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Immunology and Infection

Ensayo de infiltración bacteriana de la hoja por Fine Caracterización de las respuestas de defensa de la planta utilizando el Published: October 1, 2015 doi: 10.3791/53364

Abstract

En ausencia de las células inmunes móviles especializadas, las plantas utilizan su localizada muerte celular programada y sistémica resistencia adquirida a defenderse contra el ataque de patógenos. La contribución de un gen de Arabidopsis específica a la respuesta inmune general de la planta puede ser específicamente y cuantitativamente evaluado ensayando el crecimiento de patógenos en el tejido infectado. Durante más de tres décadas, la bacteria hemibiotrophic Pseudomonas syringae pv. Maculicola ES4326 (PSM ES4326) se ha aplicado ampliamente como el modelo de patógenos para investigar los mecanismos moleculares que subyacen a la respuesta inmune de Arabidopsis. Para entregar agentes patógenos en el tejido de la hoja, múltiples métodos de inoculación se han establecido, por ejemplo, infiltración de la jeringa, la inoculación por inmersión, pulverización, infiltración al vacío, y la inoculación de inundación. El siguiente protocolo describe un método de infiltración jeringa optimizado para ofrecer virulenta PSM ES4326 en hojas de adultossuelo cultivado plantas de Arabidopsis y la pantalla con precisión para una mayor susceptibilidad a la enfermedad (EDS) en dirección a este patógeno. Además, este protocolo se puede complementar con múltiples tratamientos previos para diseccionar más defectos inmunes específicas dentro de las diferentes capas de defensa de la planta, incluyendo el ácido salicílico (SA) Inmunidad -Accionados (ITS) e Inmunidad-Triggered MAMP (MTI).

Introduction

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Debido a su naturaleza sésiles, las plantas están constantemente amenazados por una gran cantidad de patógenos que presentan diferentes estilos de vida y estrategias nutricionales 1. En una primera aproximación, los patógenos biotróficos mantienen su huésped vivo para recuperar los nutrientes, mientras que los agentes patógenos necrotróficos toxinas activamente secretas y enzimas para matar tejido del huésped y se alimentan de las células muertas de la 1. Otro grupo de agentes patógenos, hemibiotrophs denominados, comienza su curso con la etapa de la infección biotrófico y los cambios a la etapa necrotrófico al alcanzar un cierto umbral de acumulación patógeno 2. Con el fin de defender eficazmente contra estos microorganismos, las plantas han desarrollado un sistema inmune innato complicada equipado con múltiples mecanismos de vigilancia para detectar el ataque de patógenos y desencadenar la muerte celular localizada 3, así como resistencia sistémica adquirida (SAR) 4 programado. La investigación actual se centra en la caracterización de la sig esencialcomponentes naling y cruzadas conversaciones dentro del sistema inmunológico planta 5.

Tal como se propone en el modelo de "Zig-Zag" 5, la primera capa de la respuesta inmune innata planta requiere la presencia de la membrana plasmática-localizada Patrón receptores de reconocimiento (PRRS) para detectar la invasión de un microbio. Derechos y responsabilidades parentales son capaces de reconocer patrones Microbio asociada Moleculares (mAmps) y establecer Inmunidad-Triggered MAMP (MTI) 6. Además de inducir una regulación positiva de la transcripción de genes que codifican proteínas PR antimicrobianos 7, MTI conduce a una variedad de eventos que la detención del crecimiento de patógenos, incluyendo la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS) y reactivas de nitrógeno Especies (RNS), deposición de callose a la pared celular así como la activación de la señalización de vías múltiples quinasa 8.

Hasta ahora, varios MAMPs se han identificado para desencadenar MTI en Arabidopsis, incluyendo flg22 bacteriana 9 10 (18 aminoácidos del factor de elongación de la traducción bacteriana Tu) y un componente estructural de la pared celular peptidoglicanos 11. Para establecer una infección exitosa, algunos patógenos especializados han desarrollado la capacidad de las proteínas efectoras secretas virulencia en los espacios intercelulares o intracelulares, y en consecuencia reprimir MTI y desencadenar Susceptibilidad-Triggered efectoras (ETS) 12,13. Por ejemplo, efectores de virulencia pueden inactivar proteína activada por mitógeno cascadas de quinasas (MAPK) fosforilación de MTI para inducir el desarrollo de la enfermedad dentro del tejido infectado 14-16 de. Durante la co-evolución dinámica entre los ejércitos y agentes patógenos, las plantas también desarrollaron la estrategia de contraataque para reconocer las proteínas efectoras y atenuar la virulencia de patógenos moléculas 17. Este reconocimiento directo o indirecto efector está mediada por resistencia a enfermedades (R) 18 proteínas. La mayoría de tdobladillo son miembros de NB-LRR (nucleótidos vinculante y ricos en leucina repite) la familia 19. La percepción de un efector no virulenta por una proteína R provoca una respuesta más fuerte y más amplia inmunológico caracterizado como Inmunidad Accionado efector (ETI) 20. Además de inducir la expresión de genes de defensa 21 y la producción de metabolitos de defensa 22, ETI menudo conduce a una localizada muerte celular programada conocida como hipersensible rápida respuesta (HR) para restringir el patógeno se propague en el tejido adyacente 3.

Además de la muerte celular programada localizada 23, las plantas son capaces de iniciar un largo plazo y la respuesta inmune en todo el sistema denominado Systemic Acquired Resistencia (SAR) 4. Tras la estimulación con un patógeno biotrófico, las células vegetales desencadenan la biosíntesis y acumulación de un ácido fitohormona endógena salicílico (SA) y proteínas PR en ambos tejidos locales y sistémicos 24. A través de tsu proceso, se logra un mayor estado de preparación en las hojas infectadas que permite para el montaje de las respuestas de defensa más rápidos durante una infección posterior por un amplio espectro de patógenos 24. SA y sus análogos sintéticos como el benzo (1,2,3), 7-carbotioico tiadiazol éster del ácido S metil (BTH) y ácido 2,6-dicloroisonicotínico (INA) son capaces de inducir químicamente ácido salicílico (SA) Inmunidad -Accionados (ITS) tras la aplicación externa de 24. Nonexpressor de los genes relacionados con la patogénesis (1 NPR1) se propone para ser uno de los receptores SA y funciona como un importante regulador transcripcional durante la respuesta de defensa mediada por SA en ambos tejidos locales y sistémicos 21,25,26. Se ha demostrado de manera concluyente que NPR1 se requiere para el establecimiento SAR y la pérdida de NPR1 conduce a la susceptibilidad dramática hacia Pseudomonas syringae 25.

