Introduction
Fosfolipider är huvudkomponenter i cellmembran och membranen i organeller, och fluiditeten av dessa membranskikt påverkar ofta cellulära funktioner genom att förändra aktiviteten av membranproteiner 1 - 3. Exempelvis membran lipidhomeostas uppnås genom att reglera membranets fluiditet, som detekteras av membranproteiner, och en onormal nivå av fluiditet orsakar allvarliga sjukdomar, såsom leversteatos och kolestas 4. Dessutom fluiditet av en fosfolipid monoskikt vid luft alveolerna vätska gränssnitt har viktiga implikationer i dess funktioner. Hög fluiditet hos lungsurfaktant fosfolipid monoskikt underlättar spridning av skiktet under inhalering, medan en låg fluiditet möjliggör skiktet att hålla sig inom alveolerna under utandning 5,6. Det är således viktigt att uppskatta fluiditet av fosfolipiden skikten för att förstå deras roller.
_content "> En direkt mått på fluiditeten är viskositeten, och viskositeten hos fosfolipid skikt har mätts med användning av mikrometerstorlek kolloider 7, magnetiska nålar 8,9 och magnetiska mikroknappar 6,10,11. Emellertid är dessa tekniker är begränsade till relativt stela filmer, och kan inte mäta mindre viskösa filmer. För sådana fall skulle diffusivitet vara ett alternativ att kvantifiera fluiditet av fosfolipid skikt. Under flera decennier, har en mängd olika tekniker för att mäta diffusionsegenskaper av fosfolipid skikt utvecklats, såsom fluorescensutsläckning metod 12, pulsad fältgradient NMR 13 och fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) 14. En av de mest representativa metoderna är fluorescens återhämtning efter fotoblekning (FRAP) 15,16. På grund av enkelheten i mätproceduren och tillhörande teorier, flera studier på diffusionsegenskaper av fosfolipid skikt har utförts med hjälp av FRAPHär presenterar vi en ny teknik för att mäta lateral diffusion av fosfolipid monolager, betecknas som fluorescens återhämtning efter sammanslagning (FRAM). Den huvudsakliga skillnaden mellan FRAP och FRAM är att fotoblekning steget ersättas med drop sammansmältning. Sammanfoga en droppe som omfattas av icke-fluorescens monolager på en fluorescensmärkt platt monolager lämnar en cirkulär mörk fläck på en ljus lägenhet monolager, vilket inrätta samma initialtillstånd med fotoblekning steget. Vi följer sedan fluorescens återhämtning i mörk fläck med tiden för att mäta sido diffusiviteten. Denna nya "blekning" steg för droppe koalescens ger betydande fördelar jämfört FRAP: FRAM kräver endast ett fluorescensmikroskop snarare än en dyr konfokalmikroskop med en högeffekts laser som är nödvändig för FRAP. Jagn Dessutom har FRAM ett brett utbud av fluorescens färgämnen eftersom det inte innebära att fotoblekning processen. Slutligen, de två olika mono, en droppe monolager och en platt monolager, kan framställas oberoende av varandra, vilket gör interdiffusion som skall mätas, medan FRAP mäter endast självdiffusion av monolager.
FRAM erbjuder ett brett utbud av diffusion mätningar från högviskösa material till nästan friktionsfri material. I princip kan FRAM mäta den maximala diffusivitet 10 6 pm 2 / sek, vilket är jämförbart med existerande tekniker, när diffusion sker över området 100 pm med 100 um under tiden för drop sammansmältning processen (~ 10 ms). Dessutom kan långsam diffusionsprocess lätt mätas om monolager är fasta. FRAM kan användas för alla typer av ytaktiva ämnen så länge som lämpliga fluorescerande taggade molekyler är tillgängliga.
Protocol
Varning: Se säkerhetsdatablad (SDB) före användning av aceton och kloroform som är cancerframkallande.
1. Framställning av Phospholipid Monolayer på en platt luft vatten Interface
- Bildandet av en fosfolipid monoskikt
- Framställning av en fosfolipidlösning
- Rengör en 4 ml ampull med en polytetrafluoreten belagd lock med användning av aceton, etanol och avjoniserat vatten vid minst tre gånger, och blåser kvävgas noggrant in i flaskan för att bli av vatten.
