Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

مضان الانتعاش بعد دمج قطرات لقياس انتشار ثنائي الأبعاد من الفوسفوليبيدية واحد رقائق

Published: October 15, 2015 doi: 10.3791/53376
Automatic Translation
1, 2, 1, 2
1Department of Bio and Brain Engineering, KAIST, 2Information and Electrical Research Institute, KAIST

Introduction

الفوسفورية هي المكونات الرئيسية لأغشية الخلايا والأغشية العضيات، وسيولة من هذه الطبقات غشاء غالبا ما يؤثر الوظائف الخلوية عن طريق تغيير النشاط من بروتينات الغشاء 1-3. على سبيل المثال، غشاء   ويتحقق التوازن الدهون من خلال تنظيم سيولة الغشاء، والتي تم الكشف عنها بواسطة بروتينات الغشاء، ومستوى غير طبيعي للسيولة يسبب أمراضا خطيرة، مثل تشحم الكبد والكوليسترول 4. بالإضافة إلى ذلك، سيولة أحادي الطبقة فوسفورية في واجهة السائل الهواء الحويصلات الهوائية آثار هامة في وظائفها. سيولة عالية من بالسطح الرئة فسفوليبيد أحادي الطبقة يسهل انتشار طبقة أثناء الشهيق، في حين أن سيولة منخفضة تمكن طبقة البقاء داخل الحويصلات الهوائية أثناء الزفير 5،6. وبالتالي فمن المهم تقدير سيولة طبقات فوسفورية على فهم أدوارهم.

_content "> مقياسا مباشرا للسيولة هو اللزوجة، وقد تم قياس اللزوجة من طبقات فوسفورية باستخدام ميكرون الحجم الغرويات 7، الإبر المغناطيسية 8،9، والمغناطيسية أزرار الدقيقة 6،10،11. ومع ذلك، هذه التقنيات تقتصر على الأفلام جامدة نسبيا، ولا يمكن قياس الأفلام أقل لزوجة. وبالنسبة لهذه الحالات، فإن انتشارية يكون بديلا لقياس سيولة طبقات فوسفورية. على مدى عدة عقود، وقد وضعت مجموعة متنوعة من التقنيات لقياس خصائص نشر طبقات فوسفورية، مثل مضان طريقة تبريد 12، حقل نابض التدرج NMR 13، والتحليل الطيفي الارتباط مضان (FCS) 14. واحدة من الطرق الأكثر تمثيلا غير الانتعاش بعد مضان photobleaching من (FRAP) 15،16. ونظرا لبساطة إجراء القياس وما يتصل بها وقد أجريت النظريات، العديد من الدراسات حول خصائص انتشار طبقات فوسفورية باستخدام FRAP 17-19. ومع ذلك، FRAP يتطلب عادة مكلفة الإعداد المجهر مبائر مع ليزر عالية الطاقة.

هنا، نقدم تقنية جديدة لقياس انتشار الأفقي من الطبقات الوحيدة فوسفورية، توصف بأنها انتعاش مضان بعد دمج (فرام). الفرق الرئيسي بين FRAP وفرام هو أن الخطوة photobleaching من يحل محله انخفاض التحام. دمج قطرات من قبل غير مضان أحادي الطبقة غطت على أحادي الطبقة مسطحة fluorescently المسمى يترك لطخة سوداء دائرية على أحادي الطبقة مسطحة زاهية، وبالتالي إقامة دولة واحدة أولية مع الخطوة photobleaching من. ثم أننا نلاحظ الانتعاش مضان في لطخة سوداء مع الوقت لقياس انتشارية الجانبي. هذا "تبييض" خطوة جديدة قطرة التحام يوفر مزايا هامة على FRAP: فرام يتطلب سوى مضان المجهر بدلا من مجهر متحد البؤر مكلفة مع ليزر عالية الطاقة ما هو ضروري لFRAP. أنان بالإضافة إلى ذلك، فرام لديها تشكيلة واسعة من الأصباغ مضان لأنها لا تنطوي على عملية photobleaching من. وأخيرا، وهما الطبقات الوحيدة مختلفة، أحادي الطبقة قطرة وأحادي الطبقة مسطحة، ويمكن أن تكون مستعدة بشكل مستقل، مما يسمح interdiffusion إلى أن تقاس، في حين FRAP يقيس فقط نشر الذاتي من الطبقات الوحيدة.

يوفر فرام مجموعة واسعة من القياسات نشر من مواد لزجة جدا للمواد inviscid تقريبا. من حيث المبدأ، يمكن فرام قياس انتشارية الأقصى من 10 6 ميكرون 2 / ثانية، وهو مشابه لتقنيات القائمة، عند حدوث نشرها في جميع أنحاء المنطقة 100 ميكرون 100 ميكرون في الوقت المناسب لعملية الهبوط التحام (~ 10 ميللي ثانية). وعلاوة على ذلك، عملية نشر بطيئة يمكن قياسها بسهولة ما لم الطبقات الوحيدة هي الصلبة. فرام يمكن استخدامها لأي من المواد الفعالة السطحية أنواع طالما مناسبة جزيئات الموسومة fluorescently المتاحة.

