificado (Figura 1).
1. As condições de crescimento de plantas
- Sementes Sow
- Prepare 2 vasos (4 de diâmetro, 3,75 de altura) em vagamente cheios de potes de solo e água, mergulhando-os de baixo para O / N antes de drenar o excesso de água.
- 50-100 semear sementes de Arabidopsis, do tipo selvagem Col-0 ou npr1-1 mutantes, em cada pote com um dobradas 70 mm com um peso de folha ou outro papel.
- Cobrir o vaso com uma cúpula transparente pulverizado em água para aumentar a humidade relativa de 80-90% (Figura 2A).
- Incubar a panela a 4 ° C durante 72 h, para permitir a estratificação e germinação completa síncrona.
- Transferir o pote para as condições de crescimento padrão (12 hr luz/ 12 horas escuro, 21 ° C, intensidade de luz de 100 umol / m 2 / s, humidade relativa 40%), para permitir que a semente germine. Crack o dome para gerar um 2-3 na abertura imediatamente após a transferência para a sala de crescimento, o que ajudará a evitar a condensação da água.
- Quando a primeira folha verdadeira atinge o tamanho de 2-3 mm de comprimento, transplantar as mudas da panela para uma senhora de 72 poços cheios de terra plana.
- Utilizar um dedo ou uma ponta de pipeta de 1 ml para criar uma depressão profunda 1-in no meio da superfície do solo sobre o plano.
- Delicadamente separar mudas individuais com tão pouco dano à raiz quanto possível. Com cuidado, pegue mudas que têm raízes intactas com fórceps.
- Coloque uma única plântula separados em conjunto com a adesão moita solo para minimizar o choque de transplante na depressão e pat delicadamente para baixo do solo circundante para preencher a depressão. Descarte as mudas extras e solo em recipiente de resíduos de risco biológico e descarte de acordocom as diretrizes de eliminação de resíduos de risco biológico locais.
- Água transferida mudas a partir do topo e completamente cobrir o plano com uma cúpula transparente pulverizada com água para manter 80-90% de umidade. Mantenha a cúpula por 3 dias, em seguida, quebrar a cúpula da manhã do dia 4 e completamente removê-lo até o final do dia.
Nota: Sementes da sementeira pode ser alternativamente realizada por estratificação sementes em 1,5 ml de tubos de centrífuga contendo 1 ml de 0,1% de agar durante 48 horas a 4 ° C, seguido de transferência de 2-3 sementes com uma pipeta de vidro para um 72-poços cheios com solo plano. Apartamentos precisam de ser cobertas com uma cúpula transparente que pode ser removido de uma semana após a germinação. Mudas extras podem ser removidas para deixar apenas uma muda por bem.
- Água plantas a cada dois dias por imersão em apartamentos de 1 em água por 20 min, em seguida, drenar o excesso de água.
Nota: O intervalo de tempo para regar as plantas depende da sala de crescimento umidade e precisa ser determinado de based na observação contínua da facilidade de crescimento da planta do usuário. Confira as plantas diariamente para se certificar que estão bem regada. Se apenas alguns pontos estão a secar, a água as plantas a partir do topo com uma garrafa de esguicho. - Realizar ensaios de infecção patogénica (Passo 3-5) nas plantas que se encontram em ou próximo estágio de desenvolvimento # 3.50 (quando o tamanho de roseta é 50% tamanho final), o que corresponde a 3-5 semanas de idade, dependendo das condições de crescimento (fotoperíodo, temperatura). Não infectam plantas após a emergência da inflorescência (etapa # 5) devido ao aparecimento de resistência relacionada com a idade 38,39.
2. Preparação de Meios de Cultura e placas
- Faça 1 L de B do Rei (KB) meio líquido. Agitar suavemente 20 g de proteose peptona e 2 g de tri-hidrato de fosfato de potássio dibásico usando uma barra de agitação magnética, com 1.000 ml de H2O desionizada até que não haja sedimento visível. Alíquota de 100 mL em garrafas de 150 mL em vidro e um ciclo de autoclave de líquido 20 min.
- PrepararAs placas de cultura com meio sólido kb.
- Agitar suavemente H Proteose Peptona 20 g, 2 g Fosfato de potássio dibásico tri-hidratado e 15 g de agar com 1.000 ml de água desionizada 2 O. Autoclave.
- Arrefecer o meio em uma placa de agitação magnética até que é legal tocar para minimizar a condensação futuro e evitar a degradação dos antibióticos. Adicionar 18 ml estéril 80% de glicerol e 5 ml de 1 M estéril MgSO4 ao meio. Dado que Psm ES4326 transporta resistência contra estreptomicina, adicionar estreptomicina para o meio arrefecido a uma concentração final de 50 ug ml - 1.