- Lös 1 mg fosfolipid (t.ex. dioleoylfosfatidylkolin, DOPC) till 1 ml kloroform i flaskan för att erhålla 1 mg / ml koncentration. Utför den här proceduren i ett dragskåp för säkerheten. Använd lägre eller högre koncentrationer av fosfolipidlösning vid behov.
- Lägg färgämne taggade fosfolipider (t.ex., rodamin dipalmitoylfosfatidyletanolamin, rodamin DPPE) med mindre än 1 mol-% av fosfolipiden lösningarning, för att visualisera den fosfolipid monoskiktet med ett fluorescensmikroskop. Utför den här proceduren i ett dragskåp för säkerheten.
- Wrap flaskan med en polytetrafluoreten tejp för att förhindra lösningsmedelsavdunstning, och lagra provet i en frys vid -20 ° C.
- Avsättning av fosfolipider på luft-vattengränsytan
- Rengör en petriskål (55 mm i diameter och 12 mm i höjd) med etanol, och avjoniserat vatten vid minst tre gånger.
- Fyll petriskål med 10 ml avjoniserat vatten för att skapa en luft-vatten-gränsytan.
- Sprid några mikroliter av fosfolipidlösningen med en mikrospruta på en ren gränssnitt för att uppnå önskat yttryck och vänta minst 30 minuter för att avdunsta lösningsmedlet fullständigt, innan du gör försöket.
Observera: Ett Langmuir tråg kan användas i stället för en petriskål om exakt kontroll av yttryck som är nödvändigt.
- Framställning av en fosfolipidlösning
- Surface tryckmätning
- Mät yttrycket av fosfolipiden monoskiktet med en Wilhelmy platta tensiometer. Vänta minst 30 minuter för att få filterpapper fuktade nog om filterpapper används som Wilhelmy platta. Den detaljerat protokoll finns i Kuhn et al. 20.
- Justera den deponerade mängden av fosfolipiden för att reglera yttrycket exakt. Tillsätt 4 | il av DOPC-lösning (1 mg / ml) på 30,25 cm 2 -area av gränssnittet om ~ 5 mN / m av yttryck krävs.
Obs: Om filterpappret inte är helt vätt, ändrar yttryck dramatiskt under de första 30 min av försöket på grund av att viktförändringen av filterpapper.
- Minimering av det konvektiva flödet av monoskiktet
- Använd en konformad apparatur som innehåller en 3 mm behållaren med två tunna kanaler, ansluten till en stor del av petriskålen, för att undertrycka den konvektiva flödet avmonoskiktet, vilket kan störa morfologin avbildning och yttryck mätning.
- Se till att matcha vattennivåerna mellan insidan och utsidan av konform apparat för att säkerställa att fosfolipider röra sig fritt över hela regionen innan de deponerar fosfolipider på luft-vattengränsytan.
2. Framställning av Phospholipid Monolayer på den krökta ytan av en droppe
- Avsmalnande processen för en glaskapillär använder mikropipett avdragare
- Placera en glaskapillär (od 1 mm, id 0,78 mm, längd 100 mm) på en kapillär innehavare av en mikropipett avdragare.
- Utforma ett program för att dra kapillärerna med lämpliga parametervärden (Heat: Ramp, Pull: 60, Vel: 70, Fördröjning: 70 och tryck 200) och dra kapillärerna med utformat program enligt tillverkarens protokoll.
Obs: En kapillär avslutas med några mikrometer diameter är nödvändig för att bilda en 100 pm-droppe av applying ett tryck med ~ 10 kPa. Om spetsänden av kapillären är för liten, mycket högre tryck,> 600 kPa, krävs för att få den lilla droppen, medan det är svårt att kontrollera storleken på de små dropparna med en för stor kapillär spetsände.
