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Bioengineering

Récupération de fluorescence après Fusionner une Droplet mesurer la Diffusion bidimensionnelle d'une monocouche de phospholipides

Published: October 15, 2015 doi: 10.3791/53376
Automatic Translation
1, 2, 1, 2
1Department of Bio and Brain Engineering, KAIST, 2Information and Electrical Research Institute, KAIST

Introduction

Les phospholipides sont des composants majeurs des membranes cellulaires et les membranes des organelles, et la fluidité de ces couches membranaires affecte souvent les fonctions cellulaires en modifiant l'activité de protéines de la membrane 1 - 3. Par exemple, la membrane   homéostasie lipidique est obtenue par le contrôle de la fluidité de la membrane, qui est détecté par les protéines de membrane, et un niveau anormal de fluidité provoque des maladies graves, telles que la stéatose hépatique et cholestase 4. En outre, la fluidité d'une monocouche de phospholipides à l'interface fluide-air alvéoles a des implications importantes dans ses fonctions. Haute fluidité du surfactant pulmonaire phospholipides monocouche facilite la propagation de la couche pendant l'inhalation, tandis qu'une fluidité à basse permet à la couche de rester dans les alvéoles lors de l'expiration de 5,6. Il est donc important d'évaluer la fluidité des couches de phospholipides de comprendre leurs rôles.

_content "> Une mesure directe de la fluidité est la viscosité et la viscosité des couches de phospholipides a été mesurée en utilisant des colloïdes de taille micronique 7, aiguilles magnétiques 8,9, et les micro-boutons magnétiques 6,10,11. Cependant, ces techniques sont limités à des films relativement rigides, et ne peut pas mesurer les films moins visqueux. Pour de tels cas, diffusivité serait une alternative à quantifier la fluidité des couches de phospholipides. Depuis plusieurs décennies, une variété de techniques pour mesurer les propriétés de diffusion des couches de phospholipides ont été développés, tels que la fluorescence procédé de trempe 12, champ pulsé gradient RMN 13, et la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) 14. Une des méthodes les plus représentatifs est la récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) 15,16. En raison de la simplicité de la procédure de mesure et connexes théories, plusieurs études sur les propriétés de diffusion des couches de phospholipides ont été effectuées en utilisant FRAP 17 - 19. Cependant, FRAP nécessite généralement une configuration microscope confocal cher avec un laser de forte puissance.

Ici, nous présentons une nouvelle technique pour mesurer la diffusion latérale de monocouches de phospholipides, appelé comme la récupération de fluorescence après la fusion (FRAM). La principale différence entre le FRAP et FRAM est que l'étape de photoblanchiment est remplacé par la coalescence des gouttes. Fusion d'une gouttelette couverte par des non-fluorescence monocouche sur une monocouche plat marqué par fluorescence laisse une tache sombre circulaire sur une monocouche appartement lumineux, mettant ainsi en place le même état initial avec l'étape de photoblanchiment. On assiste alors à la récupération de fluorescence dans la tache sombre avec le temps pour mesurer la diffusivité latérale. Cette nouvelle "blanchiment" étape de coalescence de gouttes fournit des avantages significatifs par rapport FRAP: FRAM ne nécessite qu'un microscope à fluorescence plutôt que d'un microscope confocal cher avec un laser de forte puissance qui est nécessaire pour FRAP. jen outre, FRAM dispose d'une large sélection de colorants fluorescents car elle ne comporte pas le processus de photoblanchiment. Enfin, les deux monocouches différentes, une monocouche de gouttelettes et une monocouche plat, peuvent être préparés de façon indépendante, ce qui permet interdiffusion à mesurer, tandis que FRAP ne mesure que l'auto-diffusion de monocouches.

