Introduction
Fosfolipiden zijn belangrijke componenten van celmembranen en de membranen van organellen, en de vloeibaarheid van deze membraanlagen tast vaak celfuncties door het veranderen van de activiteit van membraaneiwitten 1 - 3. Bijvoorbeeld membraan lipide homeostase wordt bereikt door het regelen membraanfluïditeit, die wordt gedetecteerd door membraaneiwitten en een abnormaal niveau van vloeibaarheid veroorzaakt ernstige aandoeningen, zoals hepatische steatose en cholestase 4. Daarnaast vloeibaarheid van een fosfolipide monolaag aan het lucht-longblaasjes vloeistof interface heeft belangrijke implicaties in zijn functies. Hoge vloeibaarheid van de long oppervlakteactieve fosfolipide monolaag vergemakkelijkt de verspreiding van de laag tijdens inademing, terwijl een lage vloeibaarheid maakt de laag binnen de longblaasjes te blijven tijdens het uitademen 5,6. Het is dus belangrijk om een schatting van de vloeibaarheid van de fosfolipide lagen hun rol begrijpen.
_content "> een directe maat voor de vloeibaarheid viscositeit en de viscositeit van fosfolipide lagen werd gemeten met behulp van microscopisch kleine colloïden 7, magneetnaalden 8,9 en magnetische micro-toetsen 6,10,11. Echter deze technieken zijn beperkt tot betrekkelijk harde folie en kan minder viskeus films meten. Voor dergelijke gevallen zou diffusie alternatief vloeibaarheid fosfolipide lagen kwantificeren. Sinds enkele jaren is een verscheidenheid van technieken om de diffusie-eigenschappen van fosfolipiden lagen meten ontwikkeld zoals fluorescentiedoving methode 12, gepulseerde veldgradiënt NMR 13 en fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS) 14. Een van de meest representatieve methoden fluorescentieherstel na fotobleken (FRAP) 15,16. Door de eenvoud van de meting en verwante theorieën, verschillende studies op diffusie eigenschappen fosfolipide lagen werden uitgevoerd met behulp FRAPHier presenteren we een nieuwe techniek om de laterale diffusie fosfolipide monolagen, genoemd als fluorescentieherstel meten na het samenvoegen (FRAM). Het belangrijkste verschil tussen FRAP en FRAM is dat de fotobleken stap wordt vervangen door de daling van de samenvoeging. Samenvoegen van een druppel gedekt door niet-fluorescentie monolaag op een fluorescent label plat monolaag laat een circulaire donkere vlek op een heldere vlakke monolaag, waardoor het opzetten van de dezelfde oorspronkelijke staat met de fotobleken stap. We zien dan de fluorescentie herstel in de donkere vlek met de tijd om de laterale diffusie te meten. Deze nieuwe "bleken" stap druppel coalescentie biedt aanzienlijke voordelen boven FRAP: FRAM vereist slechts een fluorescentiemicroscoop plaats van een dure confocale microscoop met een hoog vermogen laser die noodzakelijk is voor FRAP. Ikn Bovendien FRAM heeft een brede selectie van fluorescentie kleurstoffen, omdat het niet gaat om het fotobleken proces. Tenslotte, de twee monolagen, een druppel monolaag en een vlakke monolaag, worden afzonderlijk bereid, waardoor interdiffusie te meten, terwijl FRAP meet alleen de zelfdiffusie van monolagen.
FRAM biedt een breed scala van diffusie metingen van zeer viskeuze materialen aan bijna wrijvingsloze materialen. In principe kan FRAM de maximale diffusie van 10 6 pm 2 / sec, wat vergelijkbaar is met bestaande technieken te meten, wanneer het diffusie optreedt door het gebied 100 um van 100 urn in de tijd voor de drop coalescentie proces (~ 10 msec). Bovendien kan langzame diffusieproces eenvoudig worden gemeten, tenzij monolagen zijn solide. FRAM kan worden gebruikt voor alle soorten van oppervlakteactieve stoffen zolang geval fluorescent gemerkte moleculen zijn.
Protocol
Let op: Raadpleeg de veiligheidsinformatiebladen (VIB) voor het gebruik van aceton en chloroform die kankerverwekkend zijn.
1. Voorbereiding van de Phospholipid monolaag op een platte Air-water Interface
- Vorming van een fosfolipide monolaag
- Bereiding van een fosfolipide-oplossing
- Schoon een 4 ml flesje met polytetrafluoretheen beklede dop behulp van aceton, ethanol en gedeioniseerd water tenminste drie maal, en blaas stikstofgas grondig in de flacon te ontdoen van water.
