بكتيريا ورقة تسلل الفحص لتوصيف غرامة الردود الدفاع النبات باستخدام<em> نبات الأرابيدوبسيس thaliana-الزائفة syringae</em> Pathosystem
Summary
Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.
Abstract
في غياب الخلايا المناعية المتنقلة المتخصصة والنباتات الاستفادة من المترجمة موت الخلايا المبرمج والجهازية المكتسبة المقاومة للدفاع عن أنفسهم ضد هجوم الممرض. مساهمة جين نبات الأرابيدوبسيس محددة لاستجابة جهاز المناعة النباتي الكلي يمكن أن يكون على وجه التحديد والكمية المقررة من قبل يعاير نمو الممرض داخل الأنسجة المصابة. لأكثر من ثلاثة عقود، والبكتيريا hemibiotrophic الزائفة syringae الكهروضوئية. maculicola ES4326 (PSM ES4326) تم تطبيق على نطاق واسع الممرض نموذج للتحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة وراء الاستجابة المناعية نبات الأرابيدوبسيس. لتوفير مسببات الأمراض في الأنسجة ورقة، تم إنشاء طرق التلقيح متعددة، على سبيل المثال، تسلل حقنة، التلقيح تراجع، الرذاذ، فراغ تسلل، والتلقيح الفيضانات. يصف بروتوكول التالية أمثل طريقة حقنة تسلل لتسليم ضراوة PSM ES4326 في أوراق الكبارنمت التربة النباتات نبات الأرابيدوبسيس وشاشة بدقة من أجل تعزيز قابلية المرض (EDS) نحو هذا العامل الممرض. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استكمال هذا البروتوكول مع عدة قبل العلاج لمواصلة تشريح العيوب المناعية محددة داخل طبقات مختلفة من دفاع النبات، بما في ذلك حمض الصفصاف (SA) الحصانة -Triggered (STI) والحصانة MAMP الحفز (MTI).
Introduction
نظرا لطبيعتها اطئة، مهددة النباتات باستمرار من قبل عدد كبير من مسببات الأمراض العارضة مختلف أنماط الحياة والاستراتيجيات الغذائية 1. لتقريب الأولى، والحفاظ على مسببات الأمراض biotrophic المضيفة على قيد الحياة لاسترداد المواد الغذائية، بينما ممرضات necrotrophic السموم السرية بنشاط والانزيمات لقتل الأنسجة المضيفة وتتغذى على الخلايا الميتة 1. مجموعة أخرى من مسببات الأمراض، hemibiotrophs تسميته، ويبدأ مسار العدوى مع المرحلة biotrophic والتحول إلى مرحلة necrotrophic عند بلوغ عتبة معينة من تراكم الممرض 2. من أجل الدفاع عن أنفسهم بشكل فعال ضد هذه الكائنات الدقيقة، تطورت النباتات نظام المناعة الفطري معقدة مجهزة آليات المراقبة متعددة للكشف عن مهاجمة مسببات الأمراض ويؤدي المترجمة موت الخلايا المبرمج 3 وكذلك الجهازية المكتسبة المقاومة (SAR) 4. وتركز الأبحاث الحالية على تميز سيج أساسيnaling مكونات والمحادثات عبر في جهاز المناعة النباتية 5.
كما هو مقترح في نموذج "التعرج" 5، والطبقة الأولى من محطة الاستجابة المناعية الفطرية تتطلب وجود البلازما المترجمة الغشاء التعرف على الأنماط مستقبلات (PRRs) للكشف عن غزو الميكروب. PRRs قادرة على التعرف على الأنماط ميكروب-أسوشيتد الجزيئية (MAMPs) وإقامة الحصانة MAMP الحفز (MTI) 6. وعلاوة على ذلك الأمر الذي أدى إلى upregulation النسخي من جينات ترميز البروتينات PR المضادة للميكروبات 7، MTI يؤدي إلى مجموعة متنوعة من الأحداث التي توقيف نمو العوامل المسببة للأمراض، بما في ذلك إنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS) ورد الفعل الأنواع النيتروجين (RNS)، ترسب callose لجدار الخلية فضلا عن تفعيل العديد من الإشارات كيناز مسارات 8.
