Abstract
I avsaknad av specialiserade mobila immunceller, växter utnyttja sin lokaliserade programmerad celldöd och systemisk förvärvad resistens för att försvara sig mot patogen attack. Bidraget från en specifik Arabidopsis gen till hela anläggningen immunsvaret kan vara specifikt och kvantitativt genom att analysera patogenen tillväxt inom den infekterade vävnaden. För mer än tre decennier, har hemibiotrophic bakterien Pseudomonas syringae pv. Maculicola ES4326 (PSM ES4326) i stor utsträckning som modell patogen för att undersöka de molekylära mekanismerna bakom Arabidopsis immunsvaret. Att leverera patogener in i bladvävnaden, har flera ympning metoder fastställts, t.ex. sprut infiltration, dopp ympning, spray, vakuuminfiltrering och översvämningar ympning. Följande protokoll beskriver en optimerad spruta infiltration metod för att leverera virulent PSM ES4326 i blad av vuxnajord-odlade Arabidopsis växter och exakt skärmen för ökad känslighet sjukdom (EDS) mot denna patogen. Dessutom kan detta protokoll kompletteras med flera förbehandlingar för att ytterligare dissekera specifika immundefekter inom olika skikt av växters försvar, inklusive Salicylsyra (SA) -Triggered Immunitet (STI) och MAMP-Triggered Immunitet (MTI).
Introduction
På grund av sin fastsittande naturen, växter hotas ständigt av en uppsjö av patogener som uppvisar olika livsstilar och närings strategier 1. Till en första approximation, biotrophic patogener behålla sin värd levande att hämta näring, medan necrotrophic patogener aktivt hemliga toxiner och enzymer för att döda värdvävnad och foder på de döda cellerna 1. En annan grupp av patogener, benämnda hemibiotrophs börjar sin infektion kursen med biotrophic scenen och skiftar till necrotrophic scenen när den når en viss tröskel av patogen ackumulering 2. För att på ett effektivt sätt försvara sig mot dessa mikroorganismer har växter utvecklats ett komplicerat medfödda immunsystemet utrustad med övervakningsmekanismer flera att detektera patogener attack och utlösa lokaliserad programmerad celldöd 3 samt systemisk förvärvad resistens (SAR) 4. Pågående forskning är inriktad på att karakterisera det väsentliga signaling komponenter och kors samtalen inom anläggningen immunsystemet 5.
Såsom föreslås i "sicksack" modell 5, det första skiktet av anläggningen medfödda immunsvar kräver närvaro av plasmamembran-lokaliserad Pattern Recognition receptorer (PRRs) för att detektera invasionen av en mikrob. PRRs kan känna igen Mikrobliknande Associated Molecular mönster (mAmps) och etablera MAMP-utlöst Immunity (MTI) 6. Förutom att inducera en transkriptionell uppreglering av gener som kodar för antimikrobiella PR-proteiner 7, leder MTI till en mängd olika händelser som gripa patogen tillväxt, inklusive produktion av reaktiva syreradikaler (ROS) och reaktivt kväve Arter (RNS), avsättning av callose till cellväggen samt aktivering av multipla kinassignalvägar 8.
Hittills har flera mAmps identifierats att utlösa MTI i Arabidopsis, innefattande bakteriella flg22 9 10 (18 aminosyror från den bakteriella översättnings elongeringsfaktor Tu) och en strukturell cellväggskomponent peptidoglykaner 11. Att etablera en framgångsrik infektion har vissa specialiserade patogener utvecklats förmågan att hemliga virulens effektor proteiner i de intracellulära eller intercellulära utrymmena, och därmed undertrycka MTI och utlösa Effector-utlöst känslighet (ETS) 12,13. Till exempel kan virulensegenskaper effektorer inaktivera mitogenaktiverat proteinkinas (MAPK) fosforyleringsställen kaskader av MTI att inducera utveckling sjukdomen inom den infekterade vävnaden 14-16. Under den dynamiska samevolution mellan värdar och patogener, växter också utvecklat motattack strategi att erkänna effektorproteiner och dämpa patogenen virulens molekylerna 17. Denna direkta eller indirekta effektor erkännande förmedlas av motstånds sjukdom (R) proteiner 18. De flesta av them är medlemmar i NB-LRR (binding och leucinrika upprepning) familje 19. Upplevelsen av ett avirulent effektor av en R-proteinet framkallar ett starkare och bredare immunsvar karakteriseras som Effector-Triggered Immunity (ETI) 20. Förutom att inducera uttrycket av försvarsgener 21 och produktionen av försvars metaboliter 22, leder ETI ofta till en snabb lokal programmerad celldöd som kallas överkänslig svar (HR) för att begränsa patogenen sprids till intilliggande vävnad 3.
Förutom det lokaliserade programmerad celldöd 23, växter är i stånd att initiera en långsiktig och systemövergripande immunsvar benämns Systemisk förvärvad resistens (SAR) 4. Vid utmaning med en biotrophic patogen, växtceller utlösa biosyntes och ackumulering av en endogen fytohormonerna salicylsyra (SA) och PR-proteiner i både lokala och systemiska vävnader 24. Genom thans process, är en förhöjd beredskap uppnåtts i de oinfekterade bladen som möjliggör montering snabbare svar försvars under en efterföljande infektion av ett brett spektrum av patogener 24. SA och dess syntetiska analoger såsom benso- (1,2,3) -thiadiazole-7-karbotiosyra S -metylestern (BTH) och 2,6-dichloroisonicotinic syra (INA) är i stånd att kemiskt inducera Salicylsyra (SA) -Triggered Immunitet (STI) vid externa program 24. Nonexpressor av patogenes relaterade gener 1 (NPR1) föreslås bli en av SA-receptorer och fungerar som en stor transkriptionsregulator under SA-medierad försvarssvar i både lokala och systemiska vävnader 21,25,26. Det har slutgiltigt visat att NPR1 krävs för SAR etablering och förlusten av NPR1 leder till dramatiska känslighet mot Pseudomonas syringae 25.
Att i stor utsträckning karakterisera den molekylära bidrag anläggningkomponenter i växt patogen interaktioner, har flera bioanalyser tagits fram för att mäta de specifika försvars händelser, inklusive ROS brast 27 callose avsättning 28, försvarsgener uttryck och ackumulering av deras proteinprodukter 21. Även om dessa enskilda analyser kan ge insikter i en särskild form av anläggningen immunsvar, ingen av dem, dock kan representera hela försvars svar på hela anläggningsnivå. Omvänt, kvantifiering av patogener tillväxt efter infektion ger en övergripande bedömning av immunsvar på organismnivå. Därför är avgörande för att driva upp forskning och upptäckter på Arabidopsis immunsvar för utveckling och optimering av en exakt och mycket standardiserade patogen ympning analys.