- Los 1 mg fosfolipide (bijvoorbeeld dioleoylfosfatidylcholine, DOPC) tot 1 ml chloroform in de flacon met 1 mg / ml van de concentraties. Voer deze procedure in een zuurkast voor de veiligheid. Met lagere of hogere concentraties van fosfolipiden oplossing indien nodig.
- Dye gelabeld fosfolipiden (bijvoorbeeld Rhodamine dipalmitoylfosfatidylethanolamine, Rhodamine DPPE) met minder dan 1 mol% van het fosfolipide solutie, teneinde de fosfolipide monolaag met een fluorescentiemicroscoop zichtbaar. Voer deze procedure in een zuurkast voor de veiligheid.
- Wikkel de flacon met een polytetrafluorethyleen tape om oplosmiddelverdamping te voorkomen, en bewaar het monster in een vriezer bij -20 ° C.
- Depositie van fosfolipiden op het lucht-water-interface
- Schoon een petrischaal (55 mm in diameter en 12 mm in hoogte) met ethanol en gedeïoniseerd water minstens driemaal.
- Vul de petrischaal met 10 ml gedeïoniseerd water tot een lucht-water grensvlak te creëren.
- Verspreid enkele microliter van de fosfolipide-oplossing met een micro-injectiespuit op een schone interface gewenste oppervlaktedruk bereikt en wacht minimaal 30 minuten volledig verdampen van het oplosmiddel vóór het doen van het experiment.
Opmerking: een Langmuir trog kan worden gebruikt in plaats van een petrischaal wanneer nauwkeurige regeling van vlaktedruk noodzakelijk.
- Bereiding van een fosfolipide-oplossing
- Suce drukmeting
- Meet het oppervlak druk van de fosfolipide monolaag met een Wilhelmy plaat tensiometer. Wacht minstens 30 minuten om het filterpapier bevochtigd genoeg als filterpapier wordt toegepast als een Wilhelmy plaat. De gedetailleerde protocol is beschikbaar in Kuhn et al. 20.
- Pas de afgezette hoeveelheid van het fosfolipide aan de oppervlaktedruk nauwkeurig te regelen. Voeg 4 pi van de DOPC-oplossing (1 mg / ml) op de 30,25 cm 2 -gebied van het sluiten wanneer ~ 5 mN / m oppervlaktedruk vereist.
Opmerking: Als het filterpapier niet volledig bevochtigd, verandert oppervlaktedruk drastisch tijdens de eerste 30 minuten van het experiment vanwege de gewichtsverandering van het filterpapier.
- Minimalisatie van de convectiestroming van de monolaag
- Gebruik een kegelvormige inrichting die een reservoir 3 mm met twee dunne kanalen bevat, verbonden met een groot deel van de petrischaal, de convectieve stroom onderdrukkende monolaag die morfologie beeldvorming en oppervlaktedruk meting kan verstoren.
- Zorg ervoor dat de waterstand tussen de binnen- en buitenkant van de kegel-vorm apparaat overeen om ervoor te zorgen dat de fosfolipiden vrij bewegen over de hele regio voor het deponeren van fosfolipiden op het lucht-water interface.
2. Bereiding fosfolipide monolaag op het gebogen oppervlak van een Droplet
- Taps toelopend proces van een glazen capillair met micropipet trekker
- Plaats een glas capillair (od 1 mm, id 0,78 mm, lengte 100 mm) op een capillaire houder van een micropipet trekker.
- Het ontwerpen van een programma voor het trekken van de haarvaten met geschikte parameterwaarden (Heat: Ramp, Pull: 60, Vel: 70, Vertraging: 70 en Pressure 200) en trek de haarvaten van de ontworpen programma volgens het protocol van de fabrikant.
Opmerking: Een capillair eindigen met enkele micrometers diameter moet een 100 urn druppel vormen van applying een druk met ~ 10 kPa. Als het uiteinde van de capillair te klein is, veel hogere druk> 600 kPa, moet de druppel te verkrijgen, terwijl het moeilijk om de grootte van de druppels bedienen met een te grote capillaire uiteinde.