وحتى الآن، وقد تم تحديد عدة MAMPs لتحريك MTI نبات الأرابيدوبسيس في، بما في ذلك flg22 بكتيريا 9 </sup> (جزء حمض أميني مشتق من 22 فلاجيلين)، elf18 10 (18 الأحماض الأمينية من بكتيريا عامل ترجمة استطالة تو) ومكون جدار الخلية الهيكلي peptidoglycans 11. لإنشاء عدوى النجاح، وقد تطورت بعض مسببات الأمراض المتخصصة القدرة على سرية البروتينات الفوعة المستجيب في المساحات داخل الخلايا أو بين الخلايا، وبالتالي قمع MTI ويثير حساسية المستجيب الحفز (ETS) 12،13. على سبيل المثال، يمكن للمؤثرات الفوعة وقف نشاط البروتين Mitogen المنشط شلالات كيناز (MAPK) الفسفرة من MTI للحث على تطور المرض داخل الأنسجة المصابة 14-16. خلال دينامية التطور المشترك بين المضيفين ومسببات الأمراض، وضعت النباتات أيضا استراتيجية الهجوم المضاد على التعرف على البروتينات المستجيب والتخفيف من الفوعة الممرض جزيئات 17. وتتوسط هذا الاعتراف المباشر أو غير المباشر من قبل المستجيب مقاومة الأمراض (R) البروتينات 18. أكثر من طنتنحنح أعضاء في NB-LRR (النيوكليوتيدات وتجليد ويكرر يسين الغنية) الأسرة 19. تصور من المستجيب الفوعة من قبل البروتين R يثير استجابة مناعية أقوى وأوسع نطاقا وصفها بأنها الحصانة المستجيب الحفز (ETI) 20. إلى جانب إحداث التعبير عن الجينات الدفاع 21 وإنتاج نواتج الدفاع 22، ETI غالبا ما يؤدي إلى مترجم موت الخلية المبرمج السريع المعروف باسم الاستجابة شديد الحساسية (HR) للحد من مسببات المرض من الانتشار إلى الأنسجة المجاورة 3.
بالإضافة إلى مترجم موت الخلايا المبرمج 23، النباتات قادرة على الشروع في المدى الطويل والاستجابة المناعية على نطاق المنظومة وصف الجهازية المكتسبة المقاومة (SAR) 4. على التحدي مع الممرض biotrophic، الخلايا النباتية تؤدي الحيوي وتراكم من هرمون نباتي الذاتية حمض الصفصاف (SA) والبروتينات PR في كل الأنسجة وجهازية 24. من خلال رعملية له، ويتحقق اشتداد حالة التأهب في الأوراق غير المصابة التي تسمح لتركيب الردود الدفاع أسرع خلال عدوى لاحقة من قبل طيف واسع من مسببات الأمراض 24. SA والنظير الاصطناعية مثل benzo- (1،2،3) -thiadiazole-7-carbothioic حمض S -methyl استر (BTH) وحمض 2،6-dichloroisonicotinic (INA) قادرة على حمل كيميائيا حمض الصفصاف (SA) الحصانة -Triggered (STI) بناء على طلب الخارجي 24. ويقترح Nonexpressor من المتصلة إمراض الجينات 1 (NPR1) ليكون واحدا من المستقبلات SA وظائف كمنظم النسخي كبير خلال استجابة الدفاع SA بوساطة في كل الأنسجة وجهازية 21،25،26. وقد أثبتت بشكل قاطع أن NPR1 مطلوب للSAR إنشاء وفقدان NPR1 يؤدي إلى قابلية مثيرة نحو الزائفة syringae 25.