Pseudomonas syringae, en gramnegativ bakterie, identifierades som en phytopathogen förmåga att orsaka sjukdom i ett intervall av växtvärdar inklusive Arabidopsär 29. Som modellväxten-patogen systemet, Arabidopsis - P. syringae interaktion har i stor utsträckning för att förstå de molekylära mekanismerna bakom växters försvar svar 29. Hittills över 50 P. syringae pathovars har identifierats baserat på deras förmåga att infektera olika växtarter 30 . P. syringae pv. tomat DC3000 (Pst DC3000) 31 och P. syringae pv. maculicola ES4326 (PSM ES4326) 32 är de två mest använda och i stor utsträckning kännetecknade virulenta stammar. Bortsett från att erkännas av anläggningen och utlöser MTI svar, Pst DC3000 och PSM ES4326 är kapabla att utsöndra virulenta effektorproteiner att undertrycka MTI och utlösa ETS att gynna patogenen tillväxt 31,33.
Funktionellt dissekera samspelet mellan Arabidopsis och P. syringae, flertal0; patogeninfektion metoder har utvecklats baserat på patogen leveranstillvägagångssättet. För jordodlade växter, kan patogen levereras med spruta infiltration, vakuuminfiltrering, dopp ympning och sprut ympning 29,34. Nyligen var plantöversvämnings ympning analys utvecklad för att utföra storskaliga skärmar på vävnadsodlingsplattor odlade unga Arabidopsis växter 35. Spruta infiltrering, såsom en av de mest använda tillvägagångssättet, ger patogenen till apoplasten genom de naturliga bladöppningarna benämnda klyvöppningar 29 manuellt. Genom detta tillvägagångssätt, lika stora mängder av P. syringae kan infiltreras i den infekterade blad och styrkan i anläggningen immunsvar är omvänt korrelerad till patogen tillväxtnivåer. Därför kvantifiering av patogener tillväxt fungerar som en optimal strategi för att utvärdera immunförsvaret på hela fabriksnivå. Dessutom kan spruta infiltration skilja lokala och systemiska vävnad, som kan be tillämplig i karakterisera de molekylära mekanismerna bakom SAR 36.
I följande protokoll, beskriver vi en optimerad spruta infiltration analys med PSM ES4326 att screena Arabidopsis mutanter för ökad mottaglighet sjukdom (EDS). Detta protokoll kommer att sysselsätta två Arabidopsis genotyper: en vild-typ ekotypen Columbia-0 (Col-0) växter (kontroll) och npr1-1 förlust-of-funktion mutanter (hypersusceptible) som kommer att vara smittade med virulent bakteriestam PSM ES4326 37. Den npr1-1 mutant bär en punktmutation i ankyrin-repeat konsensussekvensen av NPR1 molekylen, som ändrar den mycket konserverade histidin till tyrosin och gör proteinet icke-funktionell 25. Dessutom är ett antal ändringar i sprutan infiltration analysen beskriven som tillåter kvantifiering av defekter i de särskilda lagren av immunsvar, inklusive MTI och STI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Följande text beskriver en stegvis protokoll för att utföra optimerad PSM ES4326 spruta infiltration analys i Arabidopsis. Större förfarandena i denna analys är representerade i en förenklad flödesschema (Figur 1).
1. Växttillväxt villkor
- Så fröer
- Förbered 2 krukor (4 i diameter, 3,75 i högväxt) löst fyllda med jord och vatten krukor genom att blötlägga dem från botten O / N innan du tömmer överflödigt vatten.
- Sugga 50-100 Arabidopsis frön, vildtyp Col-0 eller npr1-1 muterade, på varje kruka med en vikt 70 mm väger ark eller annat papper.
- Täck grytan med ett med vatten sprutas transparenta kupolen för att öka den relativa fuktigheten till 80 till 90% (Figur 2A).
- Inkubera potten vid 4 ° C under 72 timmar för att medge fullständig stratifiering och synkron groning.
- Överför potten till standardtillväxtbetingelser (12 timmar ljus/ 12 h mörker, 21 ° C, ljusintensitet 100 ^ mol / m 2 / sek, relativ fuktighet 40%) för att tillåta utsädet att gro. Spricka kupolen att generera en 2-3 att öppna omedelbart efter överföring till odlingsrummet, vilket kommer att bidra till att undvika kondens.
- När den första riktiga bladet når storleken 2-3 mm i längd, transplantera plantorna från potten till en 72-brunnar platta fylld med jord.
- Använd ett finger eller en 1 ml pipettspets för att skapa en en-i djup depression i mitten av jordytan på den plana.
- Försiktigt separera enskilda plantor med så lite root skada som möjligt. Plocka försiktigt upp plantor som har intakta rötter med pincett.
- Placera en enda separerade planta tillsammans med vidhäftande jord dunge för att minimera transplantation chock i depression och försiktigt klappa ner den omgivande marken för att fylla depression. Kasta extra plantor och jord till biologiskt avfallsbehållare och kassera i enlighetmed lokala riktlinjer för bortskaffande biologiskt avfall.
- Vatten överförs plantor från toppen och helt täcka den platta med ett vatten besprutas transparenta kupolen att bibehålla 80-90% fuktighet. Håll kupolen på 3 dagar, sedan knäcka kupolen på morgonen dag 4 och helt ta bort den i slutet av dagen.
Obs: Sådd frön kan alternativt utföras genom stratifiera frön i 1,5 ml centrifugrör innehållande 1 ml 0,1% agar för 48 h vid 4 ° C följt av överföring av 2-3 frön med en glaspipett på en 72-brunnar platta fylld med jord. Lägenheter måste täckas med en transparent kupol som kan tas bort en vecka efter groning. Extra plantor kan avlägsnas för att lämna endast en fröplanta per brunn.
- Vattenväxter varannan dag genom att blötlägga lägenheter i en-i vatten under 20 minuter, låt rinna överflödigt vatten.
Obs: Tidsintervallet för bevattning av växter beror på tillväxten rummets luftfuktighet och måste vara bestämd basd om kontinuerlig observation av användarens växters tillväxt anläggning. Kontrollera växter dagligen för att se till att de är väl vattnas. Om bara några få fläckar torkar, vatten de växter från toppen med en sprutflaska. - Utför patogen infektion analyser (steg 3-5) på växter som är vid eller nära utvecklingsstadium # 3.50 (när rosett storlek är 50% slutlig storlek), vilket motsvarar 3-5 veckor beroende på tillväxtbetingelser (fotoperiod, temperatur). Inte infektera växter efter blomväxten (steg nr 5) på grund av uppkomsten av åldersrelaterade motstånd 38,39.
2. Beredning av kultur medier och Plates
- Gör en liter Kings B (KB) flytande medium. Försiktigt rör 20 g proteospepton och 2 g kaliumfosfat dibasisk trihydrat användning av en magnetisk omrörarstav med 1000 ml avjoniserat H2O tills ingen synlig pellet. Alikvotera 100 ml i 150 ml glasflaskor och autoklav på en 20-minuters flytande cykel.