- De absorptie van fosfolipiden op de druppeloppervlak
Opmerking: Om een fosfolipide monolaag op het gebogen grensvlak van een druppelvorm, een fosfolipide-oplossing zonder kleurstof gelabeld fosfolipiden wordt gebruikt om een intensiteitscontrast verkrijgen tegen de vlakke monolaag, bereid door procedure 1. Bovendien beide procedures 2.2.1 en 2.2 0,2 zijn hier toegelaten. Wanneer geen nauwkeurige regeling van de vlaktedruk in het druppeloppervlak noodzakelijk, wordt sterk aanbevolen procedure 2.2.2. Indien niet, methode 2.2.1, wat een veel eenvoudiger wijze dan procedure 2.2.2, nuttig.- Proces van fosfolipiden bekleden bij een uiteinde
- Schoon een objectglaasje met behulp van aceton, ethanol en gedeioniseerd water minstens driemaal.
- Place van de taps toelopende capillair op een gereinigde dia glas, en kantel het capillair te faciliteren aanraken van de dia glas met een uiteinde.
- Drop een paar druppels van fosfolipiden oplossing (1 mg / ml) op het uiteinde van een capillair dat wordt gehecht aan het glaasje met een glazen spuit, en wacht tenminste 30 minuten volledig verdampen van het oplosmiddel.
Opmerking: Het wordt sterk aanbevolen om het uiteinde van het capillair het glaasje zich tijdens procedure 2.2.1.3 omdat de omtrek van het uiteinde te klein om de druppel van de fosfolipiden aan het uiteinde ooit aan capillaire kracht.
- Bereiding van een oplossing vesicle
- Reinigen van een flacon en verwijder het water uit de flacon, zoals geïntroduceerd in de procedure 1.1.1.1.
- Droog een volume 2 ml fosfolipide-oplossing (1 mg / ml) door toepassing van stikstofgas zacht en uitdrogen van het flesje gedurende 1 uur bij RT resterende oplosmiddel te verwijderen. Voer deze procedure in een zuurkast voor de veiligheid.
- Voeg 2ml gedeïoniseerd water in de flacon met gedroogde lipiden en incubeer de flacon in een oven bij 60 ° C gedurende 1 uur.
- Schud de flacon meerdere malen, en ultrasone trillingen (HF-frequentie: Tot 40 kHz, Vermogen: 370 W) gedurende 30 min om blaasjes te verkrijgen.
- Voer extrusie en vries-dooi processen om monodisperse unilamellaire vesicles te verkrijgen. De gedetailleerd protocol voor het bereiden van vesicles is beschreven in Mayer et al. 21.
Opmerking: oppervlakte druk van de druppel interface nauwkeurig geregeld door de wachttijd na het vormen van de druppel die monodisperse unilamellaire vesicles bevat. Met een hanger neerzetten 22, dient de verandering van oppervlaktedruk gemeten naar tijd vóór het doen van het experiment.
- Proces van fosfolipiden bekleden bij een uiteinde
- Vorming van een druppel die een fosfolipide monolaag op het gebogen oppervlak bevat
- Vul de tapse capillair met 10 pl gedeioniseerd water procedure 2.2.1. U kunt ook gebruik maken van 10 ul van het blaasje oplossing van de procedure 2.2.2.
- Sluit de capillair een geautomatiseerde micro-injector om de druk op de druppel vormen over.
- Monteer het capillair die is verbonden met een micro-injector een micromanipulator om de positie van de capillaire nauwkeurig te regelen.
- Bereid een helder veld microscoop (Microscope 1, objectief: 10x NA 0,3) voor het afbeelden van het zijaanzicht van het capillair met een CCD-camera. Microscoop 1 maakt het dus mogelijk om de precieze positie van de druppel langs de z-as waarnemen en schat de grootte van de druppel.
- Beweeg het uiteinde naar een positie waar het zijaanzicht van het uiteinde goed zichtbaar gemaakt door microscoop 1 met een micromanipulator en toepassen van een variabele druk (~ 100 hPa) met het uiteinde van de capillair, totdat een geschikte grootte (~ 100 urn in diameter) van de druppel wordt gevormd.
Opmerking: Het wordt aanbevolen dat geautomatiseerde micro-injector en micromanipulator worden gebruikd Indien fijnregeling van de druppelgrootte en de locatie van de druppel noodzakelijk. Het is ook mogelijk om handmatig degenen gebruiken.
3. Imaging Fluorescentie Herstel na Droplet samenvoegen
Opmerking: De grondbeginselen van dit protocol zijn identiek aan die van de FRAP techniek, met uitzondering van de drop coalescentie proces. De gedetailleerde protocol en de bijbehorende theorieën van FRAP zijn verkrijgbaar in A. Lopez et al. 15 en D. Axelrod et al. 16.
