Introduction
Fosfolipider er viktige komponenter i cellemembraner og membraner i organeller, og fluiditeten av disse membranlagene ofte påvirker cellefunksjoner ved å endre aktiviteten av membranproteiner 1 - 3. For eksempel, membran lipid homeostase oppnås ved å regulere membranfluiditet, som blir detektert av membranproteiner, og et unormalt nivå av flyt forårsaker alvorlige sykdommer, slik som hepatisk steatose og kolestase 4. I tillegg er flytende av et fosfolipid monolaget ved luft-væske-grensesnittet alveolene har viktige implikasjoner i sine funksjoner. Høy fluiditet i lungene overflateaktive fosfolipid monolaget letter spredning av laget under inhalering, mens en lav fluiditet gjør det mulig å holde seg innenfor sjiktet alveolene under utånding 5,6. Det er derfor viktig å estimere fluiditeten av fosfolipid-lag for å forstå deres roller.
_content "> En direkte måling av fluiditet er viskositeten, og viskositeten av fosfolipid-lag er blitt målt ved hjelp av mikronstore kolloider 7, magnetiske nåler 8,9, og magnetiske mikro knapper 6,10,11. Imidlertid er disse teknikker er begrenset til relativt stive filmer, og kan ikke måle mindre viskøse filmer. For slike tilfeller ville diffusiviteten være et alternativ å kvantifisere flyt av fosfolipid lag. I flere tiår har en rekke teknikker for å måle diffusjonsegenskaper av fosfolipid lag blitt utviklet, slik som fluorescensslukking metode 12, pulset feltgradient NMR 13, og fluorescens korrelasjonsspektroskopi (FCS). 14 En av de mest representative metoder er fluorescensgjenvinning etter fotobleking (FRAP) 15,16. På grunn av enkelheten i måleprosedyren, og tilhørende teorier, flere studier på diffusjonsegenskaper av fosfolipid lag er utført ved hjelp av FRAPHer presenterer vi en ny teknikk for å måle lateral spredning av fosfolipid monolag, betegnes som fluorescens gjenoppretting etter sammenslåing (FRAM). Hovedforskjellen mellom FRAP og FRAM er at fotobleking trinnet erstattes med rulle koalesens. Flette en dråpe dekket av non-fluorescens enkeltlag på en fluoresceinmerket flat monolater en sirkel mørk flekk på en lys flat enkeltlag, og dermed sette opp samme opprinnelige tilstand med fotobleking trinn. Vi deretter observere fluorescensen bedring i mørk flekk med tiden for å måle lateral diffusivitet. Denne nye "bleking" trinn for dråpe koalescens gir betydelige fordeler i forhold FRAP: FRAM krever bare et fluorescensmikroskop snarere enn en kostbar konfokalmikroskop med høyenergi lasere som er nødvendig for FRAP. Jegn tillegg har FRAM et bredt utvalg av fluorescens-farvestoffer, siden det ikke involverer fotobleking prosessen. Til slutt, de to forskjellige monosjikt, et dråpemonosjikt og et flatt monolag, kan fremstilles uavhengig av hverandre, og dermed tillater interdiffusjon som skal måles, mens FRAP måler bare den selv-diffusjon av monolag.
FRAM tilbyr et bredt spekter av diffusjon målinger fra svært viskøse materialer til nesten ikke-viskøs materialer. I prinsippet kan FRAM måle den maksimale diffusiviteten av 10 6 mikrometer 2 / sek, noe som er sammenlignbart med eksisterende teknikker, da diffusjon finner sted over området 100 mikrometer ved 100 nm i løpet av tiden for slipp koalescering prosessen (~ 10 msek). Videre kan langsom diffusjonsprosess enkelt måles med mindre mono er solide. FRAM kan brukes for alle typer overflateaktive materialer så lenge som egnede fluorescens-merkede molekyler er tilgjengelige.
Protocol
Forsiktig: Se sikkerhetsdatablad (MSDS) før bruk av aceton og kloroform som er kreftfremkallende.
1. Fremstilling av fosfolipid med ett lag på en flat grensesnittet luft-vann
- Dannelse av et fosfolipid monolag
- Fremstilling av en oppløsning fosfolipid
- Rens en 4 ml medisinglass med en polytetrafluoretylen-belagt hetten ved hjelp av aceton, etanol og avionisert vann i minst tre ganger, og blåse nitrogengass grundig inn i ampullen for å kvitte seg med vann.