- Despeje as placas. Preparar dois tamanhos diferentes de placas de meio KB: 100 mm x 15 mm e 150 mm x 15 mm pratos Petri. O prato de Petri contendo meio de menor serve como placa de cultura de bactérias primárias, e quanto maior placa de Petri serve como bactérias contando placa.
Nota: Para as bactérias contando as placas, placas de forma rectangular pode ser utilizada para reduzir oconsumíveis custar desde o dobro de tratamentos podem ser plotados por placa em comparação com placas redondas tradicionais.- Pour as placas antes da experiência a infecção. Armazenar KB médio placas a 4 ° C durante até 2-3 meses desde o sulfato de estreptomicina perde gradualmente a actividade antibiótica 40.
3. reforçada susceptibilidade à doença (EDS)
- Dia 1 - bacteria Streak na placa
- Dois dias antes do ensaio de EDS, raia Psm ES4326 de -80 ° C estoque de glicerol sobre uma KB-Strep placa de cultura bacteriana e incubar a 28 ° C durante 24-48 h.
- Dia 2 - início da cultura e da água plantas líquido
- Inicia-se a cultura líquida em um tubo de ensaio estéril com 4 mL de meio líquido contendo 50 ug KB mL - 1 de estreptomicina e agitar a 250 rpm, 28 ° CO / N.
Nota: Para o ensaio infecção EDS, usando 6 plantas por genótipo é recomendadoEd. Para STI e MTI ensaios, 6 plantas por genótipo por tratamento são recomendados. Para o inoculo de bactérias, é recomendado o uso de um líquido de cultura fresco com densidade óptica a 600 nm λ entre 0,3 e 0,6. - Mark os pecíolos das folhas de número 5 e 6, com um marcador à prova d'água blunt-end para facilitar a identificação de tecido infectado na amostragem (Figura 1). Para aumentar a abertura de estomas e facilitar a entrada da solução de agente patogénico para o folha, regar as plantas bem embebendo o plana da parte inferior durante 20 minutos, em seguida, drenar o excesso de água.
Nota: Como alternativa, cobrir o plano com uma cúpula transparente e mergulhe-o em água por 2-4 horas para aumentar a abertura dos estômatos. - Dia 3 - diluição Pathogen e seringa infiltração
Nota: infecção Pathogen durante a manhã é o ideal para a proliferação do patógeno e desenvolvimento dos sintomas da doença mais pronunciadas em genótipos suscetíveis. Faça todos os esforços para manter o Infectião temporização consistentes a eliminar o efeito dos ritmos circadianos e a regulação do gene diurna 41,42, o que ajuda a reduzir a variação entre as repetições experimentais.- Agregar a cultura bacteriana num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml a 9600 xg durante 2 min à temperatura ambiente e desprezar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento bacteriano com 1 ml de estéril 10 mM de MgCl2.
Nota: catiões de magnésio podem aumentar a motilidade e a adesão de P. syringae 43. Em alternativa, usar MgSO4 na mesma concentração. Água estéril é um substituto aceitável para as soluções de sais de Mg. - Dilui-se a suspensão de bactérias com 9 ml de MgCl2 10 mM, num tubo de centrífuga de 50 ml e medir a densidade óptica (OD) de bactérias com um espectrofotómetro a 600 nm = λ. Dilui-se as bactérias com 10 mM de MgCl2 para a 600nm OD final = 0,0002 para o ensaio de infecção EDS.
- Infiltrar-se na folhacom um 1 ml de extremidade embotada de seringa sem agulha (vulgarmente conhecida como a seringa de insulina) que contém a solução diluída bacteriana.
- Não encha a seringa até a sua plena capacidade. Preenchê-lo com 0,5-0,6 ml para permitir um controle muito melhor durante o processo de infiltração.
- Expor a superfície inferior da folha na parte superior do dedo indicador, e, em seguida, ajustar suavemente a posição da folha com a ajuda do polegar. Posicionar a seringa verticalmente contra a superfície da folha para assegurar que a pressão é distribuída uniformemente. Tente evitar a área da nervura central durante a infiltração para reduzir os danos da folha.
- Lentamente empurre o êmbolo para se infiltrar na solução bacteriana; entrada de líquido no mesófilo folha vai ser visualizado como indicado pela cor mais escura da folha. Tentativa de se infiltrar em toda a superfície da folha. Se isso não for realizado em uma única tentativa, escolha outro local infiltração e repetir as ações descritas acima até que toda a superfície da folha é coberto.
- Depois de concluído, o blot suavemente folha com papel absorvente para remover a solução de agente patogénico extra. Inspecione visualmente o tecido foliar infectada por danos.
Nota: A impressão seringa circular não deve ser visível após a se completar a infiltração. - Deixe as plantas infiltradas para secar durante 1-2 horas antes de voltar-los em suas condições de crescimento originais. Em seguida, pulverizar uma cúpula claro com água e cobrir as plantas infectadas durante 2 horas, em seguida, quebrar a cúpula para gerar um 2-3 na abertura e deixe-a durante todo o restante do experimento infecção.