- En controleren van de locatie van de druppel
- Bereid een omgekeerde microscoop set (Microscope 2, objectief: 10x NA 0,3, buis lens: brandpuntsafstand van 17 cm) die zowel een fluorescentiemicroscoop maakt met een goede filter set voor Rhodamine-DPPEs (excitatie bij 560 nm, emissie bij 583 nm) en een helder veld microscoop. Gebruik maken van een CCD-camera hier voor het visualiseren van de top uitzicht op de druppel met een fluorescentiemicroscoop mode en een heldere-veld microscoop modus.
- Verplaats de druppel bekleed met een fosfolipide naar een vlakke lucht-water grensvlak langs de z-as, maar de druppel nog niet fuseren met behulp van de micromanipulator. Gebruik Microscoop 1 het zijaanzicht van de druppel te visualiseren.
- Plaats de druppel in het midden van het bovenaanzicht van de vlakke monolaag, met de micromanipulator. Gebruik de bright-field microscoop modus Microscoop 2 tot bovenaanzicht van platte monolaag visualiseren.
- Het samenvoegen van de druppel op de vlakke lucht-water-interface
- Verplaats de druppel verder in de richting van de flat-interface totdat de druppel overgaat op de interface, met behulp van de micromanipulator. Als het samenvoegproces stand is gebracht, een donker gebied met een cirkelvormige vorm die wordt omgeven door een witte achtergrond, waargenomen met de fluorescentie microscoop modus 2.
- Noteer de reeks fluorescerende beelden naar tijd na het samenvoegen van de druppel, met het fluorescentie wijze van Microsgaan 2. Gebruik een snellere frame rate dan de verspreiding tijdschaal van de monolaag hier. In DOPC monolaag, het duurt een paar minuten om te diffunderen in de 200 pm-donkere gebied volledig.
4. Vaststelling van de diffusiecoëfficiënt van Image Analysis
Opmerking: Om de diffusiecoëfficiënt bepalen van een reeks beelden, is aangepast programma voor beeldanalyse gebouwd zoals hieronder beschreven. Een gedetailleerde broncode van dit programma is beschikbaar in Jupiter website.
- Detectie van een cirkelvormig gebied van belang
- Detectie van het centrum van het gebied van belang
- Het verkrijgen van een reeks van fluorescerende beelden die zijn opgenomen tijdens een herstel proces dat een circulaire donkere en een witte achtergrond bevat, en zet de eerste afbeelding van de reeks als een referentiebeeld. Hier, R D is de straal van de donkere gebied van een referentie in.
- Convolute imago van de referentie met een witte cirkel diese intensiteit is uniform over een hele regio. Gebruik ingebouwde functie genaamd 'conv2' voor convolutie zoals in de broncode van het programma op maat lijn 124. Hier, de straal van de witte cirkel is iets kleiner dan R D.
- Zoek een positie die een minimale waarde in de convolutie berekening aangeeft, en stel deze positie als het centrum van de regio van belang in het referentiebeeld.
- Het bepalen van een straal van de regio van belang
- Convoluut het referentiebeeld met een witte cirkel die een middenstand, bepaald door een procedure 4,1 en uniforme intensiteit over een hele regio bevat. Hier, Rs is de straal van de witte cirkel. Gebruik iteratie zoals "voor" of "terwijl" de vergelijking van een cirkel de witte cirkel maken in de broncode van het programma op maat regel 102 tot 109.
- Convolute imago van de referentie met een witte cirkel die een iets heeftgrotere radius (5% -10%), R L, dan Rs. Dezelfde methode procedure 4.1.2.1 om de cirkel maken zoals in de broncode van het programma op maat regel 113 tot 120.
- Verkrijgen van het verschil in waarde tussen de twee convolutie berekeningen van 4.1.2.1 en 4.1.2.2.
- Herhaal de bovenstaande procedures van R S = R D / 2 R S = 2R D, door het vergroten van zowel de R S en R L met een pixel-niveau. Maak een iteratie dat hele broncodes van de procedure 4.1.2.1 bevat naar 4.1.2.3 te herhalen.
- Vind de straal van R S dat de maximale verschil in waarde tussen de twee convolutie berekeningen aangeeft. Met ingesloten functie met de naam 'max' om de straal te vinden geeft het maximale verschil in waarde, zoals aangegeven in de broncode van het programma op maat lijn 148 tot 149. Dit R S geeft dus de straal van de donkere gebied in het referentiebeeld.