Protocol

تنبيه: يرجى الرجوع إلى ورقة بيانات سلامة المواد (MSDS) قبل استخدام الأسيتون والكلوروفورم التي هي مسببة للسرطان.

1. إعداد الفوسفوليبيدية واحد رقائق في بين الهواء والماء واجهة شقة

  1. تشكيل أحادي الطبقة فوسفورية
    1. إعداد حل فوسفورية
      1. تنظيف 4 مل قارورة مع غطاء تترافلوروإيثيلين المغلفة استخدام الأسيتون، والإيثانول، والماء منزوع الأيونات ثلاث مرات على الأقل، وضربة غاز النيتروجين بدقة في قارورة للتخلص من الماء.
      2. حل 1 ملغ من فسفوليبيد (على سبيل المثال، dioleoylphosphatidylcholine، DOPC) إلى 1 مل من الكلوروفورم في القارورة للحصول على 1 ملغ / مل التركيز. تنفيذ هذا الإجراء في غطاء الدخان للسلامة. استخدام تركيزات أقل أو أعلى من حل فوسفورية إذا لزم الأمر.
      3. إضافة صبغة الموسومة الدهون الفوسفاتية (على سبيل المثال، الرودامين dipalmitoylphosphatidylethanolamine، الرودامين DPPE) مع أقل من 1 مول٪ من المحاليل فوسفوريةنشوئها، من أجل تصور أحادي الطبقة فوسفورية مع المجهر مضان. تنفيذ هذا الإجراء في غطاء الدخان للسلامة.
      4. التفاف القارورة مع شريط تترافلوروإيثيلين لمنع تبخر المذيبات، وتخزين العينة في الثلاجة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
    2. ترسب الدهون الفوسفاتية على واجهة بين الهواء والماء
      1. تنظيف طبق بتري (55 مم وقطرها 12 مم في الارتفاع) مع الايثانول، والماء منزوع الأيونات ثلاث مرات على الأقل.
      2. ملء طبق بيتري مع 10 مل من الماء منزوع الأيونات لإنشاء واجهة بين الهواء والماء.
      3. نشر عدد قليل ميكرولتر من الحل فوسفورية مع حقنة صغيرة على واجهة نظيفة لتحقيق الضغط المطلوب السطح والانتظار لمدة 30 دقيقة على الأقل حتى يتبخر المذيب تماما، قبل القيام التجربة.
        ملاحظة: الحوض الصغير انجميور يمكن استخدامها بدلا من طبق بيتري إذا مراقبة دقيقة من الضغط السطحية اللازمة.
  2. سوrface قياس الضغط
    1. قياس ضغط سطح أحادي الطبقة فوسفورية مع لوحة مقياس التوتر السطحي Wilhelmy. الانتظار لمدة 30 دقيقة على الأقل للحصول على المبللة ورقة الترشيح بما فيه الكفاية إذا تم استخدام ورق الترشيح كطبق Wilhelmy. بروتوكول مفصل متوفر في كون وآخرون. 20.
    2. ضبط المبلغ المودع من فسفوليبيد للسيطرة على ضغط السطح على وجه التحديد. إضافة 4 ميكرولتر من الحل DOPC (1 ملغ / مل) على 30.25 سم 2 -area واجهة لو ~ 5 مليون / م من سطح الضغط هو مطلوب.
      ملاحظة: إذا لم يتم ترطب ورقة الترشيح تماما، يتغير ضغط السطح بشكل كبير خلال دقيقة 30 الأول من التجربة بسبب تغيير وزن ورقة الترشيح.
  3. الحد من تدفق الحمل الحراري للأحادي الطبقة
    1. استخدام جهاز على شكل مخروط التي تحتوي على 3 مم خزان مع قناتين رقيقة، متصلة قسم كبير من طبق بيتري، لمكافحة تدفق الحمل الحراري للأحادي الطبقة، والتي يمكن أن تعكر صفو التصوير التشكل وقياس ضغط السطح.
    2. التأكد من مطابقة منسوب المياه بين الداخل والخارج من جهاز مخروطية الشكل لضمان الفوسفورية تتحرك بحرية على المنطقة بأكملها قبل إيداع الفوسفورية على واجهة بين الهواء والماء.