Para caracterizar ampliamente la contribución molecular de plantascomponentes en las interacciones planta-patógeno, múltiples bioensayos se han desarrollado para medir acontecimientos de defensa específicos, incluyendo ROS estalló 27, deposición callose 28, genes de defensa expresión y acumulación de sus productos proteicos 21. Si bien estos ensayos individuales pueden proporcionar información en una forma específica de la respuesta inmune de la planta, ninguno de ellos, sin embargo, son capaces de representar la respuesta de defensa completa sobre todo el nivel de la planta. Por el contrario, la cuantificación del crecimiento de patógenos después de la infección proporciona una estimación global de la respuesta inmune a nivel del organismo. Por lo tanto, el desarrollo y optimización de un ensayo de inoculación de patógenos preciso y altamente estandarizado es crítico para alimentar la investigación y descubrimientos en las respuestas inmunes de Arabidopsis.

Pseudomonas syringae, una bacteria Gram-negativa, se identificó como un fitopatógeno capaz de causar enfermedad en una gama de huéspedes vegetales incluyendo Arabidopses 29. A medida que el sistema de la planta de patógenos modelo, la Arabidopsis - P. interacción syringae se ha aplicado ampliamente para comprender los mecanismos moleculares respuestas de defensa de las plantas subyacentes 29. Hasta ahora, más de 50 P. patovares syringae se han identificado basándose en su capacidad para infectar diferentes especies de plantas 30 . P. syringae pv. DC3000 tomate (Pst DC3000) 31 y P. syringae pv. maculicola ES4326 (PSM ES4326) 32 son las dos cepas virulentas más usados ​​y ampliamente caracterizados. Aparte de ser reconocido por la planta y la activación de la respuesta de MTI, Pst DC3000 y PSM ES4326 son capaces de secretar proteínas efectoras virulentas para suprimir MTI y desencadenar ETS para favorecer el 31,33 crecimiento de patógenos.

Para diseccionar funcionalmente la interacción entre Arabidopsis y P. syringae, múltiple0; métodos de infección de patógenos se han desarrollado sobre la base del enfoque de prestación de patógenos. Para las plantas de suelos cultivados, patógeno puede ser entregado por la infiltración de la jeringa, la infiltración de vacío, la inoculación por inmersión y la inoculación aerosol 29,34. Recientemente, ensayo de inundación de la inoculación de las plántulas fue desarrollado para realizar pantallas de gran escala en el cultivo de tejidos placas cultivadas plantas de Arabidopsis jóvenes 35. Infiltración Jeringa, como uno de los método más comúnmente utilizado, entrega manualmente el patógeno en el apoplasto través de las aberturas de las hojas naturales estomas 29 llamados. A través de este enfoque, la misma cantidad de P. syringae se puede infiltrar en la hoja infectada y la fuerza de la respuesta inmune planta está inversamente correlacionada con los niveles de crecimiento de patógenos. Por lo tanto, la cuantificación del crecimiento de patógenos sirve como un enfoque óptimo para evaluar la función inmune a nivel de planta entera. Además, la infiltración de la jeringa puede distinguir el tejido local y sistémica, que puede be aplicable en la caracterización de los mecanismos moleculares que subyacen a SAR 36.

En el siguiente protocolo, se describe un ensayo de infiltración jeringa optimizado con PSM ES4326 para detectar mutantes de Arabidopsis para una mayor susceptibilidad a la enfermedad (EDS). Este protocolo empleará dos genotipos de Arabidopsis: una de tipo salvaje ecotipo Columbia-0 (Col-0) plantas (de control) y npr1-1 mutantes de pérdida de función (hipersusceptibles) que se infectaron con la cepa bacteriana virulenta PSM ES4326 37. El mutante npr1-1 lleva una mutación puntual dentro de la secuencia de consenso-ankyrin repetida de la molécula NPR1, que altera la histidina altamente conservada en tirosina y hace que la proteína no funcional 25. Además, una serie de modificaciones del ensayo de infiltración de la jeringa se describen que permiten la cuantificación de defectos en las capas específicas de la respuesta inmune, incluyendo MTI y STI.

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Protocol

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El siguiente texto describe un protocolo escalonado a ejecutar un trabajo optimizado PSM ES4326 ensayo de infiltración de la jeringa en Arabidopsis. Los principales procedimientos de este ensayo se representan en un diagrama de flujo simplificado (Figura 1).

