Abstract
In Abwesenheit von spezialisierten mobilen Immunzellen, Pflanzen nutzen ihre lokalisierten programmierten Zelltod und Systemische Akquirierte Resistenz, sich gegen Pathogenbefall verteidigen. Der Beitrag einer speziellen Arabidopsis Gens an der Gesamtanlage Immunantwort spezifisch und quantitativ durch Bestimmung des Wachstum des Pathogens im infizierten Gewebe bewertet. Seit über drei Jahrzehnten, die hemibiotrophe Bakterium Pseudomonas syringae pv. Maculicola ES4326 (PSM ES4326) wurde weithin als Modell Erreger, die molekularen Mechanismen der Arabidopsis Immunantwort zugrunde liegenden Untersuchung angewendet. Um Krankheitserreger in das Blattgewebe zu liefern, haben mehrfache Impfung Verfahren festgelegt, beispielsweise Spritzen Infiltration, dip Inokulation, Spray, Vakuuminfiltration, und Hochwasser Inokulation. Das folgende Protokoll beschreibt eine optimierte Spritze Infiltrationsverfahren zu virulenten Psm ES4326 in Blätter von erwachsenen liefernBodenkultur Arabidopsis-Pflanzen und genau Bildschirm für erhöhte Krankheitsanfälligkeit (EDS) gegenüber diesem Erreger. Zusätzlich kann dieses Protokoll mit mehreren Vorbehandlungen, ergänzt werden, um spezifische Immundefekten weiter zerlegen innerhalb unterschiedlicher Schichten des pflanzlichen Abwehr einschließlich Salicylsäure (SA) -Triggered Immunity (STI) und MAMP-Triggered Immunity (MTI).
Introduction
Aufgrund ihrer sessilen Natur werden Pflanzen ständig von einer Vielzahl von Krankheitserregern, die verschiedene Lebensweisen und Ernährungsstrategien 1 bedroht. In erster Näherung, biotrophen Erreger behalten ihre Gastgeber, am Leben zu Nährstoffen abzurufen, während nekrotrophe Krankheitserreger aktiv geheime Giftstoffe und Enzyme, um Wirtsgewebe töten und ernähren sich von den toten Zellen 1. Eine weitere Gruppe von Krankheitserregern, bezeichnet hemibiotrophs beginnt ihre Infektion natürlich mit der biotrophen Bühne und verschiebt sich nach nekrotrophe Stufe bei Erreichen einer bestimmten Schwelle von pathogenen Ansammlung 2. Um sich gegen diese Mikroorganismen wirksam zu verteidigen, haben Pflanzen einen komplizierten angeborenen Immunsystems mit mehreren Überwachungsmechanismen ausgestattet, um den Erreger Angriff zu erkennen und auslösen entwickelt lokalisiert programmierten Zelltod 3 sowie Systemische Akquirierte Resistenz (SAR) 4. Die aktuelle Forschung auf die Charakterisierung der wesentlichen sig konzentriertnaling Komponenten und Quer Gespräche innerhalb der Anlage Immunsystem 5.
Wie in der "Zig-Zag" Modell 5 vorgeschlagen, die erste Schicht der Anlage angeborenen Immunantwort erfordert die Anwesenheit von Plasmamembran lokalisierte pattern recognition receptors (PRR), um die Invasion einer Mikrobe zu erkennen. PRRs können Microbe-associated molecular patterns (mAmps) zu erkennen und zu etablieren MAMP-Triggered Immunity (MTI) 6. Neben Induktion eines Transkriptions-Hochregulierung von Genen antimikrobielle PR-Proteinen 7 kodiert, führt MTI auf eine Vielzahl von Ereignissen, die das Wachstum des Pathogens, einschließlich der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und reaktive Stickstoffspezies (RNS), Abscheiden Callose an die Zellwand zu verhaften sowie die Aktivierung von mehreren Kinase Signalwege 8.
Bis jetzt wurden mehrere MAMPS identifiziert MTI in Arabidopsis auslösen, einschließlich bakterieller flg22 9 10 (18 Aminosäuren aus dem bakteriellen Elongationsfaktor Tu Übersetzung) und einem strukturellen Zellwandkomponente Peptidoglykane 11. Um eine erfolgreiche Infektion zu etablieren, haben einige spezielle Krankheitserreger die Möglichkeit, geheime Virulenz Effektor-Proteine in die intrazelluläre oder interzellulären Räumen entwickelt und damit zu unter MTI und lösen Effektor-Triggered Anfälligkeit (ETS) 12,13. Zum Beispiel können die Virulenz Effektoren Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK) Phosphorylierungskaskaden MTI zu inaktivieren, um die Entwicklung der Erkrankung in dem infizierten Gewebe 14-16 induzieren. Während der dynamischen Koevolution zwischen Hosts und Krankheitserreger, Pflanzen entwickelte auch die Gegenstrategie, die Effektor-Proteine erkennen und dämpfen das Pathogen Virulenz Moleküle 17. Diese direkte oder indirekte Effektor Erkennung durch Krankheitsresistenz (R) 18-Proteine vermittelt wird. Meiste tSaum sind Mitglieder der NB-LRR (Nukleotid-Bindungs und Leucin-reichen Wiederholungen) Familie 19. Die Wahrnehmung eines avirulenten Effektorzellen durch ein R-Protein löst eine stärkere und breitere Immunantwort charakterisiert als Effektor-Triggered Immunity (ETI) 20. Neben der Induktion der Expression von Abwehrgene 21 und die Produktion von Verteidigungsmetaboliten 22, ETI führt oft zu einer raschen lokalisierten programmierten Zelltod als hypersensible Reaktion (HR) bekannt, die Pathogen-Ausbreitung in das benachbarte Gewebe 3 zu beschränken.
Neben der lokalisierten programmierten Zelltods 23, sind Pflanzen der Lage, eine langfristige und systemweiten Immunantwort bezeichnet Systemische Akquirierte Resistenz (SAR) 4. Bei Provokation mit einem biotrophe Erreger, Pflanzenzellen auszulösen, die Biosynthese und Akkumulation eines endogenen Phytohormon Salicylsäure (SA) und PR-Proteinen sowohl in lokalen und systemischen Geweben 24. Durch tsein Verfahren ein gesteigertes Zustand der Bereitschaft in den nicht-infizierten Blättern, die für die Montage schneller Abwehrreaktionen bei einer nachfolgenden Infektion durch ein breites Spektrum von Erregern 24 ermöglicht erreicht. SA und ihre synthetischen Analoga, wie Benzo (1,2,3) thiadiazol-7-thiocarbonsäure-S-methyl ester (BTH) und 2,6-Dichlorisonicotinsäure (INA) in der Lage sind, chemisch zu induzieren Salicylsäure (SA) -Triggered Immunity (STI) bei der externen Anwendung 24. Nonexpressor der Pathogenese-Assoziierte Gene 1 (NPR1) wird vorgeschlagen, einer der SA-Rezeptoren und wirkt als Haupttranskriptionsregulator während SA-vermittelte Abwehrreaktion sowohl in lokalen und systemischen Geweben 21,25,26 sein. Es hat sich eindeutig gezeigt, dass NPR1 für SAR Einrichtung erforderlich ist, und der Verlust von NPR1 führt zu dramatischen Anfälligkeit gegenüber Pseudomonas syringae 25.