2. إعداد الفوسفوليبيدية واحد رقائق في سطح منحن من القطرة

  1. عملية مستدق من الزجاج الشعرية باستخدام مجتذب micropipette
    1. وضع الزجاج الشعرية (OD 1 ملم، والهوية 0.78 ملم، وطول 100 ملم) على صاحب الشعرية من مجتذب micropipette.
    2. تصميم برنامج لسحب الشعيرات الدموية مع القيم المعلمة المناسبة (الحرارة: التعلية، سحب: 60، فيل: 70، والتأخر: 70 وضغط 200) وسحب الشعيرات الدموية مع برنامج مصمم وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
      ملاحظة: A الشعرية تنتهي مع عدد قليل ميكرومتر قطرها ضروري لتشكيل 100 ميكرون الحبرية التي كتبها تطبيق ورقةيينغ الضغط مع ~ 10 كيلو باسكال. إذا كان في نهاية غيض من الشعرية هي صغيرة جدا، أعلى من ذلك بكثير ضغط،> 600 كيلو باسكال، مطلوب للحصول على قطرة، في حين أنه من الصعب التحكم في حجم قطرات مع كبير جدا نهاية طرف الشعرية.
  2. امتصاص الدهون الفوسفاتية على سطح قطرة
    ملاحظة: لتشكيل أحادي الطبقة فوسفورية في واجهة منحنية من قطرات، حل فوسفورية بدون صبغ الموسومة الفوسفورية يستخدم للحصول على النقيض من ذلك شدة، ضد أحادي الطبقة مسطحة، من خلال إجراء 1. إعداد وبالإضافة إلى ذلك، على حد سواء إجراءات 2.2.1 و 2.2 0.2 هي المسموح به هنا. إذا مراقبة دقيقة من الضغط السطحية على سطح قطرات ضرورية، ينصح بشدة الإجراء 2.2.2. ومع ذلك، إذا لم يكن كذلك، 2.2.1 الداخلي، الذي هو وسيلة أسهل بكثير من الإجراء 2.2.2، مفيد.
    1. عملية طلاء الفوسفورية في نهاية الحافة
      1. تنظيف الزجاج الشريحة باستخدام الأسيتون، والإيثانول، والماء منزوع الأيونات ثلاث مرات على الأقل.
      2. ررايس الشعرية مدبب على شريحة زجاجية تنظيفها، والميل الشعرية لتسهيل لمس شريحة زجاجية مع نهاية الحافة.
      3. إسقاط بضع قطرات من محلول فوسفورية (1 ملغ / مل) إلى نهاية غيض من الشعرية التي انضمت إلى شريحة زجاجية باستخدام حقنة زجاجية، والانتظار على الأقل 30 دقيقة حتى يتبخر المذيب تماما.
        ملاحظة: ينصح بشدة على التمسك نهاية غيض من الشعرية إلى الشريحة الزجاجية أثناء إجراء 2.2.1.3 لمحيط نهاية طرف صغير جدا للاحتفاظ قطرات من الدهون الفوسفاتية في نهاية طرف إلا بالقوة الشعرية.
    2. إعداد حل حويصلة
      1. تنظيف قنينة، وإزالة الماء من القنينة، كما أدخلت في إجراء 1.1.1.1.
      2. تجف حجم 2 مل من محلول فوسفورية (1 ملغ / مل) من خلال تطبيق غاز النيتروجين بلطف، ويجفف القارورة لمدة 1 ساعة على RT للقضاء على ما تبقى من المذيبات. تنفيذ هذا الإجراء في غطاء الدخان للسلامة.
      3. إضافة 2مل من الماء منزوع الأيونات في قارورة تحتوي على الدهون المجففة، واحتضان القارورة في فرن عند 60 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
      4. يهز قنينة عدة مرات، ويصوتن (HF-التردد: ما يصل إلى 40 كيلو هرتز، والسلطة: 370 W) لمدة 30 دقيقة للحصول على الحويصلات.
      5. أداء عمليات البثق وتجميد أذاب للحصول على الحويصلات unilamellar monodisperse. يوصف بروتوكول مفصلة لإعداد الحويصلات في ماير وآخرون. 21.
        يتم التحكم في الضغط السطحي واجهة قطرات على وجه التحديد عن طريق ضبط وقت الانتظار بعد تشكيل الحبرية التي تحتوي على حويصلات unilamellar monodisperse: مذكرة. باستخدام طريقة قطرة قلادة 22، فمن الضروري لقياس التغير في ضغط السطح وفقا لآخر، قبل القيام التجربة.
  3. تشكيل الحبرية التي تحتوي على أحادي الطبقة فوسفورية على سطح منحن
    1. ملء الشعرية مدبب مع 10 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات من الاجراءالبريد 2.2.1. بدلا من ذلك، استخدم 10 ميكرولتر من الحل الحويصلة من إجراء 2.2.2.
    2. ربط الشعرية إلى الآلية الدقيقة حاقن لتوفير الضغط لتشكيل الحبرية.
    3. جبل الشعرية متصلة حاقن الصغرى إلى micromanipulator للسيطرة على الموقف من الشعرية على وجه التحديد.
    4. إعداد المجهر حقل مشرق (1 مجهر، عدسة الهدف: 10X NA 0.3) لتصوير وجهة النظر الجانبي من شعري مع كاميرا CCD. المجهر 1 مما يتيح لمراقبة الموقف الدقيق للالحبرية على طول محور Z وتقدير حجم الحبرية.
    5. نقل نهاية طرف على الموقف حيث وجهة النظر الجانبي من نهاية طرف هو تصور جيد عن طريق مجهر 1 باستخدام micromanipulator، وتطبيق ضغط متغير (~ 100 باسكال) مع نهاية غيض من الشعيرات الدموية، وحتى حجم مناسب (~ 100 يتم تشكيل ميكرون في القطر) من الحبرية.
      ملاحظة: من المستحسن أن الآلية الدقيقة حاقن وmicromanipulator يكون الاستخدامد، إذا مراقبة دقيقة لحجم القطيرات وموقع الحبرية ضرورية. ومن الممكن أيضا استخدام تلك اليدوي.