- Förberedodlingsplattor med KB fast medium.
- Försiktigt rör 20 g proteospepton, 2 g dibasiskt kaliumfosfat trihydrat och 15 g Agar med 1000 ml avjoniserat H2O Autoklav.
- Kyla ned medium på en magnetisk omrörarplatta tills det är coolt att trycka på för att minimera framtida kondens och undvika nedbrytning av antibiotika. Lägg 18 ml steril 80% glycerol och 5 ml sterila 1 M MgSO 4 till mediet. Med tanke på att psm ES4326 bär resistens mot streptomycin, till streptomycin i de kylda media till en slutkoncentration av 50 pg ml - 1.
- Häll plattorna. Bered två olika storlekar av KB mediaplattor: 100 mm x 15 mm och 150 mm x 15 mm petriskålar. Den mindre petriskål innehållande medium tjänar som primära bakterieodlingsplatta och större petriskål tjänar som bakterier räknar platta.
Anmärkning: För bakterierna räknar plattorna, kan rektangulärt formade plattor användas för att minska denförbrukningsartiklar kostar eftersom dubbelt så många behandlingar kan ritas per platta jämfört med traditionella runda plattor.- Häll plattorna före infektionen experimentet. Store KB medel plattorna vid 4 ° C i upp till 2-3 månader sedan streptomycinsulfat förlorar gradvis den antibiotiska aktiviteten 40.
3. Förbättrad mottaglighet för sjukdomar (EDS)
- Dag 1 - Streak bakterier på plattan
- Två dagar innan EDS-analysen, strimma PSM ES4326 från -80 ° C glycerolstam på en KB-Strep bakterieodlingsplatta och inkubera vid 28 ° C under 24-48 h.
- Dag 2 - initiera flytande kultur och vattenväxter
- Starta flytande kultur i ett sterilt provrör med 4 ml flytande KB-medium innehållande 50 ug ml - 1 streptomycin och skaka vid 250 rpm, 28 ° CO / N.
Obs: För EDS infektion analys med hjälp av 6 plantor per genotyp är rekommenderared. För STI och MTI analyser är 6 plantor per genotyp per behandling rekommenderas. För bakterier inokulatet, rekommenderas att använda en ny flytande kultur med optisk densitet vid 600 nm λ mellan 0,3 och 0,6. - Markera bladskaft blad nummer 5 och 6 med en trubbig ände vattentät markör för enkel identifiering av infekterad vävnad vid provtagningen (Figur 1). För att förbättra öppnandet av klyvöppningarna och underlätta ingången av patogener lösning i blad, vattna blommorna väl genom att blötlägga den platta från botten för 20 minuter, låt rinna överflödigt vatten.
Obs: Du kan också täcka lägenhet med en transparent kupol och dränk den i vatten för 2-4 timmar att öka stomata öppning. - Dag 3 - Pathogen utspädning och spruta infiltration
Obs: patogeninfektion under morgontimmarna är optimal för patogen spridning och utveckling av de mest uttalade sjukdomssymtomen på mottagliga genotyper. Gör allt för att hålla infekteraion timing konsekvent att eliminera effekten av dygnsrytmen och dygns genreglering 41,42, vilket bidrar till att minska variationen bland experimentella replika.- Pellets bakteriekulturen i en mikrocentrifug 1,5 ml rör vid 9600 xg under 2 minuter vid RT och kassera supernatanten. Resuspendera den bakteriella pelleten med 1 ml steril 10 mM MgCl2.
Obs: magnesiumkatjoner kan förbättra motilitet och adhesion av P. syringae 43. Alternativt kan du använda MgSO 4 vid samma koncentration. Sterilt vatten är ett godtagbart substitut för Mg saltlösningar. - Späd bakteriesuspensionen med 9 ml av 10 mM MgCl2 i en 50 ml centrifugrör och mät den optiska densiteten (OD) av bakterier med en spektrofotometer vid λ = 600 nm. Späd bakterierna med 10 mM MgCl2 till den slutliga OD 600nm = 0,0002 för EDS infektionsanalysen.
- Infiltrera lövmed en 1 ml trubbig ände spruta utan nål (vanligen kallad sprutan insulin) som innehåller den utspädda bakteriella lösningen.
- Fyll inte sprutan upp till sin fulla kapacitet. Fyll upp med 0,5-0,6 ml för att möjliggöra en mycket bättre kontroll under infiltrationsprocessen.
- Exponera den undre ytan av bladet på toppen av pekfingret, och sedan försiktigt justera bladläget med hjälp av tummen. Placera sprutan vertikalt mot bladytan för att säkerställa att trycket fördelas jämnt. Försök att undvika Mittnerven området under infiltration för att minska bladskador.
- Tryck långsamt in kolven för att infiltrera den bakteriella lösningen; flytande inträde i bladet mesophyll kommer att visualiseras som indikeras av den mörkare bladfärg. Försök att infiltrera hela ytan av bladet. Om detta inte sker i ett enda försök, välj en annan infiltration plats och upprepa de åtgärder som beskrivs ovan tills hela bladytan är täckt.
- När de är färdiga, försiktigt blot blad med absorberande vävnad för att ta bort den extra patogen lösningen. Inspektera infekterad bladvävnaden för skador.
Obs: Den cirkulära spruta intryck bör inte vara synlig efter infiltreringen är klar. - Låt infiltrerat växterna torka 1-2 timmar innan han återvände dem i sina ursprungliga odlingsbetingelser. Nästa, spraya en klar kupol med vatten och täcka de infekterade plantorna under 2 h, sedan knäcka kupolen för att generera en 2-3 i öppning och lämna den på under resten av infektionen experimentet.
Obs: Eftersom P. syringae är inte en luftburen patogen, finns det ingen risk för spridning av smittämnet till andra växter som odlas i samma anläggning. Men som en extra försiktighetsåtgärd, undvika fysisk kontakt mellan smittade växter och andra experimentella anläggningar som ligger i närheten. Omfattar lägenhet med en transparent kupol ökar patogenen virulens och påskynda sjukdomsförloppet. Denbehöver för detta steg och optimala durationen av täckperioden måste fastställas på grundval av villkoren i användarens växtligheten anläggning luftfuktighet.
- Pellets bakteriekulturen i en mikrocentrifug 1,5 ml rör vid 9600 xg under 2 minuter vid RT och kassera supernatanten. Resuspendera den bakteriella pelleten med 1 ml steril 10 mM MgCl2.
- Dag 5 - Pre-torka medieplattorna
- Ta 150 mm x 15 mm KB plattor ur det kalla lagringsenheten och torka alla redan befintliga kondensvatten på plattan. Torka plattorna genom att hålla dem vid RT för ungefär 24 timmar. För att påskynda denna process, placera dem i ett laminärt flöde huva med sina lock spruckna under 30-60 min.