Um umfassend charakterisieren die molekularen Beitrag der PflanzenKomponenten in den Pflanzen-Pathogen-Interaktionen, mehrere Biotests wurden entwickelt, um spezifische Abwehr Veranstaltungen zu messen, einschließlich ROS Burst 27, Kallose-Abscheidung 28, Verteidigung Gene Expression und Anhäufung von ihrer Proteinprodukte 21. Während diese Einzeltests können Einblicke in eine spezifische Form der Pflanze Immunantwort bereitzustellen, keiner von ihnen ist jedoch in der Lage sind, das komplette Abwehrreaktion an der gesamten Pflanze Ebene darstellen. Umgekehrt ist die Quantifizierung der Pathogen Wachstum nach der Infektion bietet eine Gesamtschätzung der Immunantwort auf der organismischen Ebene. Daher ist die Entwicklung und Optimierung von einem präzisen und hoch standardisierte Erreger Inokulation Assay kritischen Kraftstoff den Forschungen und Entdeckungen auf den Arabidopsis Immunantworten.
Pseudomonas syringae, ein Gram-negatives Bakterium, wurde als Phytopathogen Lage verursacht Krankheit in einem Bereich von Wirten, einschließlich Pflanzen Arabidops identifiziertenist 29. Als Modellpflanze-Pathogen-System, das Arabidopsis - P. syringae Interaktion wurde in großem Umfang angewendet, um die molekularen Mechanismen zugrunde liegenden Pflanzenabwehrreaktionen 29 zu verstehen. Bisher über 50 P. syringae Pathovare wurden basierend auf ihrer Fähigkeit, verschiedene Pflanzenarten infizieren 30 identifizierten . P. syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000) 31 und P. syringae pv. maculicola ES4326 (PSM ES4326) 32 sind die beiden am weitesten verbreitete und umfassend charakterisiert virulenten Stämmen. Abgesehen davon, dass durch die Pflanze erkannt und Auslösen des MTI Reaktion Pst DC3000 und PSM ES4326 sind zur Sekretion virulenten Effektorproteine MTI drücken und lösen ETS, das Wachstum des Pathogens 31,33 begünstigen.
Funktionell sezieren die Interaktion zwischen Arabidopsis und P. syringae, multiple0; Pathogeninfektion Methoden wurden auf der Grundlage des Erregers Liefer Ansatz entwickelt. Für Bodenkultur Pflanzen, können Krankheitserreger mit einer Spritze Infiltration, Vakuuminfiltration, Tauch Inokulation und Sprühinokulation 29,34 geliefert werden. Vor kurzem wurde Sämling Flut Inokulation Assay entwickelt, um große Bildschirme auf Gewebekulturplatten durchführen wachsenen jungen Arabidopsis-Pflanzen 35. Syringe Infiltration, als einer der am häufigsten verwendeten Ansatz, manuell liefert die Erreger in den Apoplasten durch die natürlichen Blattöffnungen bezeichnet Spaltöffnungen 29. Durch diesen Ansatz, gleiche Mengen von P. syringae in die befallenen Blatt infiltriert werden und die Stärke der pflanzlichen Immunantwort ist umgekehrt an die das Wachstum des Pathogens Niveaus korreliert. Daher dient die Quantifizierung der Pathogen Wachstum als eine optimale Vorgehensweise, um die Immunfunktion im gesamten Werksebene zu bewerten. Darüber hinaus können Spritzen Infiltration der lokalen und systemischen Gewebe zu unterscheiden, worin B kanne in der Charakterisierung der molekularen Mechanismen SAR 36 erhoben.
In dem folgenden Protokoll beschreiben wir eine optimierte Spritze Infiltration Assay mit Psm ES4326 um Arabidopsis-Mutanten für erhöhte Krankheitsanfälligkeit (EDS) zu screenen. Dieses Protokoll wird zwei Arabidopsis-Genotypen zu beschäftigen: ein Wildtyp-Ökotyp Columbia-0 (Col-0), Pflanzen (Kontrolle) und npr1-1 loss-of-function-Mutanten (hypersusceptible) das wird mit virulenten Bakterienstamm Psm ES4326 37 infiziert werden. Die npr1-1 Mutante trägt eine Punktmutation in der Ankyrin-Repeat-Consensussequenz des NPR1 Molekül, das die hoch konservierten Histidin zu Tyrosin verändert und macht das Protein nicht-funktionellen 25. Darüber hinaus ist eine Anzahl von Modifikationen der Spritze Infiltration Assay beschrieben, die die Quantifizierung von Fehlern in den spezifischen Schichten aus Immunantwort, einschließlich MTI und STI ermöglichen.
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Protocol
Der folgende Text beschreibt eine schrittweise Protokoll optimiert Psm ES4326 Spritze Infiltration Assays in Arabidopsis. Haupt Verfahren dieses Assays sind in einem vereinfachten Ablaufplan (Figur 1) dargestellt.
1. Pflanzenwachstumsbedingungen
- Aussaat der Samen
- Bereiten Sie 2 Töpfen (4 im Durchmesser, 3,75 in hoch) lose mit Boden und Wasser Töpfe durch Einweichen von unten O gefüllt / N vor dem Ablassen des überschüssigen Wassers.
- Säen 50-100 Arabidopsis Samen, Wildtyp Col-0 oder npr1-1 Mutante, auf jeden Topf mit einem gefalteten Blatt mit einem Gewicht von 70 mm oder andere Papier.
- Bedecken Sie den Topf mit einem mit Wasser besprüht transparenten Kuppel, um die relative Luftfeuchtigkeit um 80-90% (2A) zu erhöhen.
- Inkubieren Sie den Topf bei 4 ° C für 72 h bis zur vollständigen Schichtung und synchrone Keimung zu ermöglichen.
- Bringen Sie den Topf zu den Standard-Wachstumsbedingungen (12 Stunden Licht/ 12 Stunden Dunkelheit, 21 ° C, Lichtintensität von 100 & mgr; mol / m 2 / sec, relative Feuchte 40%), damit die Samen zu keimen. Knacken Sie den Dome, eine 2-3 in unmittelbar nach der Übertragung auf dem Wachstumsraum, die zur Vermeidung von Kondenswasserbildung wird die Öffnung zu erzeugen.
- Wenn das erste echte Blatt der Größe von 2-3 mm in der Länge erreicht, die Sämlinge aus dem Topf auf eine 72-Mulden-Wohnung mit Erde gefüllt.
- Verwenden Sie einen Finger oder einem 1 ml Pipettenspitze, um eine 1-in tiefe Depression in der Mitte der Bodenoberfläche in der Ebene erstellen.
- Vorsichtig trennen einzelnen Sämlinge mit so wenig Wurzelschäden wie möglich. Sorgfältig abholen Sämlinge, die intakten Wurzeln mit einer Pinzette zu haben.
- Legen Sie eine einzelne getrennte Keimling zusammen mit der anhaftenden Erde Klumpen der Transplantation Schock in die Vertiefung zu minimieren und sanft pat Sie den umgebenden Boden, um die Depression zu füllen. Entsorgen Sie die zusätzliche Jungpflanzen und Boden in biohazard Abfallbehälter und entsorgen gemäßmit den lokalen biohazard Entsorgungsrichtlinien.
