Introduction
Fosfolipidler önemli hücre zarlarının yapı parçalarıdır ve organellerin zarları, ve bu membran katmanlarının akışkanlığı genellikle membran proteinlerinin 1 aktivitesini değiştirerek hücresel fonksiyonları etkiler - 3. Örneğin, membran için homeostazda zar proteinleri ile tespit edilir membran akışkanlığını düzenleyen elde edilir ve akışkanlık anormal düzeyde hepatik steatoz ve kolestaz 4 gibi ciddi hastalıklara neden olur. Buna ek olarak, hava alveol sıvı arayüzünde bir fosfolipid tek tabaka akışkanlığı fonksiyonları önemli etkileri vardır. Düşük akışkanlık ekshalasyonun 5,6 sırasında alveol içinde kalmak katmanı sağlar, oysa akciğer yüzey fosfolipid tek tabaka yüksek akışkanlık, inhalasyon sırasında katmanın yayılmasını kolaylaştırır. Bu rollerini anlamak için fosfolipid tabakaların akışkanlığını tahmin etmek oldukça önemlidir.
_content "> akışkanlığı bir doğrudan bir ölçüsüdür viskozitesi ve fosfolipid tabakaların viskozitesi mikron boyutunda kolloidleri 7, manyetik iğneler 8,9 ve manyetik mikro-düğme 6,10,11 kullanılarak ölçülmüştür. Bununla birlikte, bu tekniklerin nispeten sert filmler sınırlıdır ve daha az viskoz filmler ölçemez. Bu gibi durumlarda, yayınım fosfolipid tabakaların akışkanlığını ölçmek için bir alternatif olacaktır. Birkaç on yıl için, fosfolipid tabakaların difüzyon özelliklerini ölçmek için çeşitli teknikler geliştirilmiştir Böyle floresan su verme yöntemi 12, darbeli alan degrade NMR 13 ve flüoresan korelasyon spektroskopisi (FCS) en iyi temsil eden yöntemlerden 14. Bir şekilde (sıkı bağlamak) 15,16 photobleaching sonra floresan kurtarma olduğunu. ölçüm prosedürü ve ilgili basitliği nedeniyle Fosfolipid katmanların difüzyon özelliklerine teori, çeşitli çalışmalar FRAP kullanılarak yapılmıştırBurada, biz (FRAM) birleştirdikten sonra floresan kurtarma olarak adlandırılan fosfolipid mono tabakaları, yanal difüzyonunu ölçmek için yeni bir teknik sunuyoruz. FRAP ve FRAM arasındaki temel fark photobleaching adım damla birleşme yerini olmasıdır. Bir floresan etiketli düz tek tabaka üzerine olmayan floresan tek tabaka ile kaplıdır bir damlacık birleştirme, böylece photobleaching aşaması ile aynı başlangıç durumunu kurma, parlak düz tek tabaka üzerinde dairesel koyu bir leke bırakır. Daha sonra yanal yayılma ölçmek için zaman karanlık leke floresan kurtarma gözlemlemek. Damla birleşme ile bu yeni "ağartma" adım FRAP göre önemli avantajlar sağlamaktadır: FRAM sadece bir floresan mikroskop ziyade FRAP için gerekli olan bir yüksek güç lazer ile pahalı bir konfokal mikroskop gerektirir. beno photobleaching sürecini içermez çünkü n eklenmesi, FRAM floresan boyaların geniş bir yelpazesi vardır. Son olarak, iki farklı tek tabakalar bir damlacık tek tabaka ve düz tek-tabakalı, ve böylece sıkı bağlamak yalnızca mono tabakaları kendi kendine difüzyonunu ölçer interdifüzyon, ölçülmesine izin verecek şekilde, bağımsız bir şekilde hazırlanabilir.
FRAM yaklaşık sürtünmesiz materyallere oldukça yapışkan bir malzemeden difüzyon ölçümleri, geniş bir dizi sağlar. Difüzyon damla coalescence süreci (~ 10 msn) zamanında bölgede 100 mikron 100 mikron arasında meydana geldiğinde Prensipte, FRAM, mevcut tekniklere karşılaştırılabilir 10 6 mikron 2 / sn, maksimum yayılma ölçebilirsiniz. Tek molekül sıraları, katı olmadıkça Ayrıca, yavaş bir difüzyon işlemi kolaylıkla ölçülebilir. FRAM sürece uygun floresan etiketli moleküller bulunmaktadır gibi yüzey aktif maddelerin her türlü için kullanılabilir.
Protocol
Dikkat: kanserojen aseton ve kloroform Kullanmadan önce Malzeme Güvenlik Bilgi Formları (MSDS) bakın.
Düz hava su ara-yüzünde Fosfolipid Monolayer hazırlanması 1.
