Abstract
In assenza di cellule immunitarie specializzate mobili, piante utilizzano il loro localizzata morte cellulare programmata e Sistemica resistenza acquisita per difendersi contro l'attacco patogeno. Il contributo di uno specifico gene Arabidopsis per la risposta immunitaria impianto complessivo può essere specifico e quantitativamente valutata analizzando la crescita dei patogeni all'interno del tessuto infetto. Per oltre tre decenni, il batterio Pseudomonas syringae pv hemibiotrophic. Maculicola ES4326 (PSM ES4326) è stato ampiamente applicato come modello patogeno per studiare i meccanismi molecolari alla base della risposta immunitaria Arabidopsis. Per offrire patogeni nel tessuto foglia, sono stabilite diversi metodi di inoculazione, ad esempio, la siringa infiltrazione, tuffo inoculazione, spray, infiltrazione vuoto e inondazioni inoculazione. Il protocollo che segue descrive un metodo siringa infiltrazione ottimizzato per fornire virulenta Psm ES4326 in foglie di adultisuolo coltivato piante di Arabidopsis e schermo per una migliore precisione predisposizione alle malattie (EDS) nei confronti di questo patogeno. Inoltre, questo protocollo può essere integrato con più pre-trattamenti per sezionare ulteriormente specifici difetti immunitari all'interno di diversi livelli di difesa vegetale, compresi l'acido salicilico (SA) Immunità -Triggered (STI) e Immunità MAMP-Triggered (MTI).
Introduction
A causa della loro natura, sessili, piante sono costantemente minacciati da una pletora di agenti patogeni che espongono diversi stili di vita e le strategie nutrizionali 1. In prima approssimazione, gli agenti patogeni biotrofici mantengono il loro ospite vivo per recuperare le sostanze nutritive, mentre agenti patogeni necrotrophic tossine attivamente segreti ed enzimi per uccidere tessuto ospite e nutrono le cellule morte 1. Un altro gruppo di agenti patogeni, hemibiotrophs chiamati, inizia il loro corso l'infezione con il palco biotrofico e si sposta alla fase necrotrophic al raggiungimento di una certa soglia di accumulo patogeno 2. Al fine di difendersi efficacemente contro questi microrganismi, piante hanno sviluppato un complesso sistema immunitario innato dotato di molteplici meccanismi di sorveglianza per rilevare l'attacco patogeno e innescare localizzato morte cellulare programmata 3 e sistemica la resistenza acquisita (SAR) 4. La ricerca attuale è focalizzata sulla caratterizzazione del sig essenzialenaling componenti e incrociati colloqui all'interno del sistema immunitario pianta 5.
Come proposto nel modello "zigzag" 5, il primo strato della risposta immunitaria innata pianta richiede la presenza di plasma-membrana localizzata Motivo recettori di riconoscimento (PRR) per rilevare l'invasione di un microbo. PRR sono in grado di riconoscere i modelli Microbe-Associated Molecular (mAmps) e stabilire Immunità MAMP-Triggered (MTI) 6. Oltre ad indurre una upregulation trascrizionale di geni che codificano le proteine PR antimicrobici 7, MTI porta ad una serie di eventi che arrestare la crescita dei patogeni, inclusa la produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e reattive di azoto specie (RNS), deposizione di callosio a parete cellulare nonché l'attivazione della chinasi di segnalazione molteplici vie 8.
Fino ad oggi, diversi piani di gestione pluriennali sono stati identificati per innescare MTI in Arabidopsis, compresi flg22 batterica 9 10 (18 aminoacidi dalla batterica fattore di allungamento Tu) e un componente strutturale della parete cellulare peptidoglicani 11. Per stabilire una infezione di successo, alcuni patogeni specializzate hanno sviluppato la capacità di proteine effettrici virulenza segrete negli spazi intracellulari o intercellulari, e quindi reprimere MTI e innescare suscettibilità Effector-Triggered (ETS) 12,13. Ad esempio, effettori di virulenza possono inattivare proteine Mitogen-chinasi attivata (MAPK) fosforilazione cascate di MTI per indurre lo sviluppo della malattia entro il tessuto infetto 14-16. Durante la co-evoluzione dinamica tra host e patogeni, piante anche sviluppato la strategia di contrattacco di riconoscere le proteine effettrici e attenuare la virulenza patogeno molecole 17. Questo riconoscimento diretto o indiretto effettrici è mediata dalla resistenza alle malattie (R) 18 proteine. La maggior parte di torlo sono membri di NB-LRR (Nucleotide Binding e leucina-ricchi ripetizioni) della famiglia 19. La percezione di un effettore avirulent da una proteina R provoca una risposta più forte e più ampia immunitario caratterizzato come Immunità Effector-Triggered (ETI) 20. Oltre inducendo l'espressione di geni di difesa 21 e la produzione di metaboliti difesa 22, ETI spesso porta ad una rapida morte cellulare programmata localizzata noto come Hypersensitive Response (HR) per limitare il patogeno di diffondersi nel tessuto adiacente 3.
Oltre alla morte cellulare programmata localizzato 23, le piante sono in grado di avviare un lungo periodo e risposta immunitaria a livello di sistema denominato Systemic Acquired Resistance (SAR) 4. Su sfida con un agente patogeno biotrofico, cellule vegetali innescano la biosintesi e l'accumulo di un phytohormone endogena acido salicilico (SA) e delle proteine PR in entrambi i tessuti locali e sistemiche 24. Attraverso til suo processo, un elevato stato di preparazione si ottiene nelle foglie non infetti che consente il montaggio risposte di difesa veloce durante una successiva infezione da un ampio spettro di agenti patogeni 24. SA ed i suoi analoghi sintetici come benzo (1,2,3) -thiadiazole-7-carbothioic estere dell'acido S-metil (BTH) e acido 2,6-dichloroisonicotinic (INA) sono in grado di indurre chimicamente acido salicilico (SA) Immunità -Triggered (STI), su richiesta esterna 24. Nonexpressor di-Patogenesi correlati geni 1 (NPR1) si propone di essere uno dei recettori SA e funziona come un regolatore trascrizionale importante durante risposta di difesa SA-mediata sia nei tessuti locali e sistemiche 21,25,26. E 'stato definitivamente dimostrato che NPR1 è necessario per istituzione SAR e la perdita di NPR1 conduce alla drammatica suscettibilità verso Pseudomonas syringae 25.