تميز على نطاق واسع مساهمة الجزيئية النباتيةالمكونات في تفاعلات بين النبات والممرض، وقد وضعت اختبارات بيولوجية متعددة لقياس الأحداث دفاع محددة، بما في ذلك ROS انفجار 27، ترسب callose 28، الجينات الدفاع التعبير وتراكم المنتجات البروتين 21. في حين أن هذه المقايسات الفردية يمكن أن توفر نظرة ثاقبة شكل محدد من أشكال الاستجابة المناعية مصنع، فإن أيا منها، ومع ذلك، تكون قادرة على تمثيل استجابة الدفاع كاملة على مستوى المصنع بأكمله. على العكس من ذلك، وتحديد حجم النمو الممرض بعد الإصابة يوفر التقدير الكلي للاستجابة المناعية على المستوى العضوي. ولذلك، فإن التنمية والاستغلال الأمثل للمقايسة الممرض التلقيح دقيق وموحد للغاية أمر بالغ الأهمية لتغذية يصل البحوث والاكتشافات على الاستجابات المناعية نبات الأرابيدوبسيس.
الزائفة syringae، وهي بكتيريا سلبية الغرام، عرف بأنه phytopathogen قادرة على التسبب في المرض في مجموعة من المضيفين النبات بما في ذلك Arabidopsهو 29. كما نموذج النظام النبات الممرض، ونبات الأرابيدوبسيس – P. تم تطبيقه على نطاق واسع التفاعل syringae لفهم الآليات الجزيئية الكامنة الردود دفاع مصنع 29. حتى الآن، أكثر من 50 P. وقد تم تحديد pathovars syringae على أساس قدرتها على إصابة الأنواع النباتية المختلفة 30 . P. syringae الكهروضوئية. DC3000 الطماطم (PST DC3000) 31 و P. syringae الكهروضوئية. maculicola ES4326 (PSM ES4326) 32 هي الأكثر استخداما على نطاق واسع، وتميزت على نطاق واسع اثنين من سلالات خبيثة. بصرف النظر عن كونها معترف بها من قبل المصنع والتسبب في رد MTI، PST DC3000 وPSM ES4326 قادرة على إفراز البروتينات المستجيب خبيثة لقمع MTI ويؤدي ETS لصالح 31،33 نمو العوامل المسببة للأمراض.
لتشريح وظيفيا التفاعل بين نبات الأرابيدوبسيس وP. syringae، متعددةوقد تم تطوير طرق العدوى الممرض استنادا إلى نهج تسليم العامل الممرض؛ 0. للنباتات تزرع التربة، يمكن أن يتم تسليم الممرض تسلل حقنة، فراغ تسلل، وتراجع التلقيح والرش التلقيح 29،34. في الآونة الأخيرة، وقد وضعت الشتلات الفيضانات التلقيح فحص لأداء الشاشات على نطاق واسع في زراعة الأنسجة لوحات نمت النباتات نبات الأرابيدوبسيس الشباب 35. حقنة تسلل، باعتبارها واحدة من أكثر الطرق شيوعا، يدويا يسلم الممرض في الممر الخلوي الغشائي من خلال الفتحات الطبيعية ورقة تسمى الثغور 29. من خلال هذا النهج، كميات متساوية من P. syringae يمكن تسللت إلى ورقة المصابة ويرتبط قوة الاستجابة المناعية مصنع عكسيا مع مستويات النمو الممرض. لذلك، وتحديد حجم النمو الممرض بمثابة النهج الأمثل لتقييم الوظيفة المناعية على مستوى المصنع بأكمله. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للحقنة تسلل تمييز الأنسجة المحلية والنظامية، والتي يمكن بالبريد المطبق في وصف الآليات الجزيئية الكامنة وراء SAR 36.