- Absorption av fosfolipider på droppytan
Obs: Att bilda en fosfolipid monoskikt vid den böjda gränsytan mellan en droppe, en fosfolipid lösning utan färgämne taggade fosfolipider används för att erhålla en intensitets kontrast mot den platta mono, framställd genom förfarande 1. Dessutom båda förfarandena 2.2.1 och 2.2 0,2 är tillåtna här. Om exakt styrning av yttrycket vid droppytan är nödvändig, är proceduren 2.2.2 rekommenderas. Men om det inte, förfarande 2.2.1, vilket är ett mycket enklare sätt än förfarandet 2.2.2, är användbar.- Beläggningsprocessen av fosfolipider vid en spetsände
- Rengör ett objektglas med användning av aceton, etanol och avjoniserat vatten vid minst tre gånger.
- Pless den avsmalnande kapillären på ett rengjort objektglas, och luta kapillären för att underlätta att vidröra objektglas med en spetsände.
- Släppa några droppar av fosfolipid-lösning (1 mg / ml) på spetsänden av en kapillär som är vidhäftat till objektglaset med hjälp av en glasspruta, och vänta minst 30 min för att förånga lösningsmedlet fullständigt.
Obs: Det rekommenderas starkt att vidhäfta spetsänden av kapillären till objektglaset under förfarandet 2.2.1.3 eftersom omkretsen på spetsänden är för liten för att hålla droppen av fosfolipiderna vid spetsänden endast genom kapillärkraft.
- Framställning av en vesikel lösning
- Rengör en flaska och ta bort vatten från flaskan, som infördes i förfarandet 1.1.1.1.
- Torka en 2 ml volym av fosfolipid-lösning (1 mg / ml) genom att applicera kvävgas försiktigt och uttorka flaskan under 1 h vid RT för att eliminera eventuellt kvarvarande lösningsmedel. Utför den här proceduren i ett dragskåp för säkerheten.
- Tillsätt 2ml avjoniserat vatten i flaskan innehållande torkade lipider, och inkubera ampullen i en ugn vid 60 ° C under 1 timme.
- Skaka flaskan flera gånger, och sonikat (HF-frekvens: Upp till 40 kHz, Effekt: 370 W) under 30 minuter för att få blåsor.
- Utför extrudering och frys-tö processer för att erhålla monodispersa enlamellvesiklar. Den detaljerade protokoll för att förbereda vesiklar beskrivs i Mayer et al. 21.
Obs: Yttryck av droppen gränssnittet styrs exakt genom att justera väntetiden efter bildning av små droppar som innehåller monodispersa unilamellära vesiklar. Med hjälp av en hängande droppe metod 22, är det nödvändigt att mäta förändringen av yttrycket efter tid, innan du gör experimentet.
- Beläggningsprocessen av fosfolipider vid en spetsände
- Bildandet av en droppe som innehåller en fosfolipid monoskikt på den krökta ytan
- Fyll i den avsmalnande kapillären med 10 | il avjoniserat vatten från procedure 2.2.1. Alternativt kan du använda 10 ìl av vesikler lösning från förfarandet 2.2.2.
- Anslut kapillär till en automatiserad mikro-injektor för att tillhandahålla tryck för att bilda droppen.
- Montera kapillären som är ansluten till en mikro-injektor till en mikromanipulator för att styra läget av kapillären exakt.
- Förbered en ljusfältmikroskop (Mikroskop 1, objektivlins: 10X NA 0,3) för avbildning av lateral vy av kapillären med en CCD-kamera. Mikroskop 1 möjliggör sålunda att observera den exakta positionen för droppens längs z-axeln och uppskatta storleken på droppen.
- Flytta spetsänden till ett läge där den sidovy av spetsänden är väl visualiseras genom Mikroskop 1 under användning av en mikromanipulator, och applicera ett variabelt tryck (~ 100 hPa) med spetsänden av kapillären, tills en lämplig storlek (~ 100 ^ m i diameter) av droppen bildas.
Obs: Det rekommenderas att automatiserad mikro injektor och mikromanipulator vara användningd, om finreglering av droppstorleken och placeringen av droppen är nödvändigt. Det är också möjligt att använda manuella sådana.
3. Imaging fluorescens återhämtning efter Dropp Sammanslagning
Obs: De grundläggande principerna för detta protokoll är identiska med dem i FRAP teknik, med undantag för fall sammansmältning processen. De detaljerade protokoll och tillhörande teorier om FRAP finns i A. et al. Lopez 15 och D. Axelrod et al. 16.
