Summary
L'obiettivo di questo protocollo è quello di dimostrare come monitorare la dinamica delle proteine fluorescenti-taggato sulla superficie delle cellule di piante con variabile angolo epifluorescenza, mostrando punti di GFP-tagged PATROL1, una proteina del traffico di membrana a lampeggiare, nella corteccia cella del complesso stomi in Arabidopsis thaliana.
Protocol
1. Preparazione di Giovani pianta
- Sterilizzare i semi.
- Preparare la soluzione di sterilizzazione aggiungendo 500 microlitri NaClO (cloro disponibile: 5.0%) e 1 ml 10% Triton X-100 a 500 microlitri di acqua sterile.
- Posto circa 10 transgenico A. thaliana semi trasportano GFP-PATROL1 8 in una provetta da 1,5 ml.
- Aggiungere la soluzione di etanolo 1 ml di 70%, e mescolare bene capovolgendo cinque volte. Lasciare agire per 1 min.
- Osservare i semi si depositano sul fondo della provetta. In una cappa a flusso laminare pulito, rimuovere delicatamente la etanolo al 70% con una micropipetta, e aggiungere 1 ml di soluzione di sterilizzazione. Mescolare bene capovolgendo cinque volte e lasciar riposare per 5 minuti.
- Lavare i semi. Ancora lavorando sotto condizioni asettiche su un banco pulito, rimuovere delicatamente la soluzione con una micropipetta, e aggiungere 1 ml di acqua sterile. Ripetere questa operazione cinque volte. I semi sterilizzati possono essere conservati in acqua sterile a 4 ° C per 2 giorni.
- Cosìw i semi sterili su un 0,5% gellano gomma-solidificato 1/2 Murashige e Skoog piatto (pH 5,8) 9. Nastro il coperchio sulla piastra utilizzando due strati di nastro chirurgico.
- Incubare la piastra al buio a 4 ° C con una cella frigorifera, O / N.
- Trasferire la lastra in una camera di crescita fissato a 23,5 ° C con un / 12 hr-chiaro-scuro ciclo di 12 ore con 100 mmol m -2 s -1 luci bianche, e incubare per 7 giorni. Piantine con cotiledoni di circa 1 mm di lunghezza possono essere raccolte.
2. Cadutalibera Montaggio di Cotyledon campioni
NOTA: Un fattore importante nella preparazione dei campioni per l'osservazione VAEM è di evitare l'inclusione di bolle d'aria tra il campione e il vetro di copertura. Bolle riducono notevolmente la qualità delle immagini di VAEM provocando differenze nell'indice di rifrazione. Un metodo semplice, che abbiamo chiamato 'cielo drop' di montaggio, può essere utilizzato per evitare le bolletra la A. cotiledoni thaliana e il vetro di copertura. Questo dovrebbe essere fatto immediatamente prima osservazione.
- Mettere 30 ml di tampone basale [5 mM 2- (N -morpholino) -ethanesulfonic acid-Tris (MES-Tris) a pH 6,5, 50 mM KCl, 100 mM CaCl 2] al centro di un vetrino (dimensioni: 76 × 26 mm, spessore: 1,0-1,2 mm).
- Rimuovere un cotiledone da una piantina 7 giorni di vita con le forbici dissezione. Float cotiledone con il lato rivolto verso l'alto di osservazione sulla goccia basale tampone (Figura 1, fase 1).
- Mettere 30 ml di tampone basale al centro di un vetro di copertura (dimensioni: 18 × 18 mm, spessore: 0,12-0,17 mm) (Figura 1, fase 2). Ruotare il vetro di copertura a testa in giù con delicatezza. La tensione superficiale impedisce la caduta di tampone di cadere. Tenere il vetro di copertura con una pinzetta su un bordo. Posizionare il bordo opposto sul vetrino modo che la goccia buffer è approssimativamente sopra cotiledone.