1. Planta de condiciones de crecimiento

  1. Sembrar semillas
    1. Prepare 2 ollas (4 de diámetro, 3,75 de altura) sin apretar llenos de macetas de suelo y agua en remojo desde la parte inferior de O / N antes de drenar el exceso de agua.
    2. Siembre 50-100 semillas de Arabidopsis, de tipo salvaje Col-0 o npr1-1 mutantes, en cada maceta con plegados 70 mm con un peso de hoja u otro papel.
    3. Cubra la olla con una cúpula transparente rociado de agua para aumentar la humedad relativa de 80 a 90% (Figura 2).
  2. Incubar la olla a 4 ° C durante 72 horas para permitir la estratificación completa y la germinación síncrona.
  3. Transferir el bote a las condiciones de crecimiento estándar (luz 12 horas/ 12 h oscuro, 21 ° C, la intensidad de luz de 100 mmol / m2 / seg, humedad relativa del 40%) para permitir que la semilla germine. Romper la cúpula para generar un 2-3 en la apertura inmediatamente después de la transferencia a la sala de crecimiento, lo que ayudará a evitar la condensación de agua.
  4. Cuando la primera hoja verdadera alcanza el tamaño de 2-3 mm de longitud, trasplantar las plantas de semillero de la olla a un 72-pozos plana llenas de tierra.
    1. Use un dedo o una punta de pipeta 1 ml para crear una profunda depresión 1-in en el medio de la superficie del suelo en la parte plana.
    2. Separar suavemente plántulas individuales con el menor daño a las raíces de lo posible. Recoja cuidadosamente las plántulas que tienen raíces intactas con fórceps.
    3. Coloque una sola plántula separado junto con el grupo adherirse suelo para minimizar el choque del trasplante en la depresión y acaricie suavemente por el suelo circundante para llenar la depresión. Deseche las plántulas adicionales y el suelo en peligro biológico contenedor de residuos y disponer de acuerdocon las directrices de eliminación de residuos de riesgo biológico locales.
    4. Agua transferida plántulas desde la parte superior y completamente cubre el piso con una cúpula transparente pulverizada-agua para mantener el 80-90% de humedad. Mantenga la cúpula durante 3 días, y luego romper la cúpula de la mañana del día 4 y completamente y eliminar a finales de ese mismo día.
      Nota: Gérmenes de la siembra se pueden realizar alternativamente por semillas estratificando en tubos de 1,5 ml que contienen 1 ml de centrífuga de 0,1% de agar durante 48 horas a 4 ° C seguido por la transferencia de 2-3 semillas con una pipeta de vidrio en un 72-pozos plana llenas de tierra. Pisos necesitan ser cubierto con una cúpula transparente que se puede quitar una semana después de la germinación. Plántulas adicionales se pueden quitar para dejar sólo una plántula por pocillo.
  5. Plantas de agua cada dos días por remojo pisos en 1-en el agua durante 20 minutos, luego drenar el exceso de agua.
    Nota: El intervalo de tiempo para regar las plantas depende de la humedad de la habitación crecimiento y tiene que ser la base determinadad en la observación continua de las instalaciones crecimiento de la planta del usuario. Compruebe plantas todos los días para asegurarse de que están bien regados. Si sólo algunos puntos se están secando, el agua las plantas de la parte superior con una botella con atomizador.
  6. Realizar ensayos de infección de patógenos (Paso 3-5) en las plantas que se encuentran en o cerca del desarrollo etapa # 3.50 (cuando el tamaño de roseta es 50% del tamaño final), que corresponde a 3-5 semanas de edad dependiendo de las condiciones de crecimiento (fotoperíodo, temperatura). No infectar a las plantas después de la emergencia de la inflorescencia (etapa # 5), debido a la aparición de la resistencia asociada a la edad 38,39.

2. Preparación de medios de cultivo y placas

  1. Hacer 1 L del King B (KB) medio líquido. Agitar suavemente 20 g de peptona proteosa y 2 g de fosfato de potasio dibásico trihidrato usando una barra agitadora magnética con 1,000 ml H2O desionizada hasta que no haya pellet visible. Alícuota de 100 ml en 150 ml botellas de vidrio y de autoclave en un ciclo de líquido 20 min.
  2. Prepararplacas de cultivo con medio sólido KB.
    1. Revuelva suavemente H 20 g Proteosa peptona, 2 g fosfato de potasio dibásico Trihidrato y 15 g de agar con 1.000 ml desionizada 2 O. Autoclave.
    2. Enfriar el medio en una placa de agitación magnética hasta que esté fría al tacto para minimizar futuro condensación y evitar la degradación de los antibióticos. Añadir 18 ml estéril 80% de glicerol y 5 ml estériles 1 M MgSO 4 al medio. Dado que PSM ES4326 lleva resistencia contra estreptomicina, añadir la estreptomicina en los medios de comunicación enfría a una concentración final de 50 mg ml - 1.
    3. Verter las placas. Preparar dos tamaños diferentes de placas de medio KB: 100 mm x 15 mm y 150 mm x 15 mm placas de Petri. El medio plato que contiene Petri pequeña sirve como la placa de cultivo de bacterias primarias, y cuanto mayor placa de Petri sirve como bacterias contando plato.
      Nota: Para el conteo de bacterias placas, placas de forma rectangular se pueden utilizar para reducir elconsumibles cuestan desde el doble de tratamientos se pueden trazar por placa en comparación con las placas tradicionales redondas.
      1. Verter las placas antes del experimento infección. Almacene las planchas medianas KB a 4 ° C para un máximo de 2-3 meses desde sulfato de estreptomicina pierde gradualmente la actividad antibiótica 40.