- Berekening van een fractionele intensiteit
- Plaats een cirkel die een middenpositie en een straal, bepaald procedure 4,1 als een van belang bevat.
- Bereken de gemiddelde intensiteiten van het gebied van belang in een reeks fluorescentiebeelden naar tijd. Convolute elk frame met interessegebied en delen door specifieke regio's van belang zijn voor de gemiddelde intensiteit te berekenen. De gegevens zijn in de broncode van het aangepaste programma in Jupiter website.
- Bereken een fractionele intensiteit gedefinieerd als de volgende vergelijking, waarin F (t) de gemiddelde intensiteit van de cirkel die een van belang naar tijd, F i de oorspronkelijke intensiteit in de cirkel en Fo de intensiteit van een witte achtergrond.
f (t) = (F (t) - F i) / (F o - F i) (Vergelijking 1).
- Montage van de Fractional intensiteit FRAP theorie
- Monteer de fractionele intensiteit met de onderstaande vergelijking, waarbij τ is een karakteristieke diffusie tijd en ik 0, I 1 worden gewijzigd Bessel functies, met behulp van een passend programma, en het verkrijgen van τ
(Vergelijking 2). - Verkrijgen van een diffusiecoëfficiënt basis van de relatie, τ = a 2/4 D, waarbij D de diffusiecoëfficiënt en de straal van het donkere gebied.
Opmerking: Bij het aanpassingsproces is het mogelijk om de fractionele intensiteitsprofiel verschuiven langs een tijdsas waarop het herstelproces reeds begonnen is, voordat het opnemen van de beelden.
- Monteer de fractionele intensiteit met de onderstaande vergelijking, waarbij τ is een karakteristieke diffusie tijd en ik 0, I 1 worden gewijzigd Bessel functies, met behulp van een passend programma, en het verkrijgen van τ
- Detectie van het centrum van het gebied van belang
(Vergelijking 2). Representative Results
Een reeks van fluorescentie-beelden werden verkregen met de tijd tijdens het herstelproces na het samenvoegen van een druppel gecoat met een DOPC monolaag op een vlak DOPC monolaag, zoals vermeld in figuur 1. De DOPC monolaag op het vlakke lucht-water-interface werd gedoteerd met kleine hoeveelheden Rhodamine-DPPE en dit dus mogelijk gemaakt een achtergrond met een lichte kleur en een donker gebied nieuw in de vlakke-interface visualiseren. Er werd een herstelproces waargenomen bij 23 mN / m vaste oppervlaktedruk. Een geschikte van vergelijking 1 voor de verandering van fractionele intensiteit naar tijd is weergegeven in figuur 2. De R2 waarde van deze fit is 0,999 en het fit werkt nog goed, zelfs bij lagere of hogere drukken oppervlak. De diffusiecoëfficiënt van de DOPC monolaag verkregen uit deze fit was 27,54 urn 2 / sec bij 23 mN / m oppervlaktedruk.
Voor verdere validatie van de FRAM, diffusiecoëfficiënten van de DOPC en dipalmitoylfosfatidylcholine (DPPC) monolagen werden gemeten volgens oppervlaktedruk. Zoals getoond in figuur 3, FRAM vangt de snelle afname van de diffusiecoëfficiënt van de DPPC monolaag bij ~ 9 mN / m oppervlaktedruk, waarbij een LC (vloeistof gecondenseerd) - LE (vloeibare geëxpandeerd) faseovergang optreedt 10 en de waarden van diffusiecoëfficiënten zijn ook goed overeen met de eerder metingen door Peters et al. 19. Daarnaast werd een exponentieel verval van de diffusiecoëfficiënt van de oppervlaktedruk waargenomen in de DOPC monolaag en deze tendens is vrijwel identiek met die gemeten door Caruso et al. 12.