- Wasser übertragen Sämlinge von oben und vollständig bedecken die Wohnung mit einem mit Wasser besprüht transparenten Kuppel auf 80-90% Feuchtigkeit zu halten. Halten Sie die Kuppel auf 3 Tage, dann brechen die Kuppel am Morgen von Tag 4 und vollständig zu entfernen, es bis zum Ende des Tages.
Anmerkung: Säen kann alternativ durch die Schichtung Samen in 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen mit 1 ml 0,1% Agar für 48 Stunden bei 4 ° C gefolgt von Übertragen 2-3 Samen mit einer Glaspipette auf eine 72-Mulden flach mit Erde gefüllt, durchgeführt werden. Wohnungen müssen mit einer transparenten Kuppel, die 1 Woche entfernt werden kann nach der Keimung abgedeckt werden. Zusätzliche Sämlinge können entfernt werden, um nur ein Sämling pro Vertiefung zu verlassen.
- Wasserpflanzen alle zwei Tage durch Einweichen Wohnungen 1-in Wasser für 20 Minuten, dann lassen Sie das überschüssige Wasser.
Hinweis: Das Zeitintervall für die Bewässerung von Pflanzen hängt von der Wachstumsraumfeuchte und muss entschlossen sein Basisd auf eine kontinuierliche Beobachtung des Pflanzenwachstums Anlage Benutzers. Überprüfen Pflanzen täglich um sicherzustellen, dass sie gut bewässert werden. Wenn nur wenige Stellen trocknen, Wasser solche Pflanzen von oben mit einer Spritzflasche. - Zuführen Pathogeninfektion Tests (Schritt 3-5), die auf Pflanzen, die an oder nahe Entwicklungsstadium # 3.50 (wenn Rosette Größe beträgt 50% Endgröße), die je nach Wachstumsbedingungen (Photoperiode, Temperatur) auf 3-5 Wochen alt sind, entspricht. Infizieren nicht Pflanzen nach Blütenstände (Stufe # 5) durch Einsetzen der altersbedingten Widerstands 38,39.
2. Herstellung von Kultur, Medien und Platten
- Stellen Sie 1 l Königs B (KB) flüssiges Medium. Vorsichtig umrühren 20 g Proteosepepton und 2 g Kaliumhydrogenphosphat-Trihydrat mit einem magnetischen Rührstab mit 1000 ml entionisiertem H 2 O bis keine sichtbare Pellet. Aliquot 100 ml in 150 ml Glasflaschen und Autoklaven auf einem 20-min Flüssigkeitskreislauf.
- BereitenKulturplatten mit KB festen Medium.
- Vorsichtig umrühren 20 g Proteosepepton, 2 g dibasisches Kaliumphosphat-Trihydrat und 15 g Agar mit 1000 ml entionisiertem H 2 O Autoklaven.
- Cool down das Medium auf einer magnetischen Rührplatte, bis es kühl anfühlen, um zukünftige Kondensation zu minimieren und den Abbau von Antibiotika zu vermeiden. Hinzuzufügen 18 ml steriles 80% Glycerin und 5 ml sterilem 1 M MgSO 4 und dem Medium. Da Psm ES4326 trägt Beständigkeit gegen Streptomycin, hinzuzufügen Streptomycin in das gekühlte Medium auf eine Endkonzentration von 50 ug ml - 1.
- Gießen Sie die Platten. Bereiten Sie zwei verschiedene Größen von KB Medienplatten: 100 mm x 15 mm und 150 mm x 15 mm Petrischalen. Der kleinere Petrischale mit Medium dient als primäre Bakterienkulturplatten, und die größere Petrischale dient als Bakterienzählvorrichtung Platte.
Hinweis: Für den Bakterien zu zählen Platten können rechteckige Platten verwendet werden, um das zu reduzierenVerbrauchskosten, da doppelt so viele Behandlungen können pro Platte aufgetragen Vergleich zu traditionellen Ronden werden.- Gießen Sie die Platten vor der Infektionsversuch. Speicher KB Medium-Platten bei 4 ° C für bis zu 2-3 Monaten seit Streptomycinsulfat verliert allmählich die antibiotische Aktivität 40.
3. Erhöhte Krankheitsanfälligkeit (EDS)
- Tag 1 - Streak Bakterien auf Platte
- Zwei Tage vor dem EDS-Test, streak Psm ES4326 von -80 ° C Glycerolstammlösung auf einem KB-Strep Bakterienkultur Platte und Inkubation bei 28 ° C für 24-48 Stunden.
- Tag 2 - Einleitung Flüssigkultur und Wasserpflanzen
- Initiieren Sie die Flüssigkultur in einem sterilen Reagenzglas mit 4 ml Flüssigkeit KB-Medium, das 50 ug ml - 1 Streptomycin und schütteln mit 250 Upm, 28 ° CO / N.
Hinweis: Für die EDS-Infektion-Test unter Verwendung von 6 Pflanzen pro Genotyp empfehlened. Für STI und MTI Assays werden 6 Pflanzen pro Genotyp pro Behandlung empfohlen. Für die Bakterien-Inokulum, ist es empfehlenswert, einen frischen Flüssigkeitskultur mit der optischen Dichte bei λ 600 nm zwischen 0,3 und 0,6 zu verwenden. - Markieren Sie die Blattstiele der Blätter Nummer 5 und 6 mit einem stumpfen Enden wasserdichte Marker zur einfachen Identifizierung von infiziertem Gewebe bei der Probenahme (Abbildung 1). Um die Öffnung der Stomata zu verbessern und in das Blatt zu erleichtern das Eindringen von Pathogen-Lösung, Wasser die Pflanzen auch durch Eintauchen der Flach von unten für 20 Minuten, dann lassen Sie das überschüssige Wasser.
Hinweis: Alternativ, decken Sie die Wohnung mit einer transparenten Kuppel und genießen sie in Wasser für 2-4 Stunden, um die Stomata Öffnung zu erhöhen. - Tag 3 - Pathogen Verdünnung und Spritze Infiltration
Hinweis: Pathogen-Infektion während der Morgenstunden ist optimal für Erreger Verbreitung und Entwicklung der ausgeprägtesten Krankheitssymptome an anfälligen Genotypen. Alle Anstrengungen unternehmen, um den Infekt zu haltenIonen-Timing im Einklang, um die Wirkung der zirkadianen Rhythmen und tageszeitlichen Genregulation 41,42, die Verringerung der Unterschiede zwischen den experimentellen Wiederholungen hilft dabei.- Pellet die Bakterienkultur in einer Mikro 1,5 ml Röhrchen bei 9.600 × g für 2 min bei RT und den Überstand verwerfen. Resuspendieren Bakterienpellet mit 1 ml sterilem 10 mM MgCl 2.
Anmerkung: Magnesiumkationen können die Motilität und Adhäsion von P. erweitern syringae 43. Alternativ können MgSO 4 bei der gleichen Konzentration. Steriles Wasser ist ein akzeptabler Ersatz für die Mg-Salz-Lösungen. - Verdünne die Bakteriensuspension mit 9 ml 10 mM MgCl 2 in einem 50 ml-Zentrifugenrohr und Messen der optischen Dichte (OD) von Bakterien, die mit einem Spektrophotometer bei λ = 600 nm. Verdünnen Sie die Bakterien, die mit 10 mM MgCl 2 auf die endgültige OD 600nm = 0,0002 für die EDS-Infektion-Test.
