का उपयोग संयंत्र रक्षा प्रतिक्रियाएँ ललित विशेषता के लिए बैक्टीरियल लीफ घुसपैठ परख<em> Arabidopsis thaliana-स्यूडोमोनास syringae</em> Pathosystem
Summary
Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.
Abstract
विशेष मोबाइल प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अभाव में, पौधों उनके स्थानीयकृत क्रमादेशित कोशिका मृत्यु और प्रणालीगत अधिग्रहण प्रतिरोध रोगज़नक़ हमले के खिलाफ खुद का बचाव करने के लिए उपयोग। समग्र संयंत्र प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए एक विशिष्ट एराबिडोप्सिस जीन का योगदान विशेष रूप से और मात्रात्मक संक्रमित ऊतक के भीतर रोगज़नक़ विकास परख करने की क्रिया द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। तीन दशक से अधिक के लिए, hemibiotrophic जीवाणु स्यूडोमोनास syringae पीवी। Maculicola ES4326 (पी एस एम ES4326) व्यापक रूप से एराबिडोप्सिस प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया अंतर्निहित आणविक तंत्र की जांच करने के लिए मॉडल रोगज़नक़ के रूप में लागू किया गया है। पत्ती के ऊतकों में रोगजनकों देने के लिए, कई टीका तरीकों स्थापित किया गया है, जैसे, सिरिंज घुसपैठ, डुबकी टीका, स्प्रे, निर्वात घुसपैठ, और बाढ़ टीका। निम्नलिखित प्रोटोकॉल वयस्क की पत्तियों में ज़हरीले Psm ES4326 वितरित करने के लिए एक अनुकूलित सिरिंज घुसपैठ विधि का वर्णनArabidopsis पौधों मिट्टी देसी और सही ढंग से इस रोगज़नक़ की ओर बढ़ाया रोग संवेदनशीलता (ईडीएस) के लिए स्क्रीन। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल आगे चिरायता एसिड (एसए) -Triggered प्रतिरक्षण (एसटीआई) और MAMP-उत्प्रेरित प्रतिरक्षण (एमटीआई) सहित संयंत्र रक्षा की विभिन्न परतों के भीतर विशिष्ट प्रतिरक्षा दोष काटना करने के लिए कई पूर्व उपचार के साथ पूरक हो सकता है।
Introduction
कारण उनके बिना डंठल प्रकृति के कारण, पौधों लगातार विभिन्न जीवन शैली और पोषण संबंधी रणनीतियों 1 का प्रदर्शन करते रोगाणुओं की अधिकता के द्वारा धमकी दी हैं। Necrotrophic रोगजनकों सक्रिय रूप से गुप्त विषाक्त पदार्थों और एंजाइमों मेजबान ऊतक को मारने और मृत कोशिकाओं को 1 पर खिलाने के लिए, जबकि एक पहली सन्निकटन करने के लिए, biotrophic रोगजनकों, पोषक तत्वों को पुनः प्राप्त करने के लिए जीवित अपने मेजबान बनाए रखें। रोगजनकों, करार दिया hemibiotrophs का एक अन्य समूह, रोगज़नक़ संचय 2 की एक निश्चित सीमा पर पहुंचने पर necrotrophic चरण के लिए biotrophic मंच और बदलाव के साथ अपने संक्रमण पाठ्यक्रम शुरू होता है। प्रभावी ढंग से इन सूक्ष्मजीवों के खिलाफ खुद का बचाव करने के लिए, पौधों रोगज़नक़ हमले का पता लगाने और गति प्रदान करने के लिए कई निगरानी तंत्र से लैस एक जटिल सहज प्रतिरक्षा प्रणाली विकसित किया है कोशिका मृत्यु 3 के रूप में अच्छी तरह के रूप में प्रणालीगत अधिग्रहण प्रतिरोध (एसएआर) 4 क्रमादेशित स्थानीय। वर्तमान शोध आवश्यक हस्ताक्षर निस्र्पक पर ध्यान केंद्रित कर रहा हैnaling घटकों और संयंत्र प्रतिरक्षा प्रणाली 5 भीतर पार वार्ता।
"Zig-Zag" मॉडल 5 में प्रस्तावित रूप में, संयंत्र सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की पहली परत एक सूक्ष्म जीव के आक्रमण का पता लगाने के लिए प्लाज्मा झिल्ली स्थानीय पैटर्न पहचान रिसेप्टर्स (PRRS) की उपस्थिति की आवश्यकता है। PRRS सूक्ष्म जीव-एसोसिएटेड आणविक पैटर्न (MAMPs) को समझते हैं और MAMP-उत्प्रेरित प्रतिरक्षण (एमटीआई) 6 स्थापित करने में सक्षम हैं। रोगाणुरोधी पीआर प्रोटीन 7 एन्कोडिंग जीन की एक ट्रांसक्रिप्शनल अपरेगुलेशन उत्प्रेरण इसके अलावा, एमटीआई सेल दीवार के लिए प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन (आरओएस) और प्रतिक्रियाशील नाइट्रोजन प्रजाति (RNS), callose के बयान सहित रोगज़नक़ विकास को गिरफ्तार कि घटनाओं की एक किस्म के लिए सुराग साथ ही कई काइनेज सिगनल की सक्रियता के 8 रास्ते के रूप में।