Figuur 1. (A) Schematische weergave van de FRAM (fluorescentie herstel na het samenvoegen) techniek. Als de lipid monolaag gecoat druppel wordt samengevoegd tot vlakke lucht-water-interface, de lipide monolaag zonder fluorescentie gelabeld lipide wordt in platte fluorescerende lipide monolaag geplaatst. (B) Fluorescentiemicroscoop beelden met de tijd tijdens het herstelproces van een DOPC monolaag bij 23 mN / m oppervlaktedruk (schaalbalk = 100 pm). De donkere gebied van de DOPC monolaag is volledig hersteld door de diffusie proces binnen enkele minuten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. fractionele intensiteit vs. tijd. Zwarte cirkels en de grijze gestippelde lijn geven de waarden van fractionele intensiteiten verkregen uit beeldanalyse (procedures 4.1 en 4.2) en de pasvorm van formule 1 aan de fractionele intensiteit met de tijd,getoond in procedure 4.3, respectievelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Diffusie coëfficiënten van DOPC (driehoek) en DPPC (leeg vierkantje) monolagen als functie van de vlaktedruk. De lijnen met de lichtgrijze kleur en de donkergrijze kleur geven de waarden van de diffusiecoëfficiënt eerder beschreven door Peters et al. en Caruso et al., resp. Dit cijfer is aangepast van Jeong et al. 23. Overgenomen met toestemming van Jeong et al. Langmuir. 30 (48), 14.369-14.374. Copyright 2014 American Chemical Society. Klik op haare om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
FRAM deelt veel grondbeginselen met FRAP, in het bijzonder voor het meten van fluorescentie herstel na het bleken van een bepaald gebied, maar FRAM maakt gebruik van een proces van het samenvoegen van een druppel op de platte interface naar een gebleekte gebied te vormen, in plaats van het toepassen van een intensief licht. Het samenvoegproces is dus belangrijkste stap in FRAM, en met name de vorm van de donkere vlek in het vlakke monolaag na het samenvoegen een druppel bepaalt de nauwkeurigheid van de meting diffusie. Specifiek, op basis van een huidige methode, stellen we alleen de cirkel met een straal R als een van belang om de gemiddelde intensiteit van de donkere vlek, getoond in procedure 4 berekenen en als er teveel afwijking van de cirkelvorm, Dit zou de precieze meting van een diffusiecoëfficiënt verstoren. Daarom is het noodzakelijk om een cirkelvormige donkere gebied te verkrijgen, maar niet-cirkelvormige vormen worden soms gevormd als gevolg van verschillende redenen. Ten eerste, als er een convectieve stroming in de Petri schotel, de vorm van het donkere gebied wordt uitgerekt langs de stroomrichting. Zoals vermeld in proces 1,3, een kegelvormige inrichting helpt de convectieve stroming te onderdrukken en deze rek zal worden geminimaliseerd. Ten tweede, indien het uiteinde van de capillaire raakt het vlakke weergegeven tijdens een fusieproces, wordt het donkere gebied gevormd met een verscheidenheid aan vormen sinds capillairuiteinde onderbreekt het samenvoegproces. Door het verkrijgen van een druppel die alleen opknoping vanaf het uiteinde van de capillair, kan deze onderbreking voorkomen. Vooral een hydrofobe behandeling van het capillair helpt de druppel te zitten aan het einde van het capillair. Daarom boven moeite schietpartijen en wijzigingen stellen ons in staat om de verspreiding eigenschappen nauwkeuriger te meten.
Deze goed troubleshot proces maakt het dus mogelijk FRAM om een aantal belangrijke voordelen ten opzichte van FRAP. Ten eerste FRAM vereist eenvoudigere apparatuur opzichte FRAP. Voor FRAM, volstaat een eenvoudige fluorescentie micros gebruikengaan, in plaats van een dure confocale microscoop met een hoog vermogen laser waarvan de golflengte moet overeenkomen met het absorptiespectrum van de kleurstof. Bovendien is het noodzakelijk om aanvullende inrichting te gebruiken om de grootte van het gebleekte gebied in de FRAP regelen terwijl het FRAM bepaalt de grootte van het gebied gemakkelijk door de omvang van de druppel, of oppervlaktedruk op druppeloppervlak. Ten tweede is het mogelijk verschillende soorten kleurstoffen gebruiken FRAM. FRAP gebruikt alleen kleurstofmoleculen waarvan bleekproces is veel sneller dan het diffusieproces. Indien tijdens het bleekproces de diffusie van de kleurstoffen plaatsvindt, is het moeilijk om de woning diffusie nauwkeurig te schatten. Het FRAM echter niet nodig een werkwijze voor het bleken van kleurstoffen en dit maakt het aldus mogelijk het gebruik van verschillende soorten kleurstoffen in de fluorescentiebeeldvorming. Bovendien, de FRAP vereist extra hoogvermogen lasers en filtersets om de kleurstof species te veranderen, terwijl het slechts noodzakelijk de filtersets vervangen in het FRAM. EindelijkAangezien de monolagen van het druppeloppervlak en de vlakke-interface kan onafhankelijk worden gevormd, waardoor de studie van inter-diffusie mogelijk of menging van twee lipide monolagen door het samenvoegen A-monolaag B-type monolaag, terwijl de FRAP meet alleen de zelfdiffusie van een monolaag.