Nota: Uma vez que P. syringae não é um patógeno aéreo, não existe risco de propagação do agente infeccioso de outras plantas cultivadas na mesma facilidade. No entanto, como precaução adicional, evitar o contacto físico entre plantas infectadas e outras plantas experimentais localizados nas proximidades. Cobrindo o plano com uma cúpula transparente irá aumentar a virulência de patógenos e acelerar a progressão da doença. oprecisa para esta etapa e duração óptima do período de cobertura precisa ser determinado com base nas condições de umidade de instalação de crescimento da planta do usuário.
- Agregar a cultura bacteriana num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml a 9600 xg durante 2 min à temperatura ambiente e desprezar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento bacteriano com 1 ml de estéril 10 mM de MgCl2.
- Dia 5 - Pré-secar as placas de mídia
- Tome as placas de 150 mm x 15 mm KB fora da unidade de armazenagem a frio e secar qualquer pré-existente a condensação de água no prato. Secar as placas, mantendo-os à temperatura ambiente durante aproximadamente 24 horas. Para acelerar este processo, coloque-os em uma câmara de fluxo laminar com suas tampas rachadas por 30-60 min.
Nota: Este passo é crítico para a formação da gota de circular sobre a superfície da placa no passo seguinte.
- Tome as placas de 150 mm x 15 mm KB fora da unidade de armazenagem a frio e secar qualquer pré-existente a condensação de água no prato. Secar as placas, mantendo-os à temperatura ambiente durante aproximadamente 24 horas. Para acelerar este processo, coloque-os em uma câmara de fluxo laminar com suas tampas rachadas por 30-60 min.
- Dia 6 - Quantificar o crescimento de patógenos
Nota: O procedimento seguinte quantificação agente patogénico pode ser realizada em pontos de tempo anteriores após a infecção para confirmar quantidades iguais de bactérias são fornecidos na folha, especialmente quando as plantas alteraram a morfologia da folha.- Processar o tecido infectado após o surgimentode clorose indicado pelo amarelecimento do tecido infectado nos genótipos susceptíveis, mas antes do desenvolvimento de lesões necróticas (Figura 2B).
Nota: O tempo de amostragem sugerida é de três dias após a inoculação do patógeno. No entanto, uma vez que o crescimento do patógeno depende de uma série de factores ambientais, a duração da incubação pode variar dentro de uma gama de 2 ½ 3 dias e meio e tem de ser determinado por observações cuidadosas da progressão da infecção na instalação de crescimento de plantas do utilizador.- Preparar tubos de moagem 6 para cada genótipo (Figura 1). Coloque uma bola de aço inoxidável de moagem e adicionar 500 mL estéril 10 mM de MgCl2 para a cada tubo.
- Retire a folha infectada a partir da planta e perfurar um disco de folha com um furador de papel 1-hole (Figura 1).
Nota: Para minimizar o erro de amostragem, tente dar um soco cada folha amostrada na mesma posição. Amostragem do disco de folha a partir do topoda folha é recomendado. - Aleatoriamente colocar 2 discos foliares (a partir de duas plantas diferentes) para cada tubo de moagem usando uma pinça.
- Veda-se o tubo e homogeneizar o tecido com um homogeneizador de alto rendimento à velocidade máxima (1600 batidas por minuto) durante 10 min. Repita este processo, se necessário até que o tecido é bem homogeneizado e as soluções ficam verdes devido à liberação de clorofila das folhas infectadas.
- Enquanto espera para a homogeneização, preencher as 6 primeiras linhas de uma placa de cultura de 96 poços com 180 ul de 10 mM de MgCl 2, utilizando uma pipeta multi-canal e um reservatório de pipetagem.
- Após a moagem, transferir 20 ul de suspensão de tecido do solo na primeira fila da placa de 96 poços e misturar por pipetagem repetida do líquido para cima e para baixo. Se pequenos fragmentos de tecido entupir a ponta, prendê-lo por 2-3 mm, para ajudar a obter o volume correcto da solução.
- Para proporcionar espaço suficiente para a gota na parte superior of a placa, o espaço de tecido a partir de diferentes genótipos em linhas alternativas (Figura 1). Para preparar uma dez vezes diluição em série, transferir 20 ul líquido na segunda linha e repita este procedimento até o sexto diluição.
- Transferir 20 uL da solução a partir da placa de 96 poços para o 150 mm x 15 mm placa KB utilizando pontas de pipeta divididas (Figura 1). Trabalho a partir da suspensão mais diluído para o mais concentrado.