- Bir fosfolipid tek tabaka oluşumu
- Bir fosfolipid çözeltisinin hazırlanması
- Aseton, etanol ve deiyonize su, en az üç kez kullanarak bir politetrafloroetilen kaplı kap Şişeyi ve su kurtulmak için şişe içine iyice azot gazı darbe ml bir 4 temizleyin.
- Fosfolipidin 1 mg çözülür (örneğin, dioleoilfosfatidilkolin, DOPC) şişe içinde kloroform 1 ml 1 mg / ml konsantrasyon elde edilmiştir. Güvenliği için Davlumbaz bu yordamı gerçekleştirin. Fosfolipid çözeltisinin daha düşük ya da daha yüksek konsantrasyonlarda gerektiğinde kullanın.
- Ekle boya fosfolipidleri etiketli (örneğin, Rodamin dipalmitoilfosfatidiletanolamin, Rodamin DPPE) fosfolipid Solu az 1 mol ile%tion, bir floresan mikroskobu ile fosfolipid tek tabaka görselleştirmek için. Güvenliği için Davlumbaz bu yordamı gerçekleştirin.
- Çözücü buharlaşmasını önlemek için politetrafloroetilen bant ile flakon sarın ve -20 ° C'de bir dondurucuda örnek saklayın.
- Hava-su arayüzü üzerine Fosfolipidlerin Biriktirme
- Petri (çapı 55 mm ve yüksekliği 12 mm) etanol ve deiyonize su, en az üç kez temizleyin.
- Bir hava-su ara yüzeyine oluşturmak için deiyonize su, 10 ml ile Petri doldurun.
- Istenilen yüzey basıncını elde etmek ve önceki deney yapıyor, tamamen çözücü buharlaşması için en az 30 dakika beklemek temiz bir arayüz üzerine mikro şırınga ile fosfolipid çözümün birkaç mikrolitre yayıldı.
Not: Langmuir çukur yüzeyi basınç hassas kontrol gerekirse yerine Petri kabı kullanılabilir.
- Bir fosfolipid çözeltisinin hazırlanması
- Surface basıncı ölçümü
- Bir Wilhelmy plakası tansiyometre ile fosfolipid tek tabaka yüzey basıncını ölçün. Filtre kağıdı bir Wilhelmy plaka olarak kullanıldığında, filtre kağıdı kadar ıslatılmış almak için en az 30 dakika boyunca bekleyin. Ayrıntılı bir protokol Kuhn ve diğerleri mevcuttur. 20.
- Tam yüzey basıncını kontrol etmek fosfolipid yatırılan miktarını ayarlayın. ~ 5 mN / m bir yüzey basıncı, eğer arayüzün 30,25 cm 2 'lik üzerine DOPC çözeltisi (1 mg / ml) içinde 4 ul ekle gereklidir.
Not: Filtre kağıdı tam ıslatılmış değilse, yüzey basıncı nedeniyle filtre kağıdı ağırlık değişimi için deney ilk 30 dakika boyunca büyük ölçüde değişir.
- Tek tabakalı konvektif akışının minimizasyonu
- Petri kabı büyük bir bölümüne bağlı olan iki ince kanalları 3 mm rezervuarı içeren bir koni şeklinde cihazı kullanın, bir konvektif akışını bastırmak içinmorfoloji görüntüleme ve yüzey basıncı ölçümü rahatsız olabilir tek tabakalı.
- Fosfolipidler hava-su arayüzü üzerine fosfolipid biriktirilmesi önce tüm bölge üzerinde serbestçe hareket sağlamak için koni şeklinde aygıtının iç ve dış arasındaki su seviyelerinin maç emin olun.
Bir Sıvı fazı Eğimli Yüzeyinde Fosfolipid Monolayer 2. Hazırlık
- Mikropipet çektirmenin kullanarak bir cam kılcal sürecini sivrilen
- Mikropipet çektirmenin bir kılcal tutucu bir cam kapiler tüp (OD 1 mm id 0,78 mm, uzunluk 100 mm) yerleştirin.
- (: Pull, Rampa: 60, Vel: 70, Gecikme: Isı 70 ve basınç 200) uygun parametre değerleri ile kılcal çekerek tasarımı için bir program ve üreticinin protokolüne göre tasarlanan program ile kılcal çekin.
Not: Bir kılcal birkaç mikrometre çapında bir sona Appl ile 100 mikron damlacık oluşturulması için gerekli olan~ 10 kPa olan bir basınç Ying. Kılcal tepe ucu, daha yüksek bir basınç,> 600 kPa çok küçük olduğu takdirde, bir çok su emici ucu ucuna damlacıkların boyutunu kontrol etmek için sabit iken, damlacık elde etmek için gereklidir.