3. Mejora de Susceptibilidad a Enfermedades (EDS)

  1. Día 1 - bacterias racha en la placa
    1. Dos días antes del ensayo EDS, racha PSM ES4326 de -80 ° C glicerol en una placa de cultivo bacteriano KB-Strep e incubar a 28 ° C durante 24-48 horas.
  2. Día 2 - iniciar las plantas de cultivo y agua líquida
    1. Iniciar el cultivo líquido en un tubo de ensayo estéril con 4 ml de medio KB líquido que contiene 50 mg ml - 1 estreptomicina y agitar a 250 rpm, 28 ° CO / N.
      Nota: Para el ensayo de infección EDS, con 6 plantas por genotipo es recomendared. Para los ensayos de las ITS y el MTI, se recomiendan 6 plantas por genotipo por tratamiento. Para el inóculo de bacterias, se recomienda utilizar un cultivo líquido fresco con densidad óptica a 600 nm λ entre 0,3 y 0,6.
    2. Marque los peciolos de las hojas número 5 y 6 con un marcador resistente al agua-extremo romo para una fácil identificación de tejido infectado en el muestreo (Figura 1). Para mejorar la apertura de los estomas y facilitar la entrada de la solución de agente patógeno en la hoja, regar las plantas bien empapando la plana de la parte inferior durante 20 min, luego drenar el exceso de agua.
      Nota: Como alternativa, cubrir el piso con una cúpula transparente y sumergirlo en agua durante 2/4 hora de aumentar la apertura de los estomas.
    3. Día 3 - dilución de patógenos y la jeringa infiltración
      Nota: la infección de patógenos durante horas de la mañana es óptimo para la proliferación de patógenos y el desarrollo de los síntomas de la enfermedad más pronunciadas en los genotipos susceptibles. Haga todo lo posible para mantener el infection de temporización consistente para eliminar el efecto de los ritmos circadianos y la regulación de genes 41,42 diurna, que ayuda a reducir la variación entre repeticiones experimentales.
      1. Sedimentar las cultivo bacteriano en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml a 9600 xg durante 2 min a TA y descartar el sobrenadante. Resuspender el sedimento bacteriano con 1 ml de estéril 10 mM de MgCl 2.
        Nota: Los cationes de magnesio pueden mejorar la movilidad y la adhesión de P. syringae 43. Alternativamente, utilice MgSO 4 a la misma concentración. Agua estéril es un sustituto aceptable para las soluciones de sal de Mg.
      2. Diluir la suspensión de bacterias con 9 ml de 10 mM de MgCl 2 en un tubo de centrífuga de 50 ml y medir la densidad óptica (OD) de las bacterias con un espectrofotómetro a λ = 600 nm. Diluir las bacterias con 10 mM de MgCl 2 a la OD 600 nm = 0,0002 para el final de ensayo de infección EDS.
      3. Infíltrate en la hojacon un 1 ml extremo romo jeringa sin aguja (comúnmente conocida como la jeringa de insulina) que contiene la solución bacteriana diluida.
      4. No llene la jeringa hasta su máxima capacidad. Llenarlo con 0,5-0,6 ml para permitir un mejor control durante el proceso de infiltración.
      5. Exponer la superficie inferior de la hoja en la parte superior del dedo índice, y luego ajustar con cuidado la posición de la hoja con la ayuda del pulgar. Coloque la jeringa en posición vertical contra la superficie de la hoja para asegurarse de que la presión se distribuye uniformemente. Trate de evitar la zona nervio central durante la infiltración de reducir el daño foliar.
      6. Empuje lentamente el émbolo para infiltrarse en la solución bacteriana; entrada de líquido en el mesófilo de la hoja se visualizará como se indica por el color de la hoja más oscuro. Intento de infiltrarse en toda la superficie de la hoja. Si esto no se logra en un solo intento, elija otro lugar infiltración y repetir las acciones descritas anteriormente hasta que toda la superficie de la hoja está cubierta.
      7. Una vez completado, secar suavemente la hoja con el tejido absorbente para eliminar la solución de patógenos extra. Inspeccione visualmente el tejido de las hojas infectadas por daños.
        Nota: La impresión jeringa circular no debe ser visible después de la infiltración es completa.
      8. Deje las plantas infiltradas secar durante 1-2 horas antes de devolverlos a sus condiciones de crecimiento originales. A continuación, rocíe una cúpula transparente con agua y cubrir las plantas infectadas durante 2 horas, después romper la cúpula para generar un 2-3 en la apertura y dejar actuar durante el resto del experimento infección.
        Nota: Desde P. syringae no es un patógeno en el aire, no hay ningún riesgo de propagación del agente infeccioso a otras plantas cultivadas en la misma instalación. Sin embargo, como precaución adicional, evitar el contacto físico entre las plantas infectadas y otras plantas experimentales en las inmediaciones. Cubrir el piso con una cúpula transparente aumentará la virulencia del patógeno y acelerar la progresión de la enfermedad. losnecesitan para las necesidades de este paso y la duración óptima del período de cobertura que se determinará en base a las condiciones de humedad de las instalaciones crecimiento de la planta del usuario.
    4. Día 5 - Pre-secar las placas de medio
      1. Tome las placas de 150 mm x 15 mm KB fuera de la unidad de almacenamiento en frío y secar cualquier preexistente condensación de agua en el plato. Placas secas por mantenerlos a temperatura ambiente durante aproximadamente 24 horas. Para acelerar este proceso, colóquelos en una campana de flujo laminar con sus tapas agrietadas durante 30-60 min.
        Nota: Este paso es crítico para la formación de la gotita de circular en la superficie de la placa en el paso siguiente.
    5. Día 6 - Cuantificar el crecimiento de patógenos
      Nota: El siguiente procedimiento de cuantificación de patógenos puede realizarse en momentos anteriores después de la infección para confirmar la misma cantidad de bacterias se entregan a la hoja, especialmente cuando las plantas han alterado morfología de las hojas.
      1. Procesar el tejido infectado después de la emergenciade la clorosis indicado por el color amarillento del tejido infectado en los genotipos susceptibles, pero antes del desarrollo de lesiones necróticas (Figura 2B).
        Nota: El tiempo de muestreo sugerida es de tres días después de la inoculación de patógenos. Sin embargo, ya que el crecimiento de patógenos depende de una serie de factores ambientales, la duración de la incubación puede variar dentro de un rango de 2 ½-3 ½ días y necesita ser determinado por observaciones cuidadosas de la progresión de infecciones en las instalaciones crecimiento de la planta del usuario.
        1. Preparar 6 tubos de trituración para cada genotipo (Figura 1). Coloque bola de pulido de un acero inoxidable y añadir 500 l estéril 10 mM de MgCl 2 en el cada tubo.
        2. Separe la hoja infectada de la planta y perforar un disco de hoja con una perforadora de papel de 1 agujero (Figura 1).
          Nota: Para minimizar el error de muestreo, tratar de perforar cada hoja muestreada en la misma posición. El muestreo de la disco de hoja de la parte superiorde la hoja se recomienda.
        3. Colocar aleatoriamente 2 discos de hoja (de dos plantas diferentes) en cada tubo de molienda utilizando fórceps.
        4. Sellar el tubo y homogeneizar el tejido con un homogeneizador de alto rendimiento a la máxima velocidad (1.600 golpes por minuto) durante 10 min. Repita este proceso si es necesario hasta que el tejido está bien homogeneizada y las soluciones se vuelven verdes debido a la liberación de la clorofila de las hojas infectadas.
      2. A la espera de la homogeneización, llenar las primeras 6 filas de una placa de cultivo de 96 pocillos con 180 l 10 mM MgCl2 utilizando una pipeta multicanal y un depósito de pipeteo.
      3. Después de la molienda, transferir 20 l de suspensión de tejido molido en la primera fila de la placa de 96 pocillos y se mezcla por pipeteado repetido el líquido hacia arriba y abajo. Si los pequeños fragmentos de tejido obstruyen la punta, clip de 2.3 mm para ayudar a adquirir el volumen correcto de la solución.
        1. Para proporcionar suficiente espacio para que la gota en la parte superior of la placa, el espacio del tejido a partir de diferentes genotipos en filas alternativas (Figura 1). Para preparar una dilución de diez veces en serie, la transferencia de 20 l de líquido en la segunda fila y repita este procedimiento hasta que la sexta dilución.
      4. Transferencia de 20 l de la solución de la placa de 96 pocillos en la x 15 mm KB placa de 150 mm utilizando puntas de pipeta divididas (Figura 1). El trabajo de la suspensión más diluida a la más concentrada.
        Nota: Partiendo de más diluida a más concentrada hace innecesario cambiar las puntas de pipeta entre las diluciones. Si bien se pre-seca la placa, la gotita transferido debe permanecer intacta en la parte superior del medio hasta que se absorba (generalmente 15-30 min). El tiempo de secado varía con la temperatura ambiente y la humedad.
      5. Seque la placa a temperatura ambiente con la tapa agrietada. Una vez más líquido se puede observar en la superficie de la placa, cerrar la tapa, invertido y se incuba la placa a temperatura ambiente o una incubadora a 28 °.
      6. Incubar las placas para el 40-60 h hasta que las colonias se hacen visibles. Confirmar que el crecimiento en las placas refleja el predecible caída de 10 veces en unidades formadoras de colonias (ufc) (Figura 2C). Cuenta las bacterias antes de que crecen en exceso y las colonias se fusionan. Determinar el número de bacterias en la dilución más baja que no tiene colonias superpuestos. Por lo general, la dilución preferido para ser contado contendrá entre 10-50 colonias.
        Nota: La variación puede estar presente entre repeticiones técnica; por lo tanto, la dilución más baja para cada réplica se debe determinar por separado.
      7. Para calcular los niveles de proliferación bacteriana, documentar el número de la fila (R), así como el número de las bacterias dentro de cada repetición técnica (T) por escrito. Determinar el número de unidades formadoras de colonias - ufc / disco de hoja a través de la fórmula: disco ufc / hoja = (T × 10 R / 20) x 500/2
      8. Escriba los datos en la siguiente plantilla de hoja de cálculo para produce un gráfico (Figura 1) (para el archivo de plantilla de análisis de datos de hojas de cálculo, véase el cuadro 2). Cada punto de datos se representa como la media de seis repeticiones técnica en una escala logarítmica. Las barras de error representan el 95% intervalo de confianza de la media (n = 6).
        Nota: El cálculo de los intervalos de confianza del 95% necesita ser ajustado basado en el número de repeticiones técnica.

