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Bioengineering

एक छोटी बूंद विलय प्रतिदीप्ति वसूली के बाद एक फॉस्फोलिपिड monolayer के दो आयामी प्रसार करने के लिए उपाय

Published: October 15, 2015 doi: 10.3791/53376
Automatic Translation
1, 2, 1, 2
1Department of Bio and Brain Engineering, KAIST, 2Information and Electrical Research Institute, KAIST

Introduction

Phospholipids प्रमुख कोशिका झिल्लियों के घटकों और अंगों की झिल्ली हैं, और इन परतों झिल्ली तरलता अक्सर झिल्ली प्रोटीन 1 की गतिविधि बदलकर सेलुलर कार्यों को प्रभावित करता है - 3। उदाहरण के लिए, झिल्ली के लिए   लिपिड समस्थिति झिल्ली प्रोटीन से पता चला है जो झिल्ली तरलता, विनियमन द्वारा हासिल की है, और तरलता का एक असामान्य स्तर ऐसी यकृत स्टीटोसिस और पित्तस्थिरता 4 के रूप में गंभीर बीमारियों का कारण बनता है। इसके अलावा, एयर वायुकोष्ठिका द्रव इंटरफेस में एक फॉस्फोलिपिड monolayer की तरलता अपने कार्यों में महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। एक कम तरलता साँस छोड़ना 5,6 दौरान वायुकोष्ठिका के भीतर रहने की परत में सक्षम बनाता है, जबकि फेफड़े के पृष्ठसक्रियकारक फॉस्फोलिपिड monolayer के उच्च तरलता, साँस लेना दौरान परत के प्रसार की सुविधा। यह उनकी भूमिकाओं को समझने के लिए फॉस्फोलिपिड परतों की तरलता अनुमान लगाने के लिए इस प्रकार महत्वपूर्ण है।

_content "> तरलता का एक सीधा उपाय चिपचिपापन है, और फॉस्फोलिपिड परतों की चिपचिपाहट माइक्रोन आकार कोलाइड 7, चुंबकीय सुई 8,9, और चुंबकीय सूक्ष्म बटन 6,10,11 का उपयोग करके मापा गया है। हालांकि, इन तकनीकों अपेक्षाकृत कठोर फिल्मों तक ही सीमित हैं, और कम चिपचिपा फिल्मों उपाय नहीं कर सकते। इस तरह के मामलों के लिए, diffusivity फॉस्फोलिपिड परतों की तरलता यों के लिए एक विकल्प होगा। कई दशकों के लिए, फॉस्फोलिपिड परतों के प्रसार गुण को मापने के लिए तकनीक की एक किस्म विकसित किया गया है ऐसे प्रतिदीप्ति शमन विधि 12, स्पंदित क्षेत्र ढाल एनएमआर 13, और प्रतिदीप्ति सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी (एफसीएस) सबसे अधिक प्रतिनिधि तरीकों में से 14। वन के रूप में (FRAP) 15,16 photobleaching के बाद प्रतिदीप्ति वसूली है। माप प्रक्रिया और संबंधित की सादगी के कारण फॉस्फोलिपिड परतों के प्रसार गुण पर सिद्धांतों, कई अध्ययनों FRAP का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया है 17-19। हालांकि, FRAP आमतौर पर एक उच्च शक्ति लेजर के साथ एक महंगी confocal खुर्दबीन सेटअप की आवश्यकता है।

यहाँ, हम (ज्ञानकोष) के विलय के बाद प्रतिदीप्ति वसूली के रूप में कहा फॉस्फोलिपिड monolayers के पार्श्व प्रसार को मापने के लिए एक नई तकनीक मौजूद है। FRAP और ज्ञानकोष के बीच मुख्य अंतर photobleaching कदम बूंद संघीकरण द्वारा बदल दिया जाता है। एक fluorescently लेबल फ्लैट monolayer पर गैर प्रतिदीप्ति monolayer द्वारा कवर एक छोटी बूंद विलय इस प्रकार photobleaching के कदम के साथ ही प्रारंभिक अवस्था की स्थापना, एक उज्ज्वल फ्लैट monolayer पर एक परिपत्र अंधेरे दाग छोड़ देता है। हम तो पार्श्व diffusivity को मापने के लिए समय के साथ गहरे दाग में प्रतिदीप्ति वसूली निरीक्षण करते हैं। बूंद संघीकरण द्वारा इस नए "विरंजन" कदम FRAP अधिक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है: ज्ञानकोष केवल एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी बजाय FRAP के लिए आवश्यक है कि एक उच्च शक्ति लेजर के साथ एक महंगी confocal खुर्दबीन की आवश्यकता है। मैंयह photobleaching प्रक्रिया शामिल नहीं करता है के बाद से n इसके अलावा, ज्ञानकोष प्रतिदीप्ति रंगों की एक विस्तृत चयन किया है। अंत में, दो अलग अलग monolayers, एक छोटी बूंद monolayer और एक फ्लैट monolayer, इस प्रकार FRAP केवल monolayers के आत्म-प्रसार के उपाय, जबकि interdiffusion, मापा जा करने की इजाजत दी, स्वतंत्र रूप से तैयार किया जा सकता।