Ondanks deze voordelen, kan het proces van het samenvoegen van een druppel op een vlakke lucht-water-interface mogelijk deze techniek te beperken als gevolg van een aantal problemen die van belang zou kunnen zijn, zoals een oppervlakte druk mismatch tussen de twee monolagen, de tijdschaal van de fuserende proces en een verhoging van de oppervlaktedruk van de vlakke monolaag na het samenvoegen druppels. Deze kwesties, maar hebben geen invloed op de verspreiding meten aanzienlijk om de volgende redenen. Ten eerste, alhoewel de oppervlaktedrukken op twee monolagen zijn nogal verschillend wordt een equilibratie voltooid in een vroeg stadium tijdens het herstelproces. Bijvoorbeeld, als tHij oppervlaktedruk van de monolaag op het druppeloppervlak hoger dan die van de monolaag op het vlakke lucht-water grensvlak, het donkere gebied expandeert totdat de vlaktedruk in evenwicht. Aangezien dit proces is voltooid binnen 10 ms, zal de oppervlakte druk worden in evenwicht gebracht voordat deze van invloed op de diffusie proces aanzienlijk. Ten tweede, als de tijdschaal van de fuserende proces is snel genoeg, is het niet de diffusie meting helemaal beperken. Gelukkig is een typische samensmelting proces ook voltooid binnen 10 msec. Tenslotte, zelfs meerdere samenvoeging van de druppels op de vlakke-interface kan de oppervlaktedruk, omdat het oppervlaktegebied van de goot niet te verhogen is veel groter dan het oppervlak van de druppel. Volgens de afmetingen van de goot en de druppels in het protocol beschreven, de oppervlakte per molecuul toeneemt minder dan 0,015% door het samenvoegen van een druppel. Dienovereenkomstig, de toename van vlaktedruk door de verandering van de oppervlakte per molecuul kleiner is dan 0,1%, wat negligible omdat het veel kleiner is dan de typische fout in oppervlaktedruk, gemeten Wilhelmy plaat tensiometer.
Samengevat hebben we een nieuwe methode om de laterale diffusie eigenschap van een fosfolipide monolaag meten door het samenvoegen van een druppel monolaag op de platte-interface geïntroduceerd. Deze techniek vereist relatief eenvoudige apparatuur en maakt ook het gebruik van verschillende soorten kleurstof species. Het FRAM is dus potentieel toepasbaar voor diffusiemeting van elke oppervlakteactieve stoffen, waaronder fosfolipiden, blokcopolymeren, eiwitten en zelfs nanodeeltjes in een vloeistof-vloeistof interface. Verder verwachten we dat de FRAM biedt een nieuwe manier om de inter-verspreiding of vermenging tussen twee verschillende oppervlakte-actieve stoffen te bestuderen.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door de KAIST gefinancierde K-Valley RED & B Project voor 2014 en de Basic Science Research Program door de National Research Foundation Korea (NRF- 2012R1A6A3A040395, NRF-2013R1A1A2057708, NRF- 2012R1A1A1011023).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | OCI corporation | Acetone 3.8L Extra Pure | Purity: ≥ 99.5%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. |
| Ethanol | OCI corporation | Ethanol 3.8L Extra Pure | Purity: ≥ 94%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. |
| Dioleoylphosphatidylcholine, DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Chloroform is carcinogenic. |
| Chloroform | LiChrosolv | Chloroform ultrapure (A3633) | Purity: ≥ 99.8%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Carcinogenic |
| Rhodamine DPPE | Avanti Polar Lipids | 810158C, 810158P | Avoid direct light exposure to prevent photobleaching |
| Wilhelmy plate tensiometer | R&K ultrathin organic film technology | Wilhelmy tensiometer | http://www.rieglerkirstein.de/index.htm |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P-1000 | |
| Micro-injector | Eppendorf | Femtojet | |
| Micromanipulator | Eppendorf | Micromanipulator 5171 | |
| Microscope 1 | Objective lens: Olympus | Objective lens: UPlanFl 10x | Objective lens: 10X NA 0.3 |
| Microscope 2 | Objective lens: Olympus, Tube lens: Thorlabs | Objective lens: UPlanFl 10x | Objective lens: 10X NA 0.3, tube lens: focal length 17 cm |
| CCD for Microscope 1 | Jai | CV 950 camera | |
| CCD for Microscope 2 | Andor | iXon3 EMCCD | |
| Filter set | Chroma technology | Catalog Set 49004: ET545, T565, ET605 | Prepare suitable for dye molecules |
| Sonicator | DAIHAN Scientific | Wiseclean WUC-D06H |
References
- Van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (2), 112-124 (2008).