- Övervakning och styrning av läget för dropp
- Förbered ett inverterat mikroskop set (Mikroskop 2, objektiv: 10X NA 0,3, tublinsen: brännvidd 17 cm) som möjliggör både en fluorescensmikroskop med en ordentlig filteruppsättning för Rhodamine-DPPEs (excitation vid 560 nm, emission vid 583 nm) och ett ljust fält mikroskop. Använd en CCD-kamera här för att visualisera de bästa utsikt över droppen med ett fluorescensmikroskop mode och ett mikroskop läge ljusfält.
- Flytta droppen belagt med en fosfolipid till en platt luft-vattengränsytan längs z-axeln, men inte sammanfoga droppen ännu, med användning mikromanipulator. Använd Mikroskop 1 att visualisera sidovy av droppen.
- Lokalisera droppen vid centrum av vyn uppifrån i den platta monoskiktet, med hjälp av mikromanipulator. Använd ljusfältsmikroskop sättet Mikroskop 2 att visualisera toppvy av platta monoskikt.
- Sammanslagning droppen på den platta luft-vattengränsytan
- Flytta droppen ytterligare mot den plana gränssnittet tills droppen övergår på gränssnittet, med hjälp av mikromanipulator. Om sammanslagningen processen görs framgångsrikt, en mörk region med en cirkulär form som är omgiven av en vit bakgrund, observeras med användning av fluorescenssättet Mikroskop 2.
- Anteckna serie fluorescerande bilder beroende på tid efter sammanslagning droppen, med hjälp av fluorescensläge Microsklara 2. Använd en snabbare bildfrekvens än diffusion tidsskalan av monoskiktet här. I DOPC monolager, det tar några minuter att diffundera in i 200 nm-mörka området helt.
4. Fastställande av diffusionskoefficienten genom bildanalys
Obs: För att bestämma diffusionskoefficienten från en serie bilder är anpassat program för bildanalys byggd som beskrivs nedan. En detaljerad källkod med detta program är tillgänglig i JUPITER hemsida.
- Detektion av en cirkulär region av intresse
- Detektion av centrum av regionen av intresse
- Skaffa en serie av fluorescerande bilder som har spelats in under en återvinningsprocess som innehåller ett cirkulärt mörkt område och en vit bakgrund, och ställa in den första bilden i serien som en referensbild. Här är R D radien hos det mörka området i en referensbild.
- Convolute referensbilden med en vit cirkel somse intensiteten är likformig över en hel region. Använd inbäddade funktion som heter "conv2" för faltning som visas i källkoden för den anpassade programraden 124. Här är radien av den vita cirkeln något mindre än R D.
- Hitta en position som indikerar ett minimivärde i beräkningen faltning, och ställa denna position som centrum för regionen av intresse i referensbilden.
- Bestämning av en radie av regionen av intresse
- Convolute referensbilden med en vit cirkel som innehåller ett mittläge, bestäms genom ett förfarande 4.1 och enhetlig intensitet över en hel region. Här är R S radien hos den vita cirkeln. Använd iteration som "för" eller "medan" med ekvationen för en cirkel för att göra den vita cirkeln som visas i källkoden för den anpassade programraden 102-109.
- Convolute referensbilden med en annan vit cirkel som har en någotstörre radie (5% -10%), R L, än R-S. Använd samma metod med förfarande 4.1.2.1 att göra cirkeln som visas i källkoden för den anpassade programraden 113-120.
- Skaffa skillnaden i värde mellan de två utbuktning beräkningar av 4.1.2.1 och 4.1.2.2.
- Upprepa ovanstående procedurer från R S = R D / 2 R S = 2R D, genom att öka både R S och R L med en pixelnivå. Gör en iteration som innehåller hela källkoder från förfarande 4.1.2.1 till 4.1.2.3 att upprepa.
- Hitta radie R S som anger den maximala skillnaden i värde mellan de två utbuktning beräkningarna. Använd inbäddade funktion som heter "max" för att hitta radien anger den maximala skillnaden i värde som visas i källkoden för den anpassade programraden 148 till 149. Denna R S alltså indikerar radie det mörka området i referensbilden.