- Damlacık yüzeyi üzerine fosfolipidler emilimi
Not: Bir damlacık kavisli arayüzünde bir fosfolipid tek tabaka oluşturmak, boya olmadan bir fosfolipid çözüm Ayrıca prosedür 1. tarafından hazırlanan, düz tek tabakalı karşı, bir yoğunluk kontrastı elde etmek için kullanılan her iki usul 2.2.1 ve 2.2 olan fosfolipidler etiketli 0,2 Burada izin verilebilir. Damlacık yüzeyinde yüzey basıncı hassas kontrol gerekirse, prosedür 2.2.2 şiddetle tavsiye edilir. Ancak, eğer değil, prosedür 2.2.2 çok daha kolay bir yoldur prosedür 2.2.1, yararlıdır.- Bir ipucu sonunda Fosfolipidlerin sürecini Kaplama
- Aseton, etanol, deiyonize su ve en az üç kez kullanan bir slayt camını temizleyin.
- PlBir temizlenmiş slayt camına konik kılcal as ve bir ucu ucu ile slayt cam dokunmadan kolaylaştırmak için kılcal eğin.
- Bir cam şırınga kullanılarak bir cam slayt yapıştırıldığı bir kılcal kısmın ucu ucuna fosfolipid çözeltisi (1 mg / ml) bir kaç damla damlacıklar ve tamamen çözücünün buharlaştırılması için en az 30 dakika bekleyin.
Not: Bu son derece uç uç çevre sadece kılcal kuvveti ile ucu sonunda fosfolipidlerin damlacık tutmak için çok küçük olduğu için prosedür 2.2.1.3 sırasında cam slayt kılcal ucu ucuna bağlı tavsiye edilir.
- Vezikül solüsyonunun hazırlanması
- Bir şişe temizleyin ve prosedür 1.1.1.1 tanıtılan olarak, şişeden su çıkarmak.
- Yavaşça azot gazı uygulanarak fosfolipid çözeltisi (1 mg / ml) bir 2 ml hacim kurutun ve kalan çözücünün ortadan kaldırılması için oda sıcaklığında 1 saat için flakon ile kurutun. Güvenliği için Davlumbaz bu yordamı gerçekleştirin.
- 2 Ekleşişe içine ml deiyonize su lipidler, kurutuldu ve 1 saat süre ile 60 ° C'de bir fırın içinde şişe inkübe içeren.
- Flakon birkaç kez çalkalayın ve sonikasyon (HF-frekans: 40 kHz, Güç kadar: 370 W) veziküller elde etmek için 30 dakika.
- Tek dağılımlı tek lamelli veziküller elde edilmesi için ekstrüzyon ve donma-çözülme süreçleri gerçekleştirme. Hazırlanması veziküller detaylı bir protokol Mayer ve ark. 21 tarif edilmiştir.
Not: Damlacık arayüzü Yüzey basıncı monodispers unilamellar veziküller içeren damlacık oluşumundan sonra bekleme süresini ayarlayarak tam kontrol edilir. Bir kolye bırak yöntemini kullanarak 22, önceden deney yapıyor, zamana göre yüzey basıncı değişimi ölçmek için gereklidir.
- Bir ipucu sonunda Fosfolipidlerin sürecini Kaplama
- Kavisli yüzeyinde bir fosfolipid tek tabaka içeren bir damlacık oluşumu
- Prosedüründe de-iyonize edilmiş su 10 ul'lik konik kılcal doldurune 2.2.1. Seçenek olarak ise, prosedür 2.2.2 vezikül çözeltisi 10 ul kullanın.
- Damlacık oluşturulması için basınç temin etmek üzere otomatik bir mikro enjektöre kılcal bağlayın.
- Tam olarak kılcal konumunu kontrol etmek için bir mikromanipülatör için bir mikro-, enjektöre bağlı kılcal monte edin.
- CCD kamera ile kılcal yanal görünümünü görüntüleme için: (10X NA 0.3 Mikroskop 1, objektif lens) parlak alan mikroskobu hazırlayın. Mikroskop 1 nedenle z ekseni boyunca damlanın kesin konumunu gözlemlemek ve damlacık büyüklüğünü tahmin sağlar.
- ~ 100 (uygun büyüklükte kadar kılcal ucu ucuna bir değişken basınç (~ 100 hPa) ucu ucuna yanal görünümü de bir micromanipulator kullanarak Mikroskop 1 tarafından görüntülenmiştir bir konuma uç uca getirin ve uygulamak damlacık çapı um) oluşturulur.
Not: Bu otomatik mikro enjektör ve mikromanipülatör kullanımı olması önerilird damlacık damlacık boyutu ve konumu ince kontrolü gereklidir, eğer. Bu manuel olanları kullanmak da mümkündür.
