Introduction
Phospholipider er de vigtigste bestanddele af cellemembraner og membraner af organeller, og fluiditeten af disse membranlag ofte påvirker cellulære funktioner ved at ændre aktiviteten af membranproteiner 1 - 3. For eksempel, membran lipid homeostase opnås ved at regulere membranfluiditet, som detekteres af membranproteiner og et unormalt niveau af flydende forårsager alvorlige sygdomme, såsom hepatisk steatose og cholestasis 4. Hertil kommer, flydende en phospholipid monolag ved luft-alveolerne væske grænsefladen har vigtige implikationer i sine funktioner. Høj fluiditet lungesurfactant phospholipid monolag letter spredning af laget under inhalation, mens en lav fluiditet giver laget at holde sig inden alveolerne under udånding 5,6. Det er derfor vigtigt at vurdere fluiditet af phospholipidet lag for at forstå deres roller.
_content "> et direkte mål for fluiditeten er viskositet, og viskositeten af phospholipid lag er blevet målt ved hjælp af mikrometerstore kolloider 7, magnetiske nåle 8,9 og knapper mikromagnetiske 6,10,11. Men disse teknikker er begrænset til relativt stive film, og kan ikke måle mindre viskøse film. For sådanne tilfælde vil diffusivitet være et alternativ til at kvantificere fluiditet phospholipid lag. For flere årtier, har en række teknikker til måling af diffusionsegenskaber phospholipid lag blevet udviklet, såsom fluorescens quenching metode 12, pulseret feltgradient NMR 13 og fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) 14. En af de mest repræsentative metoder er fluorescens bedring efter fotoblegning (FRAP) 15,16. På grund af enkelheden af målingen og beslægtede teorier, flere undersøgelser af diffusion egenskaber phospholipid lag er blevet udført ved hjælp af FRAPHer præsenterer vi en ny teknik til at måle den laterale diffusion af phospholipid monolag, betegnes som fluorescens bedring efter sammenlægning (FRAM). Den afgørende forskel mellem FRAP og FRAM er, at fotoblegning trin erstattes af drop sammensmeltning. Fletning en dråbe dækket af ikke-fluorescens monolag på en fluorescens-mærket flad monolag efterlader en cirkulær mørk plet på en lys flad monolag, og dermed oprette den samme oprindelige tilstand med fotoblegning trin. Vi derefter observere fluorescens opsving i mørke pletten med tid til at måle den laterale diffusivitet. Denne nye "blegning" trin drop sammensmeltning giver betydelige fordele i forhold til FRAP: FRAM kræver kun et fluorescensmikroskop snarere end et dyrt konfokalt mikroskop med en stærk laser, der er nødvendig for FRAP. Jegn Derudover FRAM har et bredt udvalg af fluorescens farvestoffer, da det ikke involverer fotoblegning processen. Endelig er de to forskellige monolag, en dråbe monolag og en flad monolag, kan fremstilles uafhængigt af hinanden, således at interdiffusion, der skal måles, mens FRAP kun måler selv-diffusion af monolag.
FRAM tilbyder en bred vifte af diffusion målinger fra højviskose materialer til næsten inviskos materialer. I princippet kan FRAM måle den maksimale diffusivitet af 10 6 um 2 / sek, som er sammenlignelig med eksisterende teknikker, når diffusion forekommer, gennem området 100 um med 100 um under tiden for dråbe sammensmeltning processen (~ 10 msek). Desuden langsom diffusionsproces kan let måles, medmindre monolag er faste. FRAM kan anvendes til alle former for overfladeaktive materialer, så længe passende fluorescens mærkede molekyler er til rådighed.
Protocol
Advarsel: Der henvises til sikkerhedsdatabladene (MSDS) før brug af acetone og kloroform, som er kræftfremkaldende.
1. Fremstilling af Phospholipid Monolayer på et flad Air-vand-grænseflade
- Dannelse af et phospholipid monolag
- Fremstilling af en phospholipidopløsningen
- Rense en 4 ml hætteglas med en polytetrafluorethylen belagt hætte under anvendelse af acetone, ethanol og deioniseret vand mindst tre gange, og blæse nitrogengas grundigt ind i hætteglasset for at slippe af med vand.