- Oppløs 1 mg fosfolipid (f.eks dioleoylphosphatidylcholine, DOPC) til 1 ml kloroform i ampullen for å oppnå 1 mg / ml konsentrasjon. Utfør denne prosedyren i et avtrekksskap for sikkerhet. Bruke høyere eller lavere konsentrasjoner av fosfolipid oppløsning om nødvendig.
- Legg merket fargestoff fosfolipider (f.eks Rhodamine dipalmitoylphosphatidylethanolamine, Rhodamine DPPE) med mindre enn 1 mol% av fosfolipidet oppløsesjon, for å visualisere fosfolipid monolaget med et fluorescensmikroskop. Utfør denne prosedyren i et avtrekksskap for sikkerhet.
- Pakk hetteglasset med en polytetrafluoretylen-tape for å hindre fordampning av løsningsmiddel, og lagre prøven i en fryser ved -20 ° C.
- Avsetning av fosfolipider på grensesnittet luft-vann
- Rengjøre en petriskål (55 mm i diameter og 12 mm høy) med etanol og avionisert vann i minst tre ganger.
- Fyll petriskål med 10 ml deionisert vann for å lage en grensesnittet luft-vann.
- Spre få mikroliter av fosfolipid-løsning med en mikro-sprøyte på en ren grensesnitt for å oppnå ønsket flatetrykk og venter i minst 30 minutter for å fordampe løsningsmidlet fullstendig, før gjøre forsøket.
Merk: En Langmuir trau kan brukes i stedet for en petriskål hvis nødvendig nøyaktig styring av overflatetrykk.
- Fremstilling av en oppløsning fosfolipid
- Surface trykkmåling
- Mål flatetrykket av fosfolipidet monolaget med en Wilhelmy plate tensiometer. Vent i minst 30 min for å få filterpapir fuktet nok hvis filterpapir anvendes som en Wilhelmy plate. Den detaljerte protokollen er tilgjengelig i Kuhn et al. 20.
- Juster deponert mengden av fosfolipidet å kontrollere overflatetrykket nøyaktig. Tilsett 4 mL av DOPC-løsning (1 mg / ml) på 30,25 cm 2 -området av grensesnittet dersom ~ 5 mN / m av overflatetrykk er nødvendig.
Merk: Når filterpapiret ikke er fullstendig fuktet, endrer overflatetrykket dramatisk i løpet av de første 30 minutter av forsøket på grunn av vekten endring av filterpapiret.
- Minimalisering av den konvektive strømning av monolaget
- Benytte en kjegleformet apparat som inneholder en 3 mm reservoar med to tynne kanaler, forbundet med en stor del av petriskålen, for å undertrykke den konvektive strømning avmonolaget, noe som kan forstyrre morfologi avbildning og overflatetrykkmålinger.
- Sørg for å matche vannstand mellom innsiden og utsiden av kjegleform apparat for å sikre at fosfolipider bevege seg fritt over hele regionen før deponering fosfolipider på luft-vann-grensesnittet.
2. Utarbeidelse av fosfolipid med ett lag på buede overflaten av en Droplet
- Smalner prosessen med et glass kapillær hjelp mikropipette avtrekker
- Plasser en glasskapillar (od 1 mm, id 0,78 mm, lengde 100 mm) på en kapillær innehaver av en mikropipette avtrekker.
- Utforme et program for å trekke kapillærene med passende parameterverdier (Heat: Ramp, Pull: 60, Vel: 70, Pause: 70 og Trykk 200) og trekk kapillærene med designet program i henhold til produsentens protokoll.
Merk: En kapillær avslutte med noen mikrometer-diameter er nødvendig for å danne en 100 mikrometer-dråpe av ApplYing et trykk med ~ 10 kPa. Dersom den ytre enden av kapillaren er for liten, mye høyere trykk,> 600 kPa, er nødvendig for å oppnå den dråpe, mens det er vanskelig å kontrollere størrelsen på dråpene med en for stor kapillær spiss ende.