- Infiltrieren die Blattmit einer 1 ml stumpfen Ende nadellose Spritze (allgemein bekannt als der Insulinspritze bekannt), die die verdünnten Bakterienlösung enthält.
- Haben Sie die Spritze bis zu seiner vollen Kapazität zu füllen nicht. Füllen Sie es mit 0,5-0,6 ml, für eine viel bessere Kontrolle während des Infiltrationsprozess zu ermöglichen.
- Setzen die untere Oberfläche des Blattes auf der Oberseite der Zeigefinger, und dann sanft Einstellen der Blattposition mit Hilfe des Daumens. Positionieren Sie die Spritze senkrecht gegen die Blattoberfläche, um sicherzustellen, dass der Druck gleichmäßig verteilt wird. Versuchen Sie, die Mittelrippe Bereich während der Infiltration zu vermeiden zu Blattschäden zu reduzieren.
- Langsam drücken Sie den Kolben, um die Bakterienlösung zu infiltrieren; Flüssigkeitseintritt in das Blatt Mesophyll wird sichtbar gemacht werden, wie durch die dunklere Blattfarbe gekennzeichnet. Versuchen, die gesamte Oberfläche des Blattes zu infiltrieren. Wird dies nicht in einem einzigen Versuch erreicht, wählen Sie einen anderen Ort Infiltration und wiederholen Sie die oben, bis die gesamte Blattfläche abgedeckt beschriebenen Aktionen.
- Einmal vollendet, tupfen Sie leicht den Blatt mit saugfähigen Tuch, um die zusätzliche Erreger Lösung zu entfernen. Sichtprüfung der infizierten Blattgewebe auf Beschädigungen.
Hinweis: Die kreisförmige Spritze Eindruck sollte nicht sichtbar sein, nachdem die Infiltration abgeschlossen ist. - Lassen Sie die infiltrierten Pflanzen für 1-2 Stunden trocknen, bevor sie dann wieder in ihre ursprüngliche Wachstumsbedingungen. Weiter, Spray eine klare Kuppel mit Wasser und decken die infizierten Pflanzen für 2 Stunden, dann reißen die Kuppel, um eine 2-3 in der Öffnung zu erzeugen, und lassen Sie es auf den Rest des Infektionsversuch.
Hinweis: Da P. syringae ist keine Luft Pathogen, besteht keine Gefahr einer Ausbreitung des infektiösen Mittels auf andere Pflanzen in der gleichen Anlage gezüchtet. Jedoch als zusätzliche Vorsichtsmaßnahme zu vermeiden physischen Kontakt zwischen infizierten Pflanzen und anderen Versuchsanlagen in der Nähe. Abdecken der Wohnung mit einer transparenten Kuppel wird das Pathogen Virulenz zu erhöhen und zu beschleunigen, Fortschreiten der Krankheit. Dasmüssen für diesen Schritt und die optimale Dauer der Deckperiode muss auf der Grundlage der Feuchtigkeit von Pflanzenwachstumsmöglichkeiten des Benutzers bestimmt werden.
- Pellet die Bakterienkultur in einer Mikro 1,5 ml Röhrchen bei 9.600 × g für 2 min bei RT und den Überstand verwerfen. Resuspendieren Bakterienpellet mit 1 ml sterilem 10 mM MgCl 2.
- Tag 5 - Pre-trocknen die Medien Platten
- Nehmen Sie die 150 mm x 15 mm KB-Platten aus dem Kältespeicher und trocknen bereits vorhandene Wasserkondensation auf der Platte. Trockenplatten, indem man sie bei Raumtemperatur für etwa 24 Stunden. Um diesen Prozess zu beschleunigen, legen Sie sie in einer Sterilbank mit ihren Deckeln für 30-60 Minuten geknackt.
Anmerkung: Dieser Schritt ist kritisch für die Bildung kreisförmiger Tropfens auf der Oberfläche der Platte in dem nächsten Schritt.
- Nehmen Sie die 150 mm x 15 mm KB-Platten aus dem Kältespeicher und trocknen bereits vorhandene Wasserkondensation auf der Platte. Trockenplatten, indem man sie bei Raumtemperatur für etwa 24 Stunden. Um diesen Prozess zu beschleunigen, legen Sie sie in einer Sterilbank mit ihren Deckeln für 30-60 Minuten geknackt.
- Tag 6 - Quantifizierung der Pathogen Wachstum
Hinweis: Die folgende Pathogen Quantifizierungsverfahren kann zu früheren Zeitpunkten nach der Infektion durchgeführt, um gleiche Mengen von Bakterien in das Blatt zugeführt, insbesondere bei Pflanzen Blattmorphologie verändert bestätigen.- Verarbeiten Sie die infizierten Gewebe nach der EntstehungChlorose durch die Gelbfärbung der infizierten Gewebe in den empfänglichen Genotypen gezeigt, aber vor der Entwicklung nekrotischer Läsionen (2B).
Hinweis: Empfohlene Abtastzeit ist drei Tage nach der Inokulation des Erregers. Da jedoch Pathogen Wachstum hängt von einer Reihe von Umweltfaktoren, die Länge der Inkubation kann in einem Bereich von 2 ½-3 ½ Tagen variieren und muss durch sorgfältige Beobachtungen der Infektion Progression in Pflanzenwachstumsmöglichkeiten des Benutzers bestimmt werden.- Vorzubereiten 6 Probenröhrchen für jeden Genotyp (Abbildung 1). Setzen Sie einen Edelstahl Mahlkugel und fügen Sie 500 ul sterilem 10 mM MgCl 2 in die jedes Röhrchen.
- Nehmen Sie den infizierten Blatt von der Pflanze und Punsch ein Blattscheibe mit einem 1-Loch-Locher (Abbildung 1).
Hinweis: Um den Stichprobenfehler zu minimieren, versuchen, jede abgetastete Blatt an der gleichen Stelle zu stanzen. Sampling der Blattscheibe von obender Blatt empfohlen. - Zufällig Platz 2 Blattscheiben (aus zwei verschiedenen Pflanzen) in jedem Schleifrohr mit einer Pinzette.
- Abdichten des Rohres und Homogenisieren des Gewebes mit einer Hochdurchsatz-Homogenisators bei maximaler Geschwindigkeit (1600 Hübe pro Minute) für 10 min. Wiederholen Sie diesen Vorgang, wenn nötig, bis Gewebe gut homogenisiert und die Lösungen werden grün durch Chlorophyll-Freisetzung aus den infizierten Blättern.
- Während der Wartezeit für die Homogenisierung, füllen die ersten 6 Zeilen einer 96-Well-Kulturplatte mit 180 & mgr; l 10 mM MgCl 2 unter Verwendung einer Mehrkanal-Pipette und eine Pipettiervorrichtung Reservoir.
- Nach dem Schleifen übertragen 20 ul Grundgewebesuspension in die erste Reihe der 96-Well-Platte und mischen durch mehrmaliges Pipettieren der Flüssigkeit nach oben und unten. Wenn kleine Fragmente von Gewebe verstopfen die Spitze, Clip es um 2-3 mm zu helfen, erwerben die richtige Volumen der Lösung.