Nota: Procedendo de mais diluída até mais concentrada torna desnecessário mudar as pontas das pipetas entre as diluições. Se a placa é pré-secou-se bem, a gotícula transferido deve permanecer intacta no topo do meio até que seja absorvido (geralmente 15-30 minutos). O tempo de secagem varia de acordo com a RT e umidade. - Seca-se a placa à temperatura ambiente com tampa rachada. Uma vez que não mais de líquido pode ser observada na superfície da placa, fechar a tampa, invertido e incubar a placa à temperatura ambiente ou a 28 ° C uma incubadora.
- Incubar as placas por 40-60 horas até que as colónias tornam-se visíveis. Confirmar que o crescimento nas placas reflecte a previsível queda de 10 vezes em unidades formadoras de colónias (ufc) (Figura 2C). Contar as bactérias antes que elas cresçam demais e colônias fundir. Determinar o número de bactérias na diluição mais baixa que não têm as colónias que se sobrepõem. Geralmente, a diluição preferido para ser contado irá conter entre 10-50 colónias.
Nota: Variação pode estar presente entre as repetições técnicas; por conseguinte, a mais baixa diluição para cada repetição devem ser determinadas separadamente. - Para calcular os níveis de proliferação bacteriana, documentar o número da linha (R), bem como o número de bactérias no interior de cada replicado técnica (T), por escrito. Determinar o número de unidades formadoras de colônia - ufc / disco de folha através da fórmula: disco ufc / folha = (T × 10 R / 20) × 500/2
- Digite os dados no seguinte modelo de planilha para produce um gráfico (Figura 1) (para arquivo de modelo de análise de dados da planilha, consulte a Tabela 2). Cada ponto de dados é representado como a média de seis repetições técnica para uma escala logarítmica. As barras de erro representam 95% de intervalo de confiança da média (n = 6).
Nota: O cálculo dos intervalos de confiança de 95% necessita de ser ajustada com base no número de repetições técnicas.
- Processar o tecido infectado após o surgimentode clorose indicado pelo amarelecimento do tecido infectado nos genótipos susceptíveis, mas antes do desenvolvimento de lesões necróticas (Figura 2B).
- Inicia-se a cultura líquida em um tubo de ensaio estéril com 4 mL de meio líquido contendo 50 ug KB mL - 1 de estreptomicina e agitar a 250 rpm, 28 ° CO / N.
4. Imunidade SA-Provocado (STI)
- Dia 1: Seguir o mesmo procedimento como descrito no passo 3.1.
- Dia 2: Além de regar as plantas e iniciando na cultura bacteriana líquida (Passo 3.2), induzir resistência por aplicação externa de SA derivado de salicilato de sódio 21.
Nota: Pure SA tem baixa solubilidade em água e requer ajuste de pH antes, portanto, não é recomendado para este ensaio.- Para induzir defesas mediadas SA contra P. syringae e primos as plantas para futuras infecções 21,24, plantas de pulverização com uma fina névoa de 1 mM de salicilato de sódio ou H 2 O (16-24) como falsa h antes da infecção do patógeno.
- Dia 3: Preparar a diluição patógeno para OD 600 nm = 0,001 e empurrar as bactérias na superfície da folha inteira por infiltração seringa (Passo 3.3).
- Dia 6: Para a quantificação do patógeno e processo de contagem, siga o procedimento tal como descrito para o ensaio de EDS (Passos 3.4 e 3.5). Placa e contar o H 2 O e salicilato de sódio - pré-tratados amostras separadamente. Para a Arabidopsis de tipo selvagem, uma redução de 1-2 log em crescimento do patógeno é esperado nos salicilato de sódio - plantas pré-tratadas.
5. Provocado-MAMP Immunity (MTI)
Nota: Neste ensaio, usamos de Arabidopsis de tipo selvagem Col-0 e mutantes fls2 EFR e plantas. FLS2 e EFR são plasma localizada à membrana Pattern Recognition Receptors (PRRs) que pode reconhecer flg22 e elf18, respectively 9,10. Perda de cada PRR resulta na insensibilidade ao tipo específico de MAMP, o que é indicado pelo crescimento do patógeno inalterado no mutante pré-tratamento seguinte externa MAMP e seringa infiltração com Psm ES4326.
- Dia 1 e 2: Siga o mesmo procedimento descrito no Passo 3.1 e 3.2.
- Dia 3: pré-tratamento MAMP e infecção Pathogen
- Para estabelecer a imunidade MAMP-Provocado, prepare uma solução? M de flg22 flagellin epitopo ou EF-Tu epitopo elf18 e seringa infiltrar-lo em toda a superfície da folha 4 h antes da infecção patógeno (Passos 3.3.3-3.3.6). Isto irá permitir a indução de defesas mediadas por MAMP contra P. syringae e injetar as plantas para uma futura infecção 6,37.