- Opløs 1 mg phospholipid (f.eks dioleoylphosphatidylcholin, DOPC) til 1 ml chloroform i hætteglasset for at opnå 1 mg / ml koncentration. Udfør denne procedure i et stinkskab for sikkerheden. Anvende lavere eller højere koncentrationer af phospholipid løsning, hvis det er nødvendigt.
- Tilføj farvestof mærkede phospholipider (f.eks, rhodamin dipalmitoylphosphatidylethanolamin, rhodamin DPPE) med mindre end 1 mol% af phospholipidet Solution, med henblik på at visualisere phospholipid monolag med et fluorescensmikroskop. Udfør denne procedure i et stinkskab for sikkerheden.
- Wrap hætteglasset med en polytetrafluorethylen tape for at forhindre fordampning af opløsningsmiddel, og prøven opbevares i en fryser ved -20 ° C.
- Deponering af phospholipider på luft-vand-grænsefladen
- Rens en petriskål (55 mm i diameter og 12 mm i højden) med ethanol, og deioniseret vand mindst tre gange.
- Fyld petriskål med 10 ml deioniseret vand for at skabe en luft-vand-grænsefladen.
- Spred få mikroliter af phospholipid opløsning med en mikro-sprøjte på en ren grænseflade for at opnå den ønskede fladetryk og vente i mindst 30 minutter for at afdampe opløsningsmidlet fuldstændigt, forud for at gøre forsøget.
Bemærk: En Langmuir trough kan anvendes i stedet for en petriskål, hvis præcis styring af fladetrykket er nødvendig.
- Fremstilling af en phospholipidopløsningen
- Surface trykmåling
- Måle fladetryk af phospholipidet monolag med en Wilhelmy plade tensiometer. Vente mindst 30 minutter for at få filtrerpapiret befugtet nok, hvis filterpapir anvendes som Wilhelmy plade. Den detaljerede protokol er tilgængelig i Kuhn et al. 20.
- Juster afsatte mængde af phospholipidet at styre fladetryk præcist. Tilføj 4 pi af DOPC opløsning (1 mg / ml) på 30,25 cm2 -område af grænsefladen, hvis ~ 5 mN / m fladetrykket er påkrævet.
Bemærk: Hvis filtrerpapiret ikke er fuldstændig fugtet, ændrer fladetryk dramatisk i de første 30 min af eksperimentet som følge af vægten ændring af filtrerpapiret.
- Minimering af den konvektive strømning af monolaget
- Brug en kegleformet apparat, der indeholder en 3 mm reservoir med to tynde kanaler, forbundet til en stor del af petriskålen, til at undertrykke den konvektive strømning afmonolaget, som kan forstyrre morfologi billedbehandling og overfladen trykmåling.
- Sørg for at matche vandstanden mellem indersiden og ydersiden af apparatet kegleform at sikre, at phospholipider bevæge sig frit over hele regionen, før deponeringen phospholipider på luft-vand-grænsefladen.
2. Fremstilling phospholipid monolag på den krumme overflade af en dråbe
- Tilspidsende proces med et glas kapillarrør ved hjælp af mikropipette aftrækker
- Placer en glaskapillar (OD 1 mm, id 0,78 mm, længde 100 mm) på en kapillær indehaver af en mikropipette aftrækker.
- Design et program til at trække kapillærer med passende parameterværdier (Heat: Rampe, Pull: 60, Vel: 70, Forsinkelse: 70 og tryk 200) og træk kapillærerne med designet program i henhold til producentens protokol.
Bemærk: En kapillær ende med et par mikrometer diameter er nødvendigt for at danne en 100 um-dråbe af applYing et tryk med ~ 10 kPa. Hvis den spidse ende af kapillarrøret er for lille, meget højere tryk,> 600 kPa, er nødvendig for at opnå dråben, mens det er svært at styre størrelsen af dråberne med en for stor kapillær spidsende.