ज्ञानकोष लगभग inviscid सामग्री के लिए अत्यधिक चिपचिपा सामग्री से प्रसार माप की एक विस्तृत श्रृंखला उपलब्ध कराता है। प्रसार बूंद संघीकरण प्रक्रिया (~ 10 मिसे) के लिए समय के दौरान क्षेत्र की 100 माइक्रोन से 100 माइक्रोन भर में तब होता है जब प्रिंसिपल में, फ्रैम, मौजूदा तकनीक के बराबर है जो 10 6 माइक्रोन 2 / सेकंड की अधिकतम diffusivity उपाय कर सकते हैं। Monolayers ठोस हैं, जब तक कि इसके अलावा, धीमी गति से प्रसार प्रक्रिया को आसानी से मापा जा सकता है। ज्ञानकोष रूप में लंबे समय उचित fluorescently टैग किया अणुओं उपलब्ध हैं के रूप में सतह सक्रिय सामग्री के किसी भी प्रकार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Protocol

सावधानी: कैंसर हो जो एसीटोन और क्लोरोफॉर्म का उपयोग करने से पहले सामग्री सुरक्षा डाटा शीट (एमएसडीएस) का संदर्भ लें।

एक फ्लैट एयर पानी इंटरफेस में Phospholipid monolayer के 1. तैयारी

  1. एक फॉस्फोलिपिड monolayer के गठन
    1. एक फॉस्फोलिपिड समाधान की तैयारी
      1. एसीटोन, इथेनॉल, और विआयनीकृत पानी कम से कम तीन बार का उपयोग कर एक polytetrafluoroethylene लेपित टोपी के साथ शीशी, और पानी से छुटकारा पाने की शीशी में अच्छी तरह से नाइट्रोजन गैस उड़ा एमएल 4 साफ करें।
      2. फॉस्फोलिपिड के 1 मिलीग्राम भंग (जैसे, dioleoylphosphatidylcholine, DOPC) शीशी में क्लोरोफॉर्म के 1 मिलीलीटर के लिए 1 मिलीग्राम / एकाग्रता की मिलीलीटर प्राप्त करने के लिए। सुरक्षा के लिए एक धूआं हुड में इस प्रक्रिया को पूरा करें। फॉस्फोलिपिड समाधान की कम या अधिक सांद्रता यदि आवश्यक का प्रयोग करें।
      3. जोड़ें डाई फॉस्फोलिपिड टैग किया (जैसे, Rhodamine dipalmitoylphosphatidylethanolamine, Rhodamine DPPE) फॉस्फोलिपिड समाधान के कम से कम 1 मोल% के साथमोर्चे, एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के साथ फॉस्फोलिपिड monolayer कल्पना करने के क्रम में। सुरक्षा के लिए एक धूआं हुड में इस प्रक्रिया को पूरा करें।
      4. विलायक वाष्पीकरण को रोकने के लिए एक polytetrafluoroethylene टेप के साथ शीशी लपेटें, और -20 डिग्री सेल्सियस पर एक फ्रीजर में नमूना की दुकान।
    2. हवा-पानी इंटरफेस पर फॉस्फोलिपिड के बयान
      1. एक पेट्री डिश (व्यास में 55 मिमी और ऊंचाई में 12 मिमी) इथेनॉल के साथ, और विआयनीकृत पानी कम से कम तीन बार साफ करें।
      2. एक हवा-पानी इंटरफ़ेस बनाने के लिए विआयनीकृत पानी की 10 मिलीलीटर के साथ पेट्री डिश भरें।
      3. वांछित सतह दबाव को प्राप्त और पूर्व प्रयोग कर रही है, पूरी तरह से विलायक लुप्त हो जाना कम से कम 30 मिनट के लिए प्रतीक्षा करने के लिए एक साफ इंटरफ़ेस पर एक माइक्रो-सिरिंज के साथ फॉस्फोलिपिड समाधान के कुछ microliters बिखरा हुआ है।
        नोट: एक Langmuir गर्त सतह दबाव के सटीक नियंत्रण जरूरी है कि अगर बजाय एक पेट्री डिश के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  2. रrface दबाव माप
    1. एक Wilhelmy प्लेट tensiometer साथ फॉस्फोलिपिड monolayer की सतह दबाव मापने। फिल्टर पेपर एक Wilhelmy थाली के रूप में प्रयोग किया जाता है, तो फिल्टर पेपर काफी गीला पाने के लिए कम से कम 30 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें। विस्तृत प्रोटोकॉल कुहन एट अल में उपलब्ध है। 20।
    2. ठीक सतह दबाव को नियंत्रित करने के फॉस्फोलिपिड की जमा राशि को समायोजित करें। ~ 5 करोड़ / मी सतह दबाव की यदि इंटरफेस के 30.25 सेमी 2 -area पर DOPC समाधान (1 मिलीग्राम / एमएल) के 4 μl जोड़ें आवश्यक है।
      नोट: फिल्टर पेपर पूरी तरह से गीला नहीं है, तो सतह दबाव की वजह से फिल्टर पेपर के वजन परिवर्तन करने के लिए प्रयोग के पहले 30 मिनट के दौरान नाटकीय रूप से बदलता है।
  3. Monolayer के संवहनी प्रवाह के न्यूनतम
    1. पेट्री डिश के एक बड़े वर्ग से जुड़े दो पतली चैनल के साथ एक 3 मिमी जलाशय में शामिल है कि एक शंकु के आकार का उपकरण, का उपयोग करें, के संवहनी प्रवाह को दबाने के लिएआकृति विज्ञान इमेजिंग और सतह के दबाव माप परेशान कर सकते हैं जो monolayer,।
    2. फॉस्फोलिपिड हवा-पानी इंटरफेस पर फॉस्फोलिपिड जमा करने से पहले पूरे क्षेत्र पर आसानी से ले जाने कि यह सुनिश्चित करने के लिए पूड़ी तंत्र के अंदर और बाहर के बीच जल स्तर के मैच के लिए सुनिश्चित करें।