अब तक, कई MAMPs बैक्टीरियल flg22 9 सहित एराबिडोप्सिस में एमटीआई को गति प्रदान करने के लिए पहचान की गई है </sup> (Flagellin से ली गई एक 22 एमिनो एसिड टुकड़ा), और एक संरचनात्मक कोशिका दीवार घटक elf18 10 (बैक्टीरियल अनुवाद बढ़ाव कारक मं से 18 एमिनो एसिड) 11 peptidoglycans। एक सफल संक्रमण की स्थापना करने के लिए, कुछ विशेष रोगजनकों इंट्रासेल्युलर या कहनेवाला रिक्त स्थान में गुप्त डाह प्रेरक प्रोटीन करने की क्षमता विकसित किया है, और फलस्वरूप एमटीआई को दबाने और प्रेरक-उत्प्रेरित संवेदनशीलता (टिकट) 12,13 को गति प्रदान की है। उदाहरण के लिए, डाह प्रभावोत्पादक संक्रमित ऊतक 14-16 भीतर रोग के विकास के लिए प्रेरित करने एमटीआई के माइटोजन सक्रिय प्रोटीन kinase (MAPK) फास्फोरिलीकरण झरने को निष्क्रिय कर सकते हैं। मेजबान और रोगजनकों के बीच गतिशील सह-विकास के दौरान, पौधों को भी प्रेरक प्रोटीन को समझते हैं और रोगज़नक़ डाह 17 अणुओं attenuate को पलटवार की रणनीति विकसित की है। यह प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से प्रेरक मान्यता रोग प्रतिरोध (आर) प्रोटीन 18 द्वारा मध्यस्थता है। टी के सबसेहेम नायब LRR के सदस्यों (Nucleotide बंधन और Leucine-रिच दोहराता) परिवार 19 हैं। एक अनुसंधान प्रोटीन से एक असंक्रामक प्रेरक की धारणा प्रेरक-उत्प्रेरित प्रतिरक्षण (ETI) 20 के रूप में होती है एक मजबूत और व्यापक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया elicits। रक्षा जीन 21 की अभिव्यक्ति और रक्षा चयापचयों 22 के उत्पादन उत्प्रेरण इसके अलावा, ETI अक्सर आसन्न ऊतक 3 में फैलने से रोगज़नक़ प्रतिबंधित करने के लिए अतिसंवेदनशील रिस्पांस (मानव संसाधन) के रूप में जाना जाता है एक तेजी से स्थानीकृत क्रमादेशित कोशिका मृत्यु हो जाती है।
प्रोग्राम किया स्थानीयकृत कोशिका मृत्यु 23 के अलावा, पौधों (एसएआर) 4 प्रणालीगत अधिग्रहण प्रतिरोध करार दिया एक दीर्घकालिक और प्रणाली में व्यापक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की शुरुआत करने में सक्षम हैं। एक biotrophic रोगज़नक़ के साथ चुनौती पर, संयंत्र कोशिकाओं स्थानीय और प्रणालीगत ऊतकों 24 दोनों में एक अंतर्जात phytohormone चिरायता एसिड (एसए) और पीआर प्रोटीन का जैवसंश्लेषण और संचय ट्रिगर। टी के माध्यम सेउसकी प्रक्रिया, तैयारियों का बढ़ राज्य रोगजनकों 24 की एक व्यापक स्पेक्ट्रम से बाद में एक संक्रमण के दौरान तेजी से रक्षा की प्रतिक्रियाएं बढ़ते के लिए अनुमति देता है कि असंक्रमित पत्तियों में हासिल की है। एसए और उसकी ऐसी benzo- के रूप में सिंथेटिक एनालॉगों (1,2,3) -thiadiazole-7-carbothioic एसिड एस -methyl एस्टर (BTH) और 2,6-dichloroisonicotinic एसिड (आईएनए) रासायनिक चिरायता एसिड उत्प्रेरण के लिए सक्षम हैं (एसए) बाहरी आवेदन 24 पर -Triggered प्रतिरक्षण (एसटीआई)। रोगजनन से संबंधित जीन 1 (NPR1) की Nonexpressor स्थानीय और प्रणालीगत ऊतकों 21,25,26 दोनों में एसए की मध्यस्थता रक्षा प्रतिक्रिया के दौरान एक प्रमुख ट्रांसक्रिप्शनल नियामक के रूप में एसए रिसेप्टर्स और कार्यों में से एक हो जाने का प्रस्ताव है। यह निर्णायक NPR1 एसएआर स्थापना के लिए आवश्यक है और NPR1 के नुकसान स्यूडोमोनास syringae 25 की दिशा में नाटकीय संवेदनशीलता की ओर जाता है कि प्रदर्शन किया गया है।