- Absorpsjon av fosfolipider på dråpen overflaten
Merk: For å danne et fosfolipid monolaget på den buede grenseflate av en dråpe, et fosfolipid oppløsning uten fargestoff merket fosfolipider anvendes for å oppnå en intensitet kontrast mot den flate monolaget, fremstilt ved fremgangsmåte 1. I tillegg omfatter begge framgangs 2.2.1 og 2.2 0,2 er tillatte her. Hvis nødvendig nøyaktig styring av overflatetrykket på dråpeoverflaten, blir prosedyren 2.2.2 sterkt anbefalt. Imidlertid, hvis ikke, fremgangsmåte 2.2.1, som er en mye enklere måte enn prosedyre 2.2.2, er nyttig.- Belegging prosess av fosfolipider i en tupp-enden
- Rengjør glass ved hjelp av en glide aceton, etanol og avionisert vann i minst tre ganger.
- Pless koniske kapillær på en rengjort lysbilde glass og vipper kapillær å lette berøre lysbilde glass med en spiss ende.
- Slippe noen få dråper av fosfolipid-løsning (1 mg / ml) inn på spissenden av et kapillar som er klebet til objektglasset ved hjelp av en glassprøyte, og vente i minst 30 minutter for å fordampe løsningsmidlet fullstendig.
Merk: Det er sterkt anbefalt å følge spissen slutten av kapillær til glass-slide under prosedyren 2.2.1.3 fordi omkretsen av spissen enden er for liten til å holde dråpen av fosfolipidene på spissen slutten bare ved kapillær kraft.
- Utarbeidelse av en vesikkel løsning
- Rengjøre en ampulle, og fjerne vann fra beholderen, som ble introdusert i prosedyre 1.1.1.1.
- Tørk en 2 ml volum av fosfolipid-løsning (1 mg / ml) ved å anvende nitrogengass forsiktig, og desiccate ampullen i 1 time ved romtemperatur for å fjerne eventuelt gjenværende oppløsningsmiddel. Utfør denne prosedyren i et avtrekksskap for sikkerhet.
- Tilsett 2ml avionisert vann inn i hetteglasset tørkede lipider, og inkuber ampullen i en ovn ved 60 ° C i 1 time.
- Rist hetteglasset flere ganger, og sonicate (HF-frekvens: Opp til 40 kHz, Effekt: 370 W) i 30 min for å få blemmer.
- Utfør ekstrudering og fryse-tine prosesser for å få monodisperse unilamellære vesikler. Den detaljerte protokollen for forbereder vesikler er beskrevet i Mayer et al. 21.
Note: Overflate trykket av den dråpe grensesnittet styres nøyaktig ved å justere ventetid etter dannelse av dråpen som inneholder monodisperse unilamellære vesikler. Ved hjelp av en hengende dråpe metode 22, er det nødvendig å måle endringen i overflatetrykket i henhold til tid, før gjøre forsøket.
- Belegging prosess av fosfolipider i en tupp-enden
- Dannelse av en dråpe som inneholder et fosfolipid monolaget på den buede overflaten
- Fyll ut konisk kapillær med 10 mL av avionisert vann fra procedure 2.2.1. Alternativt kan du bruke 10 mL av vesikkel løsning fra prosedyre 2.2.2.
- Koble kapillær til en automatisert mikro injektor for å gi trykk for å danne dråpene.
- Monter kapillær som er koblet til en mikro-injektor til en mikromanipulator for å styre plasseringen av kapillaren presist.
- Forbered et lyst felt mikroskop (Microscope 1, objektiv: 10X NA 0.3) for å avbilde den laterale visning av kapillær med en CCD-kamera. Mikroskop 1 gjør det således mulig å overholde den nøyaktige posisjonen til dråpe langs z-aksen, og beregne størrelsen på dråpen.
- Bevege spissenden til en posisjon hvor sideriss av spissenden er godt visualisert ved Microscope en ved hjelp av en mikromanipulator og anvende et variabelt trykk (~ 100 hPa) med spissenden av kapillaren, inntil en passende størrelse (~ 100 um i diameter) av dråpe dannes.
Merk: Det anbefales at automatisert mikro-injektor og mikromanipluatoren være brukd, hvis nødvendig fin kontroll over dråpestørrelsen, og plasseringen av dråpen. Det er også mulig å bruke manuelle seg.
3. Imaging Fluorescens Recovery etter Droplet fletting
Merk: De grunnleggende prinsipper for denne protokollen er identiske med de av FRAP teknikk, med unntak av rulle koalescering prosessen. De detaljerte protokoller og beslektede teorier om FRAP er tilgjengelig i A. Lopez et al. 15 og D. Axelrod et al. 16.