Damlacık birleştirdikten sonra 3. Görüntüleme Floresan Kurtarma
Not: Bu protokol temel ilkeleri damla kaynaştırma işlemi dışında, sıkı bağlamak tekniğin özdeştir. FRAP detaylı bir protokol ve ilgili teoriler A. Lopez ve ark., 15 ve D Axelrod vd. 16 mevcuttur.
- İzleme ve damlacık konumunu kontrol
- Rhodamine-DPPEs (560 nm'de uyarma, 583 nm emisyon) için uygun bir filtre seti ile bir floresan mikroskop hem sağlar (: 10X NA 0.3, tüp lens odak uzaklığı 17 cm Mikroskop 2, objektif lens) ayarlanmış ters bir mikroskop hazırlayın ve parlak bir alan mikroskobu. Bir floresan mikroskop m damlanın üst görüşlerini görselleştirmek için buraya bir CCD kamera kullanınkaside ve parlak alan mikroskobu modu.
- Z ekseni boyunca düz bir hava-su arayüzü bir fosfolipid ile kaplanmış damlacık taşıyabilirsiniz, ancak mikromanipülatör kullanarak, henüz damlacık birleştirme yok. Damlacık yanal görünümünü görselleştirmek için Mikroskop 1 kullanın.
- Mikromanipülatör kullanarak, düz tek tabaka üst görünümden merkezinde damlacığı bulun. Düz tek tabaka üstten görünümünü görselleştirmek için Mikroskobu 2 aydınlık alan mikroskobu modunu kullanın.
- Düz hava-su arayüzü üzerine damlacığı birleştirme
- Damlacık mikromanipülatör kullanarak, arayüzü üzerine birleştirir kadar düz arayüzü doğru daha da damlacık hareket ettirin. Birleştirme işlemi başarıyla yapılırsa, beyaz bir arka plan ile çevrili bir dairesel şekle sahip bir karanlık bölge, Mikroskop 2 floresan modunu kullanarak gözlenir.
- Micros floresan modunu kullanarak, damlacık birleştirdikten sonra zamana göre floresan görüntü serisi kaydedin2. Burada tek tabaka difüzyon süresi ölçeğinde daha hızlı bir kare hızı kullanın başa. DOPC tek tabaka olarak, tamamen 200 mikron-karanlık alana yaymak için bir kaç dakika sürer.
4. Görüntü Analizi Difüzyon Katsayısı belirlenmesi
Not: Aşağıda tarif edildiği gibi bir görüntü dizisinden difüzyon katsayısının saptanması için, görüntü analizi için özel program inşa edilmiştir. Bu programın detaylı bir kaynak kodu vallahi sitesinde mevcuttur.
- Ilgi dairesel bir tespit edilmesi
- Ilgili bölgenin merkezine tespiti
- Dairesel karanlık alanı ve beyaz bir arka plan içeren bir kurtarma işlemi sırasında kaydedilmiş olan floresan görüntüleri bir dizi elde etmek ve bir referans görüntü olarak serinin ilk resmi ayarlayın. Burada, R D referans görüntüdeki karanlık alanın yarıçapı.
- Beyaz bir daire ile referans görüntü dürülmüş kimse yoğunluğu bütün bölge üzerinde üniforma olduğunu. İşte özelleştirilmiş program satırına 124. kaynak kodda gösterildiği gibi kıvrım için 'conv2' adlı gömülü işlevini kullanın, beyaz çemberin yarıçapı R D biraz daha küçüktür.
- Kıvrım hesaplamasında asgari değeri gösterir bir pozisyon bulun ve referans görüntüdeki ilgi bölgenin merkezi olarak bu konumunu ayarlamak.
- Ilgili bölgenin çapındaki belirlenmesi
- Bütün bölge üzerinde bir prosedür 4.1 ve üniform yoğunluk tarafından belirlenen bir merkez konumunu içeren beyaz bir daire ile referans görüntü dürülmüş. Burada, R S beyaz dairenin yarıçapı. Kullan yineleme gibi 'için' veya özelleştirilmiş program satırına 109 102 kaynak kodda gösterildiği gibi beyaz bir daire yapmak için bir çemberin denklemi ile 'while' olarak.
- Biraz olan başka bir beyaz bir daire ile referans görüntü dürülmüşR, S daha büyük yarıçapı (% 5-% 10), R L,. Özelleştirilmiş program satırına 120 113 kaynak kodda gösterildiği gibi daire yapmak için prosedür 4.1.2.1 ile aynı yöntemi kullanın.
- 4.1.2.1 ve 4.1.2.2 iki convolution hesaplamalarında arasındaki değer farkı edinin.
- Bir piksel seviyesi ile R S ve R L artırarak, R S = 2R D R S = R D / 2 yukarıdaki işlemleri tekrarlayın. Tekrarlamak 4.1.2.3 prosedürü 4.1.2.1 gelen tüm kaynak kodları içeren bir yineleme olun.