في بروتوكول التالية، وصفنا حقنة الأمثل تسلل مقايسة مع PSM ES4326 لفحص المسوخ نبات الأرابيدوبسيس لتعزيز قابلية المرض (EDS). وهذا البروتوكول توظيف اثنين من المورثات نبات الأرابيدوبسيس: البرية من نوع نوع إيكولوجي كولومبيا-0 (كو-0) النباتات (السيطرة) وnpr1-1 الخسارة من وظيفة المسوخ (hypersusceptible) التي من شأنها أن تكون مصابة السلالة البكتيرية ضراوة PSM ES4326 37. متحولة npr1-1 يحمل طفرة نقطة في تسلسل توافق في الآراء ankyrin تكرار للجزيء NPR1، الذي يغير الحامض الاميني الحفظ جدا لالتيروزين ويجعل البروتين غير وظيفية 25. بالإضافة إلى ذلك، وصف عدد من التعديلات للمقايسة حقنة التسلل التي تسمح الكمي من العيوب في طبقات معينة من الاستجابة المناعية، بما في ذلك MTI وSTI.
Protocol
Representative Results
Discussion
مع تناقص الأراضي الزراعية المتاحة وزيادة عدد السكان، وتحدى الباحثين في جميع أنحاء العالم مع الاحتياجات الملحة لتحسين المحاصيل. العائد يمكن أن تتأثر بشكل كبير من قبل مختلف الضغوط الحيوية وغير الحيوية. من بينها، إصابة الممرض هي واحدة من الأسباب الرئيسية لانخفاض غلة ا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Shahid Mukhtar for critiquing the manuscript and Dr. Xinnian Dong for the sample data analysis file. This work is supported by a NSF-CAREER award (IOS-1350244) to KPM and the UAB Biology Department.
Materials
| MetroMix 360 | Grosouth | SNGMM360 | |
| Large pots | Grosouth | TEKUVCC10TC | |
| 12×6 Inserts | Grosouth | LM1206 | |
| 11×21 Flats with no holes | Grosouth | LM1020 | |
| 11×21 Flats with holes | Grosouth | LM1020H | |
| Vinyl propagation domes | Grosouth | CW-221 | |
| Proteose Peptone | Fisher Scientific | DF0122-17-4 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate | MP Biomedicals | 151946 | |
| Agar | Fisher Scientific | A360-500 | |
| Streptomycin sulfate | Bio Basic Inc | SB0494 | |
| 100x15mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 150x15mm Petri dishes | Fisher Scientific | R80150 | |
| Rectangular plate | Fisher Scientific | 12-565-450 | |
| MgCl2 Hexahydrate | Bio Basic Inc | MB0328 | |
| Glycerol | Bio Basic Inc | GB0232 | |
| MgSO4 | Bio Basic Inc | MN1988 | |
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | NC9992493 | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| Grinding tubes | Denville Scientific | B1257 | |
| Caps for grinding tubes | Denville Scientific | B1254 | |
| Stainless steel grinding ball | Fisher Scientific | 2150 | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 12-556-008 | |
| Sodium Salicylate | Sigma Aldrich | s3007-1kg | |
| flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA) | Genescript | Made to order | |
| elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | Genescript | Made to order | |
| Hole puncher | Staples | 146308 | |
| Biophotometer plus | Eppendorf | 952000006 | |
| PowerGen High-Throughput Homogenizer | Fisher Scientific | 02-215-503 | |
| Accu spin micro centrifuge | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Multichannel pipette (10-100 µl) | Eppendorf | 3122 000.043 | |
| Multichannel pipette (30-300µl) | Eppendorf | 3122 000.060 | |
| Pipette (20µl) | Eppendorf | 3120 000.038 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 3552-HR | |
| Sharpie permanent marker | Staples | 507130 | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 22363204 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 08-890 |
References
- Glazebrook, J. Contrasting mechanisms of defense against biotrophic and necrotrophic pathogens. Annu. Rev. Phytopathol. 43, 205-227 (2005).
- Hammond-Kosack, K. E., Jones, J. D. Plant disease resistance genes. Annual review of plant biolog. 48, 575-607 (1997).
- Pontier, D., Balague, C., Roby, D. The hypersensitive response. A programmed cell death associated with plant resistance. C R Acad Sci II. 321, 721-734 (1998).
- Ryals, J. A., et al. Systemic Acquired Resistance. Plant Cel. 8, 1809-1819 (1996).
- Jones, J. D., Dangl, J. L. The plant immune system. Natur. 444, 323-329 (2006).