4. Inmunidad Accionado-SA (STI)

  1. Día 1: Siga el mismo procedimiento que se describe en el paso 3.1.
  2. Día 2: Además de regar las plantas y la iniciación de cultivo bacteriano líquido (Paso 3.2), inducir resistencia por aplicación externa de SA derivado de salicilato de sodio 21.
    Nota: Pure SA tiene escasa solubilidad en agua y no requiere ajuste de pH antes, por lo tanto no se recomienda para este ensayo.
    1. Para inducir defensas mediadas por SA contra P. syringae y principales de las plantas para la infección por el futuro 21,24, las plantas de pulverización con una fina niebla de 1 mM salicilato de sodio o H 2 O (mock) como de 16-24 h antes de la infección por patógenos.
  3. Día 3: Preparar la dilución de patógenos a 600 nm OD = 0,001 y empujar las bacterias en toda la superficie de la hoja por la infiltración jeringa (Paso 3.3).
  4. Día 6: Para la cuantificación de patógenos y el proceso de conteo, siga el procedimiento que se describe para el ensayo de EDS (Pasos 3.4 y 3.5). Muestras pretratadas por separado - Plate y contar el H 2 O y salicilato de sodio. Por tipo salvaje de Arabidopsis, se espera una reducción de 1.2 log en el crecimiento de patógenos en los salicilato de sodio - plantas tratadas previamente.

5. Inmunidad MAMP-Triggered (MTI)

Nota: En este ensayo, utilizamos tipo salvaje de Arabidopsis Col-0 y mutantes FLS2 y efr plantas. FLS2 y EFR son plasma membrana localizada Patrón receptores de reconocimiento (PRRS) que pueden reconocer flg22 y elf18, respectively 9,10. Pérdida de cada resultados PRR en la insensibilidad al tipo específico de MAMP, que se indica por el crecimiento de patógenos inalterada en el mutante siguiente MAMP pre-tratamiento externo y la infiltración jeringa con PSM ES4326.

  1. Día 1 y 2: Siga el mismo procedimiento que se describe en el paso 3.1 y 3.2.
  2. Día 3: pretratamiento MAMP y la infección por patógenos
    1. Para establecer la inmunidad-Triggered MAMP, preparar 1 M solución de flg22 epítopo flagelina o EF-Tu epítopo elf18 y jeringa infiltrarse en toda la superficie de la hoja 4 h antes de la infección por patógenos (Pasos 3.3.3-3.3.6). Esto permitirá que para la inducción de defensas MAMP mediada contra P. syringae y cebar las plantas para futuras infecciones 6,37.
      Nota: Los datos de microarrays disponibles al público revelaron la reprogramación máxima transcripcional de los genes MAMP responden pasa 4 horas después flg22 o elf18 tratamiento 37,44. Por lo tanto, 4 hr es el recomendadoduración de la pre-tratamiento MAMP que consigue lograr una clara diferencia en el crecimiento de patógenos entre MAMP tratados con Col-0 y FLS2 y EFR mutantes.
    2. Retire la solución adicional MAMP con papel absorbente y dejar las plantas descubiertas para acelerar el proceso de absorción de líquido dentro de la hoja. Para tener en cuenta el efecto de la infiltración hiriendo presión jeringa, infiltrarse en H 2 O en las hojas de las plantas de control.
    3. Preparar la dilución a 600 nm patógeno OD = 0,001 y empujar las bacterias en toda la superficie de la hoja de MAMP / H 2 O pre-tratada de la hoja por la infiltración de jeringa (Paso 3.3).
  3. Día 6: Para la cuantificación de patógenos y el proceso de conteo, siga el procedimiento que se describe en el paso 3.4 y 3.5. Placa y contar el H 2 O y muestras pretratadas-MAMP separado. En tipo salvaje de Arabidopsis, se espera una reducción de 1.2 log en el crecimiento de patógenos en las plantas MAMP pretratados, con un tanto fuertereducción er mediada por flg22 en comparación con elf18.