3. التصوير مضان الانتعاش بعد دمج قطرة

ملاحظة: المبادئ الأساسية لهذا البروتوكول هي مماثلة لتلك التي من تقنية FRAP، باستثناء عملية هبوط التحام. تتوفر في A. لوبيز وآخرون 15 و D. اكسلرود وآخرون. 16 البروتوكول وما يتصل بها من نظريات مفصلة من FRAP.

  1. مراقبة والسيطرة على موقع الحبرية
    1. إعداد مجهر مقلوب مجموعة (مجهر 2، عدسة الهدف: 10X NA 0.3، عدسة أنبوب: البعد البؤري 17 سم) التي تمكن كلا المجهر مضان مع مجموعة مرشح مناسب لالرودامين-DPPEs (الإثارة في 560 نانومتر، والانبعاثات في 583 نانومتر) والمجهر حقل مشرق. استخدام كاميرا CCD هنا لتصور وجهات العليا من قطيرة مع المجهر مضان مقصيدة ووضع المجهر مشرق الميدان.
    2. تحريك قطرات المغلفة مع فسفوليبيد إلى واجهة بين الهواء والماء مسطحة على طول محور Z، ولكن لا دمج قطرة حتى الآن، وذلك باستخدام micromanipulator. استخدام مجهر 1 إلى تصور وجهة النظر الجانبي من الحبرية.
    3. تحديد الحبرية في مركز العرض العلوي من أحادي الطبقة مسطحة، وذلك باستخدام micromanipulator. استخدام وضع المجهر مشرق الميدان مجهر 2 لتصور رأي كبار من أحادي الطبقة مسطحة.
  2. دمج الحبرية على واجهة بين الهواء والماء مسطحة
    1. نقل الحبرية كذلك نحو واجهة مسطحة حتى يدمج الحبرية على واجهة، وذلك باستخدام micromanipulator. إذا لم يتم القيام بعملية الدمج بنجاح، وهي منطقة مظلمة مع شكل دائري محاط خلفية بيضاء، لوحظ استخدام وضع مضان المجهر 2.
    2. تسجيل سلسلة من الصور الفلورسنت وفقا لآخر بعد دمج الحبرية، وذلك باستخدام طريقة مضان من مايكروونمواجهة 2. استخدام معدل الإطار أسرع من النطاق الزمني نشر أحادي الطبقة هنا. في DOPC أحادي الطبقة، يستغرق بضع دقائق لنزع فتيل في منطقة 200 ميكرون مظلمة تماما.

4. تحديد معامل إنتشار بواسطة تحليل الصور

ملاحظة: لتحديد معامل الانتشار من سلسلة من الصور، هو مبني برنامج مخصص لتحليل الصور كما هو موضح أدناه. A شفرة المصدر مفصل لهذا البرنامج متاح في الموقع إن الرب.