Nota: Os dados de microarranjos publicamente disponíveis revelou a reprogramação máximo da transcrição de genes que respondem acontece MAMP 4 h após flg22 ou elf18 tratamento 37,44. Assim, 4 hr é o recomendadoduração do pré-tratamento MAMP que resulta na obtenção de uma clara diferença no crescimento do patógeno entre MAMP-tratada Col-0 e fls2 EFR e mutantes. - Remover a solução adicional MAMP com papel absorvente e deixar as plantas a descoberto para acelerar o processo de absorção de líquido no interior da folha. Para ter em conta o efeito da seringa ferindo infiltração pressão, infiltrar-se H 2 O para as folhas das plantas de controlo.
- Preparar a diluição patógeno OD 600 nm = 0,001 e empurrar as bactérias na superfície da folha inteira de MAMP / H2O pré-tratada por meio de seringa folha infiltração (Passo 3.3).
- Para estabelecer a imunidade MAMP-Provocado, prepare uma solução? M de flg22 flagellin epitopo ou EF-Tu epitopo elf18 e seringa infiltrar-lo em toda a superfície da folha 4 h antes da infecção patógeno (Passos 3.3.3-3.3.6). Isto irá permitir a indução de defesas mediadas por MAMP contra P. syringae e injetar as plantas para uma futura infecção 6,37.
- Dia 6: Para a quantificação do patógeno e processo de contagem, siga o procedimento tal como descrito no passo 3.4 e 3.5. Placa e contar o H 2 O e amostras pré-tratadas separadamente-MAMP. Na Arabidopsis de tipo selvagem, uma redução de log 1-2 no crescimento do patógeno está previsto para as plantas pré-tratados com MAMP, com um pouco forteer redução mediada por flg22 comparação com elf18.
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Representative Results
O protocolo aqui descrito representa um P. otimizado syringae ensaio seringa infiltração para avaliar quantitativamente a resposta imune em plantas de Arabidopsis. Tal como ilustrado na Figura 1, a seringa infiltração do PSM ES4326 é seguido por extracção e quantificação patogénio através de diluições em série e as colónias enumeração.
Tal como descrito no Passo 3 dentro do texto do protocolo, susceptibilidade aumentada da doença (EDS) contra Psm ES4326 pode ser avaliada por uma infecção com um inoculo com OD = 0,0002. Como mostrado na Figura 3, os mutantes npr1-1 altamente susceptíveis têm aproximadamente 2,5 log (300 vezes) mais o crescimento de agentes patogénicos em comparação com a de tipo selvagem Col-0 plantas. Dependendo das condições experimentais, as plantas npr1-1 pode suportar até 3,0 log de crescimento mais do que bacteriana Col-0, com os resultados mais comuns dentro da gama de 1,5-2,5 log. Portanto, este burro EDSay fornece uma ampla janela de diferença, em que os investigadores pode ser capaz de colocar os seus mutantes de Arabidopsis e transgénicos para identificar genes candidatos potencialmente envolvidas na resposta imune planta.
Além de determinar a EDS, o PSM ES4326 ensaio seringa infiltração pode ser modificado para dissecar diferentes camadas de resposta imune. Para avaliar a imunidade Ácido Salicílico-disparado, a aplicação externa do salicilato química de sódio é utilizado para desencadear a resposta imune, o qual é quantificado pelo crescimento do patógeno (Figura 4A). A perda de NPR1, que funciona como receptor principal SA e co-regulador da transcrição de genes alvo SA-dependentes, leva a insensibilidade à aplicação exógena de derivado de ácido salicílico. Esta insensibilidade aos SA é demonstrado pelo crescimento do patógeno inalterado nas plantas pré-tratados npr1-1 salicilato de sódio, em contraste com uma redução acentuada na Col-0 plantas (20 vezes menos Pathog en mediante aplicação de salicilato de sódio) (Figura 4B).
Para a caracterização da imunidade, o pré-tratamento Provocado-MAMP com flg22 ou elf18 foi realizada como demonstrado na Figura 5A. Para caracterizar a imunidade desencadeada-flagellin, Col-0 e plantas mutantes fls2 são usados. FLS2, como um receptor-quinase localizado na membrana, reconhece flg22 e desencadeia MTI 9. Como demonstrado na Figura 5B, os tratados com flg22 Col-0 plantas suportado um ~ 1 log (10 vezes) redução da população bacteriana, enquanto as plantas mutantes fls2 falhou para desencadear o efeito restrição do crescimento bacteriano. Do mesmo modo, a perda de receptor de EF-Tu EFR nas plantas mutantes efr leva a insensibilidade à elf18 pré-tratamento, como demonstrado pelo crescimento do patógeno inalterado após a elf18 pré-tratamento (Figura 5B).