- Con il bordo del vetro di copertura ancora sul vetrino, e ancora tenendo il bordo opposto con pinzette, regolare la posizione della goccia tampone sotto il vetro di copertura in modo che sia direttamente sopra il campione cotiledone (Figura 1, fase 3). Lasciate andare il vetro di copertura. Montare una goccia sul campione risultante in un preparato senza bolle d'aria.
- Pulire il tampone in eccesso utilizzando tessuti privo di lanugine. Osservare immediatamente la preparazione (vedi punto 3).
NOTA: Non è necessario sigillare i campioni.
3. VAEM Osservazione e Movie acquisizione
NOTA: Il sistema di microscopia TIRF 9 utilizzati nel presente studio è descritto come segue: Un microscopio invertito è dotato di una unità TIRF e una lente obiettivo TIRF con un'apertura numerica di 1,49. Per il controllo computerizzato del dell'angolo di ingresso del laser, viene utilizzata una scatola di controllo. Proteina fluorescente verde (GFP) è eccitato con un laser a semiconduttore 488 nm pompaggio ottico, e tegli fluorescenza viene rilevata attraverso un filtro passa-banda 510-550 nm per impedire autofluorescenza da cloroplasti. Il valore massimo misurato della potenza di uscita fibra è 13,0-13,5 mW. Per il rilevamento, un elettrone moltiplicando charge-coupled device (EM-CCD) Sistema di testa macchina fotografica e di un C-mount unità cambiamento di ingrandimento della fotocamera sono utilizzati.
- Calibrare il laser centratura e messa a fuoco in base alle istruzioni del produttore.
NOTA: Questo passaggio è fondamentale per precise osservazioni VAEM. Si raccomanda vivamente che i controlli periodici delle procedure di regolazione percorso laser, appropriata al microscopio, vengono effettuati.- Determinare la posizione centrale illuminato con una luce obiettivo percorso senza lente sul soffitto della stanza microscopia. Per segnare la posizione centrale, mettere un sigillo cerchio colorato sul soffitto (figura 2, punto 1, 2).
- Illuminare il soffitto con una lente obiettivo (Figura 2, fase 3, 4). Spostare l'illuminated regione sulla posizione centrale (figura 2, punto 5). Mettere a fuoco il laser (figura 2, punto 6). Mettere a punto la posizione del laser focalizzato al centro (Figura 2, punto 7).
- Impostare un preparato sul tavolino del microscopio e selezionare le celle di osservazione in illuminazione campo chiaro.
- Verificare che la proteina fluorescente può essere osservato nelle cellule, e impostare la posizione z -axis sulla superficie cellulare mediante illuminazione epifluorescenza (Figura 3A).
- Eseguire osservazioni VAEM.
- Inclinare l'angolo di ingresso del fascio laser gradualmente con la scatola del regolatore. Allo stesso tempo, controllare l'immagine inquadrata accuratamente. Inizialmente, l'immagine sarà offuscata (Figura 3B).
- Quando l'angolo laser aumenta, l'immagine VAEM diventerà meno offuscata, fino a produrre una chiara immagine (Figura 3C e D). A questo punto, interrompere Increacantare l'angolo del laser. Se il segnale di fluorescenza viene perso, ridurre ad un angolo poco profondo.
- Ottimizzare l'angolo di ingresso del laser per ottenere una migliore immagine. Messa a punto della posizione z -axis può anche migliorare l'immagine. Se necessario, regolare i parametri ottici (potenza del laser, lunghezza d'onda e filtro scelto) e parametri del sensore immagine [dimensioni dell'immagine, tempo di esposizione, guadagno, digitizer e-elettroni moltiplicando (EM) di guadagno].
NOTA: Nel caso delle apparecchiature microscopio TIRF descritto sopra, i parametri rappresentativi sono i seguenti. Ingrandimento dell'obiettivo proprio di fronte alla macchina da presa: 2X; Uscita laser: 1,0 mW; Dimensione immagine: 512 × 512 pixel; Tempo di esposizione: 100 msec; Guadagno: 5 ×; Digitizer: 11 MHz; e EM guadagno: 100.