Per caratterizzare ampiamente il contributo molecolare della piantacomponenti nelle interazioni pianta-patogeno, molteplici test biologici sono stati sviluppati per misurare gli eventi di difesa specifici, tra cui i ROS scoppio 27, callosio di deposizione 28, espressione geni di difesa e l'accumulo dei loro prodotti proteici 21. Mentre questi dosaggi individuali possono fornire intuizioni in una forma specifica della risposta immunitaria pianta, nessuno di essi, tuttavia, sono in grado di rappresentare la risposta di difesa completa sull'intera livello di impianto. Al contrario, la quantificazione della crescita dei patogeni dopo l'infezione fornisce una stima complessiva della risposta immunitaria a livello di organismi. Pertanto, lo sviluppo e l'ottimizzazione di un preciso e altamente standardizzata saggio patogeno inoculazione è fondamentale per alimentare la ricerca e le scoperte sulle risposte immunitarie Arabidopsis.
Pseudomonas syringae, un batterio Gram-negativi, è stato identificato come un phytopathogen in grado di causare la malattia in una vasta gamma di piante ospiti tra cui Arabidopsè 29. Poiché il sistema pianta-patogeno modello Arabidopsis - P. interazione syringae è stato ampiamente applicato per comprendere i meccanismi molecolari alla base della pianta risposte di difesa 29. Finora, oltre 50 P. patovar syringae sono stati identificati in base alla loro capacità di infettare diverse specie vegetali 30 . P. syringae pv. DC3000 pomodoro (Pst DC3000) 31 e P. syringae pv. maculicola ES4326 (PSM ES4326) 32 sono i due ceppi virulenti più utilizzati e ampiamente caratterizzate. Oltre ad essere riconosciuto dalla pianta e innescando la risposta MTI, Pst DC3000 e Psm ES4326 sono in grado di secernere proteine effettrici virulenti per sopprimere MTI e attivare ETS per favorire la crescita del 31,33 patogeno.
Per sezionare funzionalmente l'interazione tra Arabidopsis e P. syringae, multiplo0; metodi di infezione patogeni sono stati sviluppati sulla base del metodo di consegna patogeno. Per gli impianti di terreno coltivati, agente patogeno può essere trasportata da siringa infiltrazione, infiltrazione di vuoto, tuffo inoculazione e spruzzo inoculazione 29,34. Recentemente, piantina saggio alluvione-inoculazione è stato sviluppato per eseguire grandi schermi su colture di tessuti piastre-grown giovani piante di Arabidopsis 35. Siringa infiltrazione, come una delle soluzione più utilizzata, garantisce manualmente patogeno nel nell'apoplasto attraverso le aperture dell'anta naturale chiamati stomi 29. Attraverso questo approccio, gli importi uguali di P. syringae può essere infiltrato nella foglia infetta e la forza della risposta immunitaria pianta è inversamente correlato ai livelli di crescita dei patogeni. Pertanto, la quantificazione della crescita dei patogeni serve come un approccio ottimale per valutare la funzione immunitaria a livello di tutta la pianta. Inoltre, siringa infiltrazione può distinguere il tessuto locale e sistemica, che può be applicabile nel caratterizzare i meccanismi molecolari alla base SAR 36.
Nel seguente protocollo, si descrive una siringa infiltrazione dosaggio ottimizzato con PSM ES4326 per lo screening mutanti di Arabidopsis per una maggiore suscettibilità alle malattie (EDS). Questo protocollo si avvarrà di due genotipi di Arabidopsis: una wild-type ecotipo Columbia-0 (Col-0) piante (controllo) e mutanti npr1-1 perdita di funzione (ipersensibili) che sarà infettato con ceppo batterico virulento Psm ES4326 37. Il mutante npr1-1 porta una mutazione puntiforme all'interno della sequenza consenso ankyrin-repeat della molecola NPR1, che altera la istidina altamente conservata in tirosina e rende la proteina non funzionale 25. Inoltre, una serie di modifiche del dosaggio siringa infiltrazione sono descritte che consentono la quantificazione dei difetti negli strati specifici della risposta immunitaria, compresi MTI e STI.
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Protocol
Il testo che segue descrive un protocollo graduale a compiere ottimizzato Psm ES4326 saggio siringa infiltrazione in Arabidopsis. Principali procedure di questo test sono rappresentate in un diagramma di flusso semplificato (grafico 1).
1. Impianto condizioni di crescita
- Seminare i semi
- Preparare 2 vasetti (4 di diametro, 3,75 in alto) senza bloccare pieni di pentole suolo e le acque, mettetelo a bagno dalla parte inferiore O / N prima di scaricare l'acqua in eccesso.
- Seminare 50-100 semi di Arabidopsis, wild-type Col-0 o npr1-1 mutanti, su ogni piatto con un piegato 70 mm del peso di foglio o altra carta.
- Coprire la pentola con una cupola trasparente spruzzato acqua per aumentare l'umidità relativa al 80-90% (Figura 2A).
- Incubare la pentola a 4 ° C per 72 ore per permettere la stratificazione completa e germinazione sincrona.
- Trasferire il piatto per le condizioni di crescita normali (luce 12 ore/ 12 hr scuro, 21 ° C, l'intensità della luce 100 micromol / m 2 / sec, umidità relativa del 40%) per consentire il seme di germinare. Crack la cupola per generare un 2-3 in apertura subito dopo il trasferimento alla camera di crescita, che contribuirà a evitare la formazione di condensa.
- Quando la prima foglia vera raggiunge la dimensione di 2-3 mm di lunghezza, trapiantare le piantine dalla pentola per un 72-pozzetti riempiti con terreno pianeggiante.
- Utilizzare un dito o un puntale 1 ml per creare un 1-in depressione profonda al centro della superficie del terreno in piano.
- Separare delicatamente le singole piantine con il minor danno possibile radice. Prendere con cautela piantine che hanno radici intatte con una pinza.
- Posizionare un singolo piantina separata insieme al ciuffo terreno aderente per ridurre al minimo urto il trapianto nella depressione e tamponando delicatamente verso il basso il terreno circostante per riempire la depressione. Eliminare le piantine in più e il suolo in contenitore per rifiuti biologici e smaltire a normacon le linee guida locali di smaltimento dei rifiuti a rischio biologico.