- Absorption af phospholipider på dråbens overflade
Bemærk: at danne et phospholipid monolag på den buede grænseflade en lille dråbe, et phospholipid løsning uden farvestof mærkede phospholipider anvendes til at opnå en intensitet derimod mod den flade monolag, fremstillet ved proceduren 1. Ud begge procedurer 2.2.1 og 2.2 .2 er tilladte her. Hvis det er nødvendigt præcis styring af fladetrykket på dråbens overflade, procedure 2.2.2 stærkt anbefales. Men hvis ikke, procedure 2.2.1, som er en meget nemmere måde end proceduren 2.2.2, er nyttig.- Belægningsproces af phospholipider ved en spidsende
- Rense en objektglas under anvendelse af acetone, ethanol og deioniseret vand mindst tre gange.
- Place det tilspidsede kapillær på en rengjort dias glas, og vip kapillarrøret at lette røre slide glas med en spids ende.
- Drop et par dråber af phospholipid-opløsning (1 mg / ml) på den spidse ende af et kapillarrør, der er klæbet til objektglasset ved hjælp af en glassprøjte, og vent i mindst 30 minutter for at afdampe opløsningsmidlet fuldstændigt.
Bemærk: Det anbefales at klæbe den spidse ende af kapillarrøret til objektglasset under proceduren 2.2.1.3 fordi omkredsen af den spidse ende er for lille til at holde dråben af phospholipiderne ved spidsen kun ved kapillær kraft.
- Fremstilling af en vesikel opløsning
- Rengør et hætteglas, og fjerne vand fra hætteglasset, som indført i proceduren 1.1.1.1.
- Tørre en 2 ml volumen phospholipid-opløsning (1 mg / ml) ved anvendelse af nitrogengas forsigtigt og udtørre hætteglasset i 1 time ved stuetemperatur for at fjerne eventuelt tilbageværende opløsningsmiddel. Udfør denne procedure i et stinkskab for sikkerheden.
- Tilføj 2ml deioniseret vand i hætteglasset med tørrede lipider, og inkuber hætteglasset i en ovn ved 60 ° C i 1 time.
- Ryst hætteglasset flere gange, og sonikeres (HF-frekvens: Op til 40 kHz, Effekt: 370 W) i 30 min for at få vesikler.
- Udfør ekstrudering og fryse-tø fremgangsmåder til opnåelse af monodisperse unilamellare vesikler. Den detaljerede protokol for forbereder vesikler er beskrevet i Mayer et al. 21.
Bemærk: Surface tryk af dråben grænseflade styres præcist ved at justere ventetid efter dannelse af dråben, som indeholder monodisperse unilamellare vesikler. Ved hjælp af en vedhæng drop fremgangsmåde 22, er det nødvendigt at måle ændringen af fladetryk i forhold til tid, forud for at gøre forsøget.
- Belægningsproces af phospholipider ved en spidsende
- Dannelse af en dråbe, der indeholder et phospholipid monolag på den buede overflade
- Udfyld koniske kapillær med 10 pi deioniseret vand fra procedure 2.2.1. Alternativt kan du bruge 10 ul af vesikel løsning fra procedure 2.2.2.
- Slut kapillarrøret til en automatiseret mikro-injektor for at tilvejebringe tryk til dannelse dråben.
- Monter kapillarrøret, der er tilsluttet en mikro-injektor til en mikromanipulator at styre placeringen af kapillarrøret præcist.
- Forbered et lyst felt mikroskop (mikroskop 1, objektivlinse: 10X NA 0.3) til afbildning af sidebillede af kapillarrøret med et CCD-kamera. Mikroskop 1 gør det således muligt at observere nøjagtige position af dråben langs z-aksen og anslå størrelsen af dråben.
- Bevæge spidsen ende til en position, hvor sidebillede af den spidse ende er godt visualiseret ved mikroskop 1 ved hjælp af en mikromanipulator, og anvende en variabel tryk (~ 100 hPa) med den spidse ende af kapillarrøret, indtil en passende størrelse (~ 100 um i diameter) af dråber dannes.
Bemærk: Det anbefales, at automatiseret mikro-injektor og mikromanipulator være brugd, hvis fine styring af dråbestørrelsen og placering af dråben er nødvendig. Det er også muligt at anvende manuelle dem.
3. Imaging Fluorescens Recovery efter Droplet Fletning
Bemærk: De grundlæggende principper i denne protokol er identiske med dem i FRAP teknik, bortset fra drop sammensmeltning processen. De detaljerede protokol og relaterede teorier FRAP er tilgængelige i A. Lopez et al. 15 og D. Axelrod et al. 16.