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Representative Results

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El protocolo que describimos aquí representa un P. optimizado syringae ensayo de infiltración de jeringa para evaluar cuantitativamente la respuesta inmune en plantas de Arabidopsis. Como se ilustra en la Figura 1, la infiltración jeringa de PSM ES4326 es seguido por la extracción y cuantificación de patógenos a través de diluciones seriadas y colonias enumeración.

Como se describe en el Paso 3 en el texto del protocolo, Enhanced Susceptibilidad a Enfermedades (EDS) contra PSM ES4326 puede ser evaluada por la infección con un inóculo con OD = 0,0002. Como se muestra en la Figura 3, los mutantes npr1-1 altamente susceptibles tienen aproximadamente 2,5 log (300 veces) más el crecimiento de patógenos en comparación con la de tipo salvaje Col-0 plantas. Dependiendo de las condiciones experimentales, las plantas npr1-1 pueden soportar hasta 3,0 log crecimiento más bacteriana de Col-0, con la mayoría de los resultados comunes dentro de la gama de 1,5 a 2,5 log. Por lo tanto, este culo EDSay ofrece una amplia ventana de la diferencia, en la que los investigadores pueden ser capaces de colocar sus mutantes de Arabidopsis y transgénicos para identificar genes candidatos potencialmente implicados en la respuesta inmune de las plantas.

Además de determinar EDS, PSM ES4326 ensayo de infiltración de la jeringa se puede modificar para diseccionar las diferentes capas de la respuesta inmune. Para evaluar la inmunidad Se activa-ácido salicílico, la aplicación externa de la química de Sodio salicilato se utiliza para desencadenar la respuesta inmune, que se cuantifica por el crecimiento de patógenos (Figura 4A). La pérdida de NPR1, que funciona como el receptor y SA importante co-regulador transcripcional de los genes diana SA-dependientes, conduce a la insensibilidad a la aplicación exógena de derivado de ácido salicílico. Esta insensibilidad a SA se demuestra por el crecimiento inalterada patógeno en las plantas pretratados salicilato de sodio npr1-1 en contraste con una marcada reducción en plantas Col-0 (20 veces menos Pathog en al sodio aplicación salicilato) (Figura 4B).

Para caracterizar la inmunidad, tratamiento previo MAMP-Se activa con flg22 o elf18 se realizó como se demuestra en la Figura 5A. Para caracterizar la inmunidad flagelina activadas, se utilizan Col-0 y plantas mutantes FLS2. FLS2, un receptor-quinasa como membrana localizada, reconoce flg22 y desencadena MTI 9. Como se demuestra en la Figura 5B, las plantas Col-0 flg22 tratados apoyaron una ~ 1 log (10 veces) de reducción en la población bacteriana, mientras que las plantas mutantes FLS2 fallaron para disparar el efecto restricción del crecimiento bacteriano. Del mismo modo, la pérdida de receptor EF-Tu EFR en las plantas mutantes EFR conduce a la insensibilidad a elf18 pre-tratamiento como lo demuestra el crecimiento de patógenos inalterada después de la elf18 pre-tratamiento (Figura 5B).

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Figura 1. Representación esquemática de PSM ES4326 ensayo de infiltración de la jeringa en plantas de Arabidopsis. Número de hojas 5 y 6 de plantas adultas cultivadas en suelo de Arabidopsis están marcados y se infectaron con PSM ES4326 través de la infiltración jeringa. Después de la aparición de síntomas de la enfermedad, separar las hojas y los discos de hojas de la cosecha para la homogeneización de los tejidos. Bueno tejido homogeneizado-se diluye en serie en placas de 96 pocillos antes de transferir a una bacteria contar plato. Después de colonias aparición en el plato, contar el número de bacterias y procesar los datos para generar un gráfico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
Figura 2. Los procedimientos representativos del ensayo EDS.Ollas (A) se cubren con una cúpula transparente rociado de agua después de la siembra las semillas. (B) síntomas representativos de Col-0 y hojas npr1-1 sometidos al ensayo EDS (600 nm OD = 0,0002) 3 días después de la inoculación. Nota clorosis severa en npr1-1 y la apariencia casi normal de Col-0. (C) diluciones seriadas de PSM ES4326 crecen en KB (50 mg / ml de estreptomicina) placa de los medios de comunicación después de ~ 45 h de incubación. Cinco diluciones son visibles. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. Los resultados representativos del ensayo EDS crecimiento PSM ES4326 (unidades formadoras de colonias -. Ufc / disco hoja, expressed en una escala logarítmica) se cuantificó en Col-0 y npr1-1 plantas 4 semanas de edad de 3 días después de la inoculación (600 nm OD = 0,0002). Las barras de error representan intervalos de confianza del 95% de la media (n = 6). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Procedimiento Representante y los resultados del ensayo de ITS. (A) Representación esquemática de la inmunidad producida por ácido salicílico (ITS) de ensayo. Inmunidad Accionado por ácido (B) salicílico se cuantificó basado en el crecimiento de patógenos en las plantas de pre-tratadas con 1 mM salicilato de sodio o H 2 O 16 h antes de PSM ES4326 infiltración jeringa (OD 600 nm = 0,001). El crecimiento de patógenos se cuantificó 3días después de la inoculación. Las barras de error representan intervalos de confianza del 95% de la media (n = 6). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5. Procedimiento representativo y los resultados del ensayo de MTI. (A) Representación esquemática de la inmunidad-Triggered MAMP (MTI) de ensayo. (B) MTI se cuantificó por el crecimiento de patógenos en las plantas de pre-tratados con una solución de 1μM de flg22, elf18 o H 2 O (como control) 4 h antes de la Psm ES4326 infiltración jeringa (OD 600 nm = 0,001). El crecimiento de patógenos se cuantificó 3 días después de la inoculación. Las barras de error representan intervalos de confianza del 95% de la media (n = 6). Por favor, haga clic en élvolver para ver una versión más grande de esta figura.