FRAM offre une large gamme de mesures de diffusion à partir de matériaux très visqueux à des matériaux presque non-visqueux. A priori, FRAM peut mesurer la diffusivité maximum de 10 6 um 2 / sec, ce qui est comparable aux techniques existantes, lorsque la diffusion a lieu à travers la zone 100 um par 100 um pendant le temps pour le processus de coalescence de gouttes (~ 10 msec). En outre, lent processus de diffusion peut être facilement mesurée à moins monocouches sont solides. FRAM peut être utilisé pour toutes sortes de matières actives de surface aussi longtemps que les molécules étiquetées par fluorescence appropriés sont disponibles.

Protocol

Attention: Reportez-vous aux fiches de données de sécurité (FDS) avant l'utilisation de l'acétone et le chloroforme qui sont cancérigènes.

1. Préparation de phospholipides monocouche à une interface air-eau plat

  1. Formation d'une monocouche de phospholipides
    1. Préparation d'une solution de phospholipide
      1. Nettoyer un flacon de 4 ml avec un bouchon de polytétrafluoroéthylène revêtu avec de l'acétone, de l'éthanol et de l'eau déminéralisée au moins trois fois, et souffler à fond de l'azote gazeux dans le flacon de se débarrasser de l'eau.
      2. Dissoudre 1 mg de phospholipides (par exemple, la dioléoylphosphatidylcholine, DOPC) à 1 ml de chloroforme dans le flacon pour obtenir 1 mg / ml de concentration. Effectuez cette procédure dans une hotte de sécurité. Utiliser des concentrations inférieures ou supérieures d'une solution de phospholipide, si nécessaire.
      3. Ajouter colorant phospholipides marqués (par exemple, la rhodamine dipalmitoylphosphatidyléthanolamine, la rhodamine DPPE) avec moins de 1% en moles de phospholipide de la solution, afin de visualiser la monocouche de phospholipide avec un microscope à fluorescence. Effectuez cette procédure dans une hotte de sécurité.
      4. Envelopper le flacon avec un ruban de polytétrafluoroéthylène pour empêcher l'évaporation du solvant, et de stocker l'échantillon dans un congélateur à -20 ° C.
    2. Dépôt de phospholipides sur l'interface air-eau
      1. Nettoyer une boîte de Petri (55 mm de diamètre et 12 mm de hauteur) avec de l'éthanol et de l'eau désionisée au moins trois fois.
      2. Remplissez la boîte de Petri avec 10 ml d'eau déminéralisée pour créer une interface air-eau.
      3. Étaler quelques microlitres de la solution de phospholipides avec une micro-seringue sur une interface propre pour obtenir la pression de surface souhaitée et attendez au moins 30 minutes pour évaporer le solvant complètement, avant de faire l'expérience.
        Remarque: Une cuvette de Langmuir peut être utilisé à la place d'une boîte de Pétri si le contrôle précis de la pression de surface est nécessaire.
  2. Sumesure de la pression rface
    1. Mesurer la pression de surface de la monocouche de phospholipide avec un tensiomètre à plaque de Wilhelmy. Attendez au moins 30 minutes pour obtenir le papier filtre mouillé suffisant si papier filtre est utilisé comme une plaque Wilhelmy. Le protocole détaillé est disponible dans Kuhn et al. 20.
    2. Ajuster la quantité déposée du phospholipide pour réguler la pression de surface de précision. Ajouter 4 ul de la solution de DOPC (1 mg / ml) sur la -zone 30,25 cm 2 de l'interface si ~ 5 mN / m de surface de pression est nécessaire.
      Remarque: Si le papier filtre est pas complètement mouillée, la pression de surface change radicalement au cours des 30 premières minutes de l'expérience en raison du changement de poids du papier filtre.
  3. Minimisation de l'écoulement convectif de la monocouche
    1. Utilisation d'un appareil en forme de cône qui contient un réservoir de 3 mm avec deux canaux minces, connecté à une grande partie de la boîte de Petri, afin de supprimer le flux convectif dela monocouche, ce qui peut perturber la morphologie de l'imagerie et de mesure de pression de surface.
    2. Veillez à faire correspondre les niveaux d'eau entre l'intérieur et l'extérieur de l'appareil en forme de cône pour assurer que les phospholipides se déplacer librement sur l'ensemble de la région avant de déposer phospholipides sur l'interface air-eau.