- Overvågning og kontrol af placeringen af dråben
- Forbered et inverteret mikroskop sæt (Mikroskop 2, objektiv: 10X NA 0,3, rør linse: brændvidde 17 cm), der muliggør både en fluorescens mikroskop med en ordentlig filter sæt til Rhodamin-DPPES (excitation ved 560 nm, emission ved 583 nm) og en lys felt mikroskop. Brug et CCD-kamera her for at visualisere de bedste visninger af dråben med et fluorescensmikroskop mode og en lys-felt mikroskop tilstand.
- Flyt dråben overtrukket med et phospholipid og et fast luft-vand-grænsefladen langs z-aksen, men ikke fusionere dråben endnu, ved hjælp af mikromanipulator. Brug Microscope 1 at visualisere sidebillede af dråben.
- Find dråben i midten af ovenfra af den flade monolag ved hjælp af mikromanipulator. Brug lysfeltsbillede mikroskop form for Microscope 2 at visualisere ovenfra af flade monolag.
- Fletning dråben på den flade air-vand-grænsefladen
- Flyt dråben yderligere mod den flade grænseflade, indtil dråben fusionerer på grænsefladen, ved hjælp af mikromanipulator. Hvis sammenlægningsarbejdet er gjort med succes, en mørk region med en cirkulær form, der er omgivet af en hvid baggrund, observeres under anvendelse af fluorescens form for Microscope 2.
- Optag rækken af fluorescerende billeder i forhold til tidspunkt efter sammenlægning dråben, under anvendelse af fluorescens form for Microsklare 2. Brug en hurtigere billedhastighed end diffusion tidsskala af monolag her. I DOPC monolag, det tager et par minutter til at diffundere ind i 200 um-mørke område helt.
4. Bestemmelse af diffusionskoefficienten ved billedanalyse
Bemærk: For at bestemme diffusionskoefficienten fra en serie af billeder, der er skræddersyet program til billedanalyse bygget som beskrevet nedenfor. En detaljeret kildekode med dette program er tilgængelig i JOVE hjemmeside.
- Påvisning af et cirkulært område af interesse
- Påvisning af midten af området af interesse
- Anskaf en serie af fluorescerende billeder, der er taget under et opsving proces, som indeholder et cirkulært mørkt område og en hvid baggrund, og sæt det første billede i serien som en reference billede. Her R D er radius af det mørke område i et referencebillede.
- Convolute reference billede med en hvid cirkel, derSE intensitet er ensartet over en hel region. Brug indlejret funktion med navnet "conv2 'for foldning som vist i kildekode tilpasset programlinie 124. Her radius af den hvide cirkel er lidt mindre end R D.
- Find en position, der angiver en minimumsværdi i beregningen af foldning, og indstille denne position som centrum for området af interesse i referenceperioden billedet.
- Bestemmelse en radius af regionen af interesse
- Convolute referencebilledet med en hvid cirkel, der indeholder en midterstilling, bestemmes ved en procedure 4.1 og ensartet intensitet over en hel region. Her R S er radius af den hvide cirkel. Brug iteration som "for" eller "samtidig" med ligningen af en cirkel for at gøre den hvide cirkel som vist i kildekoden til tilpassede programlinie 102 til 109.
- Convolute referencebilledet med en anden hvid cirkel, der har en lidtstørre radius (5% -10%), R L, end R S. Brug samme metode med procedure 4.1.2.1 at gøre cirklen som vist på kildekoden til tilpassede program linje 113-120.
- Få forskellen i værdi mellem de to foldning beregninger af 4.1.2.1 og 4.1.2.2.
- Gentag ovenstående procedurer fra R S = R D / 2 til R S = 2R D, ved at øge både R S og R L med en pixel-niveau. Lav en iteration, der indeholder hele kildekoder fra proceduren 4.1.2.1 til 4.1.2.3 til at gentage.
- Find radius R S, der angiver den maksimale forskel i værdi mellem de to foldning beregninger. Brug indlejret funktion med navnet 'max' for at finde radius angiver den maksimale forskel i værdi som vist i kildekoden til den tilpassede program linje 148 til 149. Dette R S angiver således radius af det mørke område i henvisningen billedet.