- Um ausreichend Platz für den Tröpfchen auf die Oberseite o liefernf die Platte den Raum der Gewebe von verschiedenen Genotypen in alternativen Reihen (Abbildung 1). Um eine zehnfache Verdünnungsreihe vorzubereiten, übertragen 20 ul Flüssigkeit in der zweiten Zeile und wiederholen Sie den Vorgang, bis der sechsten Verdünnung.
- Transfer 20 ul Lösung aus der 96-Well-Platte auf die 150 mm x 15 mm-Platte unter Verwendung KB aufgeteilt Pipettenspitzen (Abbildung 1). Arbeiten aus dem die meisten verdünnten Suspension auf die am stärksten konzentrierten.
Anmerkung: Ausgehend von den meisten für die meisten konzentrierten verdünnt macht es unnötig, Pipettenspitzen zwischen den Verdünnungen ändern. Wenn die Platte gut vorgetrocknet, sollte die übertragenen Tröpfchen intakt auf der Oberseite des Mediums bleiben, bis absorbiert (in der Regel 15 bis 30 min). Die Trocknungszeit variiert mit der RT und der Luftfeuchtigkeit. - Trocknen Sie die Platte bei RT mit Deckel geknackt. Sobald keine Flüssigkeit mehr kann auf der Plattenoberfläche beobachtet werden, schließen Sie den Deckel, Invertzucker und inkubieren Sie die Platte bei Raumtemperatur oder 28 ° C Inkubator.
- Inkubation erfolgt während 40 bis 60 Stunden, bis die Kolonien sichtbar werden. Zu bestätigen, dass das Wachstum auf den Platten reflektiert die vorhersagbare 10fachen Abfall der koloniebildenden Einheiten (cfu) (2C). Zählen Sie die Bakterien, bevor sie überwuchern und Kolonien zu verschmelzen. Bestimmen Sie die Anzahl der Bakterien in der niedrigsten Verdünnung, die keine überlappenden Kolonien. In der Regel ist das bevorzugte Verdünnungs gezählt werden zwischen 10-50 Kolonien enthalten.
Hinweis: Variation kann unter technische Replikate vorhanden sein; daher sollte die niedrigste Verdünnung für jede Wiederholung gesondert zu ermitteln. - Um das Niveau der Bakterienvermehrung zu berechnen, dokumentieren Sie die Nummer der Reihe (R) sowie die Anzahl der Bakterien in jedem technischen replizieren (T) schriftlich. Bestimmung der Anzahl der koloniebildende Einheit - cfu / Blattscheibe durch die Formel: KBE / Blattscheiben = (T × R 10/20) · 500/2
- Geben Sie die Daten in der folgenden Tabellenvorlage zu produce eine Grafik (Abbildung 1) (für Tabellenkalkulationsdatenanalyse Vorlage-Datei, siehe Tabelle 2). Jeder Datenpunkt wird als Mittelwert aus sechs technische Replikate auf einer logarithmischen Skala dargestellt. Fehlerbalken stellen 95% -Konfidenzintervall des Mittelwertes (n = 6).
Anmerkung: Die Berechnung der 95% -Konfidenzintervalle muss auf der Grundlage der Anzahl der technische Replikate eingestellt werden.
- Verarbeiten Sie die infizierten Gewebe nach der EntstehungChlorose durch die Gelbfärbung der infizierten Gewebe in den empfänglichen Genotypen gezeigt, aber vor der Entwicklung nekrotischer Läsionen (2B).
- Initiieren Sie die Flüssigkultur in einem sterilen Reagenzglas mit 4 ml Flüssigkeit KB-Medium, das 50 ug ml - 1 Streptomycin und schütteln mit 250 Upm, 28 ° CO / N.
4. SA-Triggered Immunity (STI)
- Tag 1: Folgen Sie dem gleichen Verfahren wie in Schritt 3.1 beschrieben.
- Tag 2: Zusätzlich zur Bewässerung der Pflanzen und die Einleitung des flüssigen Bakterienkultur (Schritt 3.2), induzieren Widerstand durch äußere Anwendung von SA-Derivat Sodium Salicylate 21.
Hinweis: Reine SA hat eine schlechte Wasserlöslichkeit und bedarf der vorherigen pH-Einstellung, so dass es nicht für diesen Test empfohlen.- Um SA-vermittelten Abwehr gegen P. induzieren syringae und Prime die Pflanzen für die zukünftige Infektion 21,24, Spritzanlagen mit einem feinen Nebel von 1 mM Natriumsalicylat oder H 2 O (als mock) 16-24 h vor der Pathogeninfektion.
- Tag 3: Bereiten Erreger Verdünnung auf OD 600nm = 0.001 und drücken Sie die Bakterien in der gesamten Blattoberfläche mit einer Spritze Infiltration (Schritt 3.3).
- 6. Tag: Für Erreger Quantifizierung und Zählvorgang, folgen Sie den Anweisungen wie für die EDS-Test (Schritte 3.4 und 3.5) beschrieben. Platte und zähle die H 2 O und Sodium Salicylate - vorbehandelten Proben getrennt. Vorbehandelten Pflanzen - für Wildtyp-Arabidopsis wird ein 1-2 log Reduktion in Pathogen Wachstum in den Sodium Salicylate erwartet.
5. MAMP-Triggered Immunity (MTI)
Hinweis: Bei diesem Test verwenden wir Arabidopsis-Wildtyp Col-0 und mutierten FLS2 und EFR Pflanzen. FLS2 und EFR sind Plasmamembran lokalisierte pattern recognition receptors (PRR), die flg22 und elf18 erkennen können, welche nach Süctively 9,10. Verlust jeder PRR ergibt die Unempfindlichkeit auf die spezifische Art von MAMP, die von dem unveränderten Wachstum des Pathogens in der Mutante folgenden externen MAMP Vorbehandlung und Spritze Infiltration mit Psm ES4326 deutet ist.
- Tag 1 und 2: Folgen Sie dem gleichen Verfahren wie in Schritt 3.1 und 3.2 beschrieben.
- Tag 3: MAMP Vorbehandlung und Pathogeninfektion
- Um den MAMP-Triggered Immunität aufzubauen, bereiten 1 uM Lösung von Flagellin Epitop flg22 oder EF-Tu-Epitop elf18 und Spritze-zu infiltrieren sie in der gesamten Blattoberfläche 4 h vor der Pathogeninfektion (Schritte 3.3.3-3.3.6). Dies wird für die Induktion der MAMP-vermittelten Abwehr gegen P. ermöglichen syringae und Prime die Pflanzen für zukünftige Infektionen 6,37.
Hinweis: Öffentlich zugängliche Microarray-Daten ergab die maximale Transkriptions Umprogrammierung der MAMP-responsive Gene geschieht, 4 h nach flg22 oder elf18 Behandlung 37,44. Somit ist 4 Stunden die empfohleneDauer des MAMP Vorbehandlung, die bei der Verwirklichung einer klaren Unterschied in der Pathogen Wachstum zwischen MAMP behandelten Col-0 und FLS2 und EFR-Mutanten führt. - Entfernen Sie die zusätzlichen MAMP-Lösung mit saugfähigen Tuch und lassen Sie die Pflanzen aufgedeckt, um das flüssige Absorptionsprozess innerhalb des Blattes zu beschleunigen. Um sich für die Verwundung Wirkung vom Spritzendruckinfiltration Konto, zu infiltrieren H 2 O in den Blättern von Kontrollpflanzen.