Asunto Causas posibles Acciones recomendadas
No hay crecimiento de bacterias en el medio líquido después de la cultura O / N Reducción de la actividad bacterias Iniciar cultivo líquido de un plato recién rayada
Impresión jeringa Circular presenta en la hoja después de la infiltración de la jeringa El exceso de presión durante la infiltración Reducir el pressue durante la infiltración
Impresión jeringa parcial presenta en la hoja después de la infiltración de la jeringa Posicionamiento inadecuado de la jeringa Ajustar la jeringa para ser posicionado contra la superficie vertical de la hoja de
Marchita hoja wthtin pocas horas después de la infiltración Demasiado solución mucho patógeno se infiltra en la hoja Detener infiltrating inmediatamente después de toda la superficie de la hoja se vuelve más oscuro de color verde
No hay síntomas de la enfermedad de tres días después de la infección La humedad es demasiado baja para patógeno para proliferar Aumente la humedad donde se mantienen las plantas infectadas
Patógeno entra en fase necrotrófico en o antes de 3 dpi Concentración incorrecta de la solución de patógenos 600 nm Uso OD = 0,0002 para el ensayo EDS; confirmar la dilución utilizando espectrofotómetro indepediente
Las gotas se unen en la parte superior de las bacterias contando placa Las bacterias contando placa no se seca adecuadamente Pre-seca la placa de O / N antes de su uso
Dilución de patógenos no representa reducción de 10 veces La dilución se realiza con precisión no Utilice una pipeta multicanal bien calibrado para la transferencia de líquido; confirmar que todo el líquido se dispensa
El crecimiento de patógenos en el tipo silvestre supera 8 log ufc / disco de hoja Overgrew de patógenos en el tejido infectado - muestreo realizado demasiado tarde Muestra de tejido infectado después de la aparición de clorosis
Gran variación entre repeticiones técnica Las plantas no están en la misma etapa de desarrollo o el número de hojas infiltrado es inconsistente Utilice únicamente las plantas dentro de la misma etapa de desarrollo de la infección. Confirme la germinación síncrona. Infectar número de hojas consistente entre diferentes plantas

Tabla 1. Solución de problemas del ensayo de infiltración jeringa.

Haga clic aquí para ver la Tabla 2.

Tabla 2. Hoja de cálculo para el análisis estadístico de los datos de crecimiento de patógenos.

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Discussion

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Con la disminución de las tierras agrícolas disponibles y el aumento de la población, los investigadores de todo el mundo tienen el reto con las necesidades apremiantes para el mejoramiento de cultivos. El rendimiento puede ser muy influenciada por diversos estreses bióticos y abióticos. Entre ellos, la infección por patógenos es una de las principales causas de la reducción del rendimiento de los cultivos, responsable de aproximadamente 12% las pérdidas sólo en los EE.UU. 45. Para resolver este problema, la investigación masiva ha llevado a cabo en el modelo Arabidopsis - P. syringae patosistema caracterizar exhaustivamente los componentes y mecanismos de regulación de la respuesta inmune de las plantas. A continuación, presentamos una P. optimizado syringae ES4326 ensayo de infiltración de la jeringa para evaluar cuantitativamente las diferencias sutiles en la respuesta inmune de plantas en todo el nivel de la planta.

Aunque se han desarrollado ensayos de infección múltiple patógenos para caracterizar la respuesta inmune planta de 29,35, la infiltración jeringa ofreceun sistema bien controlado donde se administran cantidades iguales de patógeno en el tejido infectado. En otros ensayos de infección, incluyendo la inoculación de inmersión y pulverización de la inoculación, el patógeno se aplica a todo el tejido aéreo, incluyendo los cotiledones, así como hojas verdaderas 34. Se ha informado de que los cotiledones de Landsberg erecta ecotipo (I er) son mucho más susceptibles al patógeno durante el ensayo de la inoculación por inmersión, lo que puede sesgar los datos y llevar a conclusiones erróneas sobre la resistencia general de la enfermedad 34. Además, los dos ensayos mencionados anteriormente requieren patógeno para entrar en la hoja través de los estomas, que está controlado por diversos factores ambientales, incluyendo la humedad y la luz. Fluctuación de estos factores contribuye a un mayor nivel de variación en los síntomas de la enfermedad en comparación con el ensayo de infiltración de jeringa 35. Para infiltración al vacío, las principales desventajas incluyen la necesidad de grandes volúmenes de solución de agente patógeno, dificultadpara infiltrarse con eficacia todas las hojas, mientras que evitar daños, y una considerable intensidad de trabajo 29. Por otra parte, las plantas infectadas con rociado, inmersión o la inoculación de vacío son menos propensos a recuperarse ya que toda la plántula está infectado con patógeno. Dadas las numerosas limitaciones de otros métodos, el ensayo de infiltración jeringa sigue siendo el método de elección para lograr progresión de la enfermedad altamente uniforme y predecible y la cuantificación exacta del patógeno para caracterizar la respuesta inmune de forma fiable dentro de la hoja verdadera. Además, este ensayo se puede modificar fácilmente para caracterizar Inmunidad-Triggered MAMP y resistencia sistémica adquirida. Además de eso, prometiendo futuras aplicaciones de la técnica podría aplicarse para los efectos de prueba de múltiples fitohormonas, productos químicos o inhibidores de la pre-tratamientos seguidos por patógeno jeringa infiltración para diseccionar las diferentes capas de red de señalización inmune planta o identificar funciones de una vía específica en la planta inmune respuesta. Wi Infecciónth una dosis aumentada de la (600 nm OD = 0,001) patógeno en ausencia de cualquier defensa de cebado pre-tratamientos, conocidos como la prueba mejorada de resistencia a las enfermedades (EDR), es otra modificación útil de este método que puede ser utilizado para identificar mutantes o transgénicos con resistencia a enfermedades mejorada.

Cabe señalar que la infiltración de ensayo de la jeringa no se aplica a la caracterización de la etapa de pre-invasiva de la respuesta de defensa ya que el patógeno se administra directamente en el tejido de la hoja a través de los estomas. Cierre de los estomas, que sirve como barrera física para la entrada de patógenos, a menudo se desencadena para restringir la entrada de patógenos en el establecimiento de MAMP-Accionados Inmunidad 46. Además, fitohormona ácido abscísico contribuye a cierre de los estomas durante la etapa de pre-invasiva 47. Por lo tanto, los métodos de pulverización o inmersión puede resultar ventajoso para caracterizar la capa de los estomas de la respuesta inmune, a pesar de advertencias asociadoscon esos tipos de inoculaciones, se discutió anteriormente 29.