- Acqua piantine trasferito dalla parte superiore e completamente coprire il piatto con una cupola trasparente spruzzato acqua per mantenere 80-90% di umidità. Mantenere la cupola per 3 giorni, poi rompere la cupola la mattina del giorno 4 e rimuovere completamente entro la fine di quel giorno.
Nota: Sementi possono essere alternativamente svolte da semi stratificando in 1,5 ml provette contenenti 1 ml 0,1% agar per 48 ore a 4 ° C seguita da trasferimento 2-3 semi con una pipetta di vetro su un 72-pozzetti piatto riempito con terreno. Case devono essere coperti con una cupola trasparente che può essere rimossa una settimana dopo la germinazione. Piantine in più possono essere rimossi per lasciare un solo piantina per pozzetto.
- Piante acquatiche ogni due giorni di immersione appartamenti a 1-in acqua per 20 minuti, poi scolare l'acqua in eccesso.
Nota: l'intervallo di tempo per l'irrigazione delle piante dipende l'umidità della stanza di crescita e deve essere determinata la based sull'osservazione costante di struttura crescita delle piante dell'utente. Controllare le piante ogni giorno per assicurarsi che siano ben innaffiate. Se solo pochi punti si stanno prosciugando, acqua quelle piante dall'alto con una bottiglia spruzzo. - Eseguire saggi di infezione patogeno (Fase 3-5) su piante che sono in prossimità o di sviluppo stadio # 3,50 (quando la dimensione rosetta è il 50% dimensione finale), il che corrisponde a 3-5 settimane di età in base alle condizioni di crescita (fotoperiodo, temperatura). Non infettare le piante dopo infiorescenza nascita (fase # 5) a causa della comparsa di resistenza legate all'età 38,39.
2. Preparazione di cultura dei media e Piastre
- Fare 1 L di B King (KB) mezzo liquido. Mescolare delicatamente 20 g peptone proteoso e 2 g di fosfato di potassio triidrato bibasico utilizzando un bastoncino magnetico con 1.000 ml di H 2 O deionizzata fino a quando non vi è alcun pellet visibile. Aliquotare 100 ml in 150 ml e bottiglie di vetro autoclave su un ciclo liquido 20 min.
- Prepararepiastre di coltura con terreno solido KB.
- Mescolare delicatamente H 20 g proteoso Peptone, 2 g di potassio fosfato dibasico triidrato e 15 g Agar con 1.000 ml deionizzata 2 O. Autoclave.
- Raffreddare il mezzo su un piatto mescolare magnetica fino a quando è fresco al tatto per ridurre al minimo la formazione di condensa e futuro evitare il degrado degli antibiotici. Aggiungere 18 ml sterile 80% glicerolo con 5 ml sterili 1 M MgSO4 al mezzo. Dato che Psm ES4326 porta resistenza contro streptomicina, aggiungere streptomicina nei media raffreddati ad una concentrazione finale di 50 pg ml - 1.
- Versare le piastre. Preparare due diverse misure di piatti supporti KB: 100 mm x 15 mm e 150 mm x 15 mm e piatti Petri. Il Petri piatto contenente il mezzo più piccola funge da piastra di coltura dei batteri primarie, e la piastra di Petri più grande funge batteri contare piatto.
Nota: per i batteri conteggio piatti, piatti a forma rettangolare possono essere utilizzate per ridurre lamateriali di consumo costano in quanto il doppio dei trattamenti possono essere tracciati per piastra rispetto ai piatti rotondi tradizionali.- Versare le piastre prima dell'esperimento infezione. Conservare le piastre KB medie a 4 ° C per un massimo di 2-3 mesi dal streptomicina solfato perde gradualmente l'attività antibiotica 40.
3. Maggiore Malattia suscettibilità (EDS)
- Giorno 1 - batteri Streak sulla piastra
- Due giorni prima del test EDS, striscia Psm ES4326 da -80 ° C stock di glicerolo su una piastra di coltura batterica KB-Strep e incubare a 28 ° C per 24-48 ore.
- Giorno 2 - avviare la cultura e piante acquatiche liquidi
- Avviare la coltura liquida in una provetta sterile con 4 ml di liquido KB mezzo contenente 50 ug ml - 1 streptomicina e agitare a 250 rpm, 28 ° CO / N.
Nota: Per EDS analisi infezione, utilizzando 6 piante per genotipo è suggerisceed. Per STI e MTI test, si raccomanda di 6 piante per genotipo per il trattamento. Per l'inoculo batteri, si raccomanda di utilizzare una coltura fresca liquido con densità ottica a 600nm λ tra 0,3 e 0,6. - Mark piccioli delle foglie numero 5 e 6 con un pennarello impermeabile smussato-end per una facile identificazione dei tessuti infetti a campionamento (Figura 1). Per migliorare l'apertura degli stomi e facilitare l'ingresso della soluzione di agente patogeno nella foglia, innaffiare le piante ben immergendo il piatto dal fondo per 20 minuti, poi scaricare l'acqua in eccesso.
Nota: In alternativa, coprire il piatto con una cupola trasparente e immergerlo in acqua per 2-4 ore per aumentare l'apertura degli stomi. - Giorno 3 - diluizione agenti patogeni e la siringa infiltrazione
Nota: infezione patogeno durante le ore del mattino è ottimale per la proliferazione degli agenti patogeni e lo sviluppo dei sintomi della malattia più pronunciati su genotipi sensibili. Fare ogni sforzo per mantenere la infettaretempi di ioni coerente per eliminare l'effetto dei ritmi circadiani e regolazione genica diurno 41,42, che aiuta a ridurre la variabilità tra le repliche sperimentali.- Pellet coltura batterica in una microcentrifuga tubo da 1,5 ml a 9.600 xg per 2 minuti a temperatura ambiente e scartare il surnatante. Risospendere il pellet batterico con 1 ml di soluzione sterile 10 mM MgCl 2.
Nota: cationi magnesio può migliorare la motilità e l'adesione di P. syringae 43. In alternativa, utilizzare MgSO4 alla stessa concentrazione. Acqua sterile è un sostituto accettabile per le soluzioni saline Mg. - Diluire la sospensione batteri con 9 ml di 10 mM MgCl 2 in una provetta da centrifuga da 50 ml e di misurare la densità ottica (OD) di batteri con λ = spettrofotometro a 600 nm. Diluire i batteri con 10 mM MgCl 2 al OD 600nm finale = 0.0002 per EDS test infezione.