- Beregning af en fraktioneret intensitet
- Sæt en cirkel, der indeholder en midterposition og en radius, der bestemmes af proceduren 4.1 som et område af interesse.
- Beregn de gennemsnitlige intensiteter af området af interesse i en række fluorescens billeder efter tid. Convolute hver ramme med område af interesse og dividere det med området for regionen af interesse at beregne den gennemsnitlige intensitet. Detaljerne er tilgængelige i kildekode tilpasset program, som er tilgængelig i JOVE hjemmeside.
- Beregne en fraktioneret intensitet, defineret som følgende ligning, hvor F (t) er gennemsnittet intensitet i cirklen, der er et område af interesse i forhold til tid, F i er oprindelige intensitet i cirklen, og F o er intensiteten af en hvid baggrund.
f (t) = (F (t) - f I) / (F o - F i) (ligning 1).
- Montering af fractional intensitet til FRAP teori
- Monter fraktioneret intensitet med nedenstående ligning, hvor τ er en karakteristisk diffusion tid, og jeg 0, I 1 er modificeret Bessel funktioner, ved hjælp af en passende program, og få τ
(Ligning 2). - Opnå en diffusionskoefficient baseret på relationen, τ = 2/4 D, hvor D er diffusionskoefficienten og a er radius af det mørke område.
Bemærk: Under tilpasningsprocessen, er det muligt at forskyde fraktioneret intensitet profil langs en tidsakse når opsvinget processen allerede er startet, før du optager billeder.
- Monter fraktioneret intensitet med nedenstående ligning, hvor τ er en karakteristisk diffusion tid, og jeg 0, I 1 er modificeret Bessel funktioner, ved hjælp af en passende program, og få τ
- Påvisning af midten af området af interesse
(Ligning 2). Representative Results
En serie af fluorescens billeder blev opnået med tiden under gendannelsesprocessen efter sammenlægning en dråbe belagt med en DOPC monolag på en flad DOPC monolag, som anført i figur 1. Den DOPC monolag på det flade luft-vand-grænsefladen blev doteret med små mængder rhodamin-DPPE, og dette gjorde det således muligt at visualisere en baggrund med en lys farve og en mørk region nyligt tilføjede til den flade grænseflade. Der blev et opsving proces observeret ved 23 mN / m af fast tryk overflade. Et anfald af ligning 1 med ændringen af fraktioneret intensitet i forhold til tid er vist i figur 2. Den R2 værdien af denne pasform er 0,999, og dette passer stadig fungerer godt selv ved lavere eller højere fladetryk. Diffusionskoefficienten af DOPC monolag fra denne pasform var 27,54 um 2 / sek ved 23 mN / m fladetryk.
For yderligere validering af FRAM, diffusionskoefficienter af DOPC og dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC) monolag blev målt i henhold til overfladen pres. Som vist i figur 3, FRAM indfanger den hurtige fald i diffusionskoefficient DPPC monolag på ~ 9 mN / m fladetryk, hvor en LC (væske kondenseret) - LE (flydende udvidet) faseovergang optræder 10, og værdierne for diffusionskoefficienter er også enige godt med de tidligere målinger af Peters et al. 19. Desuden blev en eksponentiel henfald af diffusionskoefficienten med fladetrykket observeret i DOPC monolag, og denne tendens er næsten identisk med den målt ved Caruso et al. 12.
Figur 1. (A) Skematisk illustration af FRAM (fluorescens bedring efter sammenlægning) teknik. Som læbenid monolag belagt dråben fusionerede fladt luft-vand-grænsefladen, lipidmonolaget uden fluorescens mærkede lipid indsættes i flade fluorescerende lipidmonolaget. (B) Fluorescens mikroskop billeder med tiden under inddrivelse proces med en DOPC monolag på 23 mN / m af overfladevand tryk (skala bar = 100 um). Den mørke region af DOPC monolag er fuldt tilbagebetalt ved diffusion proces i flere minutter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Fraktioneret intensitet som funktion af tid. Sorte cirkler og den grå stiplede linje angiver værdierne af fraktioneret intensiteter opnået fra billedanalyse (procedurer 4.1 og 4.2) og anfald af ligning 1 til brøkdele intensiteter de med tiden,vist i procedure 4.3, henholdsvis. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Diffusionskoefficienter DOPC (trekant) og DPPC (tom firkant) monolag som en funktion af overfladen tryk. Linjerne med den lyse grå farve og med mørkegrå farve angiver værdierne af diffusionskoefficienten tidligere rapporteret af Peters et al. og Caruso et al., henholdsvis. Dette tal er blevet ændret fra Jeong et al. 23. Genoptrykt med tilladelse fra Jeong et al. Langmuir. 30 (48), 14369-14374. Copyright 2014 American Chemical Society. Klik hendee at se en større version af dette tal.