Obs: Detta steg är avgörande för bildandet av cirkulär droppe på ytan av plattan i nästa steg.
- Ta 150 mm x 15 mm KB plattor ur det kalla lagringsenheten och torka alla redan befintliga kondensvatten på plattan. Torka plattorna genom att hålla dem vid RT för ungefär 24 timmar. För att påskynda denna process, placera dem i ett laminärt flöde huva med sina lock spruckna under 30-60 min.
- Dag 6 - Kvantifiera patogenen tillväxt
Obs: Följande patogen kvantifiering förfarande kan utföras vid tidigare tidpunkter efter infektionen att bekräfta lika mängder av bakterier levereras i blad, särskilt när växter har förändrats blad morfologi.- Bearbeta infekterad vävnad efter uppkomstenav kloros indikeras av gulfärgning av den infekterade vävnaden i de mottagliga genotyper, men innan utvecklingen av nekrotiska skador (Figur 2B).
Obs: Förslag på provtagningstiden är tre dagar efter patogenen ympning. Eftersom patogen tillväxt är beroende av ett antal miljöfaktorer, kan längden av inkubationstiden variera inom ett intervall av 2 ½-3 ½ dagar och måste bestämmas genom noggranna observationer av infektionen progression i användarens växtligheten anläggning.- Förbered 6 slip rör för varje genotyp (Figur 1). Placera en av rostfritt stål slip kula och tillsätt 500 | il steril 10 mM MgCb 2 in i varje rör.
- Drag av den infekterade bladet från anläggningen och stansa en bladskiva med ett en-håls hålslag (Figur 1).
Obs! För att minimera urvalsfel, försök att slå varje samplat löv på samma position. Provtagning av bladskivan från toppenav bladet rekommenderas. - Slumpmässigt placera 2 bladskivor (från två olika växter) i varje slip rör med hjälp av pincett.
- Försegla röret och homogenisera vävnaden med en hög genomströmning homogeniseringsanordning vid maximal hastighet (1600 slag per minut) under 10 minuter. Upprepa denna process om det behövs tills vävnaden är väl homogeniseras och lösningarna blir gröna på grund av klorofyll frisättning från infekterade blad.
- I väntan på homogenisering, fylla de första 6 raderna i en 96-brunnars odlingsplatta med 180 pl 10 mM MgCl2 med hjälp av en flerkanals pipett och en pipetteringsbehållare.
- Efter målning, överföra 20 pl bottenvävnadssuspension in i den första raden i 96-brunnar och blanda genom upprepad pipettering vätskan upp och ned. Om små fragment av vävnad täppa spetsen, fäst den med 2-3 mm för att få den korrekta volymen av lösningen.
- För att ge tillräckligt utrymme för droppen på toppen of plattan, utrymme vävnad från olika genotyper i alternativa rader (Figur 1). För att framställa en tiofaldigt serieutspädning, överföring 20 pl vätska i den andra raden och upprepa proceduren tills den sjätte utspädning.
- Överför 20 ul av lösningen från 96-brunnar på 150 mm x 15 mm KB plattan med uppdelade pipettspetsar (Figur 1). Arbeta från de mest utspädda suspensionen till mest koncentrerade.
Obs: Med utgångspunkt från de flesta utspädd till mest koncentrerade gör det onödigt att ändra pipettspetsar mellan utspädningar. Om plattan är väl förtorkas, bör den överförda droppen förbli intakt på toppen av medium tills absorberats (vanligen 15-30 min). Torktiden varierar med RT och fuktighet. - Torka plattan vid RT med lock knäckt. När kan observeras inte mer vätska på plattans yta, stäng locket, vänd och inkubera plattan vid rumstemperatur eller 28 ° C inkubator.
- Inkubera plattorna under 40-60 timmar tills kolonierna blir synliga. Bekräfta att tillväxten på plattorna återspeglar förutsägbara 10-faldig minskning av kolonibildande enheter (cfu) (figur 2C). Räkna bakterierna innan de växa över och kolonier smälta. Bestäm antalet bakterier i den lägsta utspädning som inte har överlappande kolonier. Vanligtvis till den föredragna utspädning räknas innehåller mellan 10-50 kolonier.
Obs: Variation kan förekomma bland tekniska replikat; Därför bör den lägsta utspädning för varje kopia bestämmas separat. - För att beräkna nivåerna av bakteriell spridning, dokumentera antalet raden (R) liksom antalet bakterier i skriftligen varje teknisk replikat (T). Bestäm antalet kolonibildande enhet - cfu / bladskiva genom formeln: cfu / bladskiva = (T × 10 R / 20) × 500/2
- Skriv in data i följande kalkylblad mall för att produce en graf (Figur 1) (för datakalkylanalys mallfilen, se tabell 2). Varje datapunkt representeras som medelvärdet av sex tekniska replikat på en logaritmisk skala. Felstaplar representerar 95% konfidensintervall för medelvärdet (n = 6).
Obs: Beräkningen av 95% konfidensintervall behöver justeras baserat på antal tekniska replikat.
- Bearbeta infekterad vävnad efter uppkomstenav kloros indikeras av gulfärgning av den infekterade vävnaden i de mottagliga genotyper, men innan utvecklingen av nekrotiska skador (Figur 2B).
- Starta flytande kultur i ett sterilt provrör med 4 ml flytande KB-medium innehållande 50 ug ml - 1 streptomycin och skaka vid 250 rpm, 28 ° CO / N.
4. SA-Triggered Immunity (STI)
- Dag 1: Följ samma procedur som beskrivs i steg 3,1.
- Dag 2: Förutom att vattna växterna och initiera flytande bakteriekultur (steg 3,2), framkalla motstånd genom extern tillämpning av SA derivat natriumsalicylat 21.
Obs: Ren SA har dålig vattenlöslighet och kräver förhands pH-justerande, varför det inte rekommenderas för denna analys.- För att inducera SA-medie försvar mot P. syringae och främsta anläggningarna för framtida infektion 21,24, sprutanläggningar med en fin dimma av 1 mM natriumsalicylat eller H2O (som mock) 16-24 timmar före patogeninfektion.
- Dag 3: Förbered patogen utspädning till OD 600 nm = 0,001 och skjut bakterier i hela bladytan med spruta infiltration (steg 3,3).
- Dag 6: För patogen kvantifiering och räkna processen, följ proceduren som beskrivits för EDS-analysen (steg 3.4 och 3.5). Plate och räkna H2O och natriumsalicylat - förbehandlade prov separat. För vildtyp Arabidopsis, är en 1-2 log minskning av patogener tillväxt väntas i natriumsalicylat - förbehandlade växter.
5. MAMP-Triggered Immunitet (MTI)
Obs: I denna analys använder vi Arabidopsis vildtyp Col-0 och muterade FLS2 och EFR-anläggningar. FLS2 och EFR är plasmamembran-lokaliserad Pattern Recognition receptorer (PRRS) som kan känna igen flg22 och elf18, respectively 9,10. Förlust av varje PRR resulterar i okänslighet för den specifika typ av MAMP, vilket anges av den oförändrade patogen tillväxt i mutanten efter den externa MAMP förbehandling och spruta infiltrering med PSM ES4326.