- Infiltrati nella fogliacon 1 ml siringa senza ago punta smussata (comunemente noto come la siringa insulina) che contiene la soluzione diluita batterica.
- Non riempire la siringa fino alla sua massima capacità. Riempire con 0,5-0,6 ml per consentire un controllo molto migliore durante il processo di infiltrazione.
- Esporre la superficie inferiore del foglio sulla parte superiore del dito indice, e quindi regolare la posizione delicatamente foglia con l'aiuto di pollice. Posizionare la siringa in posizione verticale contro la superficie del foglio per assicurare che la pressione è uniformemente distribuita. Cercate di evitare la zona nervatura centrale durante l'infiltrazione per ridurre i danni foglia.
- Spingere lentamente lo stantuffo per infiltrarsi soluzione batterica; ingresso liquido nel mesofillo foglia verrà visualizzato come indicato dal colore delle foglie più scuro. Tentativo di infiltrazione tutta la superficie della foglia. Se questo non viene realizzato in un unico tentativo, scegliere un altro punto infiltrazione e ripetere le operazioni sopra descritte finché l'intera superficie del foglio è coperto.
- Una volta completato, asciugare delicatamente la foglia con carta assorbente per rimuovere la soluzione patogeno supplementare. Ispezionare visivamente il tessuto fogliare infetta per danni.
Nota: L'impressione siringa circolare non deve essere visibile dopo l'infiltrazione è completa. - Lasciare le piante infiltrati asciugare per 1-2 ore prima di restituirli nelle loro condizioni di crescita originali. Successivamente, spruzzare una cupola trasparente con acqua e coprire le piante infette per 2 ore, poi rompere la cupola per generare un 2-3 in apertura e lasciarlo acceso per tutto il resto dell'esperimento infezione.
Nota: Poiché P. syringae non è un patogeno nell'aria, non vi è alcun rischio di diffusione dell'agente infettivo ad altre piante coltivate nella stessa struttura. Tuttavia, come ulteriore precauzione, evitare il contatto fisico tra piante infette e di altri impianti sperimentali situati nelle vicinanze. Coprendo il piatto con una cupola trasparente aumenterà la virulenza degli agenti patogeni e accelerare la progressione della malattia. Ilhanno bisogno per esigenze questo passaggio e la durata ottimale del periodo di copertura deve essere determinato in base alle condizioni di umidità di impianto crescita delle piante dell'utente.
- Pellet coltura batterica in una microcentrifuga tubo da 1,5 ml a 9.600 xg per 2 minuti a temperatura ambiente e scartare il surnatante. Risospendere il pellet batterico con 1 ml di soluzione sterile 10 mM MgCl 2.
- Giorno 5 - Pre-asciugare i piatti dei media
- Prendere le piastre 150 mm x 15 mm KB dall'unità di conservazione frigorifera e asciugare qualsiasi preesistente condensa sulla piastra. Lastre secche di tenerli a temperatura ambiente per circa 24 ore. Per accelerare questo processo, metterli in una cappa a flusso laminare con i loro coperchi incrinate per 30-60 min.
Nota: Questo passaggio è fondamentale per la formazione di goccioline circolare sulla superficie della piastra nella fase successiva.
- Prendere le piastre 150 mm x 15 mm KB dall'unità di conservazione frigorifera e asciugare qualsiasi preesistente condensa sulla piastra. Lastre secche di tenerli a temperatura ambiente per circa 24 ore. Per accelerare questo processo, metterli in una cappa a flusso laminare con i loro coperchi incrinate per 30-60 min.
- Giorno 6 - Quantificare la crescita dei patogeni
Nota: La seguente procedura di quantificazione patogeno può essere effettuata in precedenti momenti dopo l'infezione per confermare la stessa quantità di batteri vengono consegnati in foglia, soprattutto quando le piante hanno alterato foglia morfologia.- Elaborare il tessuto infetto dopo la nascitadella clorosi indicato dalla ingiallimento del tessuto infetto nei genotipi suscettibili, ma prima dello sviluppo di lesioni necrotiche (Figura 2B).
Nota: consigliato tempo di campionamento è di tre giorni dopo l'inoculazione patogeno. Tuttavia, poiché la crescita patogeno dipende da una serie di fattori ambientali, la lunghezza di incubazione può variare in un intervallo di 2 ½-½ 3 giorni e deve essere determinato da attente osservazioni della progressione dell'infezione in funzione della crescita delle piante dell'utente.- Preparare 6 tubi di frantumazione per ciascun genotipo (Figura 1). Mettere una macinazione in acciaio inox palla e aggiungere 500 microlitri sterile 10 mM MgCl 2 in ciascun tubo.
- Rimuovere il foglio infetto dalla pianta e punzone un disco foglia con un punzone di carta 1 foro (Figura 1).
Nota: Per ridurre al minimo l'errore di campionamento, provare a pugni ogni foglia campionato nella stessa posizione. Il campionamento del disco foglio dall'altodella foglia è raccomandato. - Casualmente posizionare 2 dischi fogliari (da due impianti diversi) in ciascun tubo di rettifica con pinze.
- Sigillare la provetta e omogeneizzare il tessuto con un omogeneizzatore ad alta produttività a velocità massima (1600 colpi al minuto) per 10 min. Ripetere questo processo, se necessario, fino a quando il tessuto è ben omogeneizzato e le soluzioni diventano verdi a causa di liberazione clorofilla dalle foglie infette.
- In attesa del omogeneizzazione, riempire le prime 6 righe di una piastra di coltura a 96 pozzetti con 180 microlitri 10 mM MgCl 2 utilizzando una pipetta multicanale e un serbatoio pipettaggio.
- Dopo la molatura, trasferire 20 ml di sospensione di tessuto terra nella prima riga della piastra a 96 pozzetti e mescolare pipettando ripetuto il liquido su e giù. Se i piccoli frammenti di tessuto intasare la punta, la clip è di 2-3 mm per aiutare acquisire il corretto volume della soluzione.
- Per fornire spazio sufficiente per la goccia sul o superioref la piastra, spazio tessuto da differenti genotipi nelle righe alternative (Figura 1). Per preparare una volte dieci diluizioni seriali, trasferire 20 microlitri liquido nella seconda fila e ripetere la procedura fino al sesto diluizione.