  1. الكشف عن منطقة دائرية من الفائدة
    1. الكشف عن مركز المنطقة ذات الاهتمام
      1. الحصول على سلسلة من الصور الفلورسنت التي تم تسجيلها خلال عملية الانتعاش الذي يحتوي على منطقة مظلمة دائرية وخلفية بيضاء، وضبط الصورة الأولى من سلسلة كصورة مرجعية. هنا، R D هو نصف قطر منطقة مظلمة في صورة مرجع.
      2. ملفوف الصورة المرجعية مع دائرة بيضاء الذينكثافة حد ذاتها هي موحدة على المنطقة بأسرها. استخدام وظيفة جزءا لا يتجزأ من اسمه 'conv2 "للالتفاف كما هو مبين في التعليمات البرمجية المصدر من الخط برنامج مخصص 124. هنا، ونصف قطر الدائرة البيضاء أصغر قليلا من R D.
      3. العثور على الموقف الذي يدل على قيمة الحد الأدنى في حساب الالتواء، ووضع هذا الموقف كمركز للمنطقة مصلحة في الصورة المرجعية.
    2. تحديد دائرة نصف قطرها المنطقة ذات الاهتمام
      1. ملفوف الصورة المرجعية مع دائرة بيضاء تحتوي على موقف وسط، والتي تحددها إجراء 4.1 وكثافة موحدة على المنطقة بأسرها. هنا، R S هو نصف قطر الدائرة البيضاء. استخدام التكرار مثل 'ل' أو 'في حين أن' مع معادلة دائرة لجعل دائرة بيضاء كما هو مبين في التعليمات البرمجية المصدر من الخط برنامج مخصص 102-109.
      2. ملفوف الصورة المرجعية مع دائرة بيضاء أخرى التي لديها قليلادائرة نصف قطرها أكبر (5٪ -10٪)، R L، من R S. استخدام نفس الأسلوب مع الإجراء 4.1.2.1 لجعل الدائرة كما هو موضح في التعليمات البرمجية المصدر من الخط برنامج مخصص 113-120.
      3. الحصول على الفرق في القيمة بين الحسابات الإلتواء 4.1.2.1 و4.1.2.2.
      4. كرر الإجراءات المذكورة أعلاه من R S = R D / 2 إلى R S = 2R D، عن طريق زيادة كل من R S و R L مع مستوى بكسل. جعل التكرار الذي يحتوي رموز المصدر كاملة من 4.1.2.1 الإجراء ل4.1.2.3 لتكرار.
      5. العثور على دائرة نصف قطرها R S الذي يشير إلى الفرق الأقصى في القيمة بين الحسابات التفاف اثنين. استخدام وظيفة جزءا لا يتجزأ من اسمه "ماكس" للعثور على دائرة نصف قطرها يشير إلى الفرق الأقصى في القيمة كما هو موضح في التعليمات البرمجية المصدر من الخط برنامج مخصص 148 إلى 149. هذه R S مما يدل على نصف قطر منطقة مظلمة في الصورة المرجعية.
    3. حساب كثافة كسور
      1. تحديد الدائرة التي تحتوي على موقف المركز ودائرة نصف قطرها، والتي تحددها الإجراء 4.1 كمنطقة ذات الاهتمام.
      2. حساب متوسط ​​كثافة المنطقة من الفائدة في سلسلة من الصور مضان وفقا لآخر. ملفوف كل إطار مع المنطقة من اهتمام ونقسمه مجال المنطقة من اهتمام لحساب متوسط ​​الكثافة. تتوفر في التعليمات البرمجية المصدر من البرنامج مخصصة الذي يتوفر في الموقع إن الرب التفاصيل.
      3. حساب كثافة كسور، الذي يعرف بأنه المعادلة أدناه، حيث F (ر) هو متوسط ​​كثافة في الدائرة التي هي منطقة ذات الاهتمام وفقا لآخر، F i غير شدة الأولية في الدائرة، وF o غير شدة خلفية بيضاء.
        و (ر) = (F (ر) - F ط) / (F س - F ط) (المعادلة 1).
    4. تركيب وكثافة ractional لنظرية FRAP
      1. تناسب كثافة كسور مع المعادلة أدناه، حيث τ هو وقت انتشار مميزة وI 0، I 1 يتم تعديل وظائف بسل، وذلك باستخدام برنامج المناسب، والحصول على τ
        المعادلة 2 (المعادلة 2).
      2. الحصول على معامل الانتشار على أساس العلاقة، τ = أ 2/4 D، حيث D هو معامل الانتشار وهي نصف قطر منطقة مظلمة.
        ملاحظة: خلال عملية تركيب، فمن الممكن لتحويل ملف كثافة كسور على طول محور الزمن عند عملية الانتعاش قد بدأت بالفعل، قبل تسجيل الصور.

Representative Results

تم الحصول على سلسلة من الصور مضان مع مرور الوقت أثناء عملية الاسترداد بعد دمج قطرات المغلفة مع أحادي الطبقة DOPC الصعود إلى DOPC أحادي الطبقة مسطحة، كما هو موضح في الشكل 1. وكان مخدر وأحادي الطبقة DOPC في واجهة بين الهواء والماء مسطحة مع كميات قليلة من رودامين-DPPE، وهذا مما جعل من الممكن تصور خلفية ذات لون مشرق ومنطقة مظلمة المضافة حديثا إلى واجهة مسطحة. هناك، لوحظ وجود عملية الانتعاش في 23 مليون / م الضغط سطح ثابت. ويرد نوبة من المعادلة 1 لتغير كثافة كسور وفقا لآخر في الشكل 2. قيمة R 2 من هذا يصلح هو 0.999، وهذا صالح لا يزال يعمل بشكل جيد حتى في انخفاض أو ارتفاع ضغط السطح. وكان معامل انتشار أحادي الطبقة DOPC تم الحصول عليها من هذا يصلح 27.54 ميكرومتر 2 / ثانية في 23 مليون / م من سطح الضغط.

لمزيد من التحقق من صحة فرام، معاملات نشر من DOتم قياس PC وdipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) الطبقات الوحيدة فقا لضغط السطح. كما هو مبين في الشكل (3)، فرام يلتقط الانخفاض السريع للمعامل انتشار أحادي الطبقة DPPC في ~ 9 مليون / م من ضغط السطح، حيث LC (السائل مكثف) - LE (توسيع السائل) مرحلة انتقالية يحدث 10، وقيم يتم الاتفاق على معاملات نشر أيضا بشكل جيد مع القياسات من قبل بيترز وآخرون. 19. وبالإضافة إلى ذلك، لوحظ واضمحلال الأسي من معامل الانتشار مع الضغط السطحي في أحادي الطبقة DOPC، وهذا الاتجاه هو متطابقة تقريبا مع واحد يقاس كاروسو وآخرون. 12.