2. Préparation de phospholipides monocouche à la surface courbe d'un Droplet

  1. Resserré processus d'un capillaire de verre en utilisant micropipette extracteur
    1. Placer un capillaire en verre (1 od mm, 0,78 mm ID, longueur 100 mm) sur un support de capillaire d'un extracteur micropipette.
    2. Concevoir un programme pour tirer les capillaires avec des valeurs de paramètres appropriées (Heat: Rampe, Pull: 60, Vel: 70, Delay: 70 et 200 Pression) et tirez les capillaires avec le programme conçu selon le protocole du fabricant.
      Remarque: un capillaire fin avec un diamètre de quelques micromètres, est nécessaire pour former une gouttelette de 100 pm d'appl parying une pression avec ~ 10 kPa. Si l'extrémité du capillaire de la pointe est trop petit, la pression beaucoup plus élevé,> 600 kPa, est nécessaire pour obtenir la goutte, alors qu'il est difficile de contrôler la taille des gouttelettes avec un trop grand extrémité de pointe capillaire.
  2. Absorption des phospholipides sur la surface de la gouttelette
    Remarque: Pour former une monocouche de phospholipides à l'interface courbée d'une goutte, une solution de phospholipide marqué sans colorant phospholipides est utilisé pour obtenir un contraste d'intensité, contre la monocouche plat, préparé selon la procédure 1. En outre, les deux procédures 2.2.1 et 2.2 .2 sont ici permise. Si un contrôle précis de la pression de surface à la surface des gouttelettes est nécessaire, la procédure 2.2.2 est fortement recommandé. Cependant, dans la négative, la procédure 2.2.1, ce qui est une manière beaucoup plus facile que la procédure 2.2.2, est utile.
    1. Processus de phospholipides revêtement à une extrémité pointe
      1. Nettoyer une lame de verre avec de l'acétone, de l'éthanol et de l'eau déminéralisée au moins trois fois.
      2. Place capillaire conique sur une lame de verre nettoyée, et inclinez le capillaire pour faciliter toucher le verre coulissant avec une extrémité de pointe.
      3. Déposez quelques gouttes de solution de phospholipides (1 mg / ml) sur l'extrémité d'un capillaire qui est collée à la lame de verre à l'aide d'une seringue de verre de pointe, et attendre au moins 30 minutes pour évaporer le solvant complètement.
        Remarque: Il est fortement recommandé de respecter l'extrémité du capillaire à la lame de verre de pointe durant la procédure 2.2.1.3 parce que le périmètre de l'extrémité de la pointe est trop petit pour contenir la goutte des phospholipides à l'extrémité de pointe que par la force capillaire.
    2. Préparation d'une solution de vésicules
      1. Nettoyer un flacon, et éliminer l'eau du flacon, comme présenté dans la procédure 1.1.1.1.
      2. Sécher le volume 2 de un ml de la solution de phospholipide (1 mg / ml) en appliquant doucement de l'azote gazeux, et dessécher la fiole pendant 1 heure à température ambiante pour éliminer tout solvant restant. Effectuez cette procédure dans une hotte de sécurité.
      3. Ajouter 2ml d'eau désionisée dans le flacon contenant les lipides séché, et incuber le flacon dans une étuve à 60 ° C pendant 1 heure.
      4. Agiter le flacon à plusieurs reprises, et soniquer (HF-fréquence: jusqu'à 40 kHz, Puissance: 370 W) pendant 30 min pour obtenir des vésicules.
      5. Effectuer les procédés d'extrusion et de gel-dégel à obtenir des vésicules unilamellaires monodisperses. Le protocole détaillé pour la préparation des vésicules est décrite dans Mayer et al., 21.
        Remarque: la pression de surface de l'interface des gouttelettes est commandé en ajustant avec précision le temps d'attente après la formation de la gouttelette qui contient des vésicules unilamellaires monodisperses. Utilisation d'une méthode de la goutte pendante 22, il est nécessaire de mesurer la variation de la pression de surface en fonction du temps, avant de faire l'expérience.
  3. La formation d'une gouttelette contenant une monocouche de phospholipides à la surface courbe
    1. Remplissez le capillaire conique avec 10 pi d'eau déminéralisée de procedure 2.2.1. Vous pouvez également utiliser 10 pi de la solution de la vésicule de la procédure 2.2.2.
    2. Connecter le capillaire à un micro-injecteur automatique pour fournir la pression pour former la goutte.
    3. Monter le capillaire qui est connecté à un micro-injecteur à un micromanipulateur pour commander la position du capillaire avec précision.
    4. Préparer un microscope à champ lumineux (Microscope 1, objectif: 10X NA 0,3) pour l'imagerie de la vue latérale du capillaire avec une caméra CCD. Microscope 1 permet ainsi d'observer la position exacte de la goutte le long de l'axe z et estimer la taille de la gouttelette.
    5. Déplacer l'extrémité de pointe à une position où la vue latérale de l'extrémité de pointe est bien visualisé par Microscope 1 en utilisant un micromanipulateur, et appliquer une pression variable (~ 100 hPa) avec l'extrémité du capillaire de pointe, jusqu'à une taille appropriée (~ 100 um de diamètre) de gouttelette est formée.
      Remarque: Il est recommandé que les micro-injecteur et micromanipulateur automatisé être utiliséd, si le contrôle précis de la taille des gouttelettes et de l'emplacement de la goutte est nécessaire. Il est également possible d'utiliser les manuels.