- Dag 1 och 2: Följ samma procedur som beskrivs i steg 3,1 och 3,2.
- Dag 3: MAMP förbehandling och patogeninfektion
- För att fastställa MAMP-Triggered Immunity, förbereda en iM lösning av flagellin epitop flg22 eller EF-Tu epitop elf18 och sprut infiltrera den i hela bladytan 4 timmar innan patogeninfektion (steg 3.3.3-3.3.6). Detta kommer att möjliggöra induktion av MAMP medierad skydd mot P. syringae och prime växterna för framtida infection 6,37.
Obs: Allmänt tillgängliga microarray data visade den maximala transkriptions omprogrammering av MAMP-känsliga gener händer 4 timmar efter flg22 eller elf18 behandling 37,44. Sålunda är fyra timmar den rekommenderadevaraktighet MAMP förbehandling som resulterar i att uppnå en tydlig skillnad i patogenen tillväxten mellan MAMP behandlade Col-0 och FLS2 och EFR-mutanter. - Ta bort extra MAMP lösningen med absorberande vävnad och lämnar växterna avslöjade att påskynda processen vätskeabsorption i bladet. Att ta hänsyn till såra verkan från spruttryck infiltration, infiltrera H2O i bladen av kontrollanläggningar.
- Förbered patogen utspädning till OD 600 nm = 0,001 och skjut bakterier i hela bladytan på MAMP / H2O förbehandlad blad med spruta infiltration (steg 3,3).
- För att fastställa MAMP-Triggered Immunity, förbereda en iM lösning av flagellin epitop flg22 eller EF-Tu epitop elf18 och sprut infiltrera den i hela bladytan 4 timmar innan patogeninfektion (steg 3.3.3-3.3.6). Detta kommer att möjliggöra induktion av MAMP medierad skydd mot P. syringae och prime växterna för framtida infection 6,37.
- Dag 6: För patogen kvantifiering och räkna processen, följ proceduren som beskrivs i steg 3,4 och 3,5. Plate och räkna H2O och MAMP-förbehandlade proverna separat. I vildtyp Arabidopsis, är en 1-2 log minskning av patogener tillväxt väntas i MAMP förbehandlat växter, med något starkter minskning medierad av flg22 jämfört med elf18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet beskriver vi här representerar en optimerad P. syringae spruta infiltration analys för att kvantitativt utvärdera immunsvar i Arabidopsis växter. Som visas i figur 1, är sprut infiltration av PSM ES4326 följt av patogen extraktion och kvantifiering via serieutspädningar och kolonier uppräkning.
Som beskrivits i steg 3 i protokollet text, kan förstärkt sjukdom känslighet (EDS) mot PSM ES4326 bedömas genom infektion med ett inokulum med OD = 0,0002. Såsom visas i fig 3, de mycket mottagliga npr1-1 mutanter har ungefär 2,5 log (300 gånger) mer patogen tillväxt jämfört med vildtyp Col-0 växter. Beroende på de experimentella betingelserna, kan npr1-1 växter stödja upp till 3,0 log mer bakterietillväxt än Col-0, med de vanligaste resultat inom intervallet 1,5-2,5 log. Därför denna EDS assay erbjuder ett brett fönster skillnad, där forskarna kan ha möjlighet att placera sina Arabidopsis mutanter och transgena för att identifiera kandidatgener potentiellt involverade i anläggningen immunsvaret.
Förutom att bestämma EDS, kan PSM ES4326 spruta infiltrering analysen modifieras för att dissekera olika skikt av immunsvar. För att utvärdera Salicylsyra-Triggered Immunity, är extern applikation av den kemiska natriumsalicylat används för att trigga immunsvaret, vilket kvantifieras genom patogenen tillväxt (Figur 4A). Förlusten av NPR1, vilken fungerar som SA-receptorn och större transkriptionell sam-regulator av SA-beroende målgener, leder till okänslighet för exogen applicering av salicylsyra-derivat. Denna okänslighet till SA visas av det oförändrade patogen tillväxt i npr1-1 natriumsalicylat förbehandlade växter i kontrast till en markant minskning av Col-0 växter (20 gånger mindre Pathog en på natriumsalicylat ansökan) (Figur 4B).
För att karakterisera MAMP-Triggered Immunity, förbehandling med flg22 eller elf18 utfördes såsom visas i figur 5A. För att karakterisera flagellinet utlöst immunitet, Col-0 och FLS2 muterade växter används. FLS2, en membran lokaliserad receptorliknande kinas erkänner flg22 och utlöser MTI 9. Som visas i figur 5B, de flg22 behandlade Col-0 anläggningar stödde en ~ 1 log (10 gånger) minskning av bakteriepopulationen, medan FLS2 muterade växterna inte utlösa bakterietillväxthämning effekt. På liknande sätt, förlusten av EF-Tu-receptom EFR i växterna EFR mutanta leder till okänslighet för elf18 förbehandling såsom visas av den oförändrade patogen tillväxt efter elf18 förbehandling (figur 5B).
iles / ftp_upload / 53.364 / 53364fig1.jpg "/>
Figur 1. Schematisk representation av PSM ES4326 spruta infiltrering analys på Arabidopsis växter. Lämnar nummer 5 och 6 av vuxna jordodlade Arabidopsis växter är märkta och infekterades med PSM ES4326 genom spruta infiltrering. Efter uppkomsten av sjukdomssymptom, ta bort löv och skörd bladskivor för vävnads homogenisering. Väl homogeniserades vävnad serieutspäddes i 96-brunnsplattor innan de överförs till en bakterie räkna platta. Efter kolonier uppkomst på plattan, räkna antalet bakterier och bearbeta data för att generera en graf. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Representativa förfaranden EDS-analys.(A) Krukor är täckta med ett vatten besprutas transparenta kupolen efter sådd frön. (B) Representativa symptom på Col-0 och npr1-1 blad utsätts för EDS-analys (OD 600 nm = 0,0002) 3 dagar efter inokulering. Obs svår kloros på npr1-1 och nästan normala utseende Col-0. (C) Serieutspädningar av PSM ES4326 växer på KB (50 | ig / ml streptomycin) media plattan efter ~ 45 h av inkubation. Fem utspädningar är synliga. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Representativa resultat av EDS-analys PSM ES4326 tillväxt (kolonibildande enheter -. Cfu / blad skiva, expressed på en log-skala) kvantifierades i 4 veckor gamla Col-0 och npr1-1 växter 3 dagar efter inokulering (OD 600nm = 0,0002). Felstaplar representerar 95% konfidensintervall av medelvärdet (n = 6). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Representativa förfarande och resultat av STI-analysen. (A) Schematisk representation av salicylsyra-Triggered Immunitet (STI) analys. (B) salicylsyra-Triggered Immunitet kvantifierades baserat på patogen tillväxt i växter som förbehandlats med 1 mM Natriumsalicylat eller H2O 16 h före PSM ES4326 spruta infiltration (OD 600 nm = 0,001). Patogen tillväxt kvantifierades 3dagar efter inokulering. Felstaplar representerar 95% konfidensintervall av medelvärdet (n = 6). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Representativa förfarandet och resultaten av MTI analysen. (A) Schematisk representation av MAMP-Triggered Immunitet (MTI) analys. (B) MTI kvantifierades genom patogen tillväxt i växter förbehandlade med 1 pM lösning av flg22, elf18 eller H 2 O (som kontroll) 4 timmar före PSM ES4326 spruta infiltration (OD 600 nm = 0,001). Patogen tillväxten kvantifierades 3 dagar efter inokulering. Felstaplar representerar 95% konfidensintervall av medelvärdet (n = 6). Klicka hanre att se en större version av denna siffra.