बड़े पैमाने पर पौधे की आणविक योगदान को चिह्नित करने के लिएसंयंत्र रोगज़नक़ बातचीत में घटकों, कई bioassays, आरओएस 27 फट सहित विशिष्ट रक्षा घटनाओं को मापने के लिए उनके प्रोटीन उत्पादों की 21 callose बयान 28, रक्षा जीनों की अभिव्यक्ति और संचय विकसित किया गया है। इन व्यक्तिगत assays संयंत्र प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का एक विशिष्ट रूप में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं, उनमें से कोई भी, हालांकि, पूरे संयंत्र के स्तर पर पूरी रक्षा की प्रतिक्रिया का प्रतिनिधित्व करने में सक्षम हैं। इसके विपरीत, संक्रमण के बाद रोगज़नक़ वृद्धि की मात्रा का ठहराव जीवधारी स्तर पर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए एक समग्र आकलन प्रदान करता है। इसलिए, एक सटीक और अत्यधिक मानकीकृत रोगज़नक़ टीका परख के विकास और अनुकूलन एराबिडोप्सिस प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया पर अनुसंधान और खोजों के लिए ईंधन के लिए महत्वपूर्ण है।
स्यूडोमोनास syringae, एक ग्राम नकारात्मक जीवाणु, Arabidops सहित संयंत्र सेनाओं के एक रेंज में रोग पैदा करने में सक्षम एक phytopathogen के रूप में पहचान की गई थी29 है। पी – मॉडल संयंत्र रोगज़नक़ प्रणाली, एराबिडोप्सिस के रूप में syringae बातचीत व्यापक रूप से आणविक तंत्र अंतर्निहित संयंत्र रक्षा प्रतिक्रियाएं 29 को समझने के लिए लागू किया गया है। अब तक, 50 से अधिक पी syringae pathovars विभिन्न प्रजातियों के पौधे 30 को संक्रमित करने के लिए अपनी क्षमता के आधार पर पहचान की गई है पी। syringae पीवी। टमाटर DC3000 (पीएसटी DC3000) 31 और पी syringae पीवी। maculicola ES4326 (पी एस एम ES4326) 32 दो सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया है और बड़े पैमाने पर की विशेषता विषमय उपभेदों हैं। एक तरफ संयंत्र द्वारा मान्यता प्राप्त है और एमटीआई प्रतिक्रिया ट्रिगर किया जा रहा से, पीएसटी DC3000 और Psm ES4326 एमटीआई को दबाने और रोगज़नक़ विकास 31,33 के पक्ष में करने के लिए टिकट को गति प्रदान करने के लिए उग्र प्रेरक प्रोटीन स्रावित करने में सक्षम हैं।
कार्यात्मक एराबिडोप्सिस और पी के बीच बातचीत के टुकड़े करना syringae, कई0; रोगज़नक़ संक्रमण तरीकों रोगज़नक़ वितरण दृष्टिकोण के आधार पर विकसित किया गया है। मिट्टी-बड़े पौधों के लिए, रोगज़नक़ सिरिंज घुसपैठ, वैक्यूम घुसपैठ, डुबकी टीका और स्प्रे टीका 29,34 से दिया जा सकता है। हाल ही में, अंकुर बाढ़ टीका परख टिशू कल्चर पर बड़े पैमाने पर स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए विकसित किया गया था युवा Arabidopsis पौधों 35 प्लेटें देसी। सिरिंज घुसपैठ, सबसे अधिक इस्तेमाल किया दृष्टिकोण में से एक के रूप में, मैन्युअल रंध्र 29 करार दिया प्राकृतिक पत्ती के उद्घाटन के माध्यम apoplast में रोगज़नक़ बचाता है। पी के इस दृष्टिकोण के माध्यम से, बराबर मात्रा में syringae संक्रमित पत्ती में घुसपैठ की जा सकती है और संयंत्र के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की ताकत व्युत्क्रमानुपाती रोगज़नक़ विकास के स्तर को जोड़ा जाता है। इसलिए, रोगज़नक़ वृद्धि की मात्रा का ठहराव पूरे संयंत्र स्तर पर प्रतिरक्षा समारोह का मूल्यांकन करने के लिए एक इष्टतम दृष्टिकोण के रूप में कार्य करता है। इसके अलावा, सिरिंज घुसपैठ स्थानीय और प्रणालीगत ऊतक भेद कर सकते हैं, जो कर सकते हैं खएसएआर 36 अंतर्निहित आणविक तंत्र निस्र्पक में लागू ई।