3. Imaging Fluorescence Recovery après la fusion des gouttelettes

Remarque: Les principes fondamentaux de ce protocole sont identiques à ceux de la technique de FRAP, sauf pour le processus de coalescence des gouttes. Les théories de protocole et connexes détaillées de FRAP sont disponibles dans A. Lopez et al. 15 et D. Axelrod et al. 16.

  1. Surveiller et contrôler l'emplacement de la gouttelette
    1. Préparer un microscope inversé set (Microscope 2, objectif: 10X NA 0,3, lentille de tube: longueur focale de 17 cm) qui permet à la fois un microscope à fluorescence avec un ensemble de filtre approprié pour la rhodamine DPPES (excitation à 560 nm, émission à 583 nm) et un microscope à champ lumineux. Utiliser une caméra CCD ici pour visualiser les vues de dessus de la gouttelette avec un microscope à fluorescence mode et un mode de microscope à champ lumineux.
    2. Déplacer la goutte revêtu d'un phospholipide à une interface air-eau à plat le long de l'axe z, mais ne pas fusionner les gouttelettes encore à l'aide du micromanipulateur. Utiliser une Microscope à visualiser la vue latérale de la gouttelette.
    3. Localisez la goutte au centre de la vue de dessus de la monocouche plat, en utilisant le micromanipulateur. Utilisez le mode de microscope à champ clair de Microscope 2 pour visualiser vue de dessus de monocouche plat.
  2. La fusion de la goutte sur l'interface air-eau plate
    1. Déplacez la gouttelette de plus vers l'interface plat jusqu'à la goutte fusionne sur l'interface, en utilisant le micromanipulateur. Si le processus de fusion est réalisé avec succès, une zone sombre avec une forme circulaire qui est entouré par un fond blanc, est observé en utilisant le mode de microscope de fluorescence 2.
    2. Enregistrer la série d'images à fluorescence en fonction du temps après la fusion de la goutte, l'aide du mode de fluorescence de Microsfaire face 2. Utilisez un taux de trame plus rapide que l'échelle de temps de diffusion de la monocouche ici. Dans DOPC monocouche, il faut quelques minutes pour diffuser dans la zone 200 um sombre complètement.

4. Détermination du coefficient de diffusion par analyse d'image

Remarque: Pour déterminer le coefficient de diffusion à partir d'une série d'images, le programme sur mesure pour l'analyse d'image est construit comme décrit ci-dessous. Un code source détaillée de ce programme est disponible sur le site JoVE.

  1. La détection d'une région d'intérêt circulaire
    1. La détection du centre de la région d'intérêt
      1. Obtenir une série d'images fluorescentes qui ont été enregistrées au cours d'un processus de récupération qui contient une zone sombre circulaire et un fond blanc, et définir la première image de la série comme une image de référence. Ici, R D est le rayon de la zone sombre dans une image de référence.
      2. Convolute l'image de référence avec un cercle blanc quiintensité soi est uniforme sur toute une région. Utilisez la fonction intégrée nommé 'conv2 »pour convolution comme indiqué dans le code source de la ligne de programme personnalisé 124. Ici, le rayon du cercle blanc est légèrement plus petit que R D.
      3. Trouver une position qui indique une valeur minimale dans le calcul de la convolution, et définir cette position en tant que centre de la région d'intérêt dans l'image de référence.
    2. La détermination d'un rayon de la région d'intérêt
      1. Convolute l'image de référence avec un cercle blanc qui contient une position de centre, déterminé par une procédure 4.1 et l'intensité uniforme sur toute une région. Ici, R S est le rayon du cercle blanc. Utilisez itération comme «pour» ou «tout» à l'équation d'un cercle pour faire le cercle blanc comme indiqué dans le code source de la ligne de programme personnalisé 102 à 109.
      2. Convolute l'image de référence avec un autre cercle blanc qui a un peuplus grand rayon (5% -10%), R L, R que S. Utilisez la même méthode avec la procédure 4.1.2.1 pour faire le cercle comme indiqué dans le code source de la ligne de programme personnalisé 113-120.
      3. Obtenir la différence de valeur entre les deux calculs de convolution de 4.1.2.1 et 4.1.2.2.
      4. Répéter les procédures ci-dessus de R S R = D / 2 à R S = 2R D, en augmentant à la fois la S R R L et à un niveau de pixel. Faire une itération qui contient les codes sources entières de procédure 4.1.2.1 à 4.1.2.3 de répéter.
      5. Trouver le rayon R S indique que la différence maximum de valeur entre les deux calculs de convolution. Utilisez la fonction intégrée nommée 'max' pour trouver le rayon indique la différence maximale de la valeur comme indiqué dans le code source de la ligne de programme personnalisé de 148 à 149. Cette R S indique ainsi le rayon de la zone sombre dans l'image de référence.
    3. Calcul d'une intensité fractionnaire
      1. Définir un cercle qui contient une position de centre et un rayon, déterminé par une procédure 4,1 comme région d'intérêt.
      2. Calculer les intensités moyennes de la région d'intérêt dans une série d'images de fluorescence en fonction du temps. Convolute chaque cadre avec la région d'intérêt et le diviser par domaine de la région d'intérêt pour calculer l'intensité moyenne. Les détails sont disponibles dans le code source du programme sur mesure qui est disponible sur le site JoVE.
      3. Calculer une intensité fractionnaire, définie par l'équation ci-dessous, où F (t) est l'intensité moyenne dans le cercle qui est une région d'intérêt en fonction du temps, F i est l'intensité initiale dans le cercle, et F o est l'intensité du un fond blanc.
        f (t) = (F (t) - F i) / (F o - F i) (équation 1).
    4. Montage de la fintensité ractional à la théorie de FRAP
      1. Monter l'intensité fractionnée avec l'équation ci-dessous, où τ est un temps caractéristique de diffusion et I 0, I 1 sont modifiés fonctions de Bessel, en utilisant un programme d'ajustement, et d'obtenir τ
        Equation 2 (Equation 2).
      2. Obtenir un coefficient de diffusion sur la base de la relation, τ = 2/4 D, où D est le coefficient de diffusion et a est le rayon de la zone sombre.
        Remarque: Pendant le processus d'ajustement, il est possible de changer le profil d'intensité fractionnée le long d'un axe de temps lorsque le processus de récupération a déjà commencé, avant d'enregistrer les images.

Representative Results

Une série d'images de fluorescence ont été obtenus avec le temps au cours du processus de récupération après la fusion une gouttelette revêtue d'une monocouche de DOPC sur un DOPC monocouche plat, comme indiqué dans la figure 1. La monocouche DOPC à l'interface air-eau plate a été dopé avec de faibles quantités de rhodamine-DPPE, et cela a donc permis de visualiser un fond avec une couleur vive et une région sombre nouvellement ajouté à l'interface plat. Là, un processus de récupération a été observée à 23 mN / m de surface de pression fixe. Un ajustement de l'équation 1 à la modification de l'intensité fractionnée en fonction du temps est représenté dans la figure 2. Le R 2 valeur de cet ajustement est de 0,999, ce qui forme fonctionne encore bien, même à des pressions de surface inférieurs ou supérieurs. Le coefficient de diffusion de la monocouche de DOPC obtenu à partir de cette forme fut 27,54 pm 2 / s à 23 mN / m de surface de pression.

Pour de plus amples validation de la FRAM, coefficients de diffusion de la DODipalmitoylphosphatidylcholine (DPPC) et PC monocouches ont été mesurés selon la pression de surface. Comme le montre la Figure 3, FRAM capture la diminution rapide du coefficient de diffusion de la monocouche de DPPC à ~ 9 mN / m de la pression de surface, où une LC (liquide condensé) - LE (liquide élargi) transition de phase se produit 10, et les valeurs de coefficients de diffusion sont également bien d'accord avec les mesures antérieurement par Peters et al., 19. En outre, une décroissance exponentielle du coefficient de diffusion de la pression de surface a été observée dans la monocouche de DOPC, et cette tendance est presque identique à celle mesurée par Caruso et al., 12.

Figure 1
Figure 1. (A) Représentation schématique de la FRAM (récupération de fluorescence après la fusion) de la technique. Comme la lèvreid monocouche gouttelettes revêtu est fusionné à l'interface air-eau plat, la monocouche lipidique sans fluorescence étiqueté lipidique est inséré dans fluorescent plat monocouche lipidique. Images (B) de fluorescence au microscope avec le temps au cours du processus d'une monocouche de DOPC de récupération à 23 mN / m de la pression de surface (barre d'échelle = 100 um). La région sombre de la monocouche de DOPC est entièrement récupéré par le processus de diffusion au sein de plusieurs minutes. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. L'intensité fractionnaire en fonction du temps. Les cercles noirs et la ligne pointillée grise indiquent les valeurs d'intensités des fractions obtenues à partir de l'analyse d'image (procédures 4.1 et 4.2) et l'ajustement de l'équation 1 aux intensités fractionnaires avec le temps,montré dans la procédure 4.3, respectivement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Les coefficients de diffusion de DOPC (triangle) et DPPC (place vide) monocouches en fonction de la pression de surface. Les lignes avec la couleur gris clair et avec la couleur gris foncé indiquent les valeurs du coefficient de diffusion rapporté précédemment par Peters et al. et Caruso et al., respectivement. Ce chiffre a été modifié depuis Jeong et al. 23. Reproduit avec la permission de Jeong et al. Langmuir. 30 (48), 14369-14374. Droit d'auteur 2014 American Chemical Society. S'il vous plaît cliquer sur sone pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

FRAM partage un grand nombre de principes fondamentaux avec FRAP, en particulier pour la mesure de la récupération de fluorescence après blanchiment d'une zone spécifique, mais FRAM utilise un processus de fusion goutte sur l'interface plane pour former une zone blanchie, au lieu d'appliquer une lumière intense. Le processus de fusion est donc l'étape la plus importante dans FRAM, et surtout, la forme de la tache sombre à la monocouche plat après la fusion d'une gouttelette détermine la précision de la mesure de diffusivité. Plus précisément, sur la base d'une méthode actuelle, nous ne fixons le cercle avec un rayon R comme une région d'intérêt pour calculer l'intensité moyenne de la tache sombre, montré dans la procédure 4, et si il ya un trop écart par rapport à la forme circulaire, ce serait perturber la mesure précise d'un coefficient de diffusion. Par conséquent, il est nécessaire d'obtenir une région sombre de forme circulaire, mais, des formes non circulaires sont formés de temps en temps pour plusieurs raisons. Tout d'abord, si il existe un flux de convection dans le Petplat ri, la forme de la zone sombre devient allongée le long de la direction de l'écoulement. Comme mentionné dans la procédure 1.3, un appareil en forme de cône aide à supprimer le flux de convection, et cet allongement serait minimisé. Deuxièmement, si l'extrémité de la pointe capillaire de l'interface en contact à plat au cours d'un processus de fusion, la zone sombre est formé avec une variété de formes depuis l'extrémité de capillaire interrompt le processus de fusion. En obtenant une gouttelette qui est seulement suspendu à partir de la fin du capillaire, cette interruption peut être empêchée. En particulier, un traitement hydrophobe du capillaire permet la gouttelette de siéger à la toute fin du capillaire. Par conséquent, des fusillades et des modifications de la panne ci-dessus nous permettent de mesurer les propriétés de diffusion plus précisément.

Ce processus bien dépanné permet ainsi FRAM d'avoir plusieurs avantages significatifs par rapport FRAP. Tout d'abord, FRAM nécessite un équipement simple par rapport à FRAP. Pour FRAM, il suffit d'utiliser un simple micros de fluorescencefaire face, au lieu d'un microscope confocal cher avec un laser de forte puissance dont la longueur d'onde doit correspondre avec le spectre d'absorption du colorant. En outre, il est nécessaire d'utiliser un appareil supplémentaire pour ajuster la taille de la zone blanchie dans la FRAP, tandis que le FRAM contrôle la taille de la zone facilement par ajustement de la taille de la goutte, ou la pression de surface à la surface des gouttelettes. Deuxièmement, il est possible d'utiliser diverses espèces de colorants dans FRAM. FRAP utilise uniquement des molécules de colorant dont le processus de blanchiment est beaucoup plus rapide que le processus de diffusion. Si la diffusion des colorants se produit pendant le processus de blanchiment, il est difficile d'estimer la propriété de diffusion de façon précise. Le FRAM, cependant, ne nécessite pas un procédé de décoloration des colorants, ce qui permet ainsi l'utilisation de divers types de colorants dans l'imagerie de fluorescence. En outre, le FRAP nécessite lasers de forte puissance supplémentaires et le filtre se met à changer les espèces tinctoriales, alors qu'il est seulement nécessaire de remplacer les jeux de filtres dans la FRAM. finalementÉtant donné que les monocouches à la surface des gouttelettes et l'interface plat peut être formé de façon indépendante, ce qui permet l'étude de l'inter-diffusion ou de mélange entre deux monocouches lipidiques différents par fusion de monocouche de type B monocouche de type A, tandis que le FRAP ne mesure la autodiffusion d'une monocouche.

Malgré ces avantages, le processus de fusion goutte sur une interface air-eau plat peut potentiellement limiter cette technique en raison de plusieurs questions qui pourraient être source de préoccupation, comme une incompatibilité de pression de surface entre les deux monocouches, l'échelle de temps du processus de fusion et une augmentation de la pression de la monocouche de surface plate après la fusion des gouttelettes. Ces questions, cependant, ne portent pas atteinte à la mesure de la diffusion de manière significative pour les raisons suivantes. Tout d'abord, même si les pressions de surface à deux monocouches différents sont tout à fait différent, un processus d'équilibrage achevé à un stade très précoce au cours du processus de récupération. Par exemple, si til pression de surface de la monocouche sur la surface de la gouttelette est plus élevée que celle de la monocouche à l'interface air-eau à plat, la zone sombre se développe jusqu'à ce que la pression superficielle se équilibre. Etant donné que ce processus soit achevé dans les 10 ms, la pression de surface sera équilibrée avant qu'il affecte le processus de diffusion de manière significative. Deuxièmement, si l'échelle de temps du processus de fusion est suffisamment rapide, elle ne limite pas la mesure de la diffusion du tout. Heureusement, un processus de fusion typique est également terminé dans les 10 msec. Enfin, même multiple fusion des gouttelettes sur l'interface plane ne pas augmenter la pression de surface depuis la surface de la cuvette est beaucoup plus grande que l'aire de surface de la gouttelette. Selon les dimensions de l'auge et les gouttelettes, décrit dans le protocole, l'aire par molécule augmente de moins de 0,015% en fusion d'une gouttelette. En conséquence, l'augmentation de la pression de surface en raison de la modification de surface par molécule est inférieur à 0,1%, ce qui est negligible car elle est beaucoup plus petite que l'erreur type de la pression de surface, telle que mesurée par plaque de Wilhelmy tensiomètre.

En résumé, nous avons introduit une nouvelle méthode pour mesurer la propriété latérale de diffusion d'une monocouche de phospholipides en fusionnant une monocouche de gouttelettes sur l'interface plat. Cette technique nécessite un équipement relativement simple et permet également l'utilisation de diverses sortes d'espèces de colorants. Le FRAM est donc potentiellement applicable à la mesure de la diffusion de tous les agents tensio-actifs, y compris des phospholipides, des copolymères séquences, des protéines et même des nanoparticules à une interface liquide-liquide. En outre, nous nous attendons à ce que le FRAM offre une nouvelle façon d'étudier l'inter-diffusion ou de mélange entre deux agents actifs de surface différents.

Acknowledgments

Ce travail est soutenu par le projet financé par le KAIST K-Vallée Rouge & B pour 2014 et le programme de recherche en sciences de base par la National Research Foundation de Corée (NRF- 2012R1A6A3A040395, NRF-2013R1A1A2057708, NRF- 2012R1A1A1011023).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone OCI corporation Acetone 3.8L Extra Pure Purity: ≥ 99.5%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use.
Ethanol OCI corporation Ethanol 3.8L Extra Pure Purity: ≥ 94%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use.
Dioleoylphosphatidylcholine, DOPC Avanti Polar Lipids 850375C Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Chloroform is carcinogenic.
Chloroform LiChrosolv Chloroform ultrapure (A3633) Purity: ≥ 99.8%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Carcinogenic
Rhodamine DPPE Avanti Polar Lipids 810158C, 810158P Avoid direct light exposure to prevent photobleaching
Wilhelmy plate tensiometer R&K ultrathin organic film technology Wilhelmy tensiometer http://www.rieglerkirstein.de/index.htm
Micropipette puller Sutter instrument P-1000
Micro-injector Eppendorf Femtojet
Micromanipulator Eppendorf Micromanipulator 5171
Microscope 1 Objective lens: Olympus Objective lens: UPlanFl 10x Objective lens: 10X NA 0.3
Microscope 2 Objective lens: Olympus, Tube lens: Thorlabs Objective lens: UPlanFl 10x Objective lens: 10X NA 0.3, tube lens: focal length 17 cm
CCD for Microscope 1 Jai CV 950 camera
CCD for Microscope 2 Andor iXon3 EMCCD
Filter set Chroma technology Catalog Set 49004: ET545, T565, ET605 Prepare suitable for dye molecules
Sonicator DAIHAN Scientific Wiseclean WUC-D06H

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References

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Bioengineering Numéro 104 FRAM la diffusion déposer coalescence monocouche de phospholipides FRAP inter-diffusion interfaces liquide-liquide
Récupération de fluorescence après Fusionner une Droplet mesurer la Diffusion bidimensionnelle d'une monocouche de phospholipides
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Jeong, D. W., Kim, K., Choi, M. C., Choi, S. Q. Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer. J. Vis. Exp. (104), e53376, doi:10.3791/53376 (2015).

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