| Problem | Möjliga orsaker | Rekommenderade åtgärder |
| Ingen bakterietillväxt i det flytande mediet efter O / N-kulturen | Reducerad bakterier aktivitet | Initiera flytande kultur från en nyligen strimmig platta |
| Cirkulär spruta intryck presenterar på bladet efter sprutan infiltration | För mycket tryck under infiltration | Minska pressue under infiltrering |
| Partiell spruta intryck presenterar på bladet efter sprutan infiltration | Olämpligt positionering av sprutan | Ställ sprutan placeras vertikalt mot bladytan |
| Leaf wilts wthtin några timmar efter infiltrering | För mycket patogen lösning infiltreras i bladet | Stopp infiltrating omedelbart efter hela bladytan vänder mörkare grön färg |
| Inga sjukdomssymptom tre dagar efter infektion | Luftfuktigheten är för låg för patogen att föröka | Öka luftfuktigheten där infekterade växter bibehålls |
| Patogen in necrotrophic scenen på eller före den 3 dpi | Felaktig koncentration av patogener lösning | Använd OD 600 nm = 0,0002 för EDS analys; bekräfta utspädning med användning indepedent spektrofotometer |
| Droppar samman på toppen av bakterier räknar platta | Bakterier räknar plattan inte lämpligt torkas | Pre-torka plattan O / N före användning |
| Patogen utspädning representerar inte 10-faldig minskning | Späd inte korrekt utförd | Använd en väl kalibrerad multikanalpipett för transport av flytande; bekräfta att all vätska dispens |
| Patogen tillväxt i vildtypen överstiger 8 log cfu / bladskiva | Patogen växte över i den infekterade vävnaden - provtagning utförs för sent | Prov infekterad vävnad efter uppkomsten av kloros |
| Stor variation mellan tekniska replikat | Växter är inte på samma utvecklingsstadium eller infiltrerade blad nummer är inkonsekvent | Använd endast anläggningar i samma utvecklingsstadium för infektion. Bekräfta synkron groning. Infect konsekvent blad nummer mellan olika anläggningar |
Tabell 1. Felsökning av sprut infiltration analysen.
Klicka här för att se tabell 2.
Tabell 2. kalkylblad för statistisk analys av patogener tillväxtdata.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med minskande tillgänglig jordbruksmark och ökande befolkning, forskare runt om i världen utmanas med trängande behov av gröda förbättring. Utbytet kan i hög grad påverkas av olika biotisk och abiotisk stress. Bland dem är patogeninfektion en av de främsta orsakerna till minskningen avkastning, som ansvarar för ungefär 12% förluster i USA enbart 45. För att lösa det här problemet, har massiv forskning bedrivits i modellen Arabidopsis - P. syringae pathosystem att övergripande karakterisera komponenter och regleringsmekanismerna för anläggningen immunsvar. Här presenterar vi en optimerad P. syringae ES4326 spruta infiltration analys för att kvantitativt bedöma de subtila skillnader i anläggningen immunsvar på hela anläggningsnivå.
Även multipelt patogeninfektion analyser har utvecklats för att karakterisera anläggningen immunsvaret 29,35 åstadkommer sprutans infiltreringett väl kontrollerat system där lika stora mängder patogener administreras in i den infekterade vävnaden. I andra infektionsanalyser, inklusive dopp inokulering och spray inokulering, är den patogen anbringas på hela antenn vävnad, inklusive hjärtblad samt äkta blad 34. Det har rapporterats att hjärtbladen från ekotypen Landsberg erecta (L er) är mycket mer mottagliga för patogenen under dip ympning analys, som kan skeva data och leda till felaktiga slutsatser om den totala sjukdomsresistens 34. Dessutom de två ovannämnda analyser kräver patogen att komma in i bladet genom stomata, som styrs av olika miljöfaktorer, bland annat fukt och ljus. Fluktuationer av dessa faktorer bidrar till en högre nivå av variation i sjukdomssymptomen jämfört med sprut infiltrering analysen 35. För vakuuminfiltrering, de viktigaste nackdelarna inkluderar behovet av stora volymer av patogener lösning, svårighetatt effektivt infiltrera alla blad samtidigt undvika skador och betydande arbete intensitet 29. Dessutom, växter infekterade med spray, dopp eller vakuum ympning är mindre benägna att återhämta sig eftersom hela plantan är infekterad med patogen. Med tanke på de många begränsningar andra metoder förblir sprutan infiltration analysen metoden för valet att uppnå en jämn och mycket förutsägbar sjukdomsprogression och noggrann kvantifiering av patogenen att tillförlitligt karakterisera immunsvaret inom riktiga bladet. Dessutom kan denna analys lätt modifieras för att karakterisera MAMP-Triggered immunitet och systemisk förvärvad resistens. Dessutom, lovande framtida tillämpningar av tekniken kan tillämpas för att testa effekterna av flera fytohormoner, kemikalier eller inhibitorer förbehandlingar följt av patogen spruta infiltration att dissekera olika skikt av vegetabiliskt immun nätsignalering eller identifiera roller en viss väg i anläggningen immun svar. Infektion with en ökad dos av patogenen (OD 600 nm = 0,001) i avsaknad av något försvar priming förbehandlingar, som kallas Enhanced Disease Resistance (EDR) testet, är en annan användbar modifiering av denna metod som kan användas för att identifiera mutanter eller transgena med förbättrad resistens mot sjukdomar.
Det bör noteras att spruta infiltration analys gäller inte för karakterisering av pre-invasiv skede av försvars svar eftersom patogenen levereras direkt in i bladvävnaden via klyvöppningar. Stomata stängning, som fungerar som fysisk barriär för patogen ingång, är ofta utlöses för att begränsa patogen inträde på inrättandet av MAMP utlöst Immunity 46. Dessutom bidrar fytohormonerna abskisinsyra till stomata stängning under pre-invasiv etapp 47. Därför kan sprutning eller doppning metoder visa sig fördelaktigt att karaktärisera stomata skiktet av immunsvaret, trots varningar associerademed dessa typer av vaccinationer, som diskuterats ovan 29.