- Newman, M. A., Sundelin, T., Nielsen, J. T., Erbs, G. MAMP (microbe-associated molecular pattern) triggered immunity in plants. Front Plant Sc. 4, 139 (2013).
- Fritig, B., Heitz, T., Legrand, M. Antimicrobial proteins in induced plant defense. Curr Opin Immuno. 10, 16-22 (1998).
- Nicaise, V., Roux, M., Zipfel, C. Recent advances in PAMP-triggered immunity against bacteria: pattern recognition receptors watch over and raise the alarm. Plant Physio. 150, 1638-1647 (2009).
- Zipfel, C., et al. Bacterial disease resistance in Arabidopsis through flagellin perception. Natur. 428, 764-767 (2004).
- Kunze, G., et al. The N terminus of bacterial elongation factor Tu elicits innate immunity in Arabidopsis plants. Plant Cel. 16, 3496-3507 (2004).
- Gust, A. A., et al. Bacteria-derived peptidoglycans constitute pathogen-associated molecular patterns triggering innate immunity in Arabidopsis. J Biol Che. 282, 32338-32348 (2007).
- Alfano, J. R., Collmer, A. Type III secretion system effector proteins: double agents in bacterial disease and plant defense. Annu Rev Phytopatho. 42, 385-414 (2004).
- Tyler, B. M. Entering and breaking: virulence effector proteins of oomycete plant pathogens. Cell Microbio. 11, 13-20 (2009).
- He, P., et al. Specific bacterial suppressors of MAMP signaling upstream of MAPKKK in Arabidopsis innate immunity. Cel. 125, 563-575 (2006).
- Gimenez-Ibanez, S., et al. AvrPtoB targets the LysM receptor kinase CERK1 to promote bacterial virulence on plants. Curr Bio. 19, 423-429 (2009).
- Zhang, Z., et al. Disruption of PAMP-induced MAP kinase cascade by a Pseudomonas syringae effector activates plant immunity mediated by the NB-LRR protein SUMM2. Cell Host Microb. 11, 253-263 (2012).
- Chisholm, S. T., Coaker, G., Day, B., Staskawicz, B. J. Host-microbe interactions: shaping the evolution of the plant immune response. Cel. 124, 803-814 (2006).
- Jones, D. A., Takemoto, D. Plant innate immunity – direct and indirect recognition of general and specific pathogen-associated molecules. Curr Opin Immuno. 16, 48-62 (2004).
- Elmore, J. M., Lin, Z. J., Coaker, G. Plant NB-LRR signaling: upstreams and downstreams. Curr Opin Plant Bio. 14, 365-371 (2011).
- Gassmann, W., Bhattacharjee, S. Effector-triggered immunity signaling: from gene-for-gene pathways to protein-protein interaction networks. Mol Plant Microbe Interac. 25, 862-868 (2012).
- Wang, D., Weaver, N. D., Kesarwani, M., Dong, X. Induction of protein secretory pathway is required for systemic acquired resistance. Scienc. 308, 1036-1040 (2005).
- Bednarek, P. Chemical warfare or modulators of defence responses – the function of secondary metabolites in plant immunity. Curr Opin Plant Bio. 15, 407-414 (2012).
- Heath, M. C. Hypersensitive response-related death. Plant Mol Bio. 44, 321-334 (2000).
- Fu, Z. Q., Dong, X. Systemic acquired resistance: turning local infection into global defense. Annu Rev Plant Bio. 64, 839-863 (2013).
- Cao, H., Glazebrook, J., Clarke, J. D., Volko, S., Dong, X. The Arabidopsis NPR1 gene that controls systemic acquired resistance encodes a novel protein containing ankyrin repeats. Cel. 88, 57-63 (1997).
- Wu, Y., et al. The Arabidopsis NPR1 protein is a receptor for the plant defense hormone salicylic acid. Cell Re. 1, 639-647 (2012).
- Smith, J. M., Heese, A. Rapid bioassay to measure early reactive oxygen species production in Arabidopsis leave tissue in response to living Pseudomonas syringae. Plant Method. 10, 6 (2014).