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल में, हम बढ़ाया रोग संवेदनशीलता (ईडीएस) के लिए एराबिडोप्सिस म्यूटेंट स्क्रीन करने के लिए Psm ES4326 के साथ एक अनुकूलित सिरिंज घुसपैठ परख का वर्णन है। इस प्रोटोकॉल दो एराबिडोप्सिस जीनोटाइप को रोजगार देगा: एक जंगली प्रकार ecotype कोलंबिया -0 (कर्नल-0) पौधों (नियंत्रण) और npr1-1 नुकसान के समारोह म्यूटेंट (Hypersusceptible) कि विषमय बैक्टीरियल तनाव Psm ES4326 37 से संक्रमित हो जाएगा। npr1-1 उत्परिवर्ती टाइरोसीन करने के लिए अत्यधिक संरक्षित हिस्टिडीन बदल और 25 गैर कार्यात्मक प्रोटीन जो renders NPR1 अणु, की ankyrin दोहराने आम सहमति अनुक्रम के भीतर एक बिंदु उत्परिवर्तन किया जाता है। इसके अलावा, सिरिंज घुसपैठ परख के संशोधनों के एक नंबर एमटीआई और एसटीआई सहित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के विशिष्ट परतों में दोष की मात्रा का ठहराव की अनुमति है कि वर्णित हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
जनसंख्या उपलब्ध खेत में कमी के साथ बढ़ रही है, दुनिया भर के शोधकर्ताओं फसल सुधार के लिए अहम जरूरतों के साथ चुनौती दी है। उपज बहुत विभिन्न जैविक और अजैविक दबावों से प्रभावित किया जा सकता है। उनमें से, रोग…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Shahid Mukhtar for critiquing the manuscript and Dr. Xinnian Dong for the sample data analysis file. This work is supported by a NSF-CAREER award (IOS-1350244) to KPM and the UAB Biology Department.
Materials
| MetroMix 360 | Grosouth | SNGMM360 | |
| Large pots | Grosouth | TEKUVCC10TC | |
| 12×6 Inserts | Grosouth | LM1206 | |
| 11×21 Flats with no holes | Grosouth | LM1020 | |
| 11×21 Flats with holes | Grosouth | LM1020H | |
| Vinyl propagation domes | Grosouth | CW-221 | |
| Proteose Peptone | Fisher Scientific | DF0122-17-4 | |
| Potassium Phosphate Dibasic Trihydrate | MP Biomedicals | 151946 | |
| Agar | Fisher Scientific | A360-500 | |
| Streptomycin sulfate | Bio Basic Inc | SB0494 | |
| 100x15mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| 150x15mm Petri dishes | Fisher Scientific | R80150 | |
| Rectangular plate | Fisher Scientific | 12-565-450 | |
| MgCl2 Hexahydrate | Bio Basic Inc | MB0328 | |
| Glycerol | Bio Basic Inc | GB0232 | |
| MgSO4 | Bio Basic Inc | MN1988 | |
| 1 mL syringe | Fisher Scientific | NC9992493 | |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-A | |
| Grinding tubes | Denville Scientific | B1257 | |
| Caps for grinding tubes | Denville Scientific | B1254 | |
| Stainless steel grinding ball | Fisher Scientific | 2150 | |
| 96-well plate | Fisher Scientific | 12-556-008 | |
| Sodium Salicylate | Sigma Aldrich | s3007-1kg | |
| flg22 (QRLSTGSRINSAKDDAAGLQIA) | Genescript | Made to order | |
| elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) | Genescript | Made to order | |
| Hole puncher | Staples | 146308 | |
| Biophotometer plus | Eppendorf | 952000006 | |
| PowerGen High-Throughput Homogenizer | Fisher Scientific | 02-215-503 | |
| Accu spin micro centrifuge | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| Multichannel pipette (10-100 µl) | Eppendorf | 3122 000.043 | |
| Multichannel pipette (30-300µl) | Eppendorf | 3122 000.060 | |
| Pipette (20µl) | Eppendorf | 3120 000.038 | |
| Pipette tips | Fisher Scientific | 3552-HR | |
| Sharpie permanent marker | Staples | 507130 | |
| 1.5 mL tube | Eppendorf | 22363204 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 08-890 |
References
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