Discussion
FRAM deler en masse af de grundlæggende principper med FRAP, især til måling af fluorescens bedring efter blegning et bestemt område, men FRAM bruger en proces for at fusionere en dråbe på den flade grænseflade til at danne en bleget område, i stedet for at anvende en intensiv lys. Sammenlægningen proces er derfor vigtigste skridt i FRAM og især, formen af den mørke plet på den flade monolag efter sammenlægning en dråbe bestemmer nøjagtigheden af diffusivitet måling. Specifikt baseret på en aktuel fremgangsmåde, vi kun indstille cirkel med en radius R som en region af interesse at beregne den gennemsnitlige intensitet af mørk plet, der er vist i procedure 4, og hvis der er en for stor afvigelse fra den cirkulære form, dette ville forstyrre den præcise måling af en diffusionskoefficient. Det er derfor nødvendigt at få et cirkulært formet mørk region, men Cd'er former dannes lejlighedsvis på grund af flere årsager. Først hvis der findes en konvektiv strømning i Petri skålen, formen af det mørke område bliver langstrakt langs strømningsretningen. Som nævnt i proceduren 1.3, et apparat kegleform hjælper til at undertrykke den konvektive strøm, og dette forlængelse ville blive minimeret. For det andet, hvis den spidse ende af kapillarrøret rører den flade grænseflade under en sammenlægning proces bliver mørkt område udformet med en række forskellige former, idet den kapillære ende afbryder sammenlægningsarbejdet. Ved at opnå en dråbe, der kun hængende fra slutningen af kapillarrøret, kan denne afbrydelse forhindres. Især en hydrofob behandling af kapillarrøret hjælper dråben til at sidde i slutningen af kapillarrøret. Derfor ovenstående problemer skyderier og ændringer giver os mulighed for at måle diffusionsegenskaber mere præcist.
Dette godt troubleshot proces gør det således muligt FRAM at have flere væsentlige fordele i forhold FRAP. Først FRAM kræver enklere udstyr i forhold til FRAP. For FRAM, er det tilstrækkeligt at bruge en simpel fluorescens mikroerklare, i stedet for et dyrt konfokalt mikroskop med en stærk laser, hvis bølgelængde skal matche med absorptionsspektret af farvestoffet. Desuden er det nødvendigt at anvende yderligere apparat til at justere størrelsen på bleget område i FRAP, mens FRAM kontrollerer størrelsen af området let ved at justere størrelsen af dråben, eller overfladen tryk ved dråben overfladen. For det andet, er det muligt at anvende forskellige arter af farvestoffer i FRAM. FRAP bruger kun farvestofmolekyler hvis blegning proces er meget hurtigere end diffusionsprocessen. Hvis der opstår diffusion af farvestofferne under blegning proces, er det svært at vurdere udbredelsen egenskaben præcist. Fram imidlertid ikke kræver en fremgangsmåde til blegning af farvestoffer, og dette muliggør således anvendelsen af forskellige typer af farvestoffer i fluorescensafbildning. Hertil kommer, at FRAP kræver yderligere højeffektlasere og filtersæt at ændre farvestof arter, mens det kun er nødvendigt at udskifte filtersættene i FRAM. EndeligDa monolagene på dråben overflade og den flade grænseflade kan dannes uafhængigt, hvilket muliggør studiet af inter-diffusion eller blanding mellem to forskellige lipidmonolag ved at sammenlægge A-type monolag til B-typen monolag, mens FRAP måler kun self-diffusion af et monolag.