- Acquisire un filmato come file TIFF immagine di più pagine tramite il software del microscopio commerciale. Qui, il film è di punti GFP-etichettata lampeggianti sulla superficie delle cellule stomatici.
NOTA: Le condizioni di acquisizione di immagini rappresentative sono come folbassi. Modalità acquisizione: Flusso di RAM; Numero di fotogrammi: 600; e la dimensione del file TIFF multi-page: ~ 302 MB.
4. Analisi chimografo per la quantificazione di GFP-etichettata Dot Residence tempo usando Fiji Software
- Installare Fiji ('Fiji è solo ImageJ') software 10 utilizzando le istruzioni degli autori (http://fiji.sc/Fiji).
- Eseguire Fiji e aprire il file TIFF a più pagine acquisite tramite il menu Fiji "File-Open".
- Posizionare una linea sul sito di interesse, utilizzando il menu barra degli strumenti Fiji "Straight Line Selection Tool". Facoltativamente, utilizzare la funzione "segmentato Linea Selection Tool" o "a mano libera linea strumento di selezione". Nei risultati presentati qui, una linea retta di 100 pixel (corrispondenti a 8,0 micron) è stato posto su una cella controllata (Figura 4A).
- Fare una immagine chimografo usando il menu Fiji "Immagine-Stack-Dynamic reslice (Figura 4B). Opzionalmente, "Rifletti verticalmente" e "ruotare di 90 gradi" in una finestra di casella di controllo sono disponibili (non utilizzato nei risultati presentati qui). La x e y l'immagine chimografo nella indicano la posizione della linea (100 pixel corrispondenti a anche 8.0 micron) e tempo di osservazione (600 pixel corrispondenti a 60 sec), rispettivamente. Se l'immagine chimografo non è soddisfacente, la posizione e il tipo (dritto, segmentati e mano libera) della linea sull'immagine più pagine possono essere modificate. Per quanto i cambiamenti di linea, l'immagine cambia in modo dinamico chimografo. Salvare una immagine chimografo come file TIFF utilizzando il menu Fiji "File-Salva con nome-Tiff".
- Misurare la lunghezza del blob nell'orientamento dell'asse tempo.
- Per eseguire la riduzione del rumore, applicare un filtro gaussiano alle immagini chimografo utilizzando il menu Fiji "Process-Filtri-Controllo sfocatura". La "Sigma (Radius) "parametro è regolabile (1 raggio pixel viene utilizzato per i risultati presentati).
- Segmento le regioni del segnale di soglia, utilizzando il menu Fiji "Immagine-Adjust-soglia".
NOTA: Ci sono diversi algoritmi di thresholding tra cui scegliere. Nei risultati presentati, l'algoritmo "Yen" è stato scelto (Figura 4C). - Preparatevi a misurare il tempo (y) -axis lunghezza del blob utilizzando il menu "Analizza-Set misure". Controllare il "rettangolo di delimitazione" nella finestra "Imposta misure". Idealmente il set area dovrebbe essere il più piccolo possibile, escludere rumore. Qui, la superficie minima è stata fissata a 50 pixel. Misurare il tempo (y) -axis lunghezza del blob utilizzando il menu "Analizza Analizza-particelle". Per ottenere i valori dei risultati e dimostrare la credibilità delle regioni di misura, controllare i "Risultati" e "Aggiungi a Gestione </ em> "scatole.
- Valori nella colonna "Altezza" sono il tempo (y) -axis lunghezze per il blob misurato (Figura 4D). Salvare i valori utilizzando il menu tabella dei risultati "File-Salva con nome" e calcolare ed elaborare il set di dati di durate immagine blob utilizzando un pacchetto statistico e / o software foglio di calcolo (Figura 4E).