- Overvåking og styring av plasseringen av dråpe
- Forbered en invertert mikroskop satt (Microscope 2, objektiv: 10X NA 0.3, tube linse: brennvidde 17 cm) som gjør at både en fluorescens mikroskop med et skikkelig filter sett for Rhodamin-DPPEs (eksitasjon ved 560 nm, emisjon på 583 nm) og et lysfelt-mikroskop. Bruke et CCD-kamera her for å visualisere toppriss av den dråpe med et fluorescensmikroskop mode og en lys-feltet mikroskop-modus.
- Flytt dråpe belagt med et fosfolipid til en flat grensesnittet luft-vann langs z-aksen, men ikke flette dråpe likevel, ved hjelp av mikromanipulator. Bruk Mikroskop 1 for å visualisere sideriss av dråpen.
- Finn dråpe ved midten av toppriss av den flate monolaget, ved hjelp av mikromanipulator. Bruk lyse-feltet mikroskop måte Microscope 2 for å visualisere ovenfra flat monolaget.
- Sammenslåing dråpene på den flate grensesnittet luft-vann
- Flytt dråpe videre mot den flate kontakten før dråpe fusjonerer på grensesnittet, ved hjelp av micromanipulator. Dersom fusjonsprosessen er ferdig med hell, en mørk region med en sirkulær form som er omgitt av en hvit bakgrunn, blir observert ved hjelp av fluorescens modus 2 mikroskop.
- Spill rekken av fluorescerende bilder i henhold til tid etter sammenslåing dråpen, ved hjelp av fluorescens måte Microstakle 2. Bruk en raskere bildefrekvens enn diffusjon tidsskala på monolaget her. I DOPC enkeltlag, tar det noen minutter å diffundere inn i 200 mikrometer-mørke området helt.
4. Bestemme diffusjonskoeffisient av Image Analysis
Merk: For å bestemme diffusjonskoeffisient fra en serie med bilder, er tilpasset program for bildeanalyse bygget som beskrevet nedenfor. En detaljert kildekoden til dette programmet er tilgjengelig i Jove nettside.
- Påvisning av et sirkulært område av interesse
- Påvisning av sentrum av regionen av interesse
- Skaff en serie med fluorescerende bilder som har blitt spilt inn i løpet av en utvinningsprosess som inneholder et sirkulært mørkt område og en hvit bakgrunn, og sette det første bildet i serien som et referansebilde. Her er R D radien til det mørke området i et referansebilde.
- Convolute referansebildet med en hvit sirkel somse intensiteten er jevnt over en hel region. Bruk innebygd funksjon som heter 'conv2' for konvolusjon som vist i kildekoden til tilpasset program linje 124. Her er radius i den hvite sirkelen litt mindre enn R D.
- Finn en stilling som indikerer en minimumsverdi i convolution beregningen, og sette denne posisjonen som sentrum av regionen av interesse i referansebildet.
- Bestemme en radius av regionen av interesse
- Convolute referansebildet med en hvit sirkel som inneholder en midtstilling, bestemt ved en prosedyre 4,1 og jevn intensitet over en hel region. Her er R S radien av den hvite sirkelen. Bruk iterasjon som "for" eller "mens" med likningen for en sirkel for å lage den hvite sirkelen som vist i kildekoden til tilpasset program ledningen 102 til 109.
- Convolute referansebildet med en annen hvit sirkel som har en littstørre radius (5% -10%), R L, enn R S. Bruk samme metode med prosedyre 4.1.2.1 å gjøre sirkelen som vist i kildekoden til tilpasset program linje 113-120.
- Innhente verdiforskjellen mellom de to beregningene av 4.1.2.1 og 4.1.2.2 konvolusjonsteknikker.
- Gjenta fremgangsmåten ovenfor fra R S = R D / 2 til R S = 2R D, ved å øke både R S og R L med en pikselnivå. Gjør en iterasjon som inneholder hele kildekoder fra prosedyre 4.1.2.1 til 4.1.2.3 å gjenta.
- Finne radius av R S som viser maksimum verdiforskjellen mellom de to beregningene konvolusjonsteknikker. Bruk innebygd funksjon som heter "max" for å finne radius indikerer maksimal forskjell i verdi som vist i kildekoden til tilpasset program linje 148 til 149. Dette R S indikerer dermed radius av det mørke området i referansebildet.
- Beregning av en brøk intensitet
- Sett en sirkel som inneholder en senterposisjon og en radius, bestemt ved fremgangsmåten 4,1 som en region av interesse.