Eftersom växt patogen interaktioner kan förändras av olika biotiska och abiotiska faktorer, är det viktigt att fokusera på de nedanstående kritiska stegen i protokollet för att uppnå en framgångsrik infektion och få tillförlitliga resultat:
Anläggningens status och bakterier aktivitet
Arabidopsis växter kan lätt stressade av olika abiotiska faktorer, bland annat suboptimal temperatur, torka och osmotisk stress och utlösa cellulära svar som stör immun utgång 48. Därför är det viktigt att odla växter under optimala tillväxtförhållanden och skydda dem från miljöpåverkande faktorer. Dessutom, eftersom utvecklingsstadiet hos den infekterade blad kan också förändra den experimentella resultatet, är det nödvändigt att genomgående infektera blad nummer 5 och 6 för att undvika artefakter. Framsteg längs utvecklingsstadier, höjt reresistansen mot några virulenta och avirulenta patogener korrelerar med övergången från vegetativt stadium till reproduktiv stadium av Arabidopsis växter. Denna dynamiska motstånd över utvecklingsstadium kallas åldersrelaterad Resistance (ARR) 38. För att undvika ARR interferens med den sanna immunsvar, är det viktigt att utföra infektionen vid rätt utvecklingsstadium som anges i det protokollet och avstå från att försöka infektionsexperiment efter debuten av det reproduktiva stadiet. Dessutom bakterie fitness och aktivitet påverkar i huvudsak patogenen spridning inom den infekterade vävnaden. Därför är det viktigt att initiera bakteriell flytande kultur från en nyligen strimmig odlingsplatta som inte är mer än två dagar gammal.
Spruta infiltrering skicklighet
Under sprut infiltration, försök att undvika fysiska skador på bladet eftersom såra effekt är väl känd för att störaväxt immunsvar, främst via jasmonsyra-förmedlad signalering som kan undertrycka SA-utlöst försvar vägar 49. Efter infektionen, bör ett löv som infiltrerades återhämta sig helt till den normala utseende utan någon synlig skada. För nybörjare, är det tillrådligt att träna denna teknik med hjälp av icke-experimentella anläggningar först innan du utför PSM ES4326 sprutan infiltration analys.
Patogen utvinning och utspädning
För att noggrant mäta patogenen tillväxt, är det viktigt att effektivt extrahera patogen ur den infekterade växtvävnad. Jämfört med andra extraktionsmetoder, mekanisk vävnads homogenisering genom hög genomströmning homogenisatorer extraherar effektivt patogen utan förlust av vävnadsprov och korskontaminering. Därefter bör provspäd vara noggrant utföras med en tillförlitligt kalibrerad multikanalpipett att minska pipettering felet.Avvikelse så lite som ± 1 pl i utspädningsprocessen skulle innebära en skillnad i patogenen tillväxt kvantifiering ~ 5%. För mer felsöknings exempel på sprut infiltration analysen, se tabell 1.
Sammanfattningsvis beskriver vi optimerat PSM ES4326 sprutan infiltration analys på Arabidopsis att kvantitativt och tillförlitligt bedöma anläggningen immunsvaret. Med hjälp av denna pathosystem kommer förståelse av växt-patogen interaktion accelereras i laboratoriet och slutligen sökas växtskydd i fält.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MetroMix 360 | Grosouth | SNGMM360 | |
| Large pots | Grosouth | TEKUVCC10TC | |
| 12 x 6 Inserts | Grosouth | LM1206 | |
| 11x 21 Flats with no holes | Grosouth | LM1020 | |
| 11x 21 Flats with holes | Grosouth | LM1020H | |
| Vinyl propagation domes | Grosouth | CW-221 | |
| Proteose Peptone | Fisher Scientific | DF0122-17-4 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate | MP Biomedicals | 151946 | |
| Agar | Fisher Scientific | A360-500 | |
| Streptomycin sulfate | Bio Basic Inc | SB0494 | |
| 100 x 15 mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 150 x 15 mm Petri dishes | Fisher Scientific | R80150 | |
| Rectangular plate | Fisher Scientific | 12-565-450 | |
| MgCl2 Hexahydrate | Bio Basic Inc | MB0328 | |
| Glycerol | Bio Basic Inc | GB0232 | |
| MgSO4 | Bio Basic Inc | MN1988 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | NC9992493 | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| Grinding tubes | Denville Scientific | B1257 | |
| Caps for grinding tubes | Denville Scientific | B1254 | |
| Stainless steel grinding ball | Fisher Scientific | 2150 | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 12-556-008 | |
| Sodium Salicylate | Sigma Aldrich | s3007-1kg | |
| flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA) | Genescript | Made to order | |
| elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | Genescript | Made to order | |
| Hole puncher | Staples | 146308 | |
| Biophotometer plus | Eppendorf | 952000006 | |
| PowerGen High-Throughput Homogenizer | Fisher Scientific | 02-215-503 | |
| Accu spin micro centrifuge | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Multichannel pipette (10-100 µl) | Eppendorf | 3122 000.043 | |
| Multichannel pipette (30-300 µl) | Eppendorf | 3122 000.060 | |
| Pipette (20µl) | Eppendorf | 3120 000.038 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 3552-HR | |
| Sharpie permanent marker | Staples | 507130 | |
| 1.5 ml tube | Eppendorf | 22363204 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 08-890 |
References
- Glazebrook, J. Contrasting mechanisms of defense against biotrophic and necrotrophic pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 43, 205-227 (2005).
- Hammond-Kosack, K. E., Jones, J. D. Plant disease resistance genes. Annual review of plant biolog. 48, 575-607 (1997).
- Pontier, D., Balague, C., Roby, D. The hypersensitive response. A programmed cell death associated with plant resistance. C R Acad Sci II. 321, 721-734 (1998).
- Ryals, J. A., et al. Systemic Acquired Resistance. Plant Cel. 8, 1809-1819 (1996).
- Jones, J. D., Dangl, J. L. The plant immune system. Natur. 444, 323-329 (2006).
- Newman, M. A., Sundelin, T., Nielsen, J. T., Erbs, G. MAMP (microbe-associated molecular pattern) triggered immunity in plants. Front Plant Sc. 4, 139 (2013).
- Fritig, B., Heitz, T., Legrand, M. Antimicrobial proteins in induced plant defense. Curr Opin Immuno. 10, 16-22 (1998).
- Nicaise, V., Roux, M., Zipfel, C. Recent advances in PAMP-triggered immunity against bacteria: pattern recognition receptors watch over and raise the alarm. Plant Physio. 150, 1638-1647 (2009).
- Zipfel, C., et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Natur. 428, 764-767 (2004).