- Christon, R., Even, V., Daveloose, D., Léger, C. L., Viret, J. Modification of fluidity and lipid—protein relationships in pig intestinal brush-border membrane by dietary essential fatty acid deficiency. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 980 (1), 77-84 (1989).
- Stubbs, C. D., Smith, A. D. The modification of mammalian membrane polyunsaturated fatty acid composition in relation to membrane fluidity and function. Biochim. Biophys. Acta - Rev. Biomembr. 779 (1), 89-137 (1984).
- Holthuis, J. C. M., Menon, A. K. Lipid landscapes and pipelines in membrane homeostasis. Nature. 510 (7503), 48-57 (2014).
- Alonso, C., Waring, A., Zasadzinski, J. A. Keeping lung surfactant where it belongs: protein regulation of two-dimensional viscosity. Biophys. J. 89 (1), 266-273 (2005).
- Kim, K., Choi, S. Q., Zell, Z. a, Squires, T. M., Zasadzinski, J. A. Effect of cholesterol nanodomains on monolayer morphology and dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.). 110 (33), E3054-E3060 (2013).
- Hormel, T. T., Kurihara, S. Q., Brennan, M. K., Wozniak, M. C., Parthasarathy, R. Measuring Lipid Membrane Viscosity Using Rotational and Translational Probe Diffusion. Phys. Rev. Letters. 112 (18), 188101 (2014).
- Ding, J., Warriner, H. E., Zasadzinski, J. a, Schwartz, D. K. Magnetic needle viscometer for Langmuir monolayers. Langmuir. 18 (13), 2800-2806 (2002).
- Dhar, P., Cao, Y., Fischer, T. M., Zasadzinski, J. A. Active interfacial shear microrheology of aging protein films. Phys. Rev. Letters. 104 (1), 1-4 (2010).
- Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Interfacial microrheology of DPPC monolayers at the air-water interface. Soft Matter. 7 (17), 7782-7789 (2011).
- Choi, S. Q., Steltenkamp, S., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Active microrheology and simultaneous visualization of sheared phospholipid monolayers. Nature Commun. 2 (5), 312 (2011).
- Caruso, F., et al. Determination of lateral diffusion coefficients in air-water monolayers by fluorescence quenching measurements. J. Am. Chem. Soc. 113 (16), 4838-4843 (1991).
- Filippov, A., Orädd, G., Lindblom, G. The effect of cholesterol on the lateral diffusion of phospholipids in oriented bilayers. Biophys. J. 84 (5), 3079-3086 (2003).
- Schwille, P., Korlach, J., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy with single-molecule sensitivity on cell and model membranes. Cytometry. 36 (3), 176-182 (1999).
- Lopez, A., Dupou, L., Altibelli, A., Trotard, J., Tocanne, J. F. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments under conditions of uniform disk illumination. Critical comparison of analytical solutions, and a new mathematical method for calculation of diffusion coefficient D. Biophys. J. 53 (6), 963-970 (1988).
- Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).
- Vaz, W. L., Clegg, R. M., Hallmann, D. Translational diffusion of lipids in liquid crystalline phase phosphatidylcholine multibilayers. A comparison of experiment with theory. Biochemistry. 24 (3), 781-786 (1985).
- Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. Lateral diffusion in phospholipid multibilayers measured by fluorescence recovery after photobleaching. Biochemistry. 16 (17), 3836-3841 (1977).
- Peters, R., Beck, K. Translational diffusion in phospholipid monolayers measured by fluorescence microphotolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.). 80 (23), 7183-7187 (1983).
- Kuhn, H., Mobius, D., Bucher, H. Physical Methods of Chemistry. Crawley, J. N., et al. 1, Part 3B, 651-653 (1972).
- Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 858 (1), 161-168 (1986).
- Rotenberg, Y., Boruvka, L., Neumann, A. Determination of surface tension and contact angle from the shapes of axisymmetric fluid interfaces. J. Colloid Interface Sci. 93 (5), 169-183 (1983).
- Jeong, D. W., Kim, K., Lee, S., Choi, M. C., Choi, S. Q. Fluorescence recovery after merging a surfactant-covered droplet: a novel technique to measure the diffusion of phospholipid monolayers at fluid/fluid interfaces. Langmuir. 30 (48), 14369-14374 (2014).