- Trasferimento 20 microlitri della soluzione dalla piastra a 96 pozzetti sul x 15 mm KB piatto 150 millimetri con punte per pipette divise (Figura 1). Lavoro dalla sospensione più diluita alla concentrazione più elevata.
Nota: Procedendo da più diluita a più alta concentrazione permette di evitare di cambiare le punte delle pipette tra le diluizioni. Se la piastra è ben pre-essiccato, la gocciolina trasferito dovrebbe rimanere intatto sulla parte superiore del mezzo fino ad assorbimento (di solito 15-30 min). Il tempo di essiccazione varia con l'RT e l'umidità. - Asciugare la piastra a temperatura ambiente con il coperchio rotto. Una volta non più liquido può essere osservato sulla superficie della piastra, chiudere il coperchio, capovolgere e incubare la piastra a temperatura ambiente o un incubatore a 28 °.
- Incubare le piastre per 40-60 ore fino a quando le colonie diventano visibili. Verificare che la crescita sulle piastre riflette il prevedibile 10 volte goccia in unità formanti colonie (ufc) (Figura 2C). Contare i batteri prima che invadere e fondono colonie. Determinare il numero di batteri in diluizione più basso che non hanno colonie sovrapposte. Di solito, la diluizione preferito da contare conterrà tra 10-50 colonie.
Nota: variazione può essere presente tra le repliche tecniche; Pertanto, la diluizione più basso per ciascun replicato deve essere determinato separatamente. - Per calcolare i livelli di proliferazione batterica, documentare il numero della riga (R), così come il numero dei batteri all'interno ciascun replicato tecnica (T) per iscritto. Determinare il numero di colonie un'unità di formatura - ufc / disco sfogliare la formula: disco ufc / foglia = (T × 10 R / 20) × 500 secondi
- Digitare i dati nel seguente modello di foglio di produCe una grafico (Figura 1) (per file di modello di analisi dati del foglio, vedi Tabella 2). Ciascun punto dati sono rappresentati come media di sei replicati tecnici su scala logaritmica. Le barre di errore rappresentano il 95% intervallo di confidenza della media (n = 6).
Nota: Il calcolo degli intervalli di confidenza al 95% deve essere regolata in base al numero di repliche tecniche.
- Elaborare il tessuto infetto dopo la nascitadella clorosi indicato dalla ingiallimento del tessuto infetto nei genotipi suscettibili, ma prima dello sviluppo di lesioni necrotiche (Figura 2B).
- Avviare la coltura liquida in una provetta sterile con 4 ml di liquido KB mezzo contenente 50 ug ml - 1 streptomicina e agitare a 250 rpm, 28 ° CO / N.
4. Immunità SA-Triggered (STI)
- 1 ° giorno: Seguire la stessa procedura descritta al punto 3.1.
- 2 ° giorno: Oltre a innaffiare le piante e l'avvio della coltura batterica liquido (punto 3.2), induce resistenza da applicazione esterna di SA derivato sodio salicilato 21.
Note: Pure SA ha scarsa solubilità in acqua e richiede la preventiva regolazione del pH, quindi non è consigliabile per questo test.- Per indurre le difese SA-mediata contro P. syringae e primi impianti per l'infezione futuro 21,24, impianti di verniciatura con una nebbia sottile di 1 mm di sodio salicilato o H 2 O (come) finto 16-24 h prima che l'infezione patogeno.
- Giorno 3: Preparare la diluizione patogeno per OD 600nm = 0.001 e spingere i batteri in tutta la superficie del foglio da siringa infiltrazione (Step 3.3).
- Giorno 6: Per patogeno quantificazione e processo di conteggio, seguire la procedura descritta per il saggio EDS (Piazza di 3.4 e 3.5). Campioni separatamente pretrattati - Piastra e contare il H 2 O e salicilato di sodio. Per wild-type Arabidopsis, una riduzione 1-2 log in crescita dei patogeni è previsto nei sodio Salicilato - piante pretrattati.
5. MAMP-Innescato Immunity (MTI)
Nota: In questo saggio, usiamo Arabidopsis wild-type Col-0 e mutanti FLS2 e EFR piante. FLS2 e EFR sono membrana plasmatica-localizzato modello recettori Recognition (PRR), che in grado di riconoscere e flg22 elf18, faucibusctively 9,10. Perdita di ogni PRR risultati nella insensibilità al tipo specifico di MAMP, indicato dalla crescita patogeno inalterato nel mutante seguente MAMP pre-trattamento esterno e la siringa infiltrazione con PSM ES4326.
- Giorno 1 e 2: Seguire la stessa procedura descritta al punto 3.1 e 3.2.
- 3 ° giorno: pretrattamento MAMP patogeni e infezioni
- Per stabilire la Immunità MAMP-Innescato, preparare 1 mM soluzione flagellina epitopi flg22 o EF-Tu epitopi elf18 e siringhe infiltrarsi in tutta la superficie del foglio 4 ore prima che l'infezione patogeno (Piazza 3.3.3-3.3.6). Ciò consentirà per l'induzione delle difese MAMP mediata contro P. syringae e adescare le piante per future infezioni 6,37.
Nota: i dati di microarray pubblicamente disponibili rivelato la riprogrammazione massima trascrizionale di geni responsivi MAMP accade 4 ore dopo flg22 o elf18 trattamento 37,44. Così, 4 hr è raccomandatodurata del MAMP pretrattamento che si traduce nel raggiungimento di una chiara differenza nella crescita dei patogeni tra MAMP trattati Col-0 e FLS2 e EFR mutanti. - Rimuovere la soluzione in più MAMP con carta assorbente e lasciare le piante scoperte per accelerare il processo di assorbimento del liquido all'interno della foglia. Per spiegare l'effetto ferimento dalla siringa pressione infiltrazione, infiltrarsi H 2 O nelle foglie delle piante di controllo.
- Preparare la diluizione patogeno per OD 600nm = 0.001 e spingere i batteri in tutta la superficie del foglio di MAMP / H 2 O foglia da siringa infiltrazione pre-trattati (Step 3.3).