- İki convolution hesaplamalar arasındaki değer maksimum farkını gösterir R S yarıçapını bulun. Bu R, böylece referans görüntüdeki karanlık alanın yarıçapını gösterir S 149. özelleştirilmiş program satırına 148 kaynak kodda gösterildiği gibi yarıçapı bulmak için 'max' adlı Kullanım gömülü fonksiyon değeri en yüksek farkını gösterir.
- Kesirli yoğunluğunun hesaplanması
- Ilgi bir bölge olarak prosedür 4.1 tarafından belirlenen bir merkez konumu ve çapındaki içeren bir daire olarak ayarlayın.
- Zamana göre flüoresans görüntü bir dizi ilgili bölgenin ortalama yoğunlukları hesaplayın. Ilgi bölgesi ile her kareyi dürülmüş ve ortalama yoğunluğunu hesaplamak için ilgi bölgenin alanına bölerek. Ayrıntılar vallahi sitesinde mevcuttur özelleştirilmiş programın kaynak kodu mevcuttur.
- F (t) zamana göre bir ilgi alanı olan bir daire içinde, ortalama yoğunluğu, aşağıdaki denklemde, tanımlanmış bir fraksiyonel yoğunluğu hesaplanır, K i daire içinde başlangıç yoğunluğu ve F o yoğunluğudur bir beyaz arka.
f (t) = (F (±) - F i) / (F o - F i) (Denklem 1).
- F takılmasıFRAP teorisine ractional yoğunluğu
- Ben 1 uydurma programı kullanarak, Bessel fonksiyonları modifiye edilmiş, τ karakteristik difüzyon süresi ve 0 aşağıda denklemi ile fraksiyonel yoğunluğunu Fit ve τ elde
(Denklem 2). - D, difüzyon katsayısı ve karanlık bir yerde yarıçapıdır ilişkisi, τ göre bir difüzyon katsayısı = a 2/4 D elde edilir.
Not: uydurma işlemi sırasında kurtarma işlemi zaten görüntüleri kaydederken önce başladığı bir zaman ekseni boyunca fraksiyonel yoğunluk profili kayması mümkündür.
- Ben 1 uydurma programı kullanarak, Bessel fonksiyonları modifiye edilmiş, τ karakteristik difüzyon süresi ve 0 aşağıda denklemi ile fraksiyonel yoğunluğunu Fit ve τ elde
- Ilgili bölgenin merkezine tespiti
(Denklem 2). Representative Results
Şekil 1 'de gösterildiği gibi floresans görüntüleri bir dizi düz DOPC tek tabaka üzerine DOPC tek tabaka ile kaplanmış bir damlacık birleştirme sonrası iyileşme sürecinde zaman elde edilmiştir. Düz bir hava-su ara DOPC tek tabakalı düşük miktarlarda katkılı edildi Rodamin-DPPE ve bu böylece bir parlak renkli ve yeni düz arayüzü eklenmiştir koyu bölgesi ile bir arka plan görselleştirmek için yapılmıştır. Orada, bir geri kazanım işlemi, sabit yüzey basıncı 23 mN / m gözlenmiştir. Zamana göre fraksiyonel yoğunluk değişimine denklem 1 'in bir uyum, bu uyum R2 değeri 0,999 olan. Şekil 2' de gösterilmiştir ve bu uyum bile hala daha düşük ya da daha yüksek yüzey basınçlarda çalışır. Bu uyum elde DOPC tek tabaka difüzyon katsayısı yüzey basıncı 23 mN / m 27,54 um 2 / sn idi.
FRAM daha doğrulama, DO difüzyon katsayılarıPC ve dipalmitoilfosfatidilkolin (DPPC) mono tabakalar yüzey basıncına göre ölçülmüştür. Şekil 3'te gösterildiği gibi, FRAM ~ 9 mN / m bir yüzey basıncı, LC (sıvı yoğunlaştırılmış) nerede DPPC tek tabaka yayılma katsayısının hızlı bir düşüş yakalar - LE (sıvı genişletilmiş) faz geçiş 10 ortaya çıkar ve değerler difüzyon katsayıları da Peters ve ark. 19 tarafından önceden ölçümlerle iyi kabul edilir. Buna ek olarak, yüzey basıncı ile difüzyon katsayısı bir üstel çürüme DOPC tek tabaka gözlendi ve bu eğilim Caruso ve diğ. 12 ile ölçülen biri ile hemen hemen aynıdır.