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Figura 1. Representação esquemática do Psm ES4326 ensaio seringa infiltração em plantas de Arabidopsis. Deixa número 5 e 6 do adulto do solo plantas de Arabidopsis adultos são marcadas e infectados com Psm ES4326 através de seringa infiltração. Após o surgimento dos sintomas da doença, retire as folhas e discos de folha colheita para homogeneização de tecido. Bem-tecido homogeneizado é diluído em série em placas de 96 poços antes de se transferir para uma placa de contagem de bactérias. Depois de colônias emergência na placa, contar o número de bactérias e processar os dados para gerar um gráfico. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Os procedimentos representativos do ensaio EDS.(A) Panelas são cobertos com uma cúpula transparente pulverizado em água após a semeadura das sementes. (B) sintomas representativos nas folhas npr1-1 submetidos ao ensaio EDS Col-0 e (OD 600 nm = 0,0002) 3 dias após a inoculação. Nota clorose grave em npr1-1 e a aparência quase normal de Col-0. (C) As diluições em série do PSM ES4326 que crescem em KB (50 ug / ml de estreptomicina) meios placa após 45 ~ hr de incubação. Cinco diluições são visíveis. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Os resultados representativos do ensaio EDS crescimento Psm ES4326 (unidades formadoras de colónias -. Ufc / disco de folha, expressed numa escala logarítmica) foi quantificado em 4 semanas de idade Col-0 e npr1-1 plantas 3 dias após a inoculação (DO 600nm = 0,0002). As barras de erro representam os intervalos de confiança de 95% da média (n = 6). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Representante procedimento e os resultados do ensaio de STI. (A) Representação esquemática da Imunidade Ácido Salicílico-Provocado (STI) de ensaio. Immunity (B) Ácido Salicílico-Provocado foi quantificada com base no crescimento do patógeno em plantas pré-tratadas com 1 mM salicilato de sódio ou de H2O 16 h antes da infiltração Psm ES4326 seringa (DO 600nm = 0,001). Crescimento do patógeno foi quantificada 3dias após a inoculação. As barras de erro representam os intervalos de confiança de 95% da média (n = 6). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. procedimento Representante e resultados do ensaio MTI. (A) Representação esquemática da imunidade MAMP-Provocado (MTI) ensaio. (B) MTI foi quantificada por crescimento de patógenos em plantas pré-tratados com uma solução 1 | iM de flg22, elf18 ou H2O (como controlo) 4 h antes do Psm ES4326 infiltração seringa (DO 600 nm = 0,001). Crescimento do patógeno foi quantificada 3 dias após a inoculação. As barras de erro representam os intervalos de confiança de 95% da média (n = 6). Por favor, clique elere para ver uma versão maior desta figura.
| Edição | Causas possíveis | Acções recomendadas |
| N crescimento de bactérias no meio líquido após a cultura D / N | Redução da atividade de bactérias | Iniciam uma cultura de líquido a partir de uma placa recentemente riscada |
| Impressão seringa Circular apresenta na folha depois da seringa infiltração | Demasiada pressão durante a infiltração | Reduzir o pressue durante a infiltração |
| Impressão seringa parcial apresenta na folha depois da seringa infiltração | Posicionamento inadequado da seringa | Ajustar a seringa a ser posicionado contra a superfície vertical, a folha |
| Wilts Folha wthtin algumas horas após a infiltração | Solução muito patógeno também é infiltrada na folha | Parar infiltrating imediatamente após toda a superfície da folha fica verde mais escuro na cor |
| Não há sintomas da doença três dias após a infecção | A umidade é muito baixa para patógeno a proliferar | Aumentar a umidade onde as plantas infectadas são mantidas |
| Patógeno entra estágio necrotrophic em ou antes de 3 de dpi | Concentração incorreta de solução patógeno | Uso OD 600nm = 0,0002 para o ensaio de EDS; confirmar diluição utilizando espectrofotômetro indepedent |
| Gotas fundir no topo da contagem de bactérias placa | Contagem de bactérias placa não está devidamente secas | Pré-seca a placa O / N antes do uso |
| Diluição patógeno não representa redução de 10 vezes | Diluição não for executada com precisão | Usar uma pipeta de multi-canal bem calibrado para a transferência de líquido; confirmar que todo o líquido é dispensado |
| Crescimento de patógenos no tipo selvagem excede 8 log ufc / disco de folha | Overgrew patógeno dentro do tecido infectado - amostragem realizada demasiado tarde | Amostra infectada tecido após o aparecimento de clorose |
| Variação grande entre as repetições técnicos | As plantas não estão no mesmo estágio de desenvolvimento ou número de folhas infiltradas é inconsistente | Utilize apenas as plantas no mesmo estágio de desenvolvimento para a infecção. Confirme germinação síncrona. Infectar número de folhas consistente entre diferentes plantas |
Tabela 1. Resolução de problemas do ensaio seringa infiltração.
Por favor clique aqui para ver Tabela 2.