- Beräkning av en fraktions intensitet
- Ställ in en cirkel som innehåller ett mittläge och en radie, som bestäms av proceduren 4,1 som en region av intresse.
- Beräkna de genomsnittliga intensiteter av regionen av intresse i en serie av fluorescensbilder beroende på tid. Convolute varje ram med regionen av intresse och dividera det med område regionen av intresse för att beräkna den genomsnittliga intensitet. Detaljerna finns i källkoden för den anpassade program som finns tillgängligt i JUPITER webbplats.
- Beräkna en fraktionerad intensitet, definierad som nedanstående ekvation, där F (t) är den genomsnittliga intensiteten i den cirkel som är en region av intresse i enlighet med tiden, F ^ är den initiala intensiteten i cirkeln, och Fo är intensiteten hos en vit bakgrund.
f (t) = (F (t) - F ^) / (Fo - F ^) (ekvation 1).
- Montering av fractional intensitet till FRAP teori
- Montera bråk intensitet med ekvationen nedan, där τ är en karakteristisk diffusionstid och jag 0, I 1 modifieras Besselfunktioner, med hjälp av en passande program, och få τ
(Ekvation 2). - Skaffa en diffusionskoefficient baseras på relationen, τ = a 2/4 D, där D är diffusionskoefficienten och är radien för det mörka området.
Not: Under utprovningsprocessen, är det möjligt att skifta fraktionerad intensitetsprofilen längs en tidsaxel när återhämtningen redan har påbörjats, innan inspelning bilderna.
- Montera bråk intensitet med ekvationen nedan, där τ är en karakteristisk diffusionstid och jag 0, I 1 modifieras Besselfunktioner, med hjälp av en passande program, och få τ
- Detektion av centrum av regionen av intresse
(Ekvation 2). Representative Results
En serie av fluorescens bilder erhölls med tiden under återhämtningsprocessen efter sammanslagning en droppe belagd med en DOPC monolager på en plan DOPC monolager, som anges i figur 1. Den DOPC monolager enligt en schablon luft-vatten gränsytan dopad med små mängder Rodamin-DPPE, vilket därmed gjort det möjligt att visualisera en bakgrund med en ljus färg och en mörk region som nyligen lagts till i plana gränsytan. Där var en återhämtningsprocess observerades vid 23 mN / m fast yttryck. En passning av ekvation 1 till förändringen av bråk intensitet beroende på tid visas i Figur 2. Värdet R2 i denna passformen är 0,999, och detta passar fortfarande fungerar bra även vid lägre eller högre yttryck. Diffusionskoefficienten av DOPC monoskiktet som erhållits från denna passning var 27,54 pm 2 / s vid 23 mN / m yttryck.
För ytterligare validering av FRAM, diffusionskoefficienter av DOPC och dipalmitoylfosfatidylkolin (DPPC) monoskikt mättes enligt yttryck. Såsom visas i fig 3, fångar FRAM den snabba minskningen av diffusionskoefficienten för DPPC monoskikt på ~ 9 mN / m av yttryck, där en LC (vätska kondenserad) - LE (flytande expanderade) fasövergång inträffar 10, och värdena på diffusionskoefficienter är också överens väl med de tidigare mätningarna av Peters et al. 19. Dessutom gjordes en exponentiell avklingning av diffusionskoefficienten med yttrycket observeras i DOPC monoskiktet, och denna tendens är nästan identisk med den en uppmätt med Caruso et al., 12.
Figur 1. (A) Schematisk illustration av FRAM (fluorescens återhämtning efter sammanslagning) teknik. Som läppenid monoskikt belagda droppe samman till platt luft-vatten gränsytan, taggade lipidmonolager utan fluorescens lipid sätts in platta fluorescerande lipidmonolager. (B) fluorescensmikroskop bilder med tid under återhämtningsprocessen av en DOPC monolager på 23 mN / m yttryck (skala bar = 100 nm). Den mörka regionen av DOPC monoskiktet helt avbetalda genom diffusionsprocessen inom några minuter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Fractional intensitet mot tid. Svarta cirklar och grå streckade linjen visar värdet av bråk intensiteter som erhållits från bildanalys (förfaranden 4.1 och 4.2) och anpassning av ekvationen 1 till bråk intensiteter med tiden,visas i förfarandet 4.3, respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. diffusionskoefficienter av DOPC (triangel) och DPPC (tom ruta) monolager som en funktion av yttryck. Linjerna med ljusa grå färg och med mörkgrå färg anger värden diffusionskoefficienten tidigare rapporterats av Peters et al. och Caruso et al., respektive. Denna siffra har ändrats från Jeong et al. 23. Återges med tillstånd från Jeong et al. Langmuir. 30 (48), 14369-14374. Copyright 2014 American Chemical Society. Klicka hennee att se en större version av denna siffra.