- Nomura, K., et al. A bacterial virulence protein suppresses host innate immunity to cause plant disease. Scienc. 313, 220-223 (2006).
- Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction. The Arabidopsis book/American Society of Plant Biologist. 1, (2002).
- Sawada, H., Suzuki, F., Matsuda, I., Saitou, N. Phylogenetic analysis of Pseudomonas syringae pathovars suggests the horizontal gene transfer of argK and the evolutionary stability of hrp gene cluster. J Mol Evo. 49, 627-644 (1999).
- Xin, X. F., He, S. Y. Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000: a model pathogen for probing disease susceptibility and hormone signaling in plants. Annu Rev Phytopatho. 51, 473-498 (2013).
- Dong, X., Mindrinos, M., Davis, K. R., Ausubel, F. M. Induction of Arabidopsis defense genes by virulent and avirulent Pseudomonas syringae strains and by a cloned avirulence gene. Plant Cel. 3, 61-72 (1991).
- Mackey, D., Holt 3rd, B. F., Wiig, A., Dangl, J. L. RIN4 interacts with Pseudomonas syringae type III effector molecules and is required for RPM1-mediated resistance in Arabidopsis. Cel. 108, 743-754 (2002).
- Tornero, P., Dangl, J. L. A high‐throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana. The Plant Journa. 28, 475-481 (2001).
- Ishiga, Y., Ishiga, T., Uppalapati, S. R., Mysore, K. S. Arabidopsis seedling flood-inoculation technique: a rapid and reliable assay for studying plant-bacterial interactions. Plant Method. 7, 32 (2011).
- Zheng, X. Y., et al. Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation. Cell Host Microb. 11, 587-596 (2012).
- Pajerowska-Mukhtar, K. M., et al. The HSF-like transcription factor TBF1 is a major molecular switch for plant growth-to-defense transition. Curr Bio. 22, 103-112 (2012).
- Rusterucci, C., et al. Age-related resistance to Pseudomonas syringae pv. tomato is associated with the transition to flowering in Arabidopsis and is effective against Peronospora parasitica. Physiological and molecular plant patholog. 66, 222-231 (2005).
- Boyes, D. C., et al. Growth stage–based phenotypic analysis of Arabidopsis a model for high throughput functional genomics in plants. The Plant Cell Onlin. 13, 1499-1510 (2001).
- Regna, P. P., Wasselle, L. A., Solomons, I. A. The stability of streptomycin. Journal of Biological Chemistr. 165, 631-638 (1946).
- Wang, W., et al. Timing of plant immune responses by a central circadian regulator. Natur. 470, 110-114 (2011).
- Hua, J. Modulation of plant immunity by light, circadian rhythm, and temperature. Current opinion in plant biolog. 16, 406-413 (2013).
- Cuppels, D. A. Chemotaxis by Pseudomonas syringae pv. tomato. Appl Environ Microbio. 54, 629-632 (1988).
- Qutob, D., et al. Phytotoxicity and innate immune responses induced by Nep1-like proteins. The Plant Cell Onlin. 18, 3721-3744 (2006).
- Pimentel, D., Lach, L., Zuniga, R., Morrison, D. Environmental and economic costs of nonindigenous species in the United States. BioScienc. 50, 53-65 (2000).
- Zeng, W., Melotto, M., He, S. Y. Plant stomata: a checkpoint of host immunity and pathogen virulence. Current opinion in biotechnolog. 21, 599-603 (2010).
- Ton, J., Flors, V., Mauch-Mani, B. The multifaceted role of ABA in disease resistance. Trends in plant scienc. 14, 310-317 (2009).
- Mahajan, S., Tuteja, N. Cold salinity and drought stresses: an overview. Archives of biochemistry and biophysic. 444, 139-158 (2005).
- León, J., Rojo, E., Sánchez‐Serrano, J. J. Wound signalling in plants. Journal of Experimental Botan. 52, 1-9 (2001).