الشكل 1
الشكل 1. (A) توضيح تخطيطي لفرام (الانتعاش مضان بعد دمج) تقنية. كما الشفةيتم دمج أحادي الطبقة المغلفة معرف الحبرية للشقة واجهة بين الهواء والماء، أحادي الطبقة الدهنية دون مضان الموسومة يتم إدخال الدهون في شقة الفلورسنت الدهن أحادي الطبقة. الصور (B) مضان المجهر مع مرور الوقت أثناء عملية استرداد أحادي الطبقة DOPC في 23 مليون / م من سطح الضغط (مقياس بار = 100 ميكرون). وتعافى تماما من المنطقة المظلمة من أحادي الطبقة DOPC بواسطة عملية الانتشار في غضون عدة دقائق. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الشكل 2. كثافة كسور مقابل الوقت. الدوائر السوداء وخط منقط الرمادية تشير قيم شدة كسور تم الحصول عليها من تحليل الصور (إجراءات 4.1 و 4.2) ونوبة من المعادلة 1 إلى شدة كسور مع مرور الوقت،هو مبين في الإجراء 4.3، على التوالي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. معاملات إنتشار DOPC (المثلث) وDPPC (مربع فارغ) الطبقات الوحيدة بوصفها وظيفة من ضغط السطح. خطوط مع اللون الرمادي مشرق ومع اللون الرمادي الداكن تشير إلى قيم معامل الانتشار ذكر سابقا من قبل بيترز وآخرون. وكاروسو وآخرون، على التوالي. تم تعديل هذا الرقم من جيونج وآخرون. 23. أعيد طبعها بإذن من جيونج وآخرون. انجميور 30 (48)، 14369-14374. حقوق الطبع والنشر 2014 الجمعية الكيميائية الأمريكية. يرجى النقر لهاه لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

فرام تشترك في الكثير من المبادئ الأساسية مع FRAP، وخاصة لقياس الانتعاش بعد مضان تبيض منطقة معينة، ولكن يستخدم فرام عملية دمج قطرات على واجهة مسطحة لتشكيل منطقة المبيض، بدلا من تطبيق الضوء المكثف. عملية دمج وهكذا أهم خطوة في فرام، وخاصة، وشكل لطخة سوداء في أحادي الطبقة مسطحة بعد دمج قطرات يحدد دقة القياس الانتشارية. على وجه التحديد، استنادا إلى الطريقة الحالية، ونحن فقط تعيين دائرة نصف قطرها R كمنطقة ذات الاهتمام لحساب متوسط ​​كثافة لطخة سوداء، كما هو موضح في إجراء 4، وإذا كان هناك الكثير من الانحراف عن الشكل الدائري، هذا من شأنه تعكير صفو قياس دقيق لمعامل الانتشار. وبالتالي، فمن الضروري للحصول على المنطقة الداكنة على شكل دائري، ولكن، يتم تشكيل الأشكال noncircular في بعض الأحيان نظرا لعدة أسباب. أولا، في حال وجود تدفق الحمل الحراري في الحيوانات الأليفةطبق ري، شكل منطقة مظلمة يصبح ممدود على طول اتجاه التدفق. كما هو مذكور في الإجراء 1.3، وهو جهاز مخروطية الشكل يساعد على منع تدفق الحمل الحراري، وسيتم التقليل من هذه الاستطالة. ثانيا، إذا كان في نهاية غيض من الشعرية تلامس واجهة مسطحة خلال عملية الدمج، ويتم تشكيل منطقة مظلمة مع مجموعة متنوعة من الأشكال منذ نهاية الشعرية المقاطعات عملية الدمج. عن طريق الحصول على قطرة أن هو معلق فقط من نهاية جدا من الشعيرات الدموية، ويمكن الوقاية من هذا الانقطاع. على وجه الخصوص، علاج مسعور من الشعرية يساعد الحبرية للجلوس في النهاية من الشعيرات الدموية. ولذلك، إطلاق النار المتاعب المذكورة أعلاه والتعديلات تمكننا من قياس خصائص الانتشار على نحو أدق.

وبالتالي يسمح هذا عملية troubleshot جيدا فرام لديك عدة مزايا هامة على FRAP. أولا، يتطلب فرام المعدات أبسط مقارنة مع FRAP. لفرام، فإنه يكفي لاستخدام مايكروين مضان بسيطةالتعامل، بدلا من مجهر متحد البؤر مكلفة مع ليزر عالية الطاقة التي يجب أن تتطابق مع الطيف امتصاص الصبغة الطول الموجي. وبالإضافة إلى ذلك، فمن الضروري استخدام جهاز إضافي لضبط حجم لمنطقة المبيض في FRAP، في حين تسيطر على فرام حجم المنطقة بسهولة عن طريق ضبط حجم القطيرات، أو الضغط السطحية على سطح الحبرية. ثانيا، من الممكن استخدام أنواع مختلفة من الأصباغ في فرام. FRAP يستخدم فقط جزيئات الصبغة التي هي أسرع بكثير من عملية نشر عملية التبييض. إذا كان نشر الأصباغ يحدث أثناء عملية التبييض، وأنه من الصعب تقدير الممتلكات نشرها بدقة. فرام، ومع ذلك، لا تتطلب عملية لتبيض الأصباغ وهذا بالتالي يمكن استخدام أنواع مختلفة من الأصباغ في التصوير مضان. بالإضافة إلى ذلك، FRAP يتطلب الليزر إضافية عالية الطاقة ومرشح يضع لتغيير نوع الصبغة، في حين أنه من الضروري فقط لاستبدال مجموعات مرشح في فرام. أخيرامنذ الطبقات الوحيدة على سطح قطرة واجهة مسطحة يمكن تشكيلها بشكل مستقل، وبالتالي تمكين دراسة بين نشر أو خلط بين الطبقات الوحيدة الدهون المختلفة من خلال دمج وهناك نوع أحادي الطبقة إلى B-نوع أحادي الطبقة، في حين أن FRAP يقيس فقط نشر الذاتي للأحادي الطبقة.