- Bereiten Erreger Verdünnung auf OD 600nm = 0.001 und drücken Sie die Bakterien in der gesamten Blattoberfläche von MAMP / H 2 O vorbehandelt Blatt mit einer Spritze Infiltration (Schritt 3.3).
- Um den MAMP-Triggered Immunität aufzubauen, bereiten 1 uM Lösung von Flagellin Epitop flg22 oder EF-Tu-Epitop elf18 und Spritze-zu infiltrieren sie in der gesamten Blattoberfläche 4 h vor der Pathogeninfektion (Schritte 3.3.3-3.3.6). Dies wird für die Induktion der MAMP-vermittelten Abwehr gegen P. ermöglichen syringae und Prime die Pflanzen für zukünftige Infektionen 6,37.
- 6. Tag: Für Erreger Quantifizierung und Zählvorgang, folgen Sie den Anweisungen wie in Schritt 3.4 und 3.5 beschrieben. Platte und zählen Sie die H 2 O und MAMP-vorbehandelten Proben getrennt. In Wildtyp-Arabidopsis, eine 1-2 log Reduktion der Pathogen Wachstum in den MAMP-vorbehandelten Pflanzen zu erwarten, mit etwas starker Reduktion durch flg22 vermittelten Vergleich zu elf18.
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Representative Results
Das Protokoll beschreiben wir hier stellt eine optimierte P. syringae Spritze Infiltration Assay eine quantitative Bewertung der Immunantwort in Arabidopsis-Pflanzen. Wie in Figur 1 dargestellt ist, ist die Spritze Infiltration Psm ES4326 von Pathogen-Extraktion und Quantifizierung über serielle Verdünnungen und Kolonien Aufzählung folgt.
Wie in Schritt 3 im Protokolltext beschrieben, kann Verbesserte Krankheitsanfälligkeit (EDS) gegen Psm ES4326 durch eine Infektion mit einem Inokulum mit OD = 0,0002 bewertet. Wie in Abbildung 3 gezeigt, haben die sehr anfällig npr1-1 Mutanten etwa 2,5 log (300-mal) mehr Pathogen Wachstum im Vergleich zum Wildtyp Col-0 Pflanzen. In Abhängigkeit von den experimentellen Bedingungen können die npr1-1 Pflanzen bis zu 3,0 log unterstützen mehr Bakterienwachstum als Col-0, mit den meisten gängigen Ergebnisse im Bereich von 1,5 bis 2,5 log. Daher ist diese EDS assay bietet eine breite Fenster der Differenz, in denen die Forscher möglicherweise in der Lage, ihre Arabidopsis Mutanten und transgenics platzieren, um Kandidatengene potentiell in der Anlage Immunantwort beteiligt zu identifizieren.
Zusätzlich zur Bestimmung EDS kann Psm ES4326 Spritze Infiltration Test modifiziert werden, um verschiedene Schichten der Immunantwort zu sezieren. Salicylsäure-Triggered Immunität zu bewerten, wird äußerliche Anwendung von chemischen Natriumsalicylat verwendet, um die Immunantwort, die durch das Wachstum des Pathogens (4A) quantifiziert wird auszulösen. Der Verlust von NPR1, die als SA-Rezeptor und wichtigen Transkriptions Co-Regulator des SA-abhängiger Zielgene nach fungiert, führt zu einer Unempfindlichkeit gegenüber exogenen Anwendung Salicylsäurederivat. Diese Unempfindlichkeit gegen SA wird durch die unveränderte Wachstum des Pathogens in den npr1-1 Natriumsalicylat vorbehandelten Pflanzen im Gegensatz zu einer deutlichen Reduktion der Col-0 -Pflanzen (20-mal weniger Pathog zeigten en auf Sodium Salicylate Anwendung) (Abbildung 4B).
Um den MAMP-Triggered Immunity, Vorbehandlung mit flg22 oder elf18 charakterisieren wurde durchgeführt, wie in 5A gezeigt. Um Flagellin ausgelöste Immunität zu charakterisieren, Col-0 und FLS2 mutierten Pflanzen verwendet. FLS2, eine Membran-lokalisierten Rezeptor-like-Kinase, erkennt flg22 und löst MTI 9. Wie in 5B gezeigt, unterstützt die flg22 behandelten Col-0 Pflanzen eine ~ 1 log (10-mal) Reduktion der Bakterienpopulation, während die FLS2 mutierten Pflanzen versäumt, die das Bakterienwachstum Drosselwirkung auszulösen. Auch der Verlust an EF-Tu-Rezeptor EFR in EFR mutierten Pflanzen führt zu Unempfindlichkeit gegenüber Vorbehandlung elf18 wie durch die unveränderte Pathogenwachstum nach elf18 Vorbehandlung (5B) gezeigt.
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Abbildung 1. Schematische Darstellung der Psm ES4326 Spritze Infiltration Assay auf Arabidopsis-Pflanzen. Blätter Nummer 5 und 6 der Erwachsenen Bodenkultur Arabidopsis-Pflanzen werden markiert und mit Psm ES4326 durch Infiltration Spritze infiziert. Nach der Entstehung der Krankheitssymptome, trennen Blättern und Ernteblattscheiben für die Gewebe-Homogenisierung. Gut homogenisiert Gewebe seriell in 96-Well-Platten vor der Übertragung auf eine Bakterienzählung Platte verdünnt. Nach dem Auftauchen Kolonien auf der Platte, zählen die Anzahl der Bakterien und Verarbeitung der Daten, um eine Grafik zu erzeugen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Repräsentative Verfahren der EDS-Test.(A) Töpfe sind mit einem wasser gesprüht transparenten Kuppel nach der Aussaat Samen Vertreter Symptome am Col-0 und npr1-1 Blätter an die EDS-Test unterzogen (OD 600nm = 0,0002) abgedeckt. (B) 3 Tage nach der Inokulation. Hinweis schwerer Chlorose auf npr1-1 und die fast normales Aussehen der Col-0. (C) Serienverdünnungen Psm ES4326 wachsen auf KB (50 ug / ml Streptomycin) Medienplatte nach ~ 45 h Inkubation. Fünf Verdünnungen sichtbar sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Repräsentative Ergebnisse der EDS-Assay Psm ES4326 Wachstum (koloniebildende Einheiten -. KBE / Blattscheibe, expressed auf einer logarithmischen Skala) wurde in 4 Wochen alten Col-0 und npr1-1 Pflanzen quantifiziert 3 Tage nach der Inokulation (OD 600nm = 0,0002). Fehlerbalken stellen 95% Konfidenzintervall des Mittelwerts (n = 6). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Repräsentative Verfahren und die Ergebnisse der STI-Test. (A) Schematische Darstellung des Salicylsäure-Triggered Immunity (STI) Assay. (B) Salicylsäure-Triggered Immunität wurde basierend auf Pathogen Wachstum der Pflanzen quantifiziert mit 1 mM vorbehandelt Natriumsalicylat oder H 2 O 16 h vor Psm ES4326 Spritze Infiltration (OD 600nm = 0,001). Pathogen Wachstum 3 quantifiziertTage nach der Inokulation. Fehlerbalken stellen 95% Konfidenzintervall des Mittelwerts (n = 6). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Repräsentative Verfahren und Ergebnisse des MTI-Assay. (A) Schematische Darstellung des MAMP-Triggered Immunity (MTI) Assay. (B) MTI wurde von Pathogen Wachstum der Pflanzen mit 1 uM Lösung von flg22, elf18 oder H 2 O (als Kontrolle) 4 h vor der Psm vorbehandelten quantifiziert ES4326 Spritze Infiltration (OD 600 nm = 0,001). Pathogen Wachstum wurde quantifiziert 3 Tage nach der Inokulation. Fehlerbalken stellen 95% -Konfidenzintervalle des Mittelwertes (n = 6). Bitte klicken ererneut, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Ausgabe | Mögliche Ursachen | Empfohlene Maßnahmen |