एक छोटी बूंद के घुमावदार सतह पर Phospholipid monolayer के 2. तैयारी

  1. Micropipette खींचने का उपयोग कर एक गिलास केशिका की प्रक्रिया गावदुम
    1. एक micropipette खींचने का एक केशिका धारक पर एक गिलास केशिका (आयुध डिपो 1 मिमी, आईडी 0.78 मिमी, लंबाई 100 मिमी) रखें।
    2. (: खींचो, रैंप: 60, वेल: 70, देरी: हीट 70 और दबाव 200) उचित पैरामीटर मान के साथ केशिकाओं खींचने के लिए एक कार्यक्रम के डिजाइन और निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार डिजाइन कार्यक्रम के साथ केशिकाओं खींच।
      नोट: एक केशिका कुछ माइक्रोमीटर व्यास के साथ समाप्त Appl से एक 100 माइक्रोन-छोटी बूंद के रूप में करने के लिए आवश्यक है~ 10 किलो पास्कल के साथ एक दबाव यिंग। केशिका की नोक अंत में बहुत अधिक दबाव है,> 600 किलो पास्कल बहुत छोटा है, तो यह एक बहुत बड़ी केशिका टिप अंत के साथ बूंदों के आकार को नियंत्रित करने के लिए कठिन है, जबकि छोटी बूंद प्राप्त करने के लिए आवश्यक है।
  2. छोटी बूंद सतह पर फॉस्फोलिपिड के अवशोषण
    नोट: एक छोटी बूंद के घुमावदार इंटरफेस में एक फॉस्फोलिपिड monolayer फार्म करने के लिए, डाई के बिना एक फॉस्फोलिपिड समाधान है, इसके अलावा प्रक्रिया 1. द्वारा तैयार की, फ्लैट monolayer के खिलाफ, एक तीव्रता विपरीत प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल दोनों प्रक्रियाओं 2.2.1 और 2.2 है फॉस्फोलिपिड टैग किया 0.2 यहाँ स्वीकार्य हैं। छोटी बूंद सतह पर सतह दबाव के सटीक नियंत्रण आवश्यक है, तो प्रक्रिया 2.2.2 अत्यधिक की सिफारिश की है। हालांकि, अगर नहीं, प्रक्रिया 2.2.2 से एक बहुत आसान तरीका है, जो प्रक्रिया 2.2.1, उपयोगी है।
    1. एक टिप के अंत में फॉस्फोलिपिड की प्रक्रिया कोटिंग
      1. एसीटोन, इथेनॉल, और विआयनीकृत पानी में कम से कम तीन बार का उपयोग कर एक स्लाइड कांच साफ करें।
      2. पी एलएक साफ स्लाइड कांच पर पतला केशिका ऐस, और एक टिप अंत के साथ स्लाइड गिलास छूने की सुविधा के लिए केशिका झुकाव।
      3. एक गिलास सिरिंज का उपयोग कर गिलास स्लाइड का पालन किया जाता है कि एक केशिका की नोक अंत पर फॉस्फोलिपिड समाधान (1 मिलीग्राम / एमएल) के कुछ बूंदों गिरा, और पूरी तरह से विलायक लुप्त हो जाना कम से कम 30 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
        नोट: यह अत्यधिक टिप अंत की परिधि केवल केशिका बल द्वारा टिप अंत में फॉस्फोलिपिड की छोटी बूंद रखने के लिए बहुत छोटा है, क्योंकि प्रक्रिया 2.2.1.3 दौरान गिलास स्लाइड के लिए केशिका की नोक अंत पालन करने के लिए सिफारिश की है।
    2. एक पुटिका समाधान की तैयारी
      1. एक शीशी साफ है, और प्रक्रिया 1.1.1.1 में पेश किया है, के रूप शीशी से पानी निकाल दें।
      2. धीरे नाइट्रोजन गैस को लागू करने से फॉस्फोलिपिड समाधान (1 मिलीग्राम / एमएल) की एक 2 मिलीलीटर मात्रा सूखी, और किसी भी शेष विलायक समाप्त करने के लिए आरटी पर 1 घंटे के लिए शीशी सूखना। सुरक्षा के लिए एक धूआं हुड में इस प्रक्रिया को पूरा करें।
      3. 2 जोड़ेंशीशी में विआयनीकृत पानी की मिलीलीटर लिपिड सूखे, और 1 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में शीशी सेते हैं।
      4. शीशी में कई बार मिलाने, और sonicate (एचएफ आवृत्ति: 40 किलोहर्ट्ज़, पावर अप करने के लिए: 370 डब्ल्यू) पुटिकाओं प्राप्त करने के लिए 30 मिनट।
      5. Monodisperse unilamellar पुटिकाओं प्राप्त करने के लिए बाहर निकालना और फ्रीज पिघलना प्रक्रियाओं को पूरा करें। तैयारी पुटिकाओं के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल मेयर एट अल। 21 में वर्णित है।
        नोट: छोटी बूंद इंटरफेस की सतह दबाव monodisperse unilamellar पुटिकाओं होता है कि छोटी बूंद के गठन के बाद इंतजार कर समय का समायोजन करके ठीक नियंत्रित किया जाता है। एक लटकन ड्रॉप विधि 22 का उपयोग करना, यह पहले प्रयोग कर रही है, समय के अनुसार सतह दबाव के परिवर्तन को मापने के लिए आवश्यक है।
  3. घुमावदार सतह पर एक फॉस्फोलिपिड monolayer होता है कि एक छोटी बूंद का गठन
    1. Procedur से विआयनीकृत पानी की 10 μl के साथ पतला केशिका में भरेंई 2.2.1। वैकल्पिक रूप से, प्रक्रिया 2.2.2 से पुटिका समाधान के 10 μl का उपयोग करें।
    2. छोटी बूंद के लिए फार्म का दबाव प्रदान करने के लिए एक स्वचालित सूक्ष्म इंजेक्टर केशिका कनेक्ट करें।
    3. ठीक केशिका की स्थिति को नियंत्रित करने के लिए एक micromanipulator के लिए एक माइक्रो-इंजेक्टर से जुड़ा है कि केशिका माउंट।
    4. एक सीसीडी कैमरा के साथ केशिका के पार्श्व दृश्य इमेजिंग के लिए: (10X एनए 0.3 माइक्रोस्कोप 1, उद्देश्य लेंस) एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप तैयार करें। माइक्रोस्कोप 1 इस प्रकार Z अक्ष के साथ छोटी बूंद की सटीक स्थिति का निरीक्षण करने और छोटी बूंद के आकार का अनुमान लगाने के लिए सक्षम बनाता है।
    5. ~ 100 (एक उचित आकार तक, केशिका की नोक अंत के साथ एक चर दबाव (~ 100 एचपीए) टिप अंत के पार्श्व दृश्य अच्छी तरह से एक micromanipulator का उपयोग माइक्रोस्कोप 1 से कल्पना की है, जहां एक की स्थिति को टिप अंत ले जाएँ, और लागू छोटी बूंद के व्यास में माइक्रोन) का गठन किया है।
      नोट: यह स्वचालित सूक्ष्म सुई लगानेवाला और micromanipulator उपयोग किया जा सिफारिश की है किघ छोटी बूंद की बूंद के आकार और स्थान के ठीक नियंत्रण आवश्यक है, यदि। यह मैनुअल लोगों का उपयोग करने के लिए भी संभव है।