Tabela 2. Planilha para análise estatística dos dados de crescimento do patógeno.
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Discussion
Com a diminuição da terra disponível e aumento da população, os investigadores de todo o mundo são desafiados com as necessidades prementes para melhoramento de culturas. O rendimento pode ser muito influenciado por vários estresses bióticos e abióticos. Entre eles, a infecção por patógeno é uma das principais causas de redução do rendimento das culturas, responsável por aproximadamente 12% as perdas em os EUA sozinhos 45. Para resolver este problema, a pesquisa maciça tem sido conduzida no modelo Arabidopsis - P. syringae Patossistema para caracterizar exaustivamente os componentes e mecanismos reguladores das respostas imunes das plantas. Aqui, apresentamos um P. otimizado syringae ES4326 ensaio seringa infiltração para avaliar quantitativamente as diferenças sutis na planta resposta imune em todo o nível da planta.
Embora ensaios de infecção múltiplos agentes patogénicos têm sido desenvolvidas para caracterizar a resposta imune 29,35 planta, a infiltração de seringa forneceum sistema bem controlado, onde quantidades iguais de agente patogénico são administrados no tecido infectado. Em outros ensaios de infecção, incluindo mergulho e inoculação inoculação de pulverização, o agente patogénico é aplicada a todo o tecido da antena, incluindo cotilédones, bem como 34 folhas verdadeiras. Tem sido relatado que cotilédones de erecta ecotype Landsberg (L er) são muito mais suscetíveis ao patógeno durante ensaio de inoculação mergulho, o que pode distorcer os dados e levar a conclusões equivocadas sobre a resistência a doenças em geral 34. Além disso, os dois ensaios acima mencionados necessitam para introduzir o agente patogénico da folha através de estomas, que é controlada por vários factores ambientais, incluindo a humidade e luz. Flutuação de estes factores contribuem para um nível mais elevado de variação dos sintomas da doença em comparação com o ensaio de infiltração seringa 35. Por infiltração por vácuo, as principais desvantagens incluem a necessidade de grandes volumes de solução de agente patogénico, dificuldadepara se infiltrar de forma eficaz todas as folhas enquanto evitar danos, e considerável intensidade de trabalho 29. Além disso, as plantas infectadas com pulverização, mergulho ou inoculação de vácuo são menos propensos a recuperar uma vez que toda a plântula está infectado com patógeno. Dadas as numerosas limitações de outros métodos, o teste de infiltração de seringa continua a ser o método de escolha para atingir a progressão da doença uniforme e altamente previsível e quantificação precisas do agente patogénico para caracterizar de forma fiável a resposta imunitária dentro da folha verdadeira. Além disso, este ensaio pode ser facilmente modificado para caracterizar Imunidade MAMP-Provocado e sistêmica a resistência adquirida. Além disso, prometendo futuras aplicações da técnica poderia ser aplicada para efeitos de teste de vários fitormônios, produtos químicos ou inibidores de pré-tratamentos, seguido por patógeno seringa infiltração para dissecar diferentes camadas da planta rede de sinalização imune ou identificar papéis de uma via específica na planta imunológico resposta. Wi infecçãoth uma dose aumentada do (600nm OD = 0,001) patógeno na ausência de qualquer defesa priming pré-tratamentos, conhecidos como o teste de maior resistência à doença (EDR), é uma outra modificação útil do presente método que pode ser utilizado para identificar mutantes ou transgênicos com resistência a doenças reforçada.
Deve notar-se que a infiltração ensaio seringa não se aplica para a caracterização da fase de pré-invasivo da resposta de defesa uma vez que o agente patogénico é fornecido directamente para o tecido da folha através de estomas. Fechamento dos estômatos, que serve como barreira física para a entrada de agentes patogénicos, muitas vezes é desencadeada para restringir a entrada de agentes patogénicos após o estabelecimento de Provocado-MAMP Immunity 46. Além disso, ácido abscísico phytohormone contribui para fechamento dos estômatos durante a fase de pré-invasiva 47. Portanto, os métodos de pulverização ou imersão pode ser vantajoso caracterizar a camada estomática da resposta imune, apesar ressalvas associadoscom esses tipos de inoculações, 29 discutido acima.