- Beregn den gjennomsnittlige intensiteter i regionen av interesse i en serie av fluorescens bilder i henhold til annen. Convolute hver ramme med regionen av interesse og dele det med område av regionen av interesse å beregne gjennomsnittlig intensitet. Detaljene er tilgjengelig i kildekoden til tilpasset program som er tilgjengelig i Jove nettside.
- Beregne en brøk intensitet, definert som ligningen nedenfor, hvor F (t) er den gjennomsnittlige intensitet i den sirkel som er en region av interesse i henhold til tid, F i er den opprinnelige intensitet i sirkelen, og F o er intensiteten av en hvit bakgrunn.
f (t) = (F (t) - F i) / (F o - F i) (ligning 1).
- Montering av fractional intensitet til FRAP teori
- Monter fractional intensitet med ligningen nedenfor, der τ er en karakteristisk diffusjon tid og jeg 0, jeg en modifisert Bessel funksjoner, ved hjelp av et passende program, og få τ
(Ligning 2). - Oppnå en diffusjonskoeffisient basert på det forhold, τ = en 2/4 D, der D er diffusjonskoeffisienten og a er radien til det mørke området.
Merk: Under tilpasningsprosessen, er det mulig å forskyve fractional intensitet profil langs en tidsakse når gjenopprettingsprosessen har allerede begynt, før opptak bildene.
- Monter fractional intensitet med ligningen nedenfor, der τ er en karakteristisk diffusjon tid og jeg 0, jeg en modifisert Bessel funksjoner, ved hjelp av et passende program, og få τ
- Påvisning av sentrum av regionen av interesse
(Ligning 2). Representative Results
En serie av fluorescens bilder ble oppnådd med tid under gjenopprettingen etter sammenslåing en dråpe belagt med et DOPC monosjikt på en flat DOPC monolag, som angitt i figur 1. Den DOPC monolaget på den flate grensesnittet luft-vann ble dopet med små mengder Rhodamine-DPPE, og dette således gjort det mulig å visualisere en bakgrunn med en lys farge, og et mørkt område som nylig er lagt til den flate grensesnitt. Det ble en gjenopprettingsprosessen observert ved 23 mN / m med fast overflatetrykk. En tilpasning av ligning 1 til endring av fraksjonert intensitet i henhold til tid er vist i figur 2. R 2 Verdien av denne form er 0,999, og dette passer fortsatt fungerer godt, selv ved lavere eller høyere overflatetrykk. Diffusjonskoeffisienten av DOPC monolag oppnådd fra dette passer var 27,54 mikrometer 2 / sek ved 23 mN / m av overflatetrykk.
For ytterligere validering av FRAM, diffusjonskoeffisienter av DOPC og dipalmitoylfosfatidylcholin (DPPC) monolag ble målt i henhold til overflatetrykk. Som vist i figur 3, fanger FRAM den raske reduksjon av diffusjonskoeffisienten av DPPC monolaget på ~ 9 mN / m av overflatetrykket, hvor en LC (væske kondensert) - LE (flytende utvidet) faseovergang inntreffer 10, og verdiene av diffusjonskoeffisienter er også stemte godt med de tidligere målingene ved Peters et al., 19. I tillegg ble en eksponensiell desintegrasjon av diffusjonskoeffisienten med overflatetrykket observert i DOPC monolaget, og denne tendensen er nesten identisk med den som måles ved Caruso et al., 12.