Discussion
FRAM delar en hel del grundläggande principer med FRAP, särskilt för mätning av fluorescens återhämtning efter blekning ett visst område, men FRAM använder en process att slå samman en droppe på den plana gränsytan för att bilda ett blekt område, i stället för att tillämpa ett intensivt ljus. Sammanslagningen Processen är därför det viktigaste steget i FRAM, och framför allt, formen av den mörka fläcken på den platta monoskiktet efter sammanslagning en droppe bestämmer noggrannheten i diffusiviteten mätningen. Specifikt, på grundval av en aktuell metod, endast ställa vi cirkeln med en radie R som en region av intresse för att beräkna medelintensiteten av den mörka fläcken, som visas i procedur 4, och om det finns en alltför stor avvikelse från den cirkulära formen, detta skulle störa den exakta mätningen av en diffusionskoefficient. Därför är det nödvändigt att erhålla en cirkulärt format mörka området, men, icke-cirkulära former bildas ibland på grund av flera skäl. Först, om det existerar en konvektivt flöde i PETri maträtt, formen på det mörka området blir utsträckt längs riktningen för flödet. Som nämnts i förfarande 1,3, hjälper en kon-form anordningen för att undertrycka det konvektiva flödet, och detta töjning skulle minimeras. För det andra, om spetsänden av kapillären vidrör den plana gränsytan under en sammanslagning process är mörkt område som bildas med en mängd olika former, eftersom kapilläränden avbryter sammanslagning processen. Genom att erhålla en liten droppe som bara hänger från slutet av kapillären, kan detta avbrott förhindras. I synnerhet har en hydrofob behandling av kapillären hjälper droppen att sitta i slutet av kapillären. Därför ovanstående problem skottlossning och modifieringar ger oss möjlighet att mäta diffusionsegenskaper mer exakt.
Denna väl utfört felsökning process tillåter således FRAM ha flera betydande fördelar jämfört med FRAP. Först kräver FRAM enklare utrustning jämfört med FRAP. För FRAM, är det tillräckligt att använda en enkel fluorescens microsklara, i stället för en dyr konfokalmikroskop med en högeffekts laser vars våglängd måste matcha med absorptionsspektrumet av färgämnet. Dessutom är det nödvändigt att använda ytterligare anordning för att justera storleken på det blekta området FRAP, medan FRAM styr storleken på området lätt genom att justera storleken på droppen, eller yttrycket vid droppytan. För det andra är det möjligt att använda olika arter av färgämnen i FRAM. FRAP använder enbart färgmolekyler vilkas blekprocess är mycket snabbare än diffusionsprocessen. Om diffusionen av färgämnena sker under blekningsprocessen, är det svårt att uppskatta diffusionen egenskapen exakt. Den FRAM emellertid inte kräver ett förfarande för blekning färgämnen och detta möjliggör således användningen av olika typer av färgämnen i fluorescensavbildning. Dessutom kräver FRAP ytterligare hög effekt lasrar och filteruppsättningar för att ändra färg arter, medan det endast är nödvändigt att byta ut filteruppsättningar i FRAM. SlutligenEftersom monolagren på droppytan och den plana gränssnittet kan bildas oberoende, vilket möjliggör studier av inter-diffusion eller blandning mellan två olika lipidmonoskikt genom en sammanslagning av A-typ monoskikt till B-typ monolager, medan FRAP mäter endast själv diffusion av ett monoskikt.