| Kein Bakterienwachstum in dem flüssigen Medium nach der O / N-Kultur | Reduzierte Bakterienaktivität | Initiate Flüssigkultur von einem neu ausgestrichen Platte |
| Circular Spritze Eindruck präsentiert auf dem Blatt nach der Spritze Infiltration | Zu viel Druck während der Infiltration | Reduzieren Sie die pressue während der Infiltration |
| Teil Spritze Eindruck präsentiert auf dem Blatt nach der Spritze Infiltration | Unangemessen Positionierung des Spritzen | Stellen Sie die Spritze senkrecht gegen die Blattoberfläche positioniert werden |
| Blattwelken wthtin wenige Stunden nach der Infiltration | Zuviel Pathogen Lösung wird in das Blatt infiltriert | Stop-infsofort iltrating nachdem die gesamte Blattfläche wird dunkler in der Farbe grün |
| Keine Krankheitssymptome drei Tage nach Infektion | Luftfeuchtigkeit ist zu gering für die Erreger vermehren | Erhöhen Sie die Luftfeuchtigkeit in dem infizierten Pflanzen werden gepflegt |
| Pathogen tritt nekrotrophe Bühne oder vor 3 dpi | Falsche Konzentration der Erreger-Lösung | Verwenden OD 600nm = 0,0002 für die EDS-Assay; bestätigen Verdünnung mit indepedent Spektralphotometer |
| Tröpfchen verschmelzen auf der Oberseite des Bakterienzählvorrichtung Platte | Bakterienzählvorrichtung Platte nicht entsprechend getrocknet | Pre-trocken die Platte O / N vor Gebrauch |
| Pathogen Verdünnung stellt keine 10-fache Reduktion | Verdünnung ist nicht genau durchgeführt | Verwenden Sie einen gut kalibrierten Mehrkanalpipette für die Übertragung von Flüssigkeit; bestätigen, dass alle Flüssigkeit abgegeben wird |
| Pathogen Wachstum im Wildtyp als 8 log KBE / Blattscheibe | Pathogen overgrew im infizierten Gewebe - Probenahme zu spät durchgeführt | Beispiel infiziertes Gewebe nach dem Auflaufen der Bleichsucht |
| Big Variation unter technische Replikate | Pflanzen sind nicht auf dem gleichen Entwicklungsstadium oder infiltriert Blattnummer ist inkonsistent | Verwenden Sie nur Anlagen innerhalb des gleichen Entwicklungsstadium für die Infektion. Bestätigen synchrone Keimung. Infizieren konsequente Blattzahl zwischen verschiedenen Pflanzen |
Tabelle 1 Fehlerbehebung der Spritze Infiltration Assay.
Bitte klicken Sie hier, um die Tabelle 2 zu sehen.
Tabelle 2. Kalkulationstabelle für die statistische Analyse des Erregers Wachstumsdaten.
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Discussion
Mit abnehmender verfügbaren Ackerland und wachsende Bevölkerung, sind die Forscher auf der ganzen Welt mit der dringendsten Bedürfnisse für die Verbesserung von Kulturpflanzen in Frage gestellt. Die Ausbeute kann stark durch verschiedene biotische und abiotische Stressfaktoren beeinflusst werden. Unter ihnen ist Pathogeninfektion eine der führenden Ursachen für Ernteertragsreduktion, für ca. 12% Verluste allein in den USA 45 verantwortlich. Um dieses Problem zu beheben, hat massive Forschung im Modell Arabidopsis durchgeführt worden - P. syringae Pathosystem umfassend zu charakterisieren, die Komponenten und Regulationsmechanismen der Pflanze Immunantworten. Hier präsentieren wir eine optimierte P. syringae ES4326 Spritze Infiltration Assay quantitativ zu bewerten, die feinen Unterschiede in der Pflanzenimmunantwort auf die gesamte Werksebene.
Obwohl mehrere Pathogeninfektion Assays sind entwickelt worden, um die Pflanze Immunantwort 29,35 charakterisieren stellt die Spritze Infiltrationeine gut gesteuerte System, in gleichen Mengen Erreger in das infizierte Gewebe verabreicht. In anderen Infektionstests, einschließlich Tauch Inokulation und Spray Inokulation wird der Erreger auf den gesamten Luft Gewebe angelegt, einschließlich Keimblättern sowie Laubblätter 34. Es wurde berichtet, dass Keimblätter aus Ökotyp Landsberg erecta (L r) sind viel anfälliger für den Erreger während dip Inokulation Assay, der die Daten verfälschen und führen zu falschen Schlussfolgerungen über die Gesamtkrankheitsresistenz 34. Darüber hinaus sind die beiden oben genannten Assays erfordern Pathogen, das Blatt durch die Spaltöffnungen, die durch verschiedene Umweltfaktoren, einschließlich Feuchtigkeit und Licht gesteuert wird, eingeben. Schwankungen dieser Faktoren trägt zu einem höheren Niveau der Variation der Krankheitssymptome im Vergleich zur Spritze Infiltration Assay 35. Für die Vakuuminfiltration, die wichtigsten Nachteile sind die Notwendigkeit für große Mengen von Pathogen-Lösung, Schwierigkeitenum effektiv zu infiltrieren alle Blätter, während Schäden zu vermeiden, und erhebliche Arbeitsintensität 29. Darüber hinaus sind Anlagen mit Sprüh-, Tauch- oder Vakuum Inokulation infiziert weniger wahrscheinlich, sich zu erholen, da der gesamte Sämling mit Pathogen infiziert. In Anbetracht der zahlreichen Einschränkungen anderer Methoden bleibt die Spritze Infiltration Assay das Verfahren der Wahl, um eine einheitliche und sehr vorhersagbar Krankheitsprogression und genaue Quantifizierung des Erregers zu erreichen, um zuverlässig zu charakterisieren, die Immunantwort in der tatsächlichen Blatt. Außerdem kann dieser Test einfach modifiziert werden, um MAMP-Triggered Immunität und Systemische Akquirierte Resistenz charakterisieren. Abgesehen davon könnte vielversprechende zukünftige Anwendungen dieser Technik zum Testen Auswirkungen verschiedener Phytohormone, Chemikalien oder Inhibitoren Vorbehandlungen gefolgt von Erreger Spritze Infiltration angewendet, um verschiedene Schichten von Pflanzenimmunsignalisierungsnetz zu zerlegen oder zu identifizieren, Rollen von einem bestimmten Weg in der Anlage Immun werden Antwort. Infektion with eine erhöhte Dosis des Erregers (OD 600 nm = 0,001) in der Abwesenheit der Einwand Priming Vorbehandlungen, wie das verstärkte Krankheitsresistenz (EDR) -Test bekannt ist, ist eine weitere nützliche Abwandlung dieses Verfahrens, die verwendet werden können, um Mutanten zu identifizieren, oder Transgenen mit verbesserter Krankheitsresistenz.