- Per stabilire la Immunità MAMP-Innescato, preparare 1 mM soluzione flagellina epitopi flg22 o EF-Tu epitopi elf18 e siringhe infiltrarsi in tutta la superficie del foglio 4 ore prima che l'infezione patogeno (Piazza 3.3.3-3.3.6). Ciò consentirà per l'induzione delle difese MAMP mediata contro P. syringae e adescare le piante per future infezioni 6,37.
- Giorno 6: Per patogeno quantificazione e processo di conteggio, seguire la procedura come descritto al punto 3.4 e 3.5. Targa e contare il O H 2 e campioni MAMP-pretrattati separatamente. In wild-type Arabidopsis, una riduzione 1-2 log in crescita dei patogeni è prevista per gli impianti MAMP pretrattati, con un po 'forteriduzione er mediato da flg22 rispetto al elf18.
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Representative Results
Il protocollo che descriviamo qui rappresenta un P. ottimizzata syringae assay siringa infiltrazione per valutare quantitativamente la risposta immunitaria in piante di Arabidopsis. Come illustrato nella figura 1, l'infiltrazione siringa Psm ES4326 è seguita da estrazione patogeno e quantificazione mediante diluizioni seriali e colonie enumerazione.
Come descritto al punto 3 nel testo protocollo Enhanced Malattia suscettibilità (EDS) contro Psm ES4326 può essere valutata l'infezione con un inoculo con OD = 0.0002. Come mostrato in figura 3, i mutanti npr1-1 altamente sensibili hanno approssimativamente 2,5 log (300 volte) maggiore crescita dei patogeni rispetto al wild-type Col-0 piante. A seconda delle condizioni sperimentali, le piante npr1-1 possono supportare fino a 3,0 log crescita più batterica di Col-0, con risultati più comuni all'interno della gamma di 1,5-2,5 log. Pertanto, questo culo EDSay fornisce un'ampia finestra di confronto, in cui i ricercatori possono essere in grado di mettere loro mutanti di Arabidopsis e transgenici per identificare geni potenzialmente coinvolti nella risposta immunitaria pianta.
Oltre a determinare EDS PSM ES4326 assay siringa infiltrazione può essere modificato per sezionare diversi strati di risposta immunitaria. Per valutare Immunità Acido Salicilico-Innescato, applicazione esterna della sostanza chimica sodio salicilato è utilizzato per attivare la risposta immunitaria, che è quantificato dalla crescita dei patogeni (figura 4A). La perdita di NPR1, che funziona come il recettore SA e maggiore trascrizionale co-regolatore di geni bersaglio SA-dipendenti, porta a insensibilità alla applicazione esogena di derivato dell'acido salicilico. Questa insensibilità a SA è dimostrata dalla crescita inalterato patogeno negli impianti pretrattati salicilato di sodio npr1-1 in contrasto con una marcata riduzione in Col-0 piante (20 volte meno pathog it su sodio applicazione Salicilato) (Figura 4B).
Per caratterizzare la Immunity, pretrattamento MAMP-Innescato con flg22 o elf18 è stato eseguito come mostrato nella Figura 5A. Per caratterizzare immunità flagellina attivati, vengono utilizzati Col-0 e piante mutanti FLS2. FLS2, una chinasi del recettore-come membrana localizzata, riconosce flg22 e innesca MTI 9. Come mostrato nella Figura 5B, i flg22 trattati Col-0 piante sostenuto un ~ 1 log (10 volte) riduzione della popolazione batterica, mentre le piante mutanti FLS2 non sono riusciti a innescare l'effetto restrizione crescita batterica. Analogamente, la perdita di recettori EF-Tu EFR nelle piante mutanti EFR porta a insensibilità a elf18 pretrattamento come dimostrato dalla crescita patogeno inalterata dopo la elf18 pretrattamento (Figura 5B).
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Figura 1. Rappresentazione schematica di Psm ES4326 test siringa infiltrazione sulle piante di Arabidopsis. Foglie numero 5 e 6 del suolo coltivato piante di Arabidopsis adulte sono contrassegnati e infettati con Psm ES4326 attraverso siringa infiltrazione. Dopo la comparsa dei sintomi della malattia, staccare le foglie e dischi foglia raccolto per l'omogeneizzazione dei tessuti. Tessuto ben omogeneizzato è serialmente diluito in piastre da 96 pozzetti prima di trasferire su un batterio conteggio piatto. Dopo colonie emergere sulla piastra, contare il numero di batteri e di elaborare i dati per generare un grafo. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Procedure rappresentativi del saggio EDS.(A) Pentole sono coperti da una cupola trasparente spruzzato acqua dopo la semina. (B) sintomi rappresentativi sul Col-0 e foglie npr1-1 sottoposte a test EDS (OD 600nm = 0.0002) 3 giorni dopo l'inoculazione. Nota grave clorosi sul npr1-1 e la quasi normale aspetto di Col, su 0. (C) diluizioni seriali dei Psm ES4326 che crescono su KB (50 ug / ml) piastra supporto streptomicina dopo ~ 45 hR di incubazione. Cinque diluizioni sono visibili. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Rappresentante risultati del dosaggio EDS crescita Psm ES4326 (unità formanti colonie -. Ufc / disco foglia, expressed su una scala logaritmica) è quantificato in 4 settimane di età 0 e Col-npr1-1 impianti 3 giorni dopo l'inoculazione (600nm = 0.0002 OD). Barre di errore rappresentano gli intervalli di confidenza 95% della media (n = 6). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Rappresentante procedura e risultati del test STI. (A) Rappresentazione schematica del Immunità Acido Salicilico-Triggered (STI) test. Immunità (B) Acido Salicilico-Innescato è stata quantificata sulla base di una crescita dei patogeni delle piante pretrattati con 1mM salicilato di sodio o H 2 O 16 ore prima di Psm ES4326 siringa infiltrazione (OD = 600nm 0.001). La crescita dei patogeni è stato quantificato 3giorni dopo l'inoculazione. Barre di errore rappresentano gli intervalli di confidenza 95% della media (n = 6). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Procedura Rappresentante e risultati del test MTI. (A) Rappresentazione schematica del Immunità MAMP-Triggered (MTI) dosaggio. (B) MTI stato quantificato dalla crescita dei patogeni nelle piante pre-trattati con una soluzione 1μM di flg22, elf18 o H 2 O (come controllo) 4 h prima Psm ES4326 siringa infiltrazione (OD 600 nm = 0,001). La crescita dei patogeni è stata quantificata 3 giorni dall'inoculazione. Barre di errore rappresentano gli intervalli di confidenza 95% della media (n = 6). Si prega di cliccare luinuovamente per vedere una versione più grande di questa figura.