Desde las interacciones planta-patógeno puede ser alterado por diversos factores bióticos y abióticos, es fundamental centrarse en los pasos críticos presentan a continuación, el protocolo para lograr la infección éxito y obtener resultados confiables:

Actividad de estado de la planta y las bacterias

Plantas de Arabidopsis se puede enfatizar fácilmente por diversos factores abióticos, incluyendo la temperatura sub-óptimo, la sequía y estrés osmótico, y desencadenan respuestas celulares que interfieren con la salida 48 inmunológico. Por lo tanto, es crucial para cultivar plantas en condiciones de crecimiento óptimas y protegerlos de los factores de estrés ambiental. Además, dado que la etapa de desarrollo de la hoja infectada también puede alterar el resultado experimental, es necesario para infectar consistentemente número de hojas 5 y 6 para evitar artefactos. Progresando a lo largo de las etapas de desarrollo, elevado reresistencia contra algunos patógenos virulentos y no virulentos se correlaciona con la transición de la etapa vegetativa a la etapa reproductiva de las plantas de Arabidopsis. Esta resistencia dinámica durante la etapa de desarrollo se denomina Relacionada con la Edad Resistencia (ARR) 38. Para evitar la interferencia ARR con la verdadera respuesta inmune, es fundamental para llevar a cabo la infección en la etapa de desarrollo correcta como se indica en el protocolo y se abstengan de intentar experimentos de infección después del inicio de la etapa reproductiva. Por otra parte, la aptitud y la actividad bacteriana afectan sustancialmente el crecimiento de patógenos en el tejido infectado. Por lo tanto, es importante para iniciar el cultivo líquido de bacterias a partir de una placa de cultivo recién rayada que es no más de 2 días de edad.

Habilidad de infiltración Jeringa

Durante la infiltración de la jeringa, trate de evitar cualquier daño físico a la hoja ya efecto hiriendo es bien conocido por interferir con larespuesta inmune de la planta, principalmente a través de la señalización mediada por el ácido jasmónico que puede suprimir la defensa desencadenada-SA vías 49. Después de la infección, una hoja que fue infiltrado debe recuperarse por completo a la apariencia física normal sin ningún daño visual. Para los principiantes, se recomienda practicar esta técnica el uso de plantas no experimentales primero antes de realizar el ensayo de infiltración jeringa PSM ES4326.

La extracción de patógenos y dilución

Para medir con precisión el crecimiento de patógenos, es vital para extraer eficientemente patógeno del tejido vegetal infectado. En comparación con otros métodos de extracción, la homogeneización del tejido mecánica a través de homogeneizadores de alto rendimiento extrae eficazmente patógeno sin la pérdida de muestra de tejido y la contaminación cruzada. Posteriormente, las diluciones de muestras deben llevarse a cabo con precisión con una pipeta multicanal calibrada de forma fiable para reducir el error de pipeteado.Desviación tan poco como ± 1 l en el proceso de dilución se traduciría en una diferencia ~ 5% en la cuantificación crecimiento de patógenos. Para más ejemplos de solución de problemas del ensayo de infiltración de la jeringa, por favor consulte la Tabla 1.

En conclusión, se describe el ensayo de infiltración optimizado la jeringa PSM ES4326 en Arabidopsis para evaluar cuantitativa y fiable la respuesta inmune de las plantas. Con la ayuda de este patosistema, la comprensión de la interacción planta-patógeno se acelerará en el laboratorio y, finalmente, se aplicará para la protección de cultivos en el campo.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MetroMix 360  Grosouth SNGMM360
Large pots Grosouth TEKUVCC10TC
12 x 6 Inserts Grosouth LM1206
11x 21 Flats with no holes Grosouth LM1020
11x 21 Flats with holes Grosouth LM1020H
Vinyl propagation domes Grosouth CW-221
Proteose Peptone Fisher Scientific DF0122-17-4
Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate  MP Biomedicals 151946
Agar  Fisher Scientific A360-500
Streptomycin sulfate Bio Basic Inc SB0494
100 x 15 mm Petri dishes Fisher Scientific FB0875713
150 x 15 mm Petri dishes Fisher Scientific R80150
Rectangular plate Fisher Scientific 12-565-450 
MgCl2 Hexahydrate Bio Basic Inc MB0328
Glycerol Bio Basic Inc GB0232
MgSO Bio Basic Inc MN1988
1 ml syringe Fisher Scientific NC9992493 
Kimwipe Fisher Scientific 06-666-A
Grinding tubes  Denville Scientific B1257
Caps for grinding tubes Denville Scientific B1254
Stainless steel grinding ball Fisher Scientific 2150
96-well plate  Fisher Scientific 12-556-008
Sodium Salicylate Sigma Aldrich s3007-1kg
flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA) Genescript Made to order
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) Genescript Made to order
Hole puncher Staples 146308
Biophotometer plus Eppendorf 952000006
PowerGen High-Throughput Homogenizer Fisher Scientific 02-215-503
Accu spin micro centrifuge Fisher Scientific 13-100-675
Multichannel pipette (10-100 µl) Eppendorf 3122 000.043
Multichannel pipette (30-300 µl) Eppendorf 3122 000.060
Pipette (20µl) Eppendorf 3120 000.038
Pipette tips Fisher Scientific 3552-HR
Sharpie permanent marker Staples 507130
1.5 ml tube Eppendorf 22363204
Forceps Fisher Scientific 08-890

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Ensayo de infiltración bacteriana de la hoja por Fine Caracterización de las respuestas de defensa de la planta utilizando el<em&gt; Thaliana-Pseudomonas syringae Arabidopsis</em&gt; Patosistema
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Liu, X., Sun, Y., Kørner, C. J., Du, X., Vollmer, M. E., Pajerowska-Mukhtar, K. M. Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem. J. Vis. Exp. (104), e53364, doi:10.3791/53364 (2015).More

Liu, X., Sun, Y., Kørner, C. J., Du, X., Vollmer, M. E., Pajerowska-Mukhtar, K. M. Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem. J. Vis. Exp. (104), e53364, doi:10.3791/53364 (2015).

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