Es sollte beachtet werden, dass Spritze Infiltration Assay nicht auf die Charakterisierung präinvasiven Stufe der Abwehrreaktion anzuwenden, da der Krankheitserreger direkt in das Blattgewebe über Spaltöffnungen geliefert werden. Stomata, die als physikalische Barriere für Krankheitserreger Eingang dient, wird oft ausgelöst, um Krankheitserreger Eintrag bei der Gründung der MAMP-Triggered Immunity 46 zu beschränken. Darüber hinaus trägt Phytohormon Abscisinsäure um Stomata während der Pre-invasive Stufe 47. Daher können die Sprüh- oder Tauchverfahren als vorteilhaft erweisen, die Spaltöffnungslage der Immunantwort zu charakterisieren, trotz Einschränkungen zugehörigendiejenigen Arten der Impfungen, über 29 diskutiert.
Da die Pflanzen-Pathogen-Interaktionen können durch verschiedene biotische und abiotische Faktoren geändert werden, ist es wichtig, auf die folgenden kritischen Schritte in dem Protokoll, um eine erfolgreiche Infektion zu erreichen und zu erhalten zuverlässige Ergebnisse zu konzentrieren:
Anlagenzustand und Bakterien-Aktivität
Arabidopsis-Pflanzen können leicht durch verschiedene abiotische Faktoren, einschließlich suboptimale Temperatur, Trockenheit und osmotischem Stress betont werden, und lösen zellulären Reaktionen, die mit der Immun Ausgang 48 stören. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, um Pflanzen unter optimalen Wachstumsbedingungen wachsen und sie aus dem belastenden Umweltfaktoren zu schützen. Da zusätzlich das Entwicklungsstadium der befallenen Blatt kann auch das experimentelle Ergebnis zu verändern, ist es notwendig, konsequent Blätter Nummer 5 und 6, um Artefakte zu vermeiden, zu infizieren. Voran entlang Entwicklungsstadien, erhöhte WiederWiderstand gegen einige virulenten und avirulenten Pathogenen korreliert mit dem Übergang von der vegetativen Stadium der reproduktiven Phase der Arabidopsis-Pflanzen. Diese dynamische Widerstand über Entwicklungsstufe wird als Altersbedingte Widerstand (ARR) 38. Um das ARR Interferenz mit dem wahren Immunantwort zu vermeiden, ist es wichtig, um die Infektion in der richtigen Entwicklungsstufe durchzuführen, wie in dem Protokoll angegeben ist und davon absehen zu versuchen Infektionsversuche nach dem Einsetzen des Fortpflanzungsphase. Außerdem bakterielle Fitness und Aktivität wesentlich Einfluss auf die Krankheitserreger Verbreitung innerhalb des infizierten Gewebes. Somit ist es wichtig, den bakteriellen Flüssigkultur von einer frisch ausgestrichenen Kulturplatte, die nicht mehr als 2 Tage alt ist initiieren.
Syringe Infiltration Geschicklichkeit
Während der Spritzen Infiltration, versuchen, irgendeine physikalische Beschädigung des Blattes, da verletzte Effekt zu vermeiden, ist bekannt, mit dem interferierenPflanzenimmunantwort, hauptsächlich über Jasmonsäure-vermittelten Signal, die SA-ausgelöst Verteidigung unterdrücken kann Pfade 49. Nach der Infektion sollte ein Blatt, das infiltriert wurde vollständig in die normale körperliche Erscheinung zu erholen, ohne sichtbare Schäden. Für Anfänger ist es ratsam, diese Technik mit nicht-Versuchsanlagen ersten vor der Durchführung der Psm ES4326 Spritze Infiltration Assay üben.
Pathogen-Extraktion und Verdünnung
Die genaue Messung der Pathogen Wachstum, ist es wichtig, um effizient zu extrahieren Erregers aus dem infizierten Pflanzengewebe. Im Vergleich zu anderen Extraktionsverfahren, mechanisches Gewebehomogenisierung durch Hochdurchsatz-Homogenisatoren effektiv extrahiert Pathogen ohne den Verlust der Gewebeprobe und eine Kreuzkontamination. Anschließend Probenverdünnungen sollte genau mit einer zuverlässig geeicht Mehrkanalpipette, um die Fehler zu reduzieren Pipettierung durchgeführt werden.Abweichung weniger als ± 1 & mgr; l in der Verdünnungsprozess würde in eine ~ 5% Unterschied in der Pathogen Wachstum Quantifizierung zu übersetzen. Für weitere Problemlösungen Beispiele der Spritze Infiltration Test finden Sie in Tabelle 1.
Abschließend beschreiben wir die optimierten das PSM ES4326 Spritze Infiltration Assay auf Arabidopsis quantitativ und zuverlässig beurteilen die Pflanzenimmunantwort. Mit Hilfe dieser Pathosystem wird Verständnis der Pflanzen-Pathogen-Interaktion im Labor beschleunigt und schließlich für den Pflanzenschutz im Bereich angewendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MetroMix 360 | Grosouth | SNGMM360 | |
| Large pots | Grosouth | TEKUVCC10TC | |
| 12 x 6 Inserts | Grosouth | LM1206 | |
| 11x 21 Flats with no holes | Grosouth | LM1020 | |
| 11x 21 Flats with holes | Grosouth | LM1020H | |
| Vinyl propagation domes | Grosouth | CW-221 | |
| Proteose Peptone | Fisher Scientific | DF0122-17-4 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate | MP Biomedicals | 151946 | |
| Agar | Fisher Scientific | A360-500 | |
| Streptomycin sulfate | Bio Basic Inc | SB0494 | |
| 100 x 15 mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 150 x 15 mm Petri dishes | Fisher Scientific | R80150 | |
| Rectangular plate | Fisher Scientific | 12-565-450 | |
| MgCl2 Hexahydrate | Bio Basic Inc | MB0328 | |
| Glycerol | Bio Basic Inc | GB0232 | |
| MgSO4 | Bio Basic Inc | MN1988 | |
| 1 ml syringe | Fisher Scientific | NC9992493 | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| Grinding tubes | Denville Scientific | B1257 | |
| Caps for grinding tubes | Denville Scientific | B1254 | |
| Stainless steel grinding ball | Fisher Scientific | 2150 | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 12-556-008 | |
| Sodium Salicylate | Sigma Aldrich | s3007-1kg | |
| flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA) | Genescript | Made to order | |
| elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | Genescript | Made to order | |
| Hole puncher | Staples | 146308 | |
| Biophotometer plus | Eppendorf | 952000006 | |
| PowerGen High-Throughput Homogenizer | Fisher Scientific | 02-215-503 | |
| Accu spin micro centrifuge | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Multichannel pipette (10-100 µl) | Eppendorf | 3122 000.043 | |
| Multichannel pipette (30-300 µl) | Eppendorf | 3122 000.060 | |
| Pipette (20µl) | Eppendorf | 3120 000.038 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 3552-HR | |
| Sharpie permanent marker | Staples | 507130 | |
| 1.5 ml tube | Eppendorf | 22363204 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 08-890 |
References
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