| Problema | Cause possibili | Azioni raccomandate |
| Nessuna crescita dei batteri nel mezzo liquido dopo O / N cultura | Attività di batteri Ridotta | Avviare coltura liquida da un piatto appena striato |
| Circolare impressione siringa presenta sulla foglia dopo la siringa infiltrazione | Troppa pressione durante l'infiltrazione | Ridurre la pressue durante l'infiltrazione |
| Impressione siringa Parziale presenta sulla foglia dopo la siringa infiltrazione | Posizionamento inappropriato della siringa | Regolare la siringa di essere posizionato in verticale contro la superficie del foglio |
| Appassisce Leaf wthtin poche ore dopo l'infiltrazione | Troppo soluzione molto patogeno è infiltrata nella foglia | Arresto infiltrating subito dopo l'intera superficie del foglio diventa verde di colore più scuro |
| Nessun sintomo della malattia tre giorni dopo l'infezione | L'umidità è troppo bassa per agente patogeno a proliferare | Aumentare l'umidità in cui sono mantenuti piante infette |
| Patogeno entra fase necrotrophic o prima 3 dpi | La concentrazione non corretta della soluzione di agente patogeno | Usa OD 600nm = 0.0002 per l'analisi EDS; confermare la diluizione con spettrofotometro indepedent |
| Goccioline si fondono sulla parte superiore della piastra di batteri conteggio | I batteri conteggio targa non è opportunamente essiccati | Pre-asciugare la piastra di O / N prima dell'uso |
| Diluizione patogeno non rappresenta la riduzione di 10 volte | Diluizione non viene eseguito in modo accurato | Utilizzare una pipetta multicanale ben calibrato per il trasferimento di liquidi; confermare che tutto il liquido viene erogato |
| La crescita dei patogeni del tipo selvatico supera 8 log ufc / disco foglia | Overgrew patogeno all'interno del tessuto infetto - campionamento effettuato troppo tardi | Esempio infettato il tessuto dopo la comparsa di clorosi |
| Grande variabilità tra le repliche tecnici | Le piante non sono allo stesso stadio di sviluppo o numero di foglie infiltrati è incoerente | Utilizzare solo le piante all'interno di uno stesso stadio di sviluppo per l'infezione. Confermare la germinazione sincrono. Infettare numero di foglie coerente tra diverse piante |
Tabella 1. Risoluzione dei problemi del saggio siringa di infiltrazione.
Cliccate qui per vedere la tabella 2.
Tabella 2. foglio di calcolo per l'analisi statistica dei dati di crescita dei patogeni.
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Discussion
Con la diminuzione a disposizione terreni agricoli e l'aumento della popolazione, i ricercatori di tutto il mondo sono sfidati con le esigenze urgenti per il miglioramento delle colture. Il rendimento può essere notevolmente influenzato da vari stress biotici e abiotici. Tra questi, l'infezione patogeno è una delle principali cause di riduzione della resa delle colture, responsabile di circa il 12% delle perdite solo 45 negli Stati Uniti. Per risolvere questo problema, la ricerca massiccia è stata condotta nel modello Arabidopsis - P. syringae patosistema per caratterizzare globalmente i componenti e meccanismi di regolazione delle risposte immunitarie delle piante. Qui, vi presentiamo una P. ottimizzata syringae ES4326 test siringa infiltrazione di valutare quantitativamente le sottili differenze in impianti risposta immunitaria nel complesso livello di impianto.
Sebbene patogeni multipli saggi di infezione sono stati sviluppati per caratterizzare la risposta immunitaria 29,35 pianta, l'infiltrazione siringa fornisceun sistema ben controllato dove la stessa quantità di agente patogeno vengono somministrati nel tessuto infetto. In altri saggi di infezione, tra dip inoculazione inoculazione e spray, l'agente patogeno viene applicato all'intero tessuto aerea, comprese cotiledoni nonché foglie vere 34. E 'stato riportato che cotiledoni da ecotipo Landsberg erecta (L er) sono molto più sensibili al patogeno durante tuffo dosaggio inoculazione, che possono falsare i dati e di portare a conclusioni erronee sulla resistenza complessiva della malattia 34. Inoltre, i due dosaggi suddette richiedono patogeno per immettere il sfogliare stomi, che è controllata da vari fattori ambientali, tra umidità e luce. Fluttuazione di questi fattori contribuisce ad un più alto livello di variazione dei sintomi della malattia rispetto alla siringa infiltrazione test 35. Per infiltrazione sotto vuoto, i principali svantaggi includono la necessità di grandi volumi di soluzione patogeno, difficoltàa infiltrarsi efficacemente tutte le foglie, mentre evitare danni, e una notevole intensità di lavoro 29. Inoltre, le piante infettate con spray, tuffo o inoculazione vuoto sono meno probabilità di recuperare da tutto piantina è stato infettato da patogeni. Date le numerose limitazioni di altri metodi, il saggio siringa infiltrazione rimane il metodo di scelta per ottenere la progressione della malattia uniforme e altamente prevedibile e quantificazione accurata del patogeno per caratterizzare in modo affidabile la risposta immunitaria nella foglia vera. Inoltre, questo test può essere facilmente modificato per caratterizzare Immunità MAMP-Innescato e Sistemica Acquisita Resistenza. Oltre a questo, promettendo le future applicazioni della tecnica potrebbe essere applicata per gli effetti di prova di più fitormoni, prodotti chimici o inibitori pre-trattamenti seguiti da agenti patogeni siringa infiltrazione di dissezionare diversi strati di pianta rete di segnalazione immunitario o identificare ruoli di un percorso specifico nella pianta immunitario risposta. Infezione with un aumento dose del patogeno (OD 600nm = 0,001) in assenza di qualsiasi difesa adescamento pretrattamenti, noto come resistenza alle malattie (EDR) prova avanzata, è un'altra modifica utile di questo metodo che può essere utilizzato per identificare mutanti o transgenici con una maggiore resistenza alle malattie.