Desde interações planta-patógeno pode ser alterada por vários fatores bióticos e abióticos, é fundamental para se concentrar nas etapas críticas a seguir enumerados no protocolo para alcançar infecção bem sucedida e obter resultados confiáveis:
Atividade status de plantas e bactérias
Plantas de Arabidopsis podem ser facilmente estressados por vários fatores abióticos, incluindo a temperatura sub-ótima, seca e estresse osmótico, e desencadear respostas celulares que interferem com a saída imune 48. Portanto, é crucial para crescer plantas sob condições de crescimento óptimas e protegê-los contra as agressões ambientais. Além disso, desde o estágio de desenvolvimento da folha infectada também pode alterar o resultado experimental, é necessário para infectar de forma consistente número de folhas 5 e 6 para evitar artefatos. Progredindo ao longo de estágios de desenvolvimento, re elevadasistance contra alguns patógenos virulentos e avirulentos correlaciona-se com a transição do estágio vegetativo até a fase reprodutiva de plantas de Arabidopsis. Esta resistência dinâmica ao longo do estágio de desenvolvimento é chamado de Age-Related Resistência (ARR) 38. Para evitar a interferência com o ARR verdadeira resposta imune, é crítico para executar a infecção no estádio de desenvolvimento correcto, conforme indicado no protocolo e tentar absterem-se de experiências de infecção após o início da fase fértil. Além disso, fitness e atividade bacteriana afectar substancialmente a proliferação do patógeno dentro do tecido infectado. Assim, é importante para iniciar a cultura bacteriana líquida a partir de uma placa de cultura recentemente riscada que é não mais de 2 dias de idade.
Skill infiltração seringa
Durante a infiltração seringa, para tentar evitar qualquer dano físico para a folha uma vez que feriu efeito é bem conhecida para interferir com oresposta imune planta, principalmente via de sinalização mediada por ácido jasmônico que pode suprimir defesa SA-49 vias acionada. Após a infecção, uma folha que foi infiltrada deve recuperar totalmente com a aparência física normal, sem qualquer dano visual. Para os iniciantes, é aconselhável praticar esta técnica usando plantas não-experimentais antes da realização do ensaio seringa infiltração Psm ES4326.
Extração patógeno e diluição
Para medir com precisão o crescimento de patógenos, é vital para extrair de forma eficiente patógeno fora do tecido da planta infectada. Em comparação com outros métodos de extracção, através da homogeneização do tecido homogeneizadores mecânicos de alta produtividade extrai eficazmente agente patogénico, sem a perda da amostra de tecido e a contaminação cruzada. Subsequentemente, as diluições da amostra deve ser levada a cabo precisamente com uma pipeta multi-canal calibrado de forma fiável para reduzir o erro de pipetagem.Desvio tão pouco quanto ± 1 uL de diluição no processo de se traduziria em uma diferença de ~ 5% para a quantificação do crescimento do patógeno. Para obter mais exemplos de resolução de problemas do ensaio de seringa infiltração, por favor, consulte a Tabela 1.
Em conclusão, podemos descrever o otimizado o ensaio seringa infiltração Psm ES4326 em Arabidopsis para quantitativamente e de forma confiável avaliar a resposta imune das plantas. Com a ajuda deste Patossistema, a compreensão da interacção planta-patógeno será acelerado no laboratório e, eventualmente, ser aplicado para a protecção das culturas no campo.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MetroMix 360 | Grosouth | SNGMM360 | |
| Large pots | Grosouth | TEKUVCC10TC | |
| 12 x 6 Inserts | Grosouth | LM1206 | |
| 11x 21 Flats with no holes | Grosouth | LM1020 | |
| 11x 21 Flats with holes | Grosouth | LM1020H | |
| Vinyl propagation domes | Grosouth | CW-221 | |
| Proteose Peptone | Fisher Scientific | DF0122-17-4 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate | MP Biomedicals | 151946 | |
| Agar | Fisher Scientific | A360-500 | |
| Streptomycin sulfate | Bio Basic Inc | SB0494 | |
| 100 x 15 mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 150 x 15 mm Petri dishes | Fisher Scientific | R80150 | |
| Rectangular plate | Fisher Scientific | 12-565-450 | |
| MgCl2 Hexahydrate | Bio Basic Inc | MB0328 | |
| Glycerol | Bio Basic Inc | GB0232 | |
| MgSO4 | Bio Basic Inc | MN1988 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | NC9992493 | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| Grinding tubes | Denville Scientific | B1257 | |
| Caps for grinding tubes | Denville Scientific | B1254 | |
| Stainless steel grinding ball | Fisher Scientific | 2150 | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 12-556-008 | |
| Sodium Salicylate | Sigma Aldrich | s3007-1kg | |
| flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA) | Genescript | Made to order | |
| elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | Genescript | Made to order | |
| Hole puncher | Staples | 146308 | |
| Biophotometer plus | Eppendorf | 952000006 | |
| PowerGen High-Throughput Homogenizer | Fisher Scientific | 02-215-503 | |
| Accu spin micro centrifuge | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Multichannel pipette (10-100 µl) | Eppendorf | 3122 000.043 | |
| Multichannel pipette (30-300 µl) | Eppendorf | 3122 000.060 | |
| Pipette (20µl) | Eppendorf | 3120 000.038 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 3552-HR | |
| Sharpie permanent marker | Staples | 507130 | |
| 1.5 ml tube | Eppendorf | 22363204 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 08-890 |
References
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