وعلى الرغم من هذه المزايا، فإن عملية دمج قطرات على واجهة بين الهواء والماء مسطحة يمكن أن تحد هذه التقنية بسبب العديد من القضايا التي قد تكون مثيرة للقلق، مثل عدم تطابق ضغط السطح بين الطبقات الوحيدة، وهما النطاق الزمني لعملية الدمج ، وزيادة في ضغط سطح أحادي الطبقة مسطحة بعد دمج قطرات. هذه القضايا، ومع ذلك، لا يؤثر على قياس انتشار كبير للأسباب التالية. أولا، على الرغم من الضغوط السطحية في اثنين من الطبقات الوحيدة المختلفة هي مختلفة تماما، اكتمال عملية موازنة في مرحلة مبكرة جدا أثناء عملية الاسترداد. على سبيل المثال، إذا ركان السطح ضغط أحادي الطبقة على سطح القطيرات هو أعلى من أحادي الطبقة في واجهة بين الهواء والماء مسطحة، توسع منطقة مظلمة حتى equilibrates ضغط السطح. منذ الانتهاء من هذه العملية في غضون 10 ميللي ثانية، سيتم المتوازنة ضغط السطح قبل أن يؤثر على عملية الانتشار بشكل ملحوظ. ثانيا، إذا كان النطاق الزمني لعملية دمج سريع بما فيه الكفاية، فإنه لا يحد من قياس نشر على الإطلاق. لحسن الحظ، يتم إكمال عملية دمج نموذجية أيضا في غضون 10 مللي ثانية. وأخيرا، دمج حتى عدة قطرات على واجهة مسطحة لا زيادة ضغط السطح منذ مساحة الحوض الصغير هو أكبر بكثير من المساحة السطحية للالحبرية. وفقا لأحجام الحوض الصغير وقطرات، هو موضح في البروتوكول، والمساحة المخصصة لكل جزيء يزيد أقل من 0.015٪ عن طريق دمج قطرة. وفقا لذلك، وزيادة ضغط السطح نتيجة لتغيير المساحة لكل جزيء أقل من 0.1٪، وهو negligiblه لأنه أصغر بكثير من الخطأ نموذجي في ضغط السطح، مقاسا Wilhelmy لوحة مقياس التوتر السطحي.

باختصار، قدمنا ​​طريقة جديدة لقياس خاصية الانتشار الأفقي للأحادي الطبقة فوسفورية خلال دمج أحادي الطبقة قطرات على واجهة مسطحة. هذه التقنية تتطلب معدات بسيطة نسبيا وتمكن أيضا استخدام أنواع مختلفة من أنواع الصبغة. فرام بالتالي يمكن تطبيقها لقياس نشر أي عوامل نشطة السطح، بما في ذلك الفوسفورية، بوليمرات كتلة والبروتينات وحتى النانوية في واجهة السائل السائل. وعلاوة على ذلك، فإننا نتوقع أن فرام يوفر طريقة جديدة لدراسة بين نشر أو خلط بين مختلف عناصر نشطة السطح.

Acknowledgments

ويؤيد هذا العمل من قبل K-وادي RED & B مشروع ممول KAIST-لعام 2014 وبرنامج بحوث العلوم الأساسية من خلال المؤسسة الوطنية لكوريا البحوث (NRF- 2012R1A6A3A040395، جبهة الخلاص الوطني، 2013R1A1A2057708، NRF- 2012R1A1A1011023).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone OCI corporation Acetone 3.8L Extra Pure Purity: ≥ 99.5%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use.
Ethanol OCI corporation Ethanol 3.8L Extra Pure Purity: ≥ 94%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use.
Dioleoylphosphatidylcholine, DOPC Avanti Polar Lipids 850375C Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Chloroform is carcinogenic.
Chloroform LiChrosolv Chloroform ultrapure (A3633) Purity: ≥ 99.8%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Carcinogenic
Rhodamine DPPE Avanti Polar Lipids 810158C, 810158P Avoid direct light exposure to prevent photobleaching
Wilhelmy plate tensiometer R&K ultrathin organic film technology Wilhelmy tensiometer http://www.rieglerkirstein.de/index.htm
Micropipette puller Sutter instrument P-1000
Micro-injector Eppendorf Femtojet
Micromanipulator Eppendorf Micromanipulator 5171
Microscope 1 Objective lens: Olympus Objective lens: UPlanFl 10x Objective lens: 10X NA 0.3
Microscope 2 Objective lens: Olympus, Tube lens: Thorlabs Objective lens: UPlanFl 10x Objective lens: 10X NA 0.3, tube lens: focal length 17 cm
CCD for Microscope 1 Jai CV 950 camera
CCD for Microscope 2 Andor iXon3 EMCCD
Filter set Chroma technology Catalog Set 49004: ET545, T565, ET605 Prepare suitable for dye molecules
Sonicator DAIHAN Scientific Wiseclean WUC-D06H