Va notato che assay siringa infiltrazione non si applica alla caratterizzazione di fase pre-invasiva della risposta di difesa dal patogeno viene consegnato direttamente nel tessuto fogliare tramite stomi. La chiusura degli stomi, che funge da barriera fisica per l'ingresso degli agenti patogeni, è spesso attivato per limitare l'ingresso degli agenti patogeni sulla creazione di MAMP-Innescato Immunità 46. Inoltre, fitormoni abscissico contribuisce alla chiusura degli stomi durante la fase di pre-invasiva 47. Pertanto, i metodi di spruzzatura o immersione può rivelarsi vantaggiosa per caratterizzare lo strato stomatico della risposta immunitaria, nonostante avvertimenti associaticon questi tipi di vaccinazioni, discusso in precedenza 29.
Dal momento che le interazioni pianta-patogeno può essere alterato da vari fattori biotici e abiotici, è fondamentale concentrarsi sulle fasi critiche di seguito elencati nel protocollo per ottenere l'infezione di successo e ottenere risultati affidabili:
Stato dell'impianto e batteri attività
Piante di Arabidopsis possono essere facilmente sottolineato da vari fattori abiotici, tra cui la temperatura non ottimale, siccità e stress osmotico e attivano le risposte cellulari che interferiscono con l'uscita immunitario 48. Pertanto, è fondamentale far crescere le piante in condizioni ottimali di crescita e proteggerli dai fattori di stress ambientali. Inoltre, poiché lo stadio di sviluppo della foglia infetto può anche alterare il risultato sperimentale, è necessario per infettare costantemente foglie numero 5 e 6 per evitare artefatti. Progredendo lungo stadi di sviluppo, elevato reresistenza contro alcuni agenti patogeni virulenti e non virulenti correla con il passaggio dalla fase vegetativa a fase riproduttiva di piante di Arabidopsis. Questa resistenza dinamica sopra fase di sviluppo è chiamato Age-Related Resistenza (ARR) 38. Per evitare l'interferenza ARR con la vera risposta immunitaria, è fondamentale per eseguire l'infezione in fase di sviluppo corretta, come indicato nel protocollo e astenersi da qualsiasi tentativo esperimenti di infezione dopo l'inizio della fase riproduttiva. Inoltre, fitness e attività batterica incidono in modo significativo la proliferazione degli agenti patogeni all'interno del tessuto infetto. Pertanto, è importante avviare la coltura liquida batterica da una piastra di coltura fresco striato che è non più di 2 giorni.
Abilità infiltrazione Siringa
Durante l'infiltrazione della siringa, cercare di evitare danni fisici alla foglia dal ferendo effetto è ben noto per interferire con ilrisposta immunitaria pianta, principalmente attraverso la segnalazione acido-mediata jasmonico che può sopprimere la difesa SA-triggered Percorsi di 49. Dopo l'infezione, una foglia che si è infiltrato dovrebbe recuperare pienamente al normale aspetto fisico senza alcun danno visivo. Per i principianti, si consiglia di praticare questa tecnica che utilizza le piante non sperimentali prima prima di eseguire il test Psm ES4326 siringa infiltrazione.
Estrazione patogeni e diluizione
Per misurare con precisione la crescita dei patogeni, è di vitale importanza per estrarre efficacemente patogeno fuori dal tessuto vegetale infetto. Rispetto ad altri metodi di estrazione, omogeneizzazione tessuto meccanico attraverso omogeneizzatori ad alta produttività estrae efficacemente patogeno senza la perdita di campione e la contaminazione incrociata. Successivamente, diluizioni dei campioni deve essere effettuata con precisione con una pipetta multicanale affidabile calibrato per ridurre l'errore di pipettamento.Deviazione minimo di ± 1 ml nel processo di diluizione si tradurrebbe in una differenza ~ 5% nella quantificazione della crescita dei patogeni. Per ulteriori esempi di risoluzione dei problemi del saggio siringa infiltrazione, si prega di vedere la Tabella 1.
In conclusione, si descrive la ottimizzato il Psm ES4326 siringa infiltrazione test su Arabidopsis per valutare quantitativamente e affidabile la risposta immunitaria pianta. Con l'aiuto di questo patosistema, comprensione dell'interazione pianta-patogeno sarà accelerato in laboratorio ed eventualmente essere applicato per la protezione delle colture in campo.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MetroMix 360 | Grosouth | SNGMM360 | |
| Large pots | Grosouth | TEKUVCC10TC | |
| 12 x 6 Inserts | Grosouth | LM1206 | |
| 11x 21 Flats with no holes | Grosouth | LM1020 | |
| 11x 21 Flats with holes | Grosouth | LM1020H | |
| Vinyl propagation domes | Grosouth | CW-221 | |
| Proteose Peptone | Fisher Scientific | DF0122-17-4 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate | MP Biomedicals | 151946 | |
| Agar | Fisher Scientific | A360-500 | |
| Streptomycin sulfate | Bio Basic Inc | SB0494 | |
| 100 x 15 mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 150 x 15 mm Petri dishes | Fisher Scientific | R80150 | |
| Rectangular plate | Fisher Scientific | 12-565-450 | |
| MgCl2 Hexahydrate | Bio Basic Inc | MB0328 | |
| Glycerol | Bio Basic Inc | GB0232 | |
| MgSO4 | Bio Basic Inc | MN1988 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | NC9992493 | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| Grinding tubes | Denville Scientific | B1257 | |
| Caps for grinding tubes | Denville Scientific | B1254 | |
| Stainless steel grinding ball | Fisher Scientific | 2150 | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 12-556-008 | |
| Sodium Salicylate | Sigma Aldrich | s3007-1kg | |
| flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA) | Genescript | Made to order | |
| elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | Genescript | Made to order | |
| Hole puncher | Staples | 146308 | |
| Biophotometer plus | Eppendorf | 952000006 | |
| PowerGen High-Throughput Homogenizer | Fisher Scientific | 02-215-503 | |
| Accu spin micro centrifuge | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Multichannel pipette (10-100 µl) | Eppendorf | 3122 000.043 | |
| Multichannel pipette (30-300 µl) | Eppendorf | 3122 000.060 | |
| Pipette (20µl) | Eppendorf | 3120 000.038 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 3552-HR | |
| Sharpie permanent marker | Staples | 507130 | |
| 1.5 ml tube | Eppendorf | 22363204 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 08-890 |
References
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