Şekil 1. (A) FRAM şematik gösterimi (birleştirdikten sonra floresan kurtarma) tekniği. Dudak olarakid tek tabakalı kaplı damlacık düz hava-su arayüzü birleştirilir, floresan olmadan lipit tek katmanlı lipit düz floresan lipit tek tabaka yerleştirilir etiketledi. Yüzey basıncı 23 mN / m (ölçek bar = 100 um) bir DOPC tek tabaka kurtarma işlemi sırasında zaman (B) Floresan mikroskop görüntüleri. DOPC tek tabaka karanlık bölge tamamen birkaç dakika içinde difüzyon işlemi ile elde edilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Zamana karşı 2. Kısmi yoğunluğunu Şekil. Siyah çevreler ve gri noktalı çizgi, zamanla fraksiyonel şiddetleri görüntü analizi (prosedürler 4.1 ve 4.2) ve denklemin 1 uyum elde kesirli şiddetleri değerlerini gösterirprosedür 4.3 gösterilen sırasıyla. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
DOPC (üçgen) ve DPPC (boş kare) yüzey basıncının bir fonksiyonu olarak mono tabakaları Şekil 3. Difüzyon katsayıları. Parlak gri renk ve koyu gri renkli çizgiler daha önce Peters ve arkadaşları tarafından bildirilen difüzyon katsayısı değerlerini göstermektedir. ve Caruso ve ark., sırasıyla. Bu rakam Jeong et al. 23 modifiye edilmiştir. Jeong ve ark., Langmuir. 30 (48), 14369-14374 izni ile yayımlanmaktadır. Telif Hakkı 2014 American Chemical Society. Onu tıklayınıze bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.
Discussion
FRAM özellikle belirli bir alanı beyazlatma sonra floresan kurtarma ölçmek için FRAP ile temel ilkeleri, bir sürü paylaşır, ancak FRAM bir ağartılmış alan oluşturmak için düz arayüzü üzerine bir damlacık birleştirme yerine yoğun bir ışık uygulamak bir işlem kullanır. Birleştirme işlemi böylece FRAM en önemli adımdır ve özellikle, bir damlacık birleştirdikten sonra düz tek tabaka karanlık leke şekli yayınım ölçüm doğruluğunu belirler. Özellikle, bir akım yöntemine dayalı, biz sadece prosedür 4'te gösterilen koyu leke ortalama yoğunluğunu hesaplamak için bir ilgi bölge olarak bir R yarıçaplı daire ayarlayın ve dairesel şekilden bir çok sapma varsa, Bu difüzyon katsayısı hassas ölçüm rahatsız olur. Bu nedenle, bu dairesel şekilli karanlık bölgeye elde etmek için gerekli olduğunu, ancak, dairesel olmayan şekiller çeşitli nedenlerden dolayı zaman oluşturulur. İlk olarak, Pet, bir konvektif akışını mevcutsari çanağı, koyu alanın şekli akış yönünde uzatılmış olur. Prosedür 1,3 belirtildiği gibi, koni şekilli cihazı konvektif akışını bastırmaya yardımcı olur ve bu uzama minimize olacaktır. Kılcal uç son bir birleşme sürecinde düz arayüzü dokunursa kılcal uç birleştirme işlemini keser çünkü İkincisi, karanlık alan şekillerin çeşitli ile oluşturulmuştur. Sadece kılcal sonuna asılı olan bir damlacık elde ederek, bu durdurma önlenebilir. Özellikle, kılcal bir hidrofobik tedavi kılcal en sonunda oturup damlacık yardımcı olur. Bu nedenle, yukarıdaki sorun çekimleri ve değişiklikler daha doğrusu difüzyon özelliklerini ölçmek için bize sağlar.
Bu iyi sorunlarını giderdiğiniz İşlem, bu nedenle FRAM FRAP göre çok önemli avantajlara sahip olmasını sağlar. İlk olarak, FRAM FRAP kıyasla daha basit bir ekipman gerektirir. FRAM için, basit bir floresan Micros kullanmak yeterlidiryerine dalga boyu boya emme spektrumu ile eşleşmesi gerekir bir yüksek güç lazer ile pahalı bir konfokal mikroskop, baş. Buna ek olarak, bu FRAM damlacık boyutu veya damlacık yüzeyinde yüzey basıncını ayarlayarak kolayca alanın boyutunu kontrol eder, FRAP ağartılmış alanına boyutunu ayarlamak için ilave aygıtlar kullanmak gereklidir. İkinci olarak, bu ömürlük, boyalar, çeşitli türlerin kullanılması mümkündür. FRAP sadece kimin ağartma işlemi difüzyon süreci çok daha hızlı boya molekülleri kullanır. Boyaların difüzyon ağartma işlemi sırasında oluşursa, doğru difüzyon özelliği tahmin etmek zordur. FRAM Ancak, boyalar ağartılması için bir işlemi gerektirir ve bu nedenle fluoresans görüntüsü boyalar çeşitli kullanımını sağlar. Buna ek olarak, sıkı bağlamak ek yüksek güç lazerleri gerektirir ve filtre o FRAM filtre setleri yerine sadece gerekli ise, boya türlerini değiştirmek için ayarlar. NihayetFRAP yalnızca ölçer, damla yüzeyi ve düz arayüzde mono tabakaları, çünkü bu şekilde arası difüzyon incelenmesine imkan veya A-tip B tipi tek tabakalı için tek tabaka birleştirme iki farklı lipid tek katmanlarının arasındaki karıştırma bağımsız olarak oluşturulabilir bir tek tabaka kendini difüzyon.