बूंद विलय के बाद 3. इमेजिंग प्रतिदीप्ति वसूली

नोट: इस प्रोटोकॉल के मौलिक सिद्धांतों बूंद संघीकरण प्रक्रिया के लिए छोड़कर, FRAP तकनीक के उन लोगों के लिए समान हैं। FRAP की विस्तृत प्रोटोकॉल और संबंधित सिद्धांत ए लोपेज एट अल। 15 और डी एक्सेरोल्ड एट अल। 16 में उपलब्ध हैं।

  1. निगरानी और छोटी बूंद के स्थान को नियंत्रित
    1. Rhodamine-DPPEs (560 एनएम पर उत्तेजना, 583 एनएम पर उत्सर्जन) के लिए एक उचित फिल्टर सेट के साथ एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी दोनों में सक्षम बनाता है कि (: 10X एनए 0.3, ट्यूब लेन्स की फोकल लंबाई 17 सेमी माइक्रोस्कोप 2, उद्देश्य लेंस) की स्थापना की एक औंधा माइक्रोस्कोप तैयार और एक चमकदार क्षेत्र माइक्रोस्कोप। एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी मीटर के साथ छोटी बूंद के शीर्ष विचारों दृश्यमान करने के लिए यहां एक सीसीडी कैमरे का उपयोग करेंस्तोत्र और एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप मोड।
    2. जेड अक्ष के साथ एक फ्लैट हवा-पानी इंटरफेस के लिए एक फॉस्फोलिपिड के साथ लेपित छोटी बूंद ले जाएँ, लेकिन micromanipulator का उपयोग, अभी तक छोटी बूंद विलय नहीं है। छोटी बूंद के पार्श्व दृश्य कल्पना करने के लिए माइक्रोस्कोप 1 का प्रयोग करें।
    3. Micromanipulator का उपयोग, फ्लैट monolayer के शीर्ष देखने के केंद्र में छोटी बूंद का पता लगा। फ्लैट monolayer के शीर्ष दृश्य कल्पना करने के लिए माइक्रोस्कोप 2 के उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप मोड का उपयोग करें।
  2. फ्लैट हवा-पानी इंटरफेस पर छोटी बूंद विलय
    1. छोटी बूंद micromanipulator का उपयोग, इंटरफेस पर विलीन हो जाती है जब तक फ्लैट इंटरफेस की ओर आगे छोटी बूंद ले जाएँ। विलय प्रक्रिया को सफलतापूर्वक किया जाता है, तो एक सफेद पृष्ठभूमि से घिरा हुआ है कि एक गोल आकार के साथ एक अंधेरे क्षेत्र, माइक्रोस्कोप 2 के प्रतिदीप्ति मोड का उपयोग कर मनाया जाता है।
    2. माइक्रो की प्रतिदीप्ति मोड का उपयोग, छोटी बूंद के विलय के बाद समय के अनुसार फ्लोरोसेंट छवियों की श्रृंखला रिकॉर्ड2. यहाँ monolayer के प्रसार समय के पैमाने से एक तेज फ्रेम दर का उपयोग करें सामना। DOPC monolayer में, यह पूरी तरह से 200 माइक्रोन अंधेरे क्षेत्र में फैलाना करने के लिए कुछ मिनट लगते हैं।

4. छवि विश्लेषण द्वारा प्रसार गुणांक निर्धारण

नोट: नीचे वर्णित के रूप में छवियों की एक श्रृंखला से प्रसार गुणांक का निर्धारण करने के लिए, छवि विश्लेषण के लिए अनुकूलित कार्यक्रम बनाया गया है। इस कार्यक्रम की एक विस्तृत स्रोत कोड जौव वेबसाइट में उपलब्ध है।