Figur 1. (A) Skjematisk illustrasjon av FRAM (fluorescens gjenoppretting etter sammenslåing) teknikk. Som leppenid monolag belegges dråpene smelter sammen til flat grensesnittet luft-vann, lipid monolaget uten fluorescens merket lipid er satt inn i flat fluorescerende lipid monolag. (B) Fluorescensmikroskop bilder med tid under gjenopprettingsprosessen av en DOPC enkeltlag på 23 mN / m av overflatetrykk (skala bar = 100 mikrometer). Den mørke region av DOPC monolaget er fullt restituert etter diffusjonsprosessen løpet av noen minutter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Delvis intensitet mot tid. Svarte sirkler og den grå stiplede linjen viser verdiene av brøk intensiteter hentet fra bildeanalyse (prosedyrer 4.1 og 4.2) og tilpasning av ligning 1 til brøk intensiteter med tiden,vist i prosedyren 4.3, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. diffusjonskoeffisienter av DOPC (trekant) og DPPC (tomt kvadrat) monolag som en funksjon av overflatetrykk. Linjene med lys grå farge og med mørk grå farge angir verdiene av diffusjonskoeffisienten tidligere rapportert av Peters et al. og Caruso et al., respektivt. Dette tallet har blitt forandret fra Jeong et al. 23. Gjengitt med tillatelse fra Jeong et al. Langmuir. 30 (48), 14369-14374. Copyright 2014 American Chemical Society. Vennligst klikk here for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
FRAM deler mye av grunnleggende prinsipper med FRAP, spesielt for måling av fluorescens gjenoppretting etter bleking et bestemt område, men FRAM bruker en prosess med sammenslåing en dråpe på flat-grensesnittet for å danne et bleket området, i stedet for å bruke et intensivt lys. Fusjonsprosessen er således det viktigste trinnet i FRAM, og spesielt, i form av den mørk flekk på det flate monolaget etter sammenslåing en dråpe bestemmer nøyaktigheten av målingen diffusivitet. Nærmere bestemt, basert på en aktuell metode, vi bare setter sirkel med en radius R som en region av interesse å beregne den gjennomsnittlige intensiteten av mørk flekk, som vist i fremgangsmåte 4, og hvis det finnes en for mye avvik fra den sirkulære form, dette ville forstyrre den nøyaktige måling av en diffusjonskoeffisient. Derfor er det nødvendig å oppnå en sirkelformet mørk region, men ikke er runde er dannet av og til på grunn av flere årsaker. Først, hvis det finnes en konvektive flyt i Petri fatet, i form av det mørke området blir forlenget langs strømningsretningen. Som nevnt i fremgangsmåte 1,3, hjelper en kjegleformet apparat for å undertrykke den konvektive strømning, og denne forlengelse vil bli minimalisert. For det andre, dersom den ytre enden av kapillæret berører den flate grensesnitt under et fusjonsprosessen, er det mørke området utformet med en rekke former, siden de kapillære enden avbryter fusjonsprosessen. Ved å skaffe en dråpe som bare henger fra enden av kapillæret, kan dette avbruddet forhindres. Spesielt en hydrofob behandling av kapillaren bidrar dråpene til å sitte ved enden av kapillæret. Derfor ovennevnte problemer skyteepisoder og modifikasjoner gjør oss i stand til å måle diffusjonsegenskaper mer presist.
Denne brønnen trouble prosessen gjør dermed FRAM å ha flere betydelige fordeler fremfor FRAP. Først FRAM krever enklere utstyr enn FRAP. For FRAM, er det tilstrekkelig å bruke en enkel fluorescens microsklare, i stedet for en kostbar konfokalmikroskop med en høyeffekts laser hvis bølgelengde må samsvare med absorpsjonsspekteret av fargestoffet. I tillegg er det nødvendig å bruke ytterligere apparatur for å justere størrelsen til det blekede område i FRAP, mens FRAM styrer størrelsen på området lett ved å justere størrelsen på dråpene, eller overflatetrykket på dråpeoverflaten. For det andre er det mulig å bruke ulike arter av fargestoffer i FRAM. FRAP bruker bare fargestoffmolekyler som blekeprosessen er mye raskere enn diffusjonsprosessen. Hvis det oppstår diffusjon av fargestoffer som under blekeprosessen, er det vanskelig å estimere egenskapen diffusjon nøyaktig. Den FRAM imidlertid ikke krever en prosess for bleking av farvestoffer, og dette gjør det således mulig å bruke ulike typer av fargestoffer på fluorescens-avbildning. I tillegg krever FRAP ekstra høyeffektslasere og filter sett å endre fargestoff arter, mens det kun er nødvendig å skifte ut filtersett i FRAM. EndeligSiden monolagene på dråpeoverflaten og den flate grensesnitt kan dannes uavhengig av hverandre, noe som muliggjør studium av inter-diffusjon eller blanding mellom to lipid monolag ved å slå sammen A-type monolag til B-type monolaget, mens den FRAP bare måler selv diffusjon av en monolayer.