Trots dessa fördelar, kan processen att slå samman en droppe på en plan luft-vatten gränsytan potentiellt begränsa denna teknik på grund av flera frågor som kan vara av intresse, såsom en yttryck obalans mellan de två mono, tidsskala sammanslagningen processen , och en ökning i yttrycket av den platta monoskiktet efter sammanslagning droppar. Dessa frågor, dock inte påverkar diffusion mätningen betydligt av följande skäl. Först, även om yttrycken vid de två olika mono är helt olika, är en jämviktsprocess avslutats på ett mycket tidigt stadium under återställningsprocessen. Till exempel, om than yttryck av monoskiktet vid droppytan är högre än den för monoskiktet enligt en schablon luft-vattengränsytan, expanderar det mörka området tills yttrycket i jämvikt. Eftersom denna process är slutförd inom 10 ms, kommer yttrycket jämviktas innan den påverkar diffusionsprocessen avsevärt. Andra, om tidsskalan för sammanslagning processen är snabb nog, det begränsar inte diffusionen mätning alls. Lyckligtvis är en typisk sammanslagning process även slutfört inom 10 ms. Slutligen är jämn multipel sammanslagning av dropparna har laddats in i plana gränsytan inte ökar tryckytan, eftersom ytarean av tråget mycket större än ytarean hos de små dropparna. Enligt storleken på tråget och dropparna, som beskrivs i protokollet, ökar området per molekyl mindre än 0,015% genom att sammanfoga en droppe. Följaktligen är ökningen av yttrycket på grund av förändringen av området per molekyl mindre än 0,1%, vilket är negligible eftersom det är mycket mindre än den typiska felet i yttryck, mätt genom Wilhelmy platt tensiometer.
Sammanfattningsvis, introducerade vi en ny metod för att mäta lateral diffusion egenskap hos en fosfolipid monoskikt genom en sammanslagning en droppmonolager på den platta gränssnittet. Denna teknik kräver relativt enkel utrustning och även möjliggör användning av olika typer av färgämnes arter. FRAM är således potentiellt tillämpbar för spridning mätning av eventuella ytaktiva medel, innefattande fosfolipider, segmentsampolymerer, proteiner och även nanopartiklar på en fluid-fluidgränsytan. Dessutom förväntar vi oss att den FRAM tillhandahåller ett nytt sätt för att studera inter diffusion eller blandning mellan två olika ytaktiva medel.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av KAIST-finansierade K-Valley RED & B Projekt för 2014 och Basic Science Research Program genom National Research Foundation of Korea (NRF- 2012R1A6A3A040395, NRF-2013R1A1A2057708, NRF- 2012R1A1A1011023).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | OCI corporation | Acetone 3.8L Extra Pure | Purity: ≥ 99.5%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. |
| Ethanol | OCI corporation | Ethanol 3.8L Extra Pure | Purity: ≥ 94%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. |
| Dioleoylphosphatidylcholine, DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Chloroform is carcinogenic. |
| Chloroform | LiChrosolv | Chloroform ultrapure (A3633) | Purity: ≥ 99.8%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Carcinogenic |
| Rhodamine DPPE | Avanti Polar Lipids | 810158C, 810158P | Avoid direct light exposure to prevent photobleaching |
| Wilhelmy plate tensiometer | R&K ultrathin organic film technology | Wilhelmy tensiometer | http://www.rieglerkirstein.de/index.htm |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P-1000 | |
| Micro-injector | Eppendorf | Femtojet | |
| Micromanipulator | Eppendorf | Micromanipulator 5171 | |
| Microscope 1 | Objective lens: Olympus | Objective lens: UPlanFl 10x | Objective lens: 10X NA 0.3 |
| Microscope 2 | Objective lens: Olympus, Tube lens: Thorlabs | Objective lens: UPlanFl 10x | Objective lens: 10X NA 0.3, tube lens: focal length 17 cm |
| CCD for Microscope 1 | Jai | CV 950 camera | |
| CCD for Microscope 2 | Andor | iXon3 EMCCD | |
| Filter set | Chroma technology | Catalog Set 49004: ET545, T565, ET605 | Prepare suitable for dye molecules |
| Sonicator | DAIHAN Scientific | Wiseclean WUC-D06H |
References
- Van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (2), 112-124 (2008).