  1. ब्याज की एक परिपत्र क्षेत्र की जांच
    1. हित के क्षेत्र के केंद्र की जांच
      1. एक परिपत्र अंधेरे क्षेत्र और एक सफेद पृष्ठभूमि में शामिल है जो एक वसूली की प्रक्रिया के दौरान दर्ज किया गया है कि फ्लोरोसेंट छवियों की एक श्रृंखला प्राप्त है, और एक संदर्भ छवि के रूप में श्रृंखला की पहली छवि निर्धारित किया है। इधर, अनुसंधान और विकास के लिए एक संदर्भ छवि में अंधेरे क्षेत्र की त्रिज्या है।
      2. एक सफेद वृत्त के साथ संदर्भ छवि कुंडलित कौनएसई तीव्रता एक पूरे क्षेत्र पर एक समान है। यहाँ अनुकूलित कार्यक्रम लाइन 124. के स्रोत कोड के रूप में दिखाया कनवल्शनफ़िल्टर्स के लिए 'conv2' नाम एम्बेडेड समारोह का प्रयोग करें, सफेद वृत्त की त्रिज्या आर डी से थोड़ा छोटा है।
      3. कनवल्शनफ़िल्टर्स गणना में एक न्यूनतम मूल्य इंगित करता है कि एक स्थिति का पता लगाएं, और संदर्भ छवि में हित के क्षेत्र के केंद्र के रूप में इस स्थिति को निर्धारित किया है।
    2. हित के क्षेत्र के एक त्रिज्या का निर्धारण
      1. एक पूरे क्षेत्र पर एक प्रक्रिया 4.1 और वर्दी तीव्रता द्वारा निर्धारित एक केंद्र की स्थिति, जिसमें एक सफेद वृत्त के साथ संदर्भ छवि कुंडलित। इधर, आर एस सफेद वृत्त की त्रिज्या है। का प्रयोग चलना ऐसी 'के लिए' या इच्छित प्रोग्राम लाइन 102-109 के स्रोत कोड के रूप में दिखाया सफेद वृत्त बनाने के लिए एक वृत्त के समीकरण के साथ 'जबकि' के रूप में।
      2. एक से थोड़ा है, जो एक और सफेद वृत्त के साथ संदर्भ छवि कुंडलितआर एस की तुलना में बड़ा त्रिज्या (5% -10%), आर एल। अनुकूलित कार्यक्रम लाइन 113-120 के स्रोत कोड के रूप में दिखाया सर्कल बनाने के लिए प्रक्रिया 4.1.2.1 के साथ ही विधि का प्रयोग करें।
      3. 4.1.2.1 और 4.1.2.2 के दो कनवल्शनफ़िल्टर्स गणना के बीच मूल्य में अंतर प्राप्त करते हैं।
      4. एक पिक्सेल स्तर के साथ आर एस और आर एल दोनों को बढ़ाने के द्वारा, आर एस = 2R डी के लिए आर एस = आर डी / 2 से उपरोक्त प्रक्रिया को दोहराएं। दोहराने के लिए 4.1.2.3 करने के लिए प्रक्रिया 4.1.2.1 से पूरे स्रोत कोड होता है कि एक चलना बनाओ।
      5. दो कनवल्शनफ़िल्टर्स गणना के बीच मूल्य में अधिकतम अंतर इंगित करता है कि आर एस की त्रिज्या का पता लगाएं। यह अनुसंधान इस प्रकार संदर्भ छवि में अंधेरे क्षेत्र की त्रिज्या को इंगित करता है S 149 के लिए अनुकूलित कार्यक्रम लाइन 148 के स्रोत कोड के रूप में दिखाया त्रिज्या खोजने के लिए 'मैक्स' नाम का प्रयोग एम्बेडेड समारोह मूल्य में अधिकतम अंतर इंगित करता है।
    3. एक आंशिक तीव्रता की गणना
      1. ब्याज की एक क्षेत्र के रूप में प्रक्रिया 4.1 द्वारा निर्धारित एक केंद्र की स्थिति और एक त्रिज्या, जिसमें एक चक्र निर्धारित करें।
      2. समय के अनुसार प्रतिदीप्ति छवियों की एक श्रृंखला के हित में इस क्षेत्र की औसत तीव्रता की गणना। हित के क्षेत्र के साथ प्रत्येक फ्रेम कुंडलित और औसत तीव्रता गणना करने के लिए ब्याज की इस क्षेत्र के क्षेत्र से विभाजित। विवरण जौव वेबसाइट में उपलब्ध है, जो अनुकूलित कार्यक्रम के स्रोत कोड में उपलब्ध हैं।
      3. एफ (टी) समय के अनुसार ब्याज की एक क्षेत्र है कि सर्कल में औसत तीव्रता है, जहां नीचे समीकरण के रूप में परिभाषित एक आंशिक तीव्रता की गणना, मैं च सर्कल में प्रारंभिक तीव्रता है, और एफ ओ की तीव्रता है एक सफेद पृष्ठभूमि।
        एफ (टी) = (एफ (टी) - मैं च) / (एफ ओ - मैं च) (1 समीकरण)।
    4. एफ फिटिंगFRAP सिद्धांत को ractional तीव्रता
      1. मैं एक एक फिटिंग प्रोग्राम का उपयोग कर, Bessel कार्य संशोधित कर रहे हैं, τ एक विशेषता प्रसार समय और मैं 0 है, जहां नीचे समीकरण के साथ आंशिक तीव्रता फिट है, और τ प्राप्त
        2 समीकरण (2 समीकरण)।
      2. डी प्रसार गुणांक है और एक अंधेरे क्षेत्र की त्रिज्या है जहां संबंध, τ के आधार पर एक प्रसार गुणांक = एक 2/4 डी, प्राप्त करते हैं।
        नोट: फिटिंग प्रक्रिया के दौरान, यह वसूली की प्रक्रिया पहले से ही छवियों रिकॉर्डिंग से पहले शुरू कर दिया है एक समय था जब अक्ष के साथ आंशिक तीव्रता प्रोफ़ाइल बदलाव संभव है।