Til tross for disse fordelene, kan prosessen med å slå sammen en dråpe på en flat luft-vann-grensesnittet potensielt begrense denne teknikken på grunn av flere forhold som kan være av interesse, for eksempel et overflatetrykk mismatch mellom de to monolagene, tidsskalaen for fusjonsprosessen og en økning i overflatetrykket av det flate monolaget etter sammenslåing dråper. Disse problemene er imidlertid ikke påvirke spredningen målingen betydelig av følgende grunner. Først, selv om overflatetrykk på de to forskjellige monolagene er ganske forskjellige, er en likevekts prosess gjennomført på et svært tidlig stadium under gjenopprettingsprosessen. For eksempel, hvis tHan overflaten trykket av monolaget på dråpeoverflaten er høyere enn for den monolaget på den flate grensesnittet luft-vann, utvider det mørke området inntil overflatetrykket likevekt. Siden denne prosessen er fullført innen 10 millisekunder, vil det overflatetrykket ekvilibreres før det påvirker diffusjonen prosessen betydelig. For det andre, dersom tidsskalaen for fusjonsprosessen er rask nok, vil det ikke begrenser diffusjonen målingen i det hele tatt. Heldigvis er en typisk fusjonsprosessen også fullført innen 10 msek. Til slutt, selv multiplum sammensmelting av dråpene på de plane grensesnitt ikke øke overflatetrykket, siden overflatearealet av rennen langt større enn overflatearealet av dråpe. I henhold til størrelser av trauet, og dråpene, som er beskrevet i protokollen, den areal per molekyl øker mindre enn 0,015% ved å slå sammen en dråpe. Følgelig er økningen av overflatetrykket på grunn av endringen av areal per molekyl mindre enn 0,1%, noe som er negligible fordi det er mye mindre enn den typiske feil i overflatetrykket, målt ved Wilhelmy plate tensiometer.
I sammendraget, vi innført en ny metode for å måle lateral diffusjon tilhører et fosfolipid enkeltlag ved å flette en dråpe enkeltlag på flat-grensesnittet. Denne teknikken krever relativt enkelt utstyr, og også muliggjør bruk av ulike typer fargestoff arter. Den FRAM er således potensielt anvendelig for diffusjon måling av eventuelle overflateaktive midler, inkludert fosfolipider, blokk-kopolymerer, proteiner og til og med nanopartikler i en væske-væske-grensesnittet. Videre forventer vi at FRAM gir en ny måte å studere inter-diffusjon og blanding mellom to forskjellige overflateaktive stoffer.
Acknowledgments
Dette arbeidet støttes av KAIST-finansierte K-dalen RED & B-prosjektet for 2014 og Basic Science Research Program gjennom National Research Foundation of Korea (NRF- 2012R1A6A3A040395, NRF-2013R1A1A2057708, NRF- 2012R1A1A1011023).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | OCI corporation | Acetone 3.8L Extra Pure | Purity: ≥ 99.5%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. |
| Ethanol | OCI corporation | Ethanol 3.8L Extra Pure | Purity: ≥ 94%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. |
| Dioleoylphosphatidylcholine, DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Chloroform is carcinogenic. |
| Chloroform | LiChrosolv | Chloroform ultrapure (A3633) | Purity: ≥ 99.8%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Carcinogenic |
| Rhodamine DPPE | Avanti Polar Lipids | 810158C, 810158P | Avoid direct light exposure to prevent photobleaching |
| Wilhelmy plate tensiometer | R&K ultrathin organic film technology | Wilhelmy tensiometer | http://www.rieglerkirstein.de/index.htm |
| Micropipette puller | Sutter instrument | P-1000 | |
| Micro-injector | Eppendorf | Femtojet | |
| Micromanipulator | Eppendorf | Micromanipulator 5171 | |
| Microscope 1 | Objective lens: Olympus | Objective lens: UPlanFl 10x | Objective lens: 10X NA 0.3 |
| Microscope 2 | Objective lens: Olympus, Tube lens: Thorlabs | Objective lens: UPlanFl 10x | Objective lens: 10X NA 0.3, tube lens: focal length 17 cm |
| CCD for Microscope 1 | Jai | CV 950 camera | |
| CCD for Microscope 2 | Andor | iXon3 EMCCD | |
| Filter set | Chroma technology | Catalog Set 49004: ET545, T565, ET605 | Prepare suitable for dye molecules |
| Sonicator | DAIHAN Scientific | Wiseclean WUC-D06H |
References
- Van Meer, G., Voelker, D. R., Feigenson, G. W. Membrane lipids: where they are and how they behave. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (2), 112-124 (2008).