Bu avantajlara rağmen, düz bir hava-su arayüzü üzerine bir damlacık birleştirme süreci potansiyel nedeniyle böyle iki mono tabakaları arasındaki yüzey basıncı uyumsuzluğu, birleştirme işleminin zaman ölçeği olarak endişe olabilir çeşitli konulara, bu tekniği sınırlandırabilir damlacıkları birleştirdikten sonra düz bir tek tabaka yüzey basınç ve artış. Bu konular, ancak, aşağıdaki nedenlerden dolayı önemli ölçüde difüzyon ölçümünü etkilemez. İlk olarak, iki farklı mono tabakaları yüzey basınçları oldukça farklı olsa bile, bir dengeleme süreci kurtarma işlemi sırasında çok erken bir aşamada tamamlanır. Örneğin, tYüzey basıncı dengeleyecek kadar o damlacık yüzeyinde tek tabaka basıncı düz hava-su ara yüzeyinde tek tabaka daha yüksek olduğu yüzey, karanlık alanı genişler. Bu süreç 10 msn içinde tamamlanır olduğundan önemli ölçüde difüzyon sürecini etkilemektedir önce yüzey basıncı dengelenmiş olacaktır. Birleştirme işleminin zaman ölçeği yeterince hızlı ise İkincisi, hiç difüzyon ölçümü sınırı yok. Neyse ki, tipik bir birleştirme işlemi de 10 msn içinde tamamlanır. Son olarak, çukur yüzey alanının beri yüzey basıncını artırmak değil düz arayüzü üzerine damlacıkların hatta birden birleştirilmesi damlacık yüzey alanının çok büyüktür. Protokolde tarif edilen çukur ve damlacıkların, boyutlarına göre, molekül başına alan bir damlacık birleştirerek en az 0,015% artar. Bu duruma göre, bağlı molekül başına alan değişikliğine yüzey basıncı artışı negligibl olan% 0.1'den az, birVVilhelmy plâka tansiyometre ile ölçülen e bu yüzey basıncı tipik hata çok daha küçük olduğu için.
Özetle, biz düz arayüzü üzerine damlacık tek tabaka birleştirerek bir fosfolipid tek tabaka yanal yayılma özelliği ölçmek için yeni bir yöntem tanıttı. Bu teknik, nispeten basit bir ekipman gerektirir ve aynı zamanda boya türlerin çeşitli türlerdeki kullanımını sağlar. FRAM böylece sıvı-sıvı arayüzünde fosfolipidler, blok kopolimerleri, proteinler ve hatta nanopartiküller içeren herhangi bir yüzey aktif ajan, bir difüzyon ölçümleri için potansiyel olarak uygulanabilir. Ayrıca, FRAM iki farklı yüzey aktif maddeler arasında karıştırma arası difüzyon veya çalışmak için yeni bir yol sağlar bekliyoruz.
Acknowledgments
Bu çalışma 2014 için KAIST tarafından finanse edilen K-Vadisi RED & B Projesi ve Temel Bilimler Araştırma Programı Kore Ulusal Araştırma Vakfı aracılığıyla (NRF- 2012R1A6A3A040395 NRF-2013R1A1A2057708, NRF- 2012R1A1A1011023) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | OCI corporation | Acetone 3.8L Extra Pure | Purity: ≥ 99.5%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. |
| Ethanol | OCI corporation | Ethanol 3.8L Extra Pure | Purity: ≥ 94%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. |
| Dioleoylphosphatidylcholine, DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Chloroform is carcinogenic. |
| Chloroform | LiChrosolv | Chloroform ultrapure (A3633) | Purity: ≥ 99.8%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Carcinogenic |
| Rhodamine DPPE | Avanti Polar Lipids | 810158C, 810158P | Avoid direct light exposure to prevent photobleaching |
| Wilhelmy plate tensiometer | R&K ultrathin organic film technology | Wilhelmy tensiometer | http://www.rieglerkirstein.de/index.htm |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P-1000 | |
| Micro-injector | Eppendorf | Femtojet | |
| Micromanipulator | Eppendorf | Micromanipulator 5171 | |
| Microscope 1 | Objective lens: Olympus | Objective lens: UPlanFl 10x | Objective lens: 10X NA 0.3 |
| Microscope 2 | Objective lens: Olympus, Tube lens: Thorlabs | Objective lens: UPlanFl 10x | Objective lens: 10X NA 0.3, tube lens: focal length 17 cm |
| CCD for Microscope 1 | Jai | CV 950 camera | |
| CCD for Microscope 2 | Andor | iXon3 EMCCD | |
| Filter set | Chroma technology | Catalog Set 49004: ET545, T565, ET605 | Prepare suitable for dye molecules |
| Sonicator | DAIHAN Scientific | Wiseclean WUC-D06H |
References
- Van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (2), 112-124 (2008).