Representative Results

चित्रा 1 में सूचीबद्ध के रूप में प्रतिदीप्ति छवियों की एक श्रृंखला, एक फ्लैट DOPC monolayer पर एक DOPC monolayer साथ लेपित एक छोटी बूंद के विलय के बाद वसूली की प्रक्रिया के दौरान समय के साथ प्राप्त किया गया। फ्लैट हवा-पानी इंटरफेस में DOPC monolayer की कम मात्रा के साथ डाल दिया गया था rhodamine-DPPE, और इस प्रकार यह संभव है एक चमकीले रंग और नव फ्लैट अंतरफलक में जोड़ा एक अंधेरे क्षेत्र के साथ एक पृष्ठभूमि कल्पना करने के लिए बनाया है। वहाँ, एक वसूली की प्रक्रिया तय की सतह दबाव के 23 करोड़ / मीटर की ऊंचाई पर मनाया गया। समय के अनुसार आंशिक तीव्रता के परिवर्तन के समीकरण 1 का एक फिट इस फिट की आर 2 मूल्य 0.999 है। चित्रा 2 में दिखाया गया है, और इस फिट अभी भी कम या अधिक सतह के दबाव में अच्छी तरह से काम करता है। इस फिट से प्राप्त DOPC monolayer के प्रसार गुणांक सतह दबाव के 23 करोड़ / मी में 27.54 माइक्रोन 2 / सेकंड था।

ज्ञानकोष के आगे सत्यापन, डीओ के प्रसार गुणांक के लिएपीसी और dipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) monolayers सतह दबाव के अनुसार मापा गया। 3 चित्र में दिखाया गया है, ज्ञानकोष ~ 9 करोड़ / मी सतह दबाव की, एक नियंत्रण रेखा (तरल सघन) जहां पर DPPC monolayer के प्रसार गुणांक की तेजी से कमी को दर्शाता है - LE (तरल का विस्तार) चरण संक्रमण 10 होता है, और मूल्यों की प्रसार गुणांक भी पीटर्स एट अल। 19 से पहले माप के साथ अच्छी तरह से सहमत हैं। इसके अलावा, सतह के दबाव के साथ प्रसार गुणांक के एक घातीय क्षय DOPC monolayer में मनाया गया था, और इस प्रवृत्ति करुसो एट अल। 12 से मापा एक साथ लगभग समान है।

चित्र 1
चित्रा 1. (क) ज्ञानकोष की योजनाबद्ध चित्रण (विलय के बाद प्रतिदीप्ति वसूली) तकनीक। होंठ के रूप मेंआईडी monolayer लेपित छोटी बूंद फ्लैट हवा-पानी इंटरफ़ेस करने के लिए विलय कर दिया है, प्रतिदीप्ति बिना लिपिड monolayer लिपिड फ्लैट फ्लोरोसेंट लिपिड monolayer में डाला जाता है चिह्नित। सतह के दबाव के 23 करोड़ / मी (पैमाने बार = 100 माइक्रोन) पर एक DOPC monolayer की वसूली की प्रक्रिया के दौरान समय के साथ (बी) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप छवियों। DOPC monolayer के अंधेरे क्षेत्र पूरी तरह से कई मिनट के भीतर प्रसार की प्रक्रिया से बरामद किया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
समय बनाम 2. आंशिक तीव्रता चित्रा। काले घेरे और ग्रे बिंदीदार रेखा, समय के साथ आंशिक तीव्रता करने के लिए छवि विश्लेषण (प्रक्रियाओं 4.1 और 4.2) और समीकरण 1 के फिट से प्राप्त आंशिक तीव्रता के मूल्यों का संकेतप्रक्रिया 4.3 में दिखाया गया है, क्रमशः। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
DOPC (त्रिकोण) और DPPC (खाली) वर्ग सतह दबाव के एक समारोह के रूप में monolayers के चित्रा 3. प्रसार गुणांक। उज्ज्वल ग्रे रंग के साथ और गहरे भूरे रंग के साथ लाइनों पहले पीटर्स एट अल द्वारा रिपोर्ट प्रसार गुणांक के मूल्यों का संकेत मिलता है। और करुसो एट अल।, क्रमशः। यह आंकड़ा जेओंग एट अल। 23 से संशोधित किया गया है। जेओंग एट अल। Langmuir। 30 (48), 14,369-14,374 से अनुमति के साथ पुनर्प्रकाशित। कॉपीराइट 2014 अमेरिकन केमिकल सोसायटी। उसकी क्लिक करेंई यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