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Representative Results
In questo articolo il video, i protocolli per l'osservazione VAEM di GFP-PATROL1 in A. sono forniti cellule complesse thaliana cotyledon stomatiche. Montaggio Sky goccia è un semplice metodo di preparazione che può aiutare a ridurre la comparsa di bolle d'aria in preparazioni VAEM di A. cotiledoni thaliana (Figura 1). Un'inclinazione eccessiva del laser ingresso e / o Z-posizionamento di campioni per VAEM fornirà un'immagine chiara. Se ciò accade, si consiglia di ripartire da una posizione immediatamente sopra il campione, come giudicato da illuminazione epifluorescenza. Dopo l'esperienza di alcuni giorni di osservazione VAEM, dovrebbe essere possibile acquisire filmati VAEM con successo e di routine, come quello mostrato qui di GFP-PATROL1 puntino lampeggiante. Utilizzando l'analisi chimografo illustrato nella figura 4, i tempi di permanenza di 185 punti GFP-PATROL1 da 12 celle controllate indipendenti in A. cotiledoni thaliana sono stati misurati. La densità montatoFunzione rivelato che la maggior parte dei puntini GFP-PATROL1 risiedevano in una cella controllata per tra 2 e 10 sec, con un picco di circa 3,5 sec (figura 4E), suggerendo esocitosi veloce / endocitosi di protoni pompe sulla superficie cellulare controllata.
Figura 1. Schema di cielo goccia metodo di montaggio Passo 1:. Campione Arabidopsis thaliana cotiledoni sono collocati su una goccia di tampone basale su un vetrino. Fase 2: Una goccia di tampone basale goccia viene posta su un vetrino coprioggetto. Fase 3: Il vetro di copertura con il calo è capovolto e il calo è posto sopra il campione sul vetrino. Fase 4: Il vetro di copertura viene rilasciato e la goccia cade al provino. (Top) veduta panoramica. (In basso) laterale ed ingrandita. Please clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. La taratura del centraggio laser e focalizzazione Passo 1:. La posizione vuota del revolver microscopio è selezionato per inviare la luce laser sul soffitto sopra il microscopio. Fase 2: La posizione centrale è marcato con un sigillo cerchio colorato sul soffitto. Fase 3: È stato selezionato un obiettivo. Fase 4: Controllare la posizione illuminata dalla luce laser attraverso la lente obiettivo. Fase 5: L'illuminazione viene regolata la posizione centrale contrassegnata. Passo 6: La luce laser viene focalizzato. Passo 7:. La luce laser concentrata viene spostato nella posizione centrale contrassegnata Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Confronto di epifluorescenza e angolo variabile epifluorescenza (VAEM). (A) Schema del percorso della luce del laser in epifluorescenza. (B) immagine epifluorescenza Rappresentante di GFP-PATROL1 alle superfici cotiledone a 7 giorni di età piantine di Arabidopsis thaliana. Barra della scala indica 5 micron. (C) Schema del percorso della luce del laser in VAEM. Si noti che l'ingresso del laser è inclinata, e illumina la superficie del campione con profondità variabile. Immagini (D) VAEM della stessa regione come in (B). Barra della scala indica 5 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. analisi chimografo per quantificare il tempo di permanenza di un GFP-PATROL1 punti. Immagine (A) VAEM con una linea retta posizione per fare una chimografo. Barra della scala indica 5 micron. (B) Una immagine chimografo lungo la linea indicata in (A). (C) Un binario immagine di (B) in base a un algoritmo di Yen, generato nel software Fiji. Le linee gialle indicano la regione automaticamente rilevata segnale GFP-PATROL1. (D) Schermata dei risultati tavolo Fidi "Analizza Particelle" la funzione. (E) Un istogramma di tempo di permanenza di GFP-PATROL1 puntino in cellule annesse. La linea rossa indica la funzione di densità. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo articolo video, protocolli sono dati per monitorare e misurare il comportamento dinamico di punti GFP-PATROL1 sul complesso stomatico di Arabidopsis thaliana. Come mostrato qui, l'osservazione VAEM è uno strumento potente per l'imaging dal vivo di superficie delle cellule delle piante. Nelle condizioni sperimentali utilizzate qui per il monitoraggio GFP-PATROL1, c'era molto poco photobleaching fluorescenza nel campione utilizzato per 1 min di cattura video, perché altamente sensibile EM-CCD consente l'uso di un laser relativamente debole eccitazione ottica VAEM. Laser centraggio e messa a fuoco, prima dell'inizio di ogni esperimento, sono importanti per l'osservazione VAEM successo. Gli utenti dovrebbero essere addestrati da personale professionale da parte della società del microscopio scelto prima di utilizzare VAEM.