På trods af disse fordele, kan processen med at sammenlægge en dråbe på en flad luft-vand-grænsefladen potentielt begrænse denne teknik på grund af flere problemer, der kan være af interesse, såsom et fladetryk misforhold mellem de to monolag, tidspunktet omfanget af de fusionerende proces og en forøgelse i overfladetryk af den flade monolag efter sammenlægning dråber. Disse spørgsmål er imidlertid ikke påvirker målingen diffusion væsentligt af følgende grunde. Først, selvom overfladen pres på de to forskellige monolag er meget forskellige, er en ligevægt proces afsluttet på et meget tidligt tidspunkt under inddrivelse proces. For eksempel, hvis than fladetryk af monolaget på overfladen dråber er højere end af monolaget på den flade air-vand-grænsefladen, det mørke område udvider indtil overfladen tryk ligevægt. Da denne proces er afsluttet inden for 10 msek, vil fladetrykket ækvilibreres før det påvirker diffusionsprocessen betydeligt. For det andet, hvis tiden omfanget af de fusionerende processen er hurtig nok, det ikke begrænser målingen diffusionen overhovedet. Heldigvis er en typisk sammensmeltningsproces også afsluttet inden for 10 msek. Endelig, multipel sammensmeltning af dråberne på den flade grænseflade øger ikke fladetrykket siden overfladearealet af truget er langt større end overfladearealet af dråben. Ifølge størrelser af truget og dråberne, beskrevet i protokollen, det areal pr molekyle øger mindre end 0,015% ved at sammenlægge en dråbe. Følgelig stigningen i fladetryk på grund af ændringen af areal pr molekyle er mindre end 0,1%, hvilket er negligible fordi det er meget mindre end den typiske fejl i fladetryk, som målt ved Wilhelmy plade tensiometer.
Sammenfattende vi indført en ny metode til at måle den laterale diffusion egenskab ved et phospholipid monolag ved at flette en dråbe monolag på den flade grænseflade. Denne teknik kræver forholdsvis enkelt udstyr og giver også mulighed for anvendelse af forskellige former for farvestof arter. Fram er altså potentielt anvendelig til diffusion måling af eventuelle overfladeaktive midler, herunder phospholipider, blokcopolymerer, proteiner og endda nanopartikler ved en fluid-fluid interface. Derudover forventer vi, at FRAM giver en ny måde at studere den inter-diffusion eller blanding mellem to forskellige overfladeaktive midler.
Acknowledgments
Dette arbejde er støttet af KAIST-finansierede K-dalen RØD & B Projekt for 2014 og Basic Science Research Program gennem National Research Foundation Korea (NRF- 2012R1A6A3A040395, NRF-2013R1A1A2057708, NRF- 2012R1A1A1011023).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | OCI corporation | Acetone 3.8L Extra Pure | Purity: ≥ 99.5%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. |
| Ethanol | OCI corporation | Ethanol 3.8L Extra Pure | Purity: ≥ 94%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. |
| Dioleoylphosphatidylcholine, DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Chloroform is carcinogenic. |
| Chloroform | LiChrosolv | Chloroform ultrapure (A3633) | Purity: ≥ 99.8%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Carcinogenic |
| Rhodamine DPPE | Avanti Polar Lipids | 810158C, 810158P | Avoid direct light exposure to prevent photobleaching |
| Wilhelmy plate tensiometer | R&K ultrathin organic film technology | Wilhelmy tensiometer | http://www.rieglerkirstein.de/index.htm |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P-1000 | |
| Micro-injector | Eppendorf | Femtojet | |
| Micromanipulator | Eppendorf | Micromanipulator 5171 | |
| Microscope 1 | Objective lens: Olympus | Objective lens: UPlanFl 10x | Objective lens: 10X NA 0.3 |
| Microscope 2 | Objective lens: Olympus, Tube lens: Thorlabs | Objective lens: UPlanFl 10x | Objective lens: 10X NA 0.3, tube lens: focal length 17 cm |
| CCD for Microscope 1 | Jai | CV 950 camera | |
| CCD for Microscope 2 | Andor | iXon3 EMCCD | |
| Filter set | Chroma technology | Catalog Set 49004: ET545, T565, ET605 | Prepare suitable for dye molecules |
| Sonicator | DAIHAN Scientific | Wiseclean WUC-D06H |
References
- Van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (2), 112-124 (2008).