- Christon, R., Even, V., Daveloose, D., Léger, C. L., Viret, J. Modification of fluidity and lipid—protein relationships in pig intestinal brush-border membrane by dietary essential fatty acid deficiency. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 980 (1), 77-84 (1989).
- Stubbs, C. D., Smith, A. D. The modification of mammalian membrane polyunsaturated fatty acid composition in relation to membrane fluidity and function. Biochim. Biophys. Acta - Rev. Biomembr. 779 (1), 89-137 (1984).
- Holthuis, J. C. M., Menon, A. K. Lipid landscapes and pipelines in membrane homeostasis. Nature. 510 (7503), 48-57 (2014).
- Alonso, C., Waring, A., Zasadzinski, J. A. Keeping lung surfactant where it belongs: protein regulation of two-dimensional viscosity. Biophys. J. 89 (1), 266-273 (2005).
- Kim, K., Choi, S. Q., Zell, Z. a, Squires, T. M., Zasadzinski, J. A. Effect of cholesterol nanodomains on monolayer morphology and dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.). 110 (33), E3054-E3060 (2013).
- Hormel, T. T., Kurihara, S. Q., Brennan, M. K., Wozniak, M. C., Parthasarathy, R. Measuring Lipid Membrane Viscosity Using Rotational and Translational Probe Diffusion. Phys. Rev. Letters. 112 (18), 188101 (2014).
- Ding, J., Warriner, H. E., Zasadzinski, J. a, Schwartz, D. K. Magnetic needle viscometer for Langmuir monolayers. Langmuir. 18 (13), 2800-2806 (2002).
- Dhar, P., Cao, Y., Fischer, T. M., Zasadzinski, J. A. Active interfacial shear microrheology of aging protein films. Phys. Rev. Letters. 104 (1), 1-4 (2010).
- Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Interfacial microrheology of DPPC monolayers at the air-water interface. Soft Matter. 7 (17), 7782-7789 (2011).
- Choi, S. Q., Steltenkamp, S., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Active microrheology and simultaneous visualization of sheared phospholipid monolayers. Nature Commun. 2 (5), 312 (2011).
- Caruso, F., et al. Determination of lateral diffusion coefficients in air-water monolayers by fluorescence quenching measurements. J. Am. Chem. Soc. 113 (16), 4838-4843 (1991).
- Filippov, A., Orädd, G., Lindblom, G. The effect of cholesterol on the lateral diffusion of phospholipids in oriented bilayers. Biophys. J. 84 (5), 3079-3086 (2003).
- Schwille, P., Korlach, J., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy with single-molecule sensitivity on cell and model membranes. Cytometry. 36 (3), 176-182 (1999).
- Lopez, A., Dupou, L., Altibelli, A., Trotard, J., Tocanne, J. F. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments under conditions of uniform disk illumination. Critical comparison of analytical solutions, and a new mathematical method for calculation of diffusion coefficient D. Biophys. J. 53 (6), 963-970 (1988).
- Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).
- Vaz, W. L., Clegg, R. M., Hallmann, D. Translational diffusion of lipids in liquid crystalline phase phosphatidylcholine multibilayers. A comparison of experiment with theory. Biochemistry. 24 (3), 781-786 (1985).
- Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. Lateral diffusion in phospholipid multibilayers measured by fluorescence recovery after photobleaching. Biochemistry. 16 (17), 3836-3841 (1977).
- Peters, R., Beck, K. Translational diffusion in phospholipid monolayers measured by fluorescence microphotolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.). 80 (23), 7183-7187 (1983).
- Kuhn, H., Mobius, D., Bucher, H. Physical Methods of Chemistry. Crawley, J. N., et al. 1, Part 3B, 651-653 (1972).
- Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 858 (1), 161-168 (1986).
- Rotenberg, Y., Boruvka, L., Neumann, A. Determination of surface tension and contact angle from the shapes of axisymmetric fluid interfaces. J. Colloid Interface Sci. 93 (5), 169-183 (1983).
- Jeong, D. W., Kim, K., Lee, S., Choi, M. C., Choi, S. Q. Fluorescence recovery after merging a surfactant-covered droplet: a novel technique to measure the diffusion of phospholipid monolayers at fluid/fluid interfaces. Langmuir. 30 (48), 14369-14374 (2014).