- Christon, R., Even, V., Daveloose, D., Léger, C. L., Viret, J. Modification of fluidity and lipid—protein relationships in pig intestinal brush-border membrane by dietary essential fatty acid deficiency. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 980 (1), 77-84 (1989).
- Stubbs, C. D., Smith, A. D. The modification of mammalian membrane polyunsaturated fatty acid composition in relation to membrane fluidity and function. Biochim. Biophys. Acta - Rev. Biomembr. 779 (1), 89-137 (1984).
- Holthuis, J. C. M., Menon, A. K. Lipid landscapes and pipelines in membrane homeostasis. Nature. 510 (7503), 48-57 (2014).
- Alonso, C., Waring, A., Zasadzinski, J. A. Keeping lung surfactant where it belongs: protein regulation of two-dimensional viscosity. Biophys. J. 89 (1), 266-273 (2005).
- Kim, K., Choi, S. Q., Zell, Z. a, Squires, T. M., Zasadzinski, J. A. Effect of cholesterol nanodomains on monolayer morphology and dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.). 110 (33), E3054-E3060 (2013).
- Hormel, T. T., Kurihara, S. Q., Brennan, M. K., Wozniak, M. C., Parthasarathy, R. Measuring Lipid Membrane Viscosity Using Rotational and Translational Probe Diffusion. Phys. Rev. Letters. 112 (18), 188101 (2014).
- Ding, J., Warriner, H. E., Zasadzinski, J. a, Schwartz, D. K. Magnetic needle viscometer for Langmuir monolayers. Langmuir. 18 (13), 2800-2806 (2002).
- Dhar, P., Cao, Y., Fischer, T. M., Zasadzinski, J. A. Active interfacial shear microrheology of aging protein films. Phys. Rev. Letters. 104 (1), 1-4 (2010).
- Kim, K., Choi, S. Q., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Interfacial microrheology of DPPC monolayers at the air-water interface. Soft Matter. 7 (17), 7782-7789 (2011).
- Choi, S. Q., Steltenkamp, S., Zasadzinski, J. A., Squires, T. M. Active microrheology and simultaneous visualization of sheared phospholipid monolayers. Nature Commun. 2 (5), 312 (2011).
- Caruso, F., et al. Determination of lateral diffusion coefficients in air-water monolayers by fluorescence quenching measurements. J. Am. Chem. Soc. 113 (16), 4838-4843 (1991).
- Filippov, A., Orädd, G., Lindblom, G. The effect of cholesterol on the lateral diffusion of phospholipids in oriented bilayers. Biophys. J. 84 (5), 3079-3086 (2003).
- Schwille, P., Korlach, J., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy with single-molecule sensitivity on cell and model membranes. Cytometry. 36 (3), 176-182 (1999).
- Lopez, A., Dupou, L., Altibelli, A., Trotard, J., Tocanne, J. F. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments under conditions of uniform disk illumination. Critical comparison of analytical solutions, and a new mathematical method for calculation of diffusion coefficient D. Biophys. J. 53 (6), 963-970 (1988).
- Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).
- Vaz, W. L., Clegg, R. M., Hallmann, D. Translational diffusion of lipids in liquid crystalline phase phosphatidylcholine multibilayers. A comparison of experiment with theory. Biochemistry. 24 (3), 781-786 (1985).
- Wu, E. S., Jacobson, K., Papahadjopoulos, D. Lateral diffusion in phospholipid multibilayers measured by fluorescence recovery after photobleaching. Biochemistry. 16 (17), 3836-3841 (1977).
- Peters, R., Beck, K. Translational diffusion in phospholipid monolayers measured by fluorescence microphotolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. (U. S. A.). 80 (23), 7183-7187 (1983).
- Kuhn, H., Mobius, D., Bucher, H. Physical Methods of Chemistry. Crawley, J. N., et al. 1, Part 3B, 651-653 (1972).
- Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 858 (1), 161-168 (1986).
- Rotenberg, Y., Boruvka, L., Neumann, A. Determination of surface tension and contact angle from the shapes of axisymmetric fluid interfaces. J. Colloid Interface Sci. 93 (5), 169-183 (1983).
- Jeong, D. W., Kim, K., Lee, S., Choi, M. C., Choi, S. Q. Fluorescence recovery after merging a surfactant-covered droplet: a novel technique to measure the diffusion of phospholipid monolayers at fluid/fluid interfaces. Langmuir. 30 (48), 14369-14374 (2014).