- Kunze, G., et al. The N terminus of bacterial elongation factor Tu elicits innate immunity in Arabidopsis plants. Plant Cel. 16, 3496-3507 (2004).
- Gust, A. A., et al. Bacteria-derived peptidoglycans constitute pathogen-associated molecular patterns triggering innate immunity in Arabidopsis. J Biol Che. 282, 32338-32348 (2007).
- Alfano, J. R., Collmer, A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annu Rev Phytopatho. 42, 385-414 (2004).
- Tyler, B. M. Entering and breaking: virulence effector proteins of oomycete plant pathogens. Cell Microbio. 11, 13-20 (2009).
- He, P., et al. Specific bacterial suppressors of MAMP signaling upstream of MAPKKK in Arabidopsis innate immunity. Cel. 125, 563-575 (2006).
- Gimenez-Ibanez, S., et al. AvrPtoB targets the LysM receptor kinase CERK1 to promote bacterial virulence on plants. Curr Bio. 19, 423-429 (2009).
- Zhang, Z., et al. Disruption of PAMP-induced MAP kinase cascade by a Pseudomonas syringae effector activates plant immunity mediated by the NB-LRR protein SUMM2. Cell Host Microb. 11, 253-263 (2012).
- Chisholm, S. T., Coaker, G., Day, B., Staskawicz, B. J. Host-microbe interactions: shaping the evolution of the plant immune response. Cel. 124, 803-814 (2006).
- Jones, D. A., Takemoto, D. Plant innate immunity - direct and indirect recognition of general and specific pathogen-associated molecules. Curr Opin Immuno. 16, 48-62 (2004).
- Elmore, J. M., Lin, Z. J., Coaker, G. Plant NB-LRR signaling: upstreams and downstreams. Curr Opin Plant Bio. 14, 365-371 (2011).
- Gassmann, W., Bhattacharjee, S. Effector-triggered immunity signaling: from gene-for-gene pathways to protein-protein interaction networks. Mol Plant Microbe Interac. 25, 862-868 (2012).
- Wang, D., Weaver, N. D., Kesarwani, M., Dong, X. Induction of protein secretory pathway is required for systemic acquired resistance. Scienc. 308, 1036-1040 (2005).
- Bednarek, P. Chemical warfare or modulators of defence responses - the function of secondary metabolites in plant immunity. Curr Opin Plant Bio. 15, 407-414 (2012).
- Heath, M. C. Hypersensitive response-related death. Plant Mol Bio. 44, 321-334 (2000).
- Fu, Z. Q., Dong, X. Systemic acquired resistance: turning local infection into global defense. Annu Rev Plant Bio. 64, 839-863 (2013).
- Cao, H., Glazebrook, J., Clarke, J. D., Volko, S., Dong, X. The Arabidopsis NPR1 gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing ankyrin repeats. Cel. 88, 57-63 (1997).
- Wu, Y., et al. The Arabidopsis NPR1 protein is a receptor for the plant defense hormone salicylic acid. Cell Re. 1, 639-647 (2012).
- Smith, J. M., Heese, A. Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae. Plant Method. 10, 6 (2014).
- Nomura, K., et al. A bacterial virulence protein suppresses host innate immunity to cause plant disease. Scienc. 313, 220-223 (2006).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. The Arabidopsis book/American Society of Plant Biologist. 1, (2002).
- Sawada, H., Suzuki, F., Matsuda, I., Saitou, N. Phylogenetic analysis of Pseudomonas syringae pathovars suggests the horizontal gene transfer of argK and the evolutionary stability of hrp gene cluster. J Mol Evo. 49, 627-644 (1999).
- Xin, X. F., He, S. Y. Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000: a model pathogen for probing disease susceptibility and hormone signaling in plants. Annu Rev Phytopatho. 51, 473-498 (2013).
- Dong, X., Mindrinos, M., Davis, K. R., Ausubel, F. M. Induction of Arabidopsis defense genes by virulent and avirulent Pseudomonas syringae strains and by a cloned avirulence gene. Plant Cel. 3, 61-72 (1991).
- Mackey, D., Holt 3rd, B. F., Wiig, A., Dangl, J. L. RIN4 interacts with Pseudomonas syringae type III effector molecules and is required for RPM1-mediated resistance in Arabidopsis. Cel. 108, 743-754 (2002).
- Tornero, P., Dangl, J. L. A high‐throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana. The Plant Journa. 28, 475-481 (2001).
- Ishiga, Y., Ishiga, T., Uppalapati, S. R., Mysore, K. S. Arabidopsis seedling flood-inoculation technique: a rapid and reliable assay for studying plant-bacterial interactions. Plant Method. 7, 32 (2011).
- Zheng, X. Y., et al. Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation. Cell Host Microb. 11, 587-596 (2012).
- Pajerowska-Mukhtar, K. M., et al. The HSF-like transcription factor TBF1 is a major molecular switch for plant growth-to-defense transition. Curr Bio. 22, 103-112 (2012).
- Rusterucci, C., et al. Age-related resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato is associated with the transition to flowering in Arabidopsis and is effective against Peronospora parasitica. Physiological and molecular plant patholog. 66, 222-231 (2005).
- Boyes, D. C., et al. Growth stage–based phenotypic analysis of Arabidopsis a model for high throughput functional genomics in plants. The Plant Cell Onlin. 13, 1499-1510 (2001).
- Regna, P. P., Wasselle, L. A., Solomons, I. A. The stability of streptomycin. Journal of Biological Chemistr. 165, 631-638 (1946).
- Wang, W., et al. Timing of plant immune responses by a central circadian regulator. Natur. 470, 110-114 (2011).
- Hua, J. Modulation of plant immunity by light, circadian rhythm, and temperature. Current opinion in plant biolog. 16, 406-413 (2013).
- Cuppels, D. A. Chemotaxis by Pseudomonas syringae pv. tomato. Appl Environ Microbio. 54, 629-632 (1988).
- Qutob, D., et al. Phytotoxicity and innate immune responses induced by Nep1-like proteins. The Plant Cell Onlin. 18, 3721-3744 (2006).
- Pimentel, D., Lach, L., Zuniga, R., Morrison, D. Environmental and economic costs of nonindigenous species in the United States. BioScienc. 50, 53-65 (2000).
- Zeng, W., Melotto, M., He, S. Y. Plant stomata: a checkpoint of host immunity and pathogen virulence. Current opinion in biotechnolog. 21, 599-603 (2010).
- Ton, J., Flors, V., Mauch-Mani, B. The multifaceted role of ABA in disease resistance. Trends in plant scienc. 14, 310-317 (2009).
- Mahajan, S., Tuteja, N. Cold salinity and drought stresses: an overview. Archives of biochemistry and biophysic. 444, 139-158 (2005).
- León, J., Rojo, E., Sánchez‐Serrano, J. J. Wound signalling in plants. Journal of Experimental Botan. 52, 1-9 (2001).