- Christon, R., Even, V., Daveloose, D., Léger, C. L., Viret, J. Modification of fluidity and lipid—protein relationships in pig intestinal brush-border membrane by dietary essential fatty acid deficiency. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 980 (1), 77-84 (1989).
- Stubbs, C. D., Smith, A. D. The modification of mammalian membrane polyunsaturated fatty acid composition in relation to membrane fluidity and function. Biochim. Biophys. Acta - Rev. Biomembr. 779 (1), 89-137 (1984).
- Holthuis, J. C. M., Menon, A. K. Lipid landscapes and pipelines in membrane homeostasis. Nature. 510 (7503), 48-57 (2014).
- Alonso, C., Waring, A., Zasadzinski, J. A. Keeping lung surfactant where it belongs: protein regulation of two-dimensional viscosity. Biophys. J. 89 (1), 266-273 (2005).
- Kim, K., Choi, S. Q., Zell, Z. a, Squires, T. M., Zasadzinski, J. A. Effect of cholesterol nanodomains on monolayer morphology and dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.). 110 (33), E3054-E3060 (2013).
- Hormel, T. T., Kurihara, S. Q., Brennan, M. K., Wozniak, M. C., Parthasarathy, R. Measuring Lipid Membrane Viscosity Using Rotational and Translational Probe Diffusion. Phys. Rev. Letters. 112 (18), 188101 (2014).
- Ding, J., Warriner, H. E., Zasadzinski, J. a, Schwartz, D. K. Magnetic needle viscometer for Langmuir monolayers. Langmuir. 18 (13), 2800-2806 (2002).
- Dhar, P., Cao, Y., Fischer, T. M., Zasadzinski, J. A. Active interfacial shear microrheology of aging protein films. Phys. Rev. Letters. 104 (1), 1-4 (2010).
- Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Interfacial microrheology of DPPC monolayers at the air-water interface. Soft Matter. 7 (17), 7782-7789 (2011).
- Choi, S. Q., Steltenkamp, S., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Active microrheology and simultaneous visualization of sheared phospholipid monolayers. Nature Commun. 2 (5), 312 (2011).
- Caruso, F., et al. Determination of lateral diffusion coefficients in air-water monolayers by fluorescence quenching measurements. J. Am. Chem. Soc. 113 (16), 4838-4843 (1991).
- Filippov, A., Orädd, G., Lindblom, G. The effect of cholesterol on the lateral diffusion of phospholipids in oriented bilayers. Biophys. J. 84 (5), 3079-3086 (2003).
- Schwille, P., Korlach, J., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy with single-molecule sensitivity on cell and model membranes. Cytometry. 36 (3), 176-182 (1999).
- Lopez, A., Dupou, L., Altibelli, A., Trotard, J., Tocanne, J. F. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments under conditions of uniform disk illumination. Critical comparison of analytical solutions, and a new mathematical method for calculation of diffusion coefficient D. Biophys. J. 53 (6), 963-970 (1988).
- Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).
- Vaz, W. L., Clegg, R. M., Hallmann, D. Translational diffusion of lipids in liquid crystalline phase phosphatidylcholine multibilayers. A comparison of experiment with theory. Biochemistry. 24 (3), 781-786 (1985).
- Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. Lateral diffusion in phospholipid multibilayers measured by fluorescence recovery after photobleaching. Biochemistry. 16 (17), 3836-3841 (1977).
- Peters, R., Beck, K. Translational diffusion in phospholipid monolayers measured by fluorescence microphotolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.). 80 (23), 7183-7187 (1983).
- Kuhn, H., Mobius, D., Bucher, H. Physical Methods of Chemistry. Crawley, J. N., et al. 1, Part 3B, 651-653 (1972).
- Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 858 (1), 161-168 (1986).
- Rotenberg, Y., Boruvka, L., Neumann, A. Determination of surface tension and contact angle from the shapes of axisymmetric fluid interfaces. J. Colloid Interface Sci. 93 (5), 169-183 (1983).
- Jeong, D. W., Kim, K., Lee, S., Choi, M. C., Choi, S. Q. Fluorescence recovery after merging a surfactant-covered droplet: a novel technique to measure the diffusion of phospholipid monolayers at fluid/fluid interfaces. Langmuir. 30 (48), 14369-14374 (2014).