Discussion

ज्ञानकोष विशेष रूप से एक विशिष्ट क्षेत्र विरंजन के बाद प्रतिदीप्ति वसूली को मापने के लिए FRAP के साथ मौलिक सिद्धांतों का एक बहुत शेयरों, लेकिन ज्ञानकोष एक प्रक्षालित क्षेत्र के रूप में करने के लिए फ्लैट इंटरफेस पर एक छोटी बूंद विलय के बजाय एक गहन प्रकाश लागू करने की एक प्रक्रिया का उपयोग करता है। विलय प्रक्रिया इस प्रकार ज्ञानकोष में सबसे महत्वपूर्ण कदम है, और विशेष रूप से, एक छोटी बूंद के विलय के बाद फ्लैट monolayer पर अंधेरे दाग के आकार diffusivity माप की सटीकता को निर्धारित करता है। विशेष रूप से, एक मौजूदा पद्धति पर आधारित है, हम केवल प्रक्रिया 4 में दिखाया अंधेरे दाग की औसत तीव्रता, गणना करने के लिए ब्याज की एक क्षेत्र के रूप में एक त्रिज्या के साथ R वृत्त सेट, और गोल आकार से भी ज्यादा विचलन नहीं है, यह एक प्रसार गुणांक की सटीक माप परेशान होगा। इसलिए, यह एक परिपत्र आकार के अंधेरे क्षेत्र प्राप्त करने के लिए आवश्यक है, लेकिन, noncircular आकार कई कारणों की वजह कभी-कभी बनते हैं। सबसे पहले, पालतू में एक संवहनी प्रवाह यदि वहां मौजूदरी पकवान, अंधेरे क्षेत्र के आकार के प्रवाह की दिशा के साथ लम्बी हो जाता है। प्रक्रिया 1.3 में उल्लेख किया है, एक पूड़ी तंत्र संवहनी प्रवाह को दबाने के लिए मदद करता है, और इस बढ़ाव कम से कम हो जाएगा। केशिका की नोक अंत एक विलय की प्रक्रिया के दौरान फ्लैट इंटरफेस को छू लेती है, तो केशिका अंत विलय प्रक्रिया बीच में आता है के बाद से दूसरा, अंधेरे क्षेत्र आकार की एक किस्म के साथ बनाई है। केवल केशिका के अंत से लटका हुआ है कि एक छोटी बूंद प्राप्त करने से, इस रुकावट को रोका जा सकता है। विशेष रूप से, केशिका के एक हाइड्रोफोबिक उपचार केशिका के बहुत अंत में बैठने के लिए छोटी बूंद मदद करता है। इसलिए, ऊपर मुसीबत शूटिंग और संशोधनों अधिक ठीक प्रसार गुणों को मापने के लिए सक्षम करें।

यह अच्छी तरह से troubleshot प्रक्रिया इस प्रकार ज्ञानकोष FRAP पर कई महत्वपूर्ण लाभ के लिए अनुमति देता। सबसे पहले, ज्ञानकोष FRAP की तुलना में सरल उपकरणों की आवश्यकता है। फ्रैम, यह एक सरल प्रतिदीप्ति माइक्रो का उपयोग करने के लिए पर्याप्त हैबजाय जिसका तरंग दैर्ध्य डाई के अवशोषण स्पेक्ट्रम के साथ मेल खाना चाहिए एक उच्च शक्ति लेजर के साथ एक महंगी confocal खुर्दबीन के, सामना। इसके अलावा, यह ज्ञानकोष छोटी बूंद के आकार, या छोटी बूंद सतह पर सतह दबाव समायोजन करके आसानी से क्षेत्र के आकार को नियंत्रित करता है, जबकि FRAP में प्रक्षालित क्षेत्र के आकार को समायोजित करने के लिए अतिरिक्त उपकरण का उपयोग करने के लिए आवश्यक है। दूसरा, यह ज्ञानकोष में रंगों की विभिन्न प्रजातियों का उपयोग संभव है। FRAP केवल जिसका विरंजन प्रक्रिया प्रसार की प्रक्रिया की तुलना में ज्यादा तेजी से होता है डाई अणु का उपयोग करता है। रंगों के प्रसार विरंजन प्रक्रिया के दौरान होता है, तो यह सही प्रसार संपत्ति का अनुमान लगाने के लिए मुश्किल है। फ्रैम, तथापि, रंग विरंजन के लिए एक प्रक्रिया की आवश्यकता नहीं है और यह इस प्रकार प्रतिदीप्ति इमेजिंग में रंगों के विभिन्न प्रकार के उपयोग के लिए सक्षम बनाता है। इसके अलावा, FRAP अतिरिक्त उच्च शक्ति लेजर की आवश्यकता है और फिल्टर यह ज्ञानकोष में फिल्टर सेट को बदलने के लिए ही आवश्यक है, जबकि डाई प्रजातियों को बदलने के लिए सेट। अंत मेंFRAP ही उपाय है, जबकि छोटी बूंद सतह और फ्लैट इंटरफेस में monolayers के बाद, इस प्रकार अंतर-प्रसार के अध्ययन को सक्षम या एक प्रकार बी प्रकार monolayer को monolayer के विलय से दो अलग-अलग लिपिड monolayers के बीच मिश्रण, स्वतंत्र रूप से गठित किया जा सकता एक monolayer के आत्म-प्रसार।