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (2), 112-124 (2008).
  2. Christon, R., Even, V., Daveloose, D., Léger, C. L., Viret, J. Modification of fluidity and lipid—protein relationships in pig intestinal brush-border membrane by dietary essential fatty acid deficiency. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 980 (1), 77-84 (1989).
  3. Stubbs, C. D., Smith, A. D. The modification of mammalian membrane polyunsaturated fatty acid composition in relation to membrane fluidity and function. Biochim. Biophys. Acta - Rev. Biomembr. 779 (1), 89-137 (1984).
  4. Holthuis, J. C. M., Menon, A. K. Lipid landscapes and pipelines in membrane homeostasis. Nature. 510 (7503), 48-57 (2014).
  5. Alonso, C., Waring, A., Zasadzinski, J. A. Keeping lung surfactant where it belongs: protein regulation of two-dimensional viscosity. Biophys. J. 89 (1), 266-273 (2005).
  6. Kim, K., Choi, S. Q., Zell, Z. a, Squires, T. M., Zasadzinski, J. A. Effect of cholesterol nanodomains on monolayer morphology and dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.). 110 (33), E3054-E3060 (2013).
  7. Hormel, T. T., Kurihara, S. Q., Brennan, M. K., Wozniak, M. C., Parthasarathy, R. Measuring Lipid Membrane Viscosity Using Rotational and Translational Probe Diffusion. Phys. Rev. Letters. 112 (18), 188101 (2014).
  8. Ding, J., Warriner, H. E., Zasadzinski, J. a, Schwartz, D. K. Magnetic needle viscometer for Langmuir monolayers. Langmuir. 18 (13), 2800-2806 (2002).
  9. Dhar, P., Cao, Y., Fischer, T. M., Zasadzinski, J. A. Active interfacial shear microrheology of aging protein films. Phys. Rev. Letters. 104 (1), 1-4 (2010).
  10. Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Interfacial microrheology of DPPC monolayers at the air-water interface. Soft Matter. 7 (17), 7782-7789 (2011).
  11. Choi, S. Q., Steltenkamp, S., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Active microrheology and simultaneous visualization of sheared phospholipid monolayers. Nature Commun. 2 (5), 312 (2011).
  12. Caruso, F., et al. Determination of lateral diffusion coefficients in air-water monolayers by fluorescence quenching measurements. J. Am. Chem. Soc. 113 (16), 4838-4843 (1991).
  13. Filippov, A., Orädd, G., Lindblom, G. The effect of cholesterol on the lateral diffusion of phospholipids in oriented bilayers. Biophys. J. 84 (5), 3079-3086 (2003).
  14. Schwille, P., Korlach, J., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy with single-molecule sensitivity on cell and model membranes. Cytometry. 36 (3), 176-182 (1999).
  15. Lopez, A., Dupou, L., Altibelli, A., Trotard, J., Tocanne, J. F. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments under conditions of uniform disk illumination. Critical comparison of analytical solutions, and a new mathematical method for calculation of diffusion coefficient D. Biophys. J. 53 (6), 963-970 (1988).
  16. Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).
  17. Vaz, W. L., Clegg, R. M., Hallmann, D. Translational diffusion of lipids in liquid crystalline phase phosphatidylcholine multibilayers. A comparison of experiment with theory. Biochemistry. 24 (3), 781-786 (1985).
  18. Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. Lateral diffusion in phospholipid multibilayers measured by fluorescence recovery after photobleaching. Biochemistry. 16 (17), 3836-3841 (1977).
  19. Peters, R., Beck, K. Translational diffusion in phospholipid monolayers measured by fluorescence microphotolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.). 80 (23), 7183-7187 (1983).
  20. Kuhn, H., Mobius, D., Bucher, H. Physical Methods of Chemistry. Crawley, J. N., et al. 1, Part 3B, 651-653 (1972).
  21. Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 858 (1), 161-168 (1986).
  22. Rotenberg, Y., Boruvka, L., Neumann, A. Determination of surface tension and contact angle from the shapes of axisymmetric fluid interfaces. J. Colloid Interface Sci. 93 (5), 169-183 (1983).
  23. Jeong, D. W., Kim, K., Lee, S., Choi, M. C., Choi, S. Q. Fluorescence recovery after merging a surfactant-covered droplet: a novel technique to measure the diffusion of phospholipid monolayers at fluid/fluid interfaces. Langmuir. 30 (48), 14369-14374 (2014).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 104، فرام، ونشرها، وانخفاض التحام، أحادي الطبقة فوسفورية، FRAP، بين الانتشار، واجهات السائل السائل
مضان الانتعاش بعد دمج قطرات لقياس انتشار ثنائي الأبعاد من الفوسفوليبيدية واحد رقائق
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jeong, D. W., Kim, K., Choi, M. C.,… More

Jeong, D. W., Kim, K., Choi, M. C., Choi, S. Q. Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer. J. Vis. Exp. (104), e53376, doi:10.3791/53376 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter