Protocol
Etik Beyanı: Çalışma Ulusal Chiayi Üniversitesi, onay numarası Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından uluslararası kurallarına uygun olarak yapılan ve kabul edildi: cetacean örnek kullanımı Tayvan Tarım Konseyi (Araştırma İzni tarafından izin verildi 99022. 100M-02.1-Cı-99).
1. Kas Numune Hazırlama ve SDS-PAGE
Not: Deniz memelilerinin 16 türün, karasal memeli 5 türler de dahil olmak üzere 23 türe kas örnekleri, ton balığı ve tavuk Bu çalışmada (Tablo 1) kullanılmıştır. cetacean kas örnekleri mahsur kişiler, balıkçılık hedef dışı av ve müsadere elde edilmiştir. Tavşan, fare, köpek ve tavuk kas dokuları Ulusal Chiayi Üniversitesi Hayvan Hastalıkları Teşhis Merkezi'nden elde edilmiştir. sığır, domuz, kuzu ve orkinos örnekleri yerel bir süpermarketten satın alındı. Liman foku (Phoca vitulina kas örneği
- kullanılana kadar -20 ° C'de tüm örnekler saklayın.
- -20 ° C'de ön-serin harcı. Sonra içine donmuş kas örnek 3 g koydu.
- Bir doku homojenleştirici kullanarak soğuk fosfat tamponlu salin içinde 10 ml (PBS) ile örnek homojenize edilir.
- 4 ° C'de 10 dakika boyunca 10,000 x g'de homojenize santrifüjleyin. süpernatantlar toplamak ve kullanılana kadar -20 ° C'de saklayın.
- (5 mi,% istifleme jeli (3.07 ml damıtılmış suya, pH 6.8,% 40 akrilamid 625 ul,% 10 amonyum persülfat (APS), 50 | il ve tetrametiletilendiamin 5 ul 4x üst jel tamponu 1.25 ml 5 hazırlanması TEMED)) ve 10 ml% 15 ayırma jeli (damıtılmış su 3.65 mi, 4 kere pH 8.8 alt jel tamponu, 2.5 ml% 40 akrilamid 3.75 mi,% 10, 100 ul APSve TEMED 4 ul).
- Elektroforez hücresinde, ikinci katılaşmasından sonra ayırma jeli (% 15 akrilamid) üzerine jel (% 5 akrilamid) istifleme dökün. istifleme jel jel tarak yerleştirin.
- Aşağıdaki koşullara göre PAGE gerçekleştirin: İlk çalışma koşulu: 100 volt, 20 dakika ve son durum: 120 volt, 40 dk.
- Jel renk eşit mavi olana kadar 30 dakika oda sıcaklığında Coomassie parlak mavisi ile jel leke.
Not: Jel artık boya çözeltisi görünür olduğunda Boyama tamamlanır. - 1 saat süre ile, oda sıcaklığında asetik asit çözeltisi (% 10) ile destain. Bantları görünmeye başlayacaktır. Arka plan temizlenene kadar bir gecede 4 ° C'de lekenin devam edin.
2. Peptid Sentezi ve Tek klonlu Antikor Üretimi
- ton balığı, tavuk, devekuşu, evcil hayvanlar, mühür ve 18 tür dahil olmak üzere, GenBank'tan Mb amino asit sekanslarını almakdeniz memelileri (Tablo 2).
- Uygun yazılım 16 kullanarak dizileri hizalayın:
- Hizala seçerek Hizalama Explorer'ı başlatın: başlatmak çubuğunda Hizalama kurmak / Edit; Yeni Hizalama Oluştur'u seçin ve Tamam'a tıklayın. Bir iletişim soran görünecektir "Bir DNA veya protein dizi hizalama oluşturuyor musunuz?"
- "Protein" etiketli düğmesini tıklayın; Açık: Verileri seçmek Dosya seçin ve dizi dosyasından dizileri Al; Düzenle'yi seçin: Bir çoklu dizi hizalaması oluşturmak için veri seti her dizisi için tüm siteleri seçmek için Tüm menü komutunu seçin.
- Seç Hizalama: ClustalW algoritması kullanılarak seçilen dizileri veri hizalamak için ana menüden ClustalW tarafından hizalayın; Tamam düğmesini tıklatın Protein Kilo Matrix olarak "BLOSUM" i seçin.
- dizi hizalama analiz:
- 5 antijenik reaktif si odaklanıntes 17: Alanı 1 (AKVEADVA, 15-22), Alanı 2 (KASEDLK, 56-62), Alanı 3 (ATKHKI, 94-99), Alanı 4 (HVLHSRH, 113-119) ve site 5 (KYKELGY, 145- 151) ve deniz memelileri arasında muhafaza fragmanı bulmak. Bir * (yıldız; hizada konsensüs sembolü (Protokol 2.2.3)) tek, tamamen korunmuş kalıntısı pozisyonları gösterir. deniz memelileri aşağıdaki korunmuş parçaları bulundu: (siteyi 2 dahil) dizisi KASEDLKKHG ve dizi HVLHSRHP (hangi siteyi 4 içerir).
- ticari hizmetlerini kullanarak taşıyıcı protein olarak ovalbümin proteininin (OVA) ile sekans analizi ve konjugat göre aday dizisi fragmanları sentezlemek.
- Ayrışma peptidin önlemek için antijenik reaktif site N-terminali hidrofobik amino asitler (örneğin, metionin) ilave (örneğin, E-KASEDLKKHG).
- immünosit çekirdek bir antijenik yeri sergilemek için antijenik reaktif sitenin C-terminal uzatır. Bundan başka, konjugatKapı Cı-terminal sistein (Cys; C) eklenerek OVA peptid (örneğin, E-KASEDLKKHG-NTVL-C).
- imünojen 1 ya da PBS içinde, her sentetik peptit, eşit hacimde (3 mL, nihai konsantrasyon 30-50 g / 100 ul) ile imünojen 2 tam olmayan Freund katkı maddesi için tam Freund katkı maddesi emülsiyon.
- deri altından 5 dişi BALB / c farelerinin her birine imünojen 1 (0.1 mg), inoküle.
- İki haftalık aralıklarla subkutan güçlendirici enjeksiyonları immünojen 2 kullanılarak beş kez gerçekleştirin ve her güçlendirici önce farelerden alınan kuyruk klip örnekleme test serumları toplamak.
- İlk tarama için, sera titresi belirlenir.
- 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna, reaksiyon tamponu ve kısım çözeltisi 50 ul 25 ml serbest peptidin 100 ug çözündürülür. Her kuyuya 10 ul birleştirme reajanı solüsyonu eklenir ve plaka karıştırın. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübasyona bırakılır.
- , Kuyunun içeriğini kaldırdamıtılmış su ile her bir oyuğa 3 kez yıkama ve bloke etme çözeltisi 200 ul ilave edilerek plaka engeller. Oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. içeriğini çıkarmak ve damıtılmış su ile her bir oyuğa 3 kez yıkayın.
- İlk tarama için sera titresinin belirlenmesi için dolaylı ELISA (Protokol 5,1-5,7) gerçekleştirin. dalak koleksiyonu için en yüksek titre (en yüksek optik yoğunluk) ile fare seçin.
- Üç gün önce dalak koleksiyonuna, deri altı yüksek titreye sunan fare içine immünojen 1 0.1 mg aşılamak.
- MAb nesil 18 için hibridoma hücreleri elde etmek için fare miyelom hücreleri F0 (sp2 / 0-Ag14) ile seçilmiş aşılanmış farelerde ve sigorta dalak hücreleri toplamak.
- 14 gün füzyon sonra, dolaylı ELISA kullanılarak içermeyen sentetik peptid doğru hibridom üst fazları (Protokol 5,1-5,7) reaktivitesini tarama ile pozitif klonlar seçin.
- maximiz için oyuk başına uygun sayıda hücreleri sulandırmaksadece tek bir klon (seyreltme klonlama) içeren havuzlara oranını ing.
- Boş kalan de A1 hariç 96 oyuklu plaka içerisinde tüm oyuklara hücre kültür ortamının 100 ul ekle.
- de A1 hücre süspansiyonu 200 ul ekle. Sonra hızlı bir şekilde B1 A1 100 ul transferi ve hafifçe pipetleme karıştırın. Tüm sütun boyunca 2 dilüsyonları, ve bunun üstünde kuyuları ile aynı hacmi ile biter böylece daha sonra H1 100 ul atmak: Bu 1 tekrarlayın.
- 8 kanallı mikropipet ile sütun 1, orta ve ek bir 100 ul ekle. Daha sonra hızlı bir şekilde, aynı pipet kullanarak sütun 2'de kişilerce sütun 1 kuyuların herbirinden 100 ul transfer ve yavaşça pipetleme karıştırın.
- tüm plaka üzerinde 2 dilüsyonları: Aynı ipuçlarını kullanarak, bu 1 tekrarlayın. son sütunda kuyuların her birinden 100 ul atın.
- Her bir oyuğa 100 ul ortamı eklenerek 200 ul tüm oyuklara nihai hacim getirin. pla inkübeTe nemlendirilmiş CO2 kuluçka makinesi içinde 37 ° C ısıda.
- Her çukurun kontrol edin ve sadece tek bir koloni içeren tüm kuyuları işaretlemek. Tek klonlar içeren kuyuların>% 90 antikor üretimi için pozitif olana kadar iki veya daha fazla klonlama yürütmek.
- Western blot ve Dot blot (protokol 3,1-4,6) ile klonları taramak. Sonra daha büyük kaplara kuyulardan alt kültür koloniler mAb elde etmek için hücreleri genişletmek için. Genellikle, her klon 12 veya 24 oyuklu bir plaka içerisinde, tek bir kuyunun içine aktarılır.
- mAbs ve inek, keçi, domuz, köpek, tavşan, ton balığı, tavuk, mühür kas özleri ve western blot ve dot blot (protokol 3,1-4,6) dört temsilci cetacean türler arasındaki yakınlık ölçün.
- Assitler ikna etmek için farelerin periton içine (en fazla 3 x 10 6) seçilen hibridoma hücreleri aşılamak. Karın şişliği 7-10 gün hibridoma enjeksiyon sonrası içinde genellikle açıktır. bir hipodermik bir iğne kullanılarak sıvının toplama(Az 20 ölçü).
- Santrifüj asit sıvısı (10 dakika 10.000 xg) hücreleri ve enkaz kaldırmak için. 0.45 um'lik bir filtre ile filtrelenir. Protein G Sefaroz kolonuna örnek 1 ila 20 ml bağlama tamponu 15 mi, ve elüsyon tamponu 3 ila 5 ml ilave edilir. farenin asit sıvısı arıtılmış antikor içeren ayırma fraksiyonu toplamak.
- Üreticinin talimatlarını kullanarak Antikor İzotipleme Kiti ile antikor izotipini belirlemek.
3. Western Blot
- BME 50 ul 2x Laemmli numune tamponu 950 ul karıştırılarak β-merkaptoetanol (BME) ihtiva eden 2 x yükleme tamponu hazırlayın. Poliklonal tavşan anti-insan Mb antikoru kullanıldığında 5 (evcil hayvanlar ve ton balığı) ve: 01:50 (, deniz memelileri ve mühür) ve 1: iyi sinyaller elde etmek için uygun oranda yükleme tamponu kas üst fazlar (protokol 1.1-1.4) seyreltin 1: 1 (domuz, tavşan, tavuk ve ton balığı), 1: 5 (inek, keçi ve köpek) ve 01:25 (deniz memelileri ve mühür) zamanntibody Hibridom yüzey arasındadır.
- 5 dakika boyunca 95 ° C'de ısı örneği. moleküler ağırlık belirteçleri ile birlikte SDS-PAGE jel (% 4 akrilamit yığınlama ve% 12 akrilamid ayırma) oyuklarına Numuneleri. V sonra yaklaşık 1 saat içinde koşmak bitirmek için 150 V gerilimi artırmak 50 ° C'de 5 dakika boyunca jel çalıştırın.
- 15 dakika boyunca 1 x transfer tampon maddesi içinde jel yerleştirin. nitroselüloza ayrılan protein aktarın (NC) membranlar da PAGE ile ayrıldıktan sonra. Aktarım 60-90 dakika boyunca 100 V'ta yapılabilir.
- engelleme çözeltisi hazırlayın: 1X PBS,% 5 yağsız kuru süt ile% 0.1 Tween 20 ihtiva etmektedir. 1 saat boyunca oda sıcaklığında bloke etme çözeltisi 25 ml Carolina membran engeller. Tween 20 (PBST), 15 ml fosfat tamponlu tuzlu su ile her biri 5 dakika için üç kez yıkayın.
- Antikor Seyreltme tampon maddesi gece boyunca 4 ° C 'de% 5 engelleme çözeltisi ile seyreltildi, 10 ml membran ve primer antikor (assit sıvısı veya hibridom üst faz) inkübe edin.
- zarı yıkayınYine PBST ile e üç kez aşırı antikor temizlemek için.
- 1 ile alkalin fosfataz konjuge edilmiş keçi anti-fare IgG'si ile membran inkübe: 1,250, oda sıcaklığında 1 saat süre ile hafif bir çalkalama ile engelleyici çözelti içinde.
- Yine zarın yıkanması ve 5-bromo-4-kloro-3-indolil fosfat / p-nitro mavi tetrazolyum klorit içinde inkübe (BCIP / NBT) fosfataz alt-tabaka karışımı 10 ila 20 dakika süreyle renk gelişimi kadar.
- damıtılmış su çeşitli değişiklikler membranın yıkama ederek reaksiyonu durdurun.
4. nokta leke
- iyi sinyaller elde etmek için uygun bir oran ile PBST içinde% 5 sığır serum albumin (BSA), kas üst fazlar (protokol 1.1-1.4) seyreltilir: 1: evcil hayvanlar ve ton 5 ve 1:25 deniz memelileri ve conta için. Noktası zarı üzerine numune 5 ul. Çözelti yavaşça uygulayarak (genellikle 3-4 mm çapında) nüfuz bölgeyi en aza indirin.
- Oda sıcaklığında (zar kurutun, örneğin <30-60 dakika boyunca, bir laminar akış / em>), oda sıcaklığında, 1 saat süre ile Petri kabındaki çözüm engelleme ile bloke eder ve PBST ile yıkayın.
- primer antikor ile membran inkübe (mAb 1 ile hibridoma süpernatanından: 10,000 veya assit sıvısı ile 1: 5% engelleme çözeltisi içinde seyreltildi 100,000), oda sıcaklığında 1 saat karıştırıldı.
- Oda sıcaklığında 1 saat boyunca (% 5 Bloklama çözeltisi, 1.250 1 alkalin fosfataz konjuge edilmiş keçi anti-fare IgG'si) kullanımı PBST fazla antikor kaldırmak ve daha sonra sekonder antikor ile inkübe edilmesi her biri 5 dakika MEMBRAN üç kez yıkamak .
- Yine membran yıkayın ve renk gelişimi kadar 10 ila 20 dakika içinde BCIP / NBT fosfataz substrat karışımı içinde kuluçkaya yatmaktadır.
- damıtılmış su çeşitli değişiklikler membranın yıkama ederek reaksiyonu durdurun.
5. Dolaylı ELISA
- Yıkama tamponu (% 0.02 Tween 20 ile 0,002 M imidazol tamponlu tuz) hazırlayın. plaka yıkama ile 3 kere yıkayınHer bir sonraki aşamada (protokol 5.2-5.5) arasında tampon.
- kaplama tamponu kas süpernatanları (protokol 1.1-1.4) ve 01:25 seyreltme hazırlayın. Ceket 96-çukurlu bir ELISA gece boyunca 4 ° C'de 100 ul seyreltilmiş supernatantlar plaka ve oda sıcaklığında 1 saat süre ile tampon (PBS içinde% 1 BSA) ile bloke ile bloke eder.
- İnceltilmiş tampon ile saflaştırılmış mAb 2.000 seyreltme ve her bir seyreltilmiş, mAb 100 ul 1 hazırlayın. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübasyona bırakılır.
- daha inkübasyon için: (seyreltilmiş tampon maddesi içinde 200 seyreltme 1) keçi anti-fare IgG yaban turpu peroksidaz ile konjüge edilmiş ekleyin.
- her bir (100 ul / çukur) peroksidaz substratı ilave edin ve 10-15 dakika inkübe edilir.
- Renk gelişimi gözlemlenir peroksidaz durdurma çözeltisi (100 ul / oyuk) enzim reaksiyonu durdurun.
- Bir mikrolevha spektrofotometre kullanılarak 450 nm'de optik yoğunluk okuyun.
Kolloidal Altın etiketli mAb 6. hazırlanması Not: koloidal altın çözüm ve karışımın rengi her zaman kırmızı olmalıdır. Siyah çökelti fark edildiğinde pH, mAb konsantrasyonu, santrifüj hızını ayarlayın. 6.1 Adımları ve 6.2 optimizasyon adımlardır.
- 5-9 arasında değişen pH değerleri ile, koloidal altın çözeltisi 100 ul mAb (50 ug / ml, 3 ul) tespit saflaştınlmış ekleyin. İki saat süre ile kırmızı rengi tutan en az optimum pH değeri pH olarak kabul edilir. Not: Bu çalışmada, 0.1 M potasyum karbonat kolloid altın (40 mil), pH 8.0 (optimum pH) çözüm ayarlamak için kullanıldı.
- pH 8.0'da koloidal altın çözeltisi 100 ul mAb tespit saflaştırılmıştır çeşitli bir miktar (500 mg / ml, 1-20 ul) eklenir. Not: Bu çalışmada, optimum konsantrasyonu 6 ng / ml (siyah tortu) 'dir.
- Yukarıdaki sonuçlara göre, arıtılmış, mAb damla damla kolloid altın çözeltisi 10 ml saptama 60 ug ekleyin. 10 dakika süre ile, oda sıcaklığında, karışımın hafifçe emülsifiye. ilankarışıma PBS içinde% 5 BSA çözeltisi (pH 7.4), 2 ml ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında yavaşça emülsifiye D interferansı azaltır.
- 4 ° C'de 30 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüjleyin karışımı.
- dikkatli bir şekilde konjüge edilmemiş antikor ile süpernatantı ve% 1 BSA ve% 0.1 Tween 20 içeren PBST ile 4 ml elde pelet askıya ve santrifüj ve süspansiyon birkaç kez tekrarlayın.
- 1 ml PBST son çökeltiler askıya alma ve kullanılana kadar 4 ° C sıcaklıkta saklayın.
Bağışıklık Strip 7. İnşaat
Not: Şekil 1, bağışıklık şerit tasarımı gösterir. Hazırlayın ve <(1 yıl) uzun süreli depolama ömrü için (% 20 Bağıl Nem düşük nem laboratuarı çevre durumda şeritler)> monte edin. pedleri ve zarın boyutları: Birleşmiş Yastığı, 300 mm x 10 mm, emici ped, 300 mm x 24 mm, Örnek Yastığı, 300 mm x 24 mm, NC membranı 300 mm x 25 mm, 300 çalışma alanınamm x 80 mm.
- Birleşmiş Yastığı, doyurulması ve sonra monte edilmeden önce 1 saat boyunca 37 ° C'de kurutmak için mikropipet ile adım 6.6 arasında kolloid altın etiketli mAB solüsyonu eklenir.
- Bir pipet ya da İmmunoStrip yazıcı kullanılarak Kuzey Carolina zar üzerinde mAb saptanması için kontrol alanının spesifik antijen yakalama test bölgesi üzerinde mAb (500 ug / ml) ve tavşan anti-fare IgG (500 ug / ml) dağıtın. bir girişimi engellemek için iki bölge arasındaki mesafeyi (> 5 mm) tutun.
- çift taraflı bant ile çalışma alanında konjuge pad, emici ped ve NC membran yapıştırın.
Not: yaklaşık 2 mm NC zarın her iki tarafındaki pedleri üzerinden geçin. Uygunsuz şerit inşaat tamamlanmamış bir testte neden olur. - eşlenik pedi üzerinde numune pedi (2 mm) yerleştirin ve çalışma alanındaki yapıştırın.
- Bir kağıt kesici ile 6 mm çapında şeritler oluşturun. kurutucu ile alüminyum folyo çanta içinde şeritler paketleyin ve kullanılana kadar 4 ° C sıcaklıkta saklayın.
8. Çapraz reaktivite Testi
- 1.5 ml santrifüj tüpüne 1 ml PBS içeren (% 0.1 BSA) bambu çubuk kullanarak ya da çubuğu taşlama ham kas numunesi 0.03 g homojenize edilir.
- Test alanlara son tersi şeridi tutun ve 5-10 dakika süreyle numune içine numune pedi parçası daldırma ve doğrudan sonucu gözlemleyin.
- İsteğe bağlı: 500 ul süpernatant toplayın ve yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.
Not: şerit doğrudan süpernatant içine batırılmış zaman sinyal açık değilse, bu adım önerilir.
- İsteğe bağlı: 500 ul süpernatant toplayın ve yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.
- üç nüsha olarak çeşitli kas örnekleri test edin.
Not: Burada orkinos, tavuk, mühür, deniz memelileri 15 tür ve karasal memeli 5 tür test. - , Beş bağımsız müfettişler, yani beş kez 8.3 tekrarlayın sahip toplam 575 şeritler kullanın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Monoklonal antikor özelliklerinin
Bu memeli Mb sırasıyla iki sentetik peptidler (MKASEDLKKHGNTVLC ve AIIHVLHSRHPAEFGC) tanıyan, iki IgG 1 mAb (CGF5H9 ve CSF1H13) geliştirildi ve bu memeli Mb hızlı tespiti için yapılan bir sandviç tipi koloidal altın immünokromatografik test şeridi oluşturmak için kullanıldı. Şekil 2, CGF5H9 yaklaşık 17 kDa'lık tahmini bir moleküler ağırlığında tek bir boyanmış bandın olarak, deniz memelileri ve diğer memelileri tespit göstermektedir. Bayağı minke balinası (Balaenoptera acutorostrata) diğer deniz memelileri bantları daha nispeten sönük bant gösterir. yaklaşık 50 kDa bir grup domuzlar için görülmektedir ise bantları, ton balığı, tavuk ve mühürler yoktur. domuz ve ton için birden çok non-spesifik grupları olmasına rağmen, bu sadece yaklaşık 17 k tahmini moleküler ağırlığında bir bant olarak deniz memelileri ve mühürler ile reaksiyona girer, çünkü CSF1H13 yüksek oranda spesifiktirDa. Mink. Sadece 1:25 gözlenen hiçbir sinyal 1:10 (veriler gösterilmemiştir) de güçlü bir sinyal gösterir balina 2 nokta blot aynı sonuçları göstermektedir.
Şekil 3A CGF5H9 deniz memelileri, tavşanlar, köpekler, keçi ve inek (OD değeri> 3.0) için pozitif bir sinyal ortaya koyduğunu göstermektedir; Domuzlar için zayıf pozitif sinyal (OD değeri = 1.5); mühürler, tavuk ve orkinos negatif sinyal. Şekil 3B CSF1H13 deniz memelileri ve mühürler karşı yüksek afinite (OD değeri> 3.0) ifade ettiğini göstermektedir. CSF1H13 ve CGF5H9 Hem dört memeli türler ile güçlü bir tepki olabilir. Bu dört tür farklı ailelerden gelmektedir (minke balinası: Balaenopteridae; Afalina: Delphinidae; cüce ispermeçet balinası: Kogiidae; finless porpoise: Phocoenidae), çeşitli deniz memelileri türlerinin geniş reaktivite gösteren.
şerit yapımı için CGF5H9, t tanır hangiO deniz memelileri ve diğer memelilerde MBS, bir kolloid altın işaretli ve miyoglobin bağlamak için algılama antikoru olarak kullanılan ve CSF1H13 yalnızca deniz memelileri ve mühürler MBS yakalamak için test hattı üzerine kaplanır. Bu nedenle test çizgisi, her iki mAb'lar cetacean Mb tespit olumlu bir sinyal göstermek için tasarlanmıştır. olmayan memeli hayvanlardan Mb sadece bu iki mAb'nin tarafından tespit edilebilir, çünkü test hattı diğer hayvanlardan kas örnekleri test edilir, bir negatif sonucu göstermektedir. tavşan anti-fare IgG kolloid altın işaretli CGF5H9 bağlar için kontrol hattı her zaman pozitif bir sonuç göstermektedir. Kontrol hattında bir başarısız sonuç şeridinde malzemelerin kalitesi kötü olduğunu gösterir.
şerit testi
Cetacean kas örnekleri kullanıldığında Şekil 4 test hattı ve kontrol çizgisi hem de sinyal bantları gösterir. Örnek deniz memelileri değil ise, kontrol hattı wi sadece tek bir grup varTest hattında bant yokluğunu th. Başarılı sonuç 10 ml PBS plastik veya bambu sopa kullanarak% 0.1 BSA içeren ve karışımın içine şeridi iliklerine ile kas 0.03 g homojenize sonra 5-10 dakika doğrudan gözlenebilir. 15 cetacean türler ve üç kopya halinde sekiz olmayan memeli türleri test ettikten sonra, özgüllük (non-memeli örneklerinin yüzdesi doğru tespit) ve duyarlılık (doğru tespit cetacean örneklerin yüzdesi) her ikisi de% 100.
Üst üste o kadar bağışıklık şerit Şekil 1. Tasarım. Tüm bileşenleri dikkatlice plastik arkalığı kartına katmanlı edilir. Bu reaktifler ve numune zar içinden ve emici ped kadar akış sağlar. T: Test bölgesi. C: kontrol bölgesi. Bu rakam Lo, C. ve ark çoğaltılamaz edilmiştir. Hızlı immün koloidal altın şerit. cetacean et kısıtlama yasadışı ticaret ve tüketim için: korunması ve halk sağlığı üzerindeki etkileri PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi:. 10,1371 / journal.pone.0060704 bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Batı benek ve hibridoma süpernatanları kullanarak nokta leke analizi. (A) CGF5H9, (B) CSF1H13. Hem hibridom üst fazları, yaklaşık 17 kDa'lık tahmini bir moleküler ağırlığında tek bir boyanmış bandın deniz memelilerinin algılayabilir. MW: minke balinası, BND: Afalina, DSW: cüce ispermeçet balinası, FP: finless porpoise, PKW: pigme katil balina, N: PBS (negatif kontrol). Bu rakam Lo, C. ve ark çoğaltılamaz edilmiştir. C Hızlı bağışıklık koloidal altın şeritetacean et frenleyici yasadışı ticaret ve tüketim. korunması ve halk sağlığı üzerindeki etkileri PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi:. 10,1371 / journal.pone.0060704 bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Saflaştırılmış mAb kullanılarak farklı türlerin, kas ekstrelerinin Şekil 3. dolaylı ELISA (A). CGF5H9, (B) CSF1H13. Sadece deniz memelileri hem mAbs güçlü olumlu sinyaller üretebilir. Bu rakam Lo, C. ve ark çoğaltılamaz olmuştur memeli et kısıtlama yasadışı ticaret ve tüketim için hızlı bağışıklık koloidal altın şerit.:. Korunması ve halk sağlığı üzerindeki etkileri PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi: 10,1371 / journal.pone.0060704. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Bağışıklık koloidal altın şerit Şekil 4. Özgünlük T:. Test hattı. C: kontrol hattı. cetacean kas örnekleri kullanıldığında Yalnızca, başarılı sonuçlar (test hattı ve kontrol çizgisi hem de sinyal bantları) görülebilir. (A) Sigara cetacean örnekler: 1: İnek. 2: Keçi. 3: Domuz. 4: Köpek. 5: Tavşan. 6: Tuna. 7: Tavuk. 8: Liman foku (Phoca vitulina). (B) Deniz Memelileri örnekleri: 1: Ortak minke balinası (Balaenoptera acutorostrata). 2: Omura balina (Balaenoptera omurai). 3: Bottlenose yunus (Tursiops aduncus). 4: Bottlenose yunus (T. truncatus). 5: Sarawak yunusu (Lagenodelphis Hosei </ Em>). 6: Hint-Pasifik kambur yunus (Sousa chinensis). 7: Boz Yunus (Grampus griseus). 8: Pantropical yunus (Stenella attenuata) gördü. 9: Kaba dişli yunus (Steno bredanensis). 10: Pigme Katil balina (Feresa attenuata). 11: Kısa yüzgeçli Pilot balina (Globicephala macrorhynchus). 12: Kavun başlı balina (Peponocephala electra). 13: Cüce ispermeçet balinası (Kogia sima). 14: Pigme ispermeçet balinası (K. breviceps). 15: Finless porpoise (Neophocaena phocaenoides). Bu rakam Lo, C. ve ark çoğaltılamaz olmuştur memeli et kısıtlama yasadışı ticaret ve tüketim için hızlı bağışıklık koloidal altın şerit.:. Korunması ve halk sağlığı üzerindeki etkileri PLoS ONE 8, e60704 (2013). doi:. 10,1371 / journal.pone.0060704 tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.
| cetacean türler | Sigara cetacean türler |
| Pigme ispermeçet balinası (Kogia breviceps) | Liman foku (Phoca vitulina) |
| Cüce ispermeçet balinası (Kogia sima) | Köpek (Canis lupus familiaris) |
| Kısa kanatlı bir pilot balina (Globicephala macrorhynchus) | Tavşan (Cryctolagus cuniculus) |
| Kavun-başlı balina (Peponocephala electra) | Domuz (Sus scrofa) |
| Pigme katil balina (Feresa attenuata) | Keçisi (Capra hircus) |
| Pantropical (Stenella attenuata) Yunus benekli | Sığır (Bos Taurus) |
| Afalina (Tursiops truncatus) | Tavuk (Gallus gallus) |
| Afalina (Tursiops aduncus) | Sarı tuna (Thunnus albacares) |
| Sarawak yunusu (Lagenodelphis Hosei) | |
| Hint-Pasifik kambur yunus (Sousa chinensis) | |
| -Pürüzlü dişli yunus (Steno bredanensis) | |
| Boz Yunus (Grampus griseus) | |
| Finless porpoise (Neophocaena phocaenoides) | |
| Bayağı minke balinası (Balaenoptera acutorostrata) | |
| Omura balina (Balaenoptera omura i) |
Kas colle oldu türlerin hangi Tablo 1.CTED ve bu çalışmada test edildi. Türler, karasal memeliler 5 tür, ve balinalar 15 tür (4 aile) ton balığı, tavuk, mühür sayılabilir.
| tür | hayır Katılım. |
| Bayağı minke balinası (Balaenoptera acutorostrata) | P02179 |
| Cüce Bryde balina (Balaenoptera edeni) | Q0KIY2 |
| Kambur balina (Megaptera novaeangliae) | P02178 |
| Gri balina (Eschrichtius robustus) | P02177 |
| Ispermeçet balinası (Physeter macrocephalus) | P02185 |
| Pigme ispermeçet balinası (Kogia breviceps) | Q0KIY5 |
| Cüce ispermeçet balinası (Kogia sima) | P02184 |
| Kısa beaked ortak yunus (Delphinus delphis) | P68276 |
| Uzun yüzgeçli Pilot balina (Globicephala melas) | P02174 |
| Katil balina (orca Orcinus) | P02173 |
| Kavun-başlı balina (Peponocephala electra) | Q0KIY3 |
| Pantropical (Stenella attenuata) Yunus benekli | Q0KIY6 |
| Afalina (Tursiops truncatus) | P68279 |
| Mutur (Phocoena phocoena) | P68278 |
| Amazon nehri yunus (Inia geoffrensis) | P02181 |
| Longman en gagalı balina (Indopacetus pacificus) | Q0KIY9 |
| Hubbs gagalı balinası (Mesoplodon carlhubbsi) | P02183 |
| Cuvier gagalı balina (Ziphius cavirostris) | P02182 |
| Liman foku (Phoca vitulina) | P68080 |
| Sığır (Bos Taurus) | P02192 |
| Keçisi (Capra hircus) | B7U9B5.3 |
| At (Equus caballus) | P68082 |
| Domuz (Sus scrofa) | P02189 |
| Köpek (Canis lupus familiaris) | P63113 |
| Tavuk (Gallus gallus) | P02197 |
| Devekuşu (Struthio camelus) | P85077 |
| Sarı tuna (Thunnus albacares) | P02205 |
Ilgili GenBank erişim numaraları ile, bu çalışmada kullanılan Tablo 2. Myoglobin dizileri. Türlere, ton balığı dahiltavuk, devekuşu, yerli memeliler, mühür ve balinalar 18 tür (7 aile). Bu tablo Lo, C. ve ark çoğaltılamaz olmuştur memeli et kısıtlama yasadışı ticaret ve tüketim için hızlı bağışıklık koloidal altın şerit.:. Konservasyon ve halk sağlığı PLoS ONE 8 üzerindeki etkileri, e60704 (2013). doi: 10,1371 / journal.pone.0060704.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
taşıyıcı proteine konjüge edilmiş sentetik bir peptidin kullanımıyla kognat proteine kıyasla önemli ölçüde daha etkilidir. mAb bilinen göreceli yerle epitopları kullanılarak geliştirilmiştir, çünkü sandviç temelli bir yöntem için, bu çalışmada iki mAb hedef antigen epitopu ile birbirlerinin etkileşime müdahale olası değildir. Ayrıca, doğal proteinin, sentetik peptit bağı ile bağışıklaştırılan farelerin antikor arasında tepkime nativ protein ve doğal proteinin 19 üretilen antikorun arasındaki reaktivite daha güçlü olabilir. sentetik peptid konjügatlarının kullanılması bu nedenle, uygun bir anti-peptid mAb etkin aşılama işlemleri ve üretim için tavsiye edilir.
bir proteinin yapısı esas olarak polipeptit zincirinin amino asit dizisini kapsar. Her bir amino asit yan zincirine özgü özelliklerine gelen ve hafif amino ACI değiştirilmesi yer alırd dizisi yapı değişiklikleri ile sonuçlanır. 10-20 amino asitlik bir uzunluğu olan peptidler antikor preparasyonu için idealdir, çünkü C-terminal bölgesinde sentetik peptitler (immünojen) uzunluğu temel antijenik bölgenin kabul edileceği sağlamak için yükseltilmiştir. Bu nedenle, farklı epitop yapılarda ortaya çıkan çeşitli hayvanlar MBS arasındaki amino asit kalıntıları etkin ayırt edilebilir. Örneğin, Şekil 3A CGF5H9 memelilerin arasında negatif conta ile kuvvetli bir reaksiyona bahsedilen peptid tasarım katkı göstermektedir. Tavuk çekirdek antijenik sitesinde 2. köpeğin buna özdeş bir sayı dizisi olmasına rağmen başka bir örnek Bu dış bölgede sekans farkı yapı değişikliği ve dolayısıyla değişken yol açabilir belirten CGF5H9 Tavuk ve köpekler karşı farklı eğilimleri olan antijen ve antikor arasında bağlanma afinitesi.
Western blot, dot blot ve dolaylı ELİSA kullanılmıştırUygun mAbs taranması için bizim yöntemi. Western Blot yaygın doku ekstraktı veya Homojenat belirli proteinleri tespit etmek için kullanılır. Bu teknikte, jel elektroforezi polipeptidin uzunluğu denatüre proteinlerin ayrılması için kullanılır. Nedenle, sinyal tahmin edilen protein molekül ağırlığını göstermektedir olup olmadığını teyit etmek mümkündür. Ancak, algılama sonucu (pozitif veya negatif, güçlü ya da zayıf sinyal) denatüre proteinler kullanıldığı için bağlayıcı antijen-antikor gerçek durumunu temsil olmayabilir. Sonuç olarak, nokta benek ikinci aşama tarama için de kullanılabilir. Nokta benek proteinleri tespit etmek için bir yöntemdir. Western blot yöntemi bir basitleştirme temsil eder. Nokta blot, saptanacak molekülü ihtiva eden bir karışım, bir nokta olarak, bir membran üzerine doğrudan uygulanmaktadır. Protein numuneleri denatüre edilmez, çünkü bu Western Blot farklıdır. Bu teknik hedef biyomolekül boyutuna hiçbir bilgi sunar unutmayın, ve tek bir nokta, iki mo eğer görünecektirfarklı boyutlarda lecules tespit edilir. Son olarak, dolaylı ELISA doğru ölçülebilir bir sinyal üretmek için, bir ligand-bağlanma deneyinde kullanılır. Bu mAb özelliklerinin daha fazla bilgi sağlar ve böylece şerit inşaat kolaylaştırır.
kasta Mb Konsantrasyonları toplama konumuna bağlı olarak değişkendir. Örneğin, deniz memelileri yüzme kasları (eksenel kasları) olmayan yüzme kasları ile karşılaştırıldığında Mb önemli ölçüde daha yüksek bir içeriğe sahip ve genç deniz memelileri örnekler nedeniyle Mb konsantrasyon artışları bir hayvanın yaşamı 20 boyunca alt Mb konsantrasyonu olurdu. Başlangıçta, sadece deniz memelileri ve mühürler Mb yakalar CSF1H13, kolloid altın etiketli olması ve antikor tespit olabilir ve birçok türün Mb tanır CGF5H9, test hattı üzerinde yakalama antikoru olacaktır amaçlanmıştır. Biz tespit antikor daha spesifik olması gerektiğini hipotezi ve yakalama antikoru gerekirdaha genel. düşük bir MB konsantrasyonları memeli örnekler kullanılmıştır, ancak zayıf bir olumlu sinyal testi hattı bulunmuştur (veriler gösterilmemiştir). Sorun iki mAb'ler pozisyonları temsilcisi sonuçları açıklandığı gibi ters zaman çözüldü. İyi bir sinyal bile yeni doğmuş bir cetacean (bir mahsur Omura balina) (Şekil 4) için gösterilmiştir. Özellikleri ve mAbs konsantrasyonu bu fenomene katkı belirsizdir.
Bu çalışmada, PBS ile homojenize dondurulmuş çözülmüş kas örnekleri şerit testi kullanılmıştır. Diğer örnek koşulları ve hazırlama yöntemleri sonucu etkileyebilir. Örneğin, Mb gibi tuz-çözünür protein, saf su yerine PBS ile ekstre edilmelidir. Aksi takdirde, ekstraksiyon bir anormal sonuca yol açabilecek, yetersiz olabilir. Uygun ekstraksiyon tamponu: Et örnek oranı şerit sonucu başarılı yorumlanması kısmen sorumludur. büyük Amount kontrol örneklerinde (örneğin, evcil hayvanların) ve (0.3 gr 1 ml tampon) olumlu sonuç ve bulanık arka plan neden olabilir. Bununla birlikte, (1: 0.03), bu çalışmada kullanılan oranı doğru sonuçlar elde edilmiştir. Sadece taze kas örnekleri bu şerit testi için kullanılabilir. Protein hidrolize ya da diğer hayvanlardan memeli kas numuneleri, aynı zamanda örnekler için, sadece pozitif sonuçlara neden olabilir, (örneğin, soya sosu, kaynatılarak sertleştirme gibi) bazı tedavilerden sonra denatüre edilebilir (veri gösterilmemiştir). Nedenle, değişken numune kaynakları ve farklı yapı tasarımı planları şerit geliştirme sırasında kullanılması gerektiğini tavsiye edilir.
Sonuç olarak, bu protokol deniz memelileri arasında Mb şiddetle reaktif iki mAb'nin gelişimini açıklar ve bu mAb'ler mühür ve diğer hayvanlardan deniz memelileri arasında Mb ayırt hızlı bir test şeridi üzerinde uygulanır. Memeli et tanımlanması için güvenilir bir PCR bazlı DNA analizi kullanılabilir 12 olmakla birlikte, bu is emek yoğun ve zaman alıcı. Pratik test şeridi düzenleyici kurumlar 21 için arzu edilen bir memeli etler, tespit etmek alanda kullanılabilen bir güvenilir ve hızlı bir yöntemdir. Şerit, at veya domuz gibi hayvanların belirli Mbs saptanması için geliştirilebilir muhtemeldir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline | AMRESCO | J373 | |
| Protein G HP SpinTrap | GE Healthcare | 28-9031-34 | spin column containing Protein G Sepharose |
| IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit | Roche | 11493027001 | Isotyping Strips, precoated with subclass- and light-chain-specific anti-mouse-Ig antibodies |
| Mini Trans-Blot | Bio-Rad | 170-3935 | |
| Nitrocellulose membrane | Whatman | Z613630 | |
| Antibody blocker solution | LTK BioLaboratories | To minimize nonspecific binding interactions of nonspecific IgG in the samples | |
| BCIP/NBT phosphatase substrate | KPL | 50-81-00 | |
| Protein Detector HRP Microwell Kit, Anti-Mouse | KPL | 54-62-18 | |
| Nunc Immunoplate MaxiSorp ELISA plate | Thermo Fisher Scientific | EW-01928-08 | |
| Multiskan EX ELISA reader | Thermo Electron Corporation | 51118170 | |
| Colloid gold (40 nm) solution | REGA biotechnology Inc. | 40-50 nm is appropriate for immunostrip | |
| Bovine serum albumin | Gibco | 15561-020 | |
| Rapid test immno-strip printer | REGA biotechnology Inc. | AGISMART RP-1000 | Only suited for small scale production of immunostrips for research and development purposes |
| Strip components (NC membranes, sample pads (#33 glass, S&S), conjugate pads (#16S, S&S) and absorbent pads (CF6, Whatman)) | REGA biotechnology Inc. | ||
| Freund’s adjuvant and incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881, F5506 | Used to produce water-in-oil emulsions of immunogens |
| Acrylamide, gel buffer, ammonium persulfate (APS), tetramethylethylenediamine (TEMED) | Protech | Gel preparation for SDS-PAGE | |
| Coomassie brilliant blue R-250 | Bio-Rad | 1610436 | Protein staining in SDS-PAGE gels |
| Laemmli sample buffer and β-mercaptoethanol | Bio-Rad | 1610737, 1610710 | Dilute protein samples before loading on SDS-PAGE gels |
References
- Robards, M. D., Reeves, R. R. The global extent and character of marine mammal consumption by humans: 1970-2009. Biol. Conserv. 144, 2770-2786 (2011).
- Booth, S., Zeller, D. Mercury, food webs, and marine mammals: implications of diet and climate change for human health. Environ. Health Perspect. 113, 521-526 (2005).
- Endo, T., et al. Total mercury, methyl mercury, and selenium levels in the red meat of small cetaceans sold for human consumption in Japan. Environ. Sci. Technol. 39, 5703-5708 (2005).
- Tryland, M., et al. Human pathogens in marine mammal meat. Norwegian Scientific Committee for Food Safety (VKM). , (2011).
- Matsunaga, T., et al. A quick and simple method for the identification of meat species and meat products by PCR assay. Meat Sci. 51, 143-148 (1999).
- Dalebout, M. L., Helden, A. V., van Waerebeek, K., Baker, C. S. Molecular genetic identification of southern hemisphere beaked whales (Cetacea: Ziphiidae). Mol. Ecol. 7, 687-694 (1998).
- Dalmasso, A., et al. A multiplex PCR assay for the identification of animal species in feedstuffs. Mol. Cell. Probes. 18, 81-87 (2004).
- Kesmen, Z., Sahin, F., Yetim, H. PCR assay for the identification of animal species in cooked sausages. Meat Sci. 77, 649-653 (2007).
- Liu, L., Chen, F. -C., Dorsey, J. L., Hsieh, Y. -H. P. Sensitive Monoclonal Antibody-based Sandwich ELISA for the Detection of Porcine Skeletal Muscle in Meat and Feed Products. J. Food Sci. 71, 1-6 (2006).
- Kotoura, S., et al. A Sandwich ELISA for the Determination of Beef Meat Content in Processed Foods. Food Sci. Techno. Res. 15, 613-618 (2009).
- Hsieh, Y. H., Chen, Y. T., Gajewski, K. Monoclonal antibody-based sandwich ELISA for reliable identification of imported Pangasius catfish. J. Food Sci. 74, 602-607 (2009).
- Ross, H. A., et al. DNA surveillance: web-based molecular identification of whales, dolphins, and porpoises. J.Hered. 94, 111-114 (2003).
- Ngom, B., Guo, Y., Wang, X., Bi, D. Development and application of lateral flow test strip technology for detection of infectious agents and chemical contaminants: a review. Anal. Bioanal. Chem. 397, 1113-1135 (2010).
- Muldoon, M. T., Onisk, D. V., Brown, M. C., Stave, J. W. Targets and methods for the detection of processed animal proteins in animal feedstuffs. Int. J. Food Sci. Technol. 39, 851-861 (2004).
- Rao, Q., Hsieh, Y. H. Evaluation of a commercial lateral flow feed test for rapid detection of beef and sheep content in raw and cooked meats. Meat Sci. 76, 489-494 (2007).
- Tamura, K., et al. MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Mol. Biol. Evol. 28, 2731-2739 (2011).
- Atassi, M. Z. Antigenic structure of myoglobin: the complete immunochemical anatomy of a protein and conclusions relating to antigenic structures of proteins. Immunochemistry. 12, 423-438 (1975).
- Zhang, C. Hybridoma technology for the generation of monoclonal antibodies. Methods Mol. Biol. 901, 117-135 (2012).
- Kao, D. J., Hodges, R. S. Advantages of a synthetic peptide immunogen over a protein immunogen in the development of an anti-pilus vaccine for Pseudomonas aeruginosa. Chem. Biol. Drug Des. 74, 33-42 (2009).
- Dolar, M. L., Suarez, P., Ponganis, P. J., Kooyman, G. L. Myoglobin in pelagic small cetaceans. J. Exp. Biol. 202, 227-236 (1999).
- Lo, C., et al. Rapid immune colloidal gold strip for cetacean meat restraining illegal trade and consumption: implications for conservation and public health. PLoS ONE. 8, e60704 (2013).