VAEM rivela che GFP-PATROL1 ha una localizzazione dinamica con un puntiforme vano immobile lampeggiante sulla membrana plasmatica. I mis-l plasma pompa protonica a membrana AHA1 fluorescenza marcataocalizes in PATROL1 mutante cellule di guardia e cellule annesse, come riportato in precedenza 8,9. Quindi, la dinamica dot GFP-PATROL1 VAEM-visualizzate possono rappresentare la mandata della pompa protonica nella membrana plasmatica. Questo comportamento dinamico di GFP-PATROL1 è difficile da visualizzare con i convenzionali Galvanometro a specchio tipo di microscopia confocale a scansione laser, che indica l'utilità di VAEM nello scoprire la dinamica delle proteine in tempo reale sulla superficie delle cellule delle piante. Osservazione GFP-PATROL1 è solo un esempio di applicazione VAEM in biologia cellulare delle piante. VAEM sarebbe applicabile al monitoraggio dei numerosi eventi nello strato corticale sottile di citoplasma nelle cellule vegetali (ad esempio, la secrezione di enzimi in sintesi della parete cellulare o modifica 11,12, membrana plasmatica dinamica delle proteine 7,13,14, della dinamica dei microtubuli corticali 4, riorganizzazione dei microfilamenti di actina 4,15 e organello movimento 6). Una vasta gamma di scienziati di cellule vegetali dovrebbe trarre beneficiomisura dalle tecniche VAEM.
Valutazione quantitativa dei dati di immagine biologici è recentemente diventato importante, guidato dai progressi nelle apparecchiature microscopio e informatica. Dati di filmati VAEM contenenti 512 (x) × 512 (y) × 600 (t) pixel possono essere facilmente ottenuti in pochi minuti. L'analisi delle immagini non solo aiuta a misurare la durata o il movimento di una proteina fluorescenza marcata, ma anche in estrazione informazioni biologiche da grandi insiemi di dati, immagini multidimensionali. Un chimografo è un semplice, ma prezioso, approccio alla determinazione bersaglio movimento proteina dai dati di film VAEM, come dimostra il reclutamento sequenziale di proteine su membrane plasmatiche 2. Il chimografo consentita la visualizzazione dei tempi di permanenza dei puntini GFP-PATROL1 ', e la loro bassa motilità sulle membrane plasmatiche, come mostrato nella Figura 4. Al contrario, un chimografo ha un'efficacia limitata per valutare movimenti più complessi, come lo streaming citoplasmatica. Per ulteriori complimovimento cato, altre analisi immagine approcci come il flusso ottico 16 sarebbe utile.
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Disclosures
L'autore non ha nulla da rivelare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inverted microscope | Olympus | IX-73 | |
| TIRF unit | Olympus | IX3-RFAEVAW | |
| TIRF objective lens | Olympus | UAPON 100 × OTIRF | NA = 1.49 |
| Laser angle control box | Chuo Seiki | QT-AK | |
| Optically pumped semiconductor laser | Coherent | SapphireTM LP USB 488-20 CDRH Laser | |
| 510–550 nm band-pass filter | Olympus | U-FBNA | |
| EM CCD camera | Hamamatsu Photonics | ImagEM C9100-13 | |
| C-mount camera magnification change unit | Olympus | U-TVCAC | |
| MetaMorph software | Molecular Devices | MetaMorph version 7.7.11.0 | |
| TIRF microscopy manual | Olympus | AX7385 | Instructions: Total Internal Reflection Illumination System (Printed in Japan on August 24, 2012) |
| Immersion oil | Olympus | Immersion Oil Typr-F | ne = 1.518 (23 degrees) |
References
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