- Christon, R., Even, V., Daveloose, D., Léger, C. L., Viret, J. Modification of fluidity and lipid—protein relationships in pig intestinal brush-border membrane by dietary essential fatty acid deficiency. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 980 (1), 77-84 (1989).
- Stubbs, C. D., Smith, A. D. The modification of mammalian membrane polyunsaturated fatty acid composition in relation to membrane fluidity and function. Biochim. Biophys. Acta - Rev. Biomembr. 779 (1), 89-137 (1984).
- Holthuis, J. C. M., Menon, A. K. Lipid landscapes and pipelines in membrane homeostasis. Nature. 510 (7503), 48-57 (2014).
- Alonso, C., Waring, A., Zasadzinski, J. A. Keeping lung surfactant where it belongs: protein regulation of two-dimensional viscosity. Biophys. J. 89 (1), 266-273 (2005).
- Kim, K., Choi, S. Q., Zell, Z. a, Squires, T. M., Zasadzinski, J. A. Effect of cholesterol nanodomains on monolayer morphology and dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.). 110 (33), E3054-E3060 (2013).
- Hormel, T. T., Kurihara, S. Q., Brennan, M. K., Wozniak, M. C., Parthasarathy, R. Measuring Lipid Membrane Viscosity Using Rotational and Translational Probe Diffusion. Phys. Rev. Letters. 112 (18), 188101 (2014).
- Ding, J., Warriner, H. E., Zasadzinski, J. a, Schwartz, D. K. Magnetic needle viscometer for Langmuir monolayers. Langmuir. 18 (13), 2800-2806 (2002).
- Dhar, P., Cao, Y., Fischer, T. M., Zasadzinski, J. A. Active interfacial shear microrheology of aging protein films. Phys. Rev. Letters. 104 (1), 1-4 (2010).
- Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Interfacial microrheology of DPPC monolayers at the air-water interface. Soft Matter. 7 (17), 7782-7789 (2011).
- Choi, S. Q., Steltenkamp, S., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Active microrheology and simultaneous visualization of sheared phospholipid monolayers. Nature Commun. 2 (5), 312 (2011).
- Caruso, F., et al. Determination of lateral diffusion coefficients in air-water monolayers by fluorescence quenching measurements. J. Am. Chem. Soc. 113 (16), 4838-4843 (1991).
- Filippov, A., Orädd, G., Lindblom, G. The effect of cholesterol on the lateral diffusion of phospholipids in oriented bilayers. Biophys. J. 84 (5), 3079-3086 (2003).
- Schwille, P., Korlach, J., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy with single-molecule sensitivity on cell and model membranes. Cytometry. 36 (3), 176-182 (1999).
- Lopez, A., Dupou, L., Altibelli, A., Trotard, J., Tocanne, J. F. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments under conditions of uniform disk illumination. Critical comparison of analytical solutions, and a new mathematical method for calculation of diffusion coefficient D. Biophys. J. 53 (6), 963-970 (1988).
- Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).
- Vaz, W. L., Clegg, R. M., Hallmann, D. Translational diffusion of lipids in liquid crystalline phase phosphatidylcholine multibilayers. A comparison of experiment with theory. Biochemistry. 24 (3), 781-786 (1985).
- Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. Lateral diffusion in phospholipid multibilayers measured by fluorescence recovery after photobleaching. Biochemistry. 16 (17), 3836-3841 (1977).
- Peters, R., Beck, K. Translational diffusion in phospholipid monolayers measured by fluorescence microphotolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.). 80 (23), 7183-7187 (1983).
- Kuhn, H., Mobius, D., Bucher, H. Physical Methods of Chemistry. Crawley, J. N., et al. 1, Part 3B, 651-653 (1972).
- Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 858 (1), 161-168 (1986).
- Rotenberg, Y., Boruvka, L., Neumann, A. Determination of surface tension and contact angle from the shapes of axisymmetric fluid interfaces. J. Colloid Interface Sci. 93 (5), 169-183 (1983).
- Jeong, D. W., Kim, K., Lee, S., Choi, M. C., Choi, S. Q. Fluorescence recovery after merging a surfactant-covered droplet: a novel technique to measure the diffusion of phospholipid monolayers at fluid/fluid interfaces. Langmuir. 30 (48), 14369-14374 (2014).