इन फायदों के बावजूद, एक फ्लैट हवा-पानी इंटरफेस पर एक छोटी बूंद विलय की प्रक्रिया संभावित कारण इस तरह के दो monolayers के बीच एक सतह दबाव बेमेल, विलय की प्रक्रिया के समय के पैमाने के रूप में चिंता का विषय हो सकता है कि कई मुद्दों पर इस तकनीक का सीमित कर सकते हैं बूंदों के विलय के बाद फ्लैट monolayer की सतह दबाव में है, और वृद्धि हुई है। इन मुद्दों पर, तथापि, निम्नलिखित कारणों के लिए काफी प्रसार माप को प्रभावित नहीं करते। सबसे पहले, दो अलग अलग monolayers पर सतह के दबाव काफी अलग हैं, भले ही एक संतुलन की प्रक्रिया वसूली प्रक्रिया के दौरान एक बहुत ही प्रारंभिक चरण में पूरा हो गया है। उदाहरण के लिए, यदि Tसतह दबाव equilibrates जब तक वह छोटी बूंद सतह पर monolayer के दबाव फ्लैट हवा-पानी इंटरफेस में monolayer की तुलना में अधिक है सतह, अंधेरे क्षेत्र का विस्तार। इस प्रक्रिया को 10 मिसे के भीतर पूरा हो गया है के बाद से यह काफी प्रसार की प्रक्रिया को प्रभावित करता है, इससे पहले कि सतह दबाव equilibrated किया जाएगा। विलय की प्रक्रिया के समय के पैमाने तेजी से पर्याप्त है, तो दूसरा, यह सब पर प्रसार माप सीमा नहीं है। सौभाग्य से, एक ठेठ विलय प्रक्रिया को भी 10 मिसे के भीतर पूरा हो गया है। अंत में, गर्त की सतह क्षेत्र के बाद से सतह दबाव में वृद्धि नहीं करते फ्लैट इंटरफेस पर बूंदों के भी कई विलय छोटी बूंद की सतह क्षेत्र की तुलना में कहीं अधिक है। प्रोटोकॉल में वर्णित गर्त और बूंदों के आकार के अनुसार, अणु प्रति क्षेत्र एक छोटी बूंद के विलय से कम से कम 0.015% बढ़ जाती है। तदनुसार, कारण अणु प्रति क्षेत्र के परिवर्तन के लिए सतह दबाव की वृद्धि negligibl है जो कम से कम 0.1% है,Wilhelmy प्लेट tensiometer द्वारा मापा के रूप में ई यह सतह दबाव में विशिष्ट त्रुटि तुलना में काफी छोटा है।

सारांश में, हम फ्लैट इंटरफेस पर एक छोटी बूंद monolayer के विलय से एक फॉस्फोलिपिड monolayer के पार्श्व प्रसार संपत्ति को मापने के लिए एक नई विधि की शुरुआत की। इस तकनीक अपेक्षाकृत सरल उपकरणों की आवश्यकता है और यह भी डाई प्रजातियों के विभिन्न प्रकार के उपयोग के लिए सक्षम बनाता है। ज्ञानकोष इस प्रकार एक तरल पदार्थ से द्रव इंटरफेस में फॉस्फोलिपिड, ब्लॉक सहपॉलिमरों, प्रोटीन और भी नैनोकणों सहित किसी भी सतह सक्रिय एजेंट के प्रसार माप के लिए संभावित लागू है। इसके अलावा, हम ज्ञानकोष दो अलग सतह सक्रिय एजेंटों के बीच मिश्रण अंतर-प्रसार या अध्ययन करने के लिए एक नया तरीका प्रदान करता है कि उम्मीद है।

Acknowledgments

यह काम 2014 के लिए KAIST वित्त पोषित कश्मीर घाटी लाल और बी परियोजना और बेसिक साइंस रिसर्च प्रोग्राम कोरिया के नेशनल रिसर्च फाउंडेशन के माध्यम से (NRF- 2012R1A6A3A040395, एनआरएफ-2013R1A1A2057708, NRF- 2012R1A1A1011023) द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone OCI corporation Acetone 3.8L Extra Pure Purity: ≥ 99.5%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use.
Ethanol OCI corporation Ethanol 3.8L Extra Pure Purity: ≥ 94%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use.
Dioleoylphosphatidylcholine, DOPC Avanti Polar Lipids 850375C Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Chloroform is carcinogenic.
Chloroform LiChrosolv Chloroform ultrapure (A3633) Purity: ≥ 99.8%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Carcinogenic
Rhodamine DPPE Avanti Polar Lipids 810158C, 810158P Avoid direct light exposure to prevent photobleaching
Wilhelmy plate tensiometer R&K ultrathin organic film technology Wilhelmy tensiometer http://www.rieglerkirstein.de/index.htm
Micropipette puller Sutter instrument P-1000
Micro-injector Eppendorf Femtojet
Micromanipulator Eppendorf Micromanipulator 5171
Microscope 1 Objective lens: Olympus Objective lens: UPlanFl 10x Objective lens: 10X NA 0.3
Microscope 2 Objective lens: Olympus, Tube lens: Thorlabs Objective lens: UPlanFl 10x Objective lens: 10X NA 0.3, tube lens: focal length 17 cm
CCD for Microscope 1 Jai CV 950 camera
CCD for Microscope 2 Andor iXon3 EMCCD
Filter set Chroma technology Catalog Set 49004: ET545, T565, ET605 Prepare suitable for dye molecules
Sonicator DAIHAN Scientific Wiseclean WUC-D06H

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 104 फ्रैम प्रसार एकीकरण फॉस्फोलिपिड monolayer FRAP अंतर-प्रसार द्रव-द्रव इंटरफेस ड्रॉप
एक छोटी बूंद विलय प्रतिदीप्ति वसूली के बाद एक फॉस्फोलिपिड monolayer के दो आयामी प्रसार करने के लिए उपाय
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Jeong, D. W., Kim, K., Choi, M. C., Choi, S. Q. Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer. J. Vis. Exp. (104), e53376, doi:10.3791/53